El objetivo general del siguiente trabajo es contribuir al mejoramiento de los conocimientos básicos que permitan evaluar y mejorar las tecnologías de biorremediación. Los objetivos específicos son: • Aislar a partir de suelos de la Patagonia semiárida, microorganismos degradadores de PAH capaces de resistir condiciones ambientales de la región. • Evaluar la aplicabilidad de las estrategias ABA de bioaumento sobre la biorremediación de suelos patagónicos contaminados con PAH y con mezclas complejas de los mismos. • Estudiar los cambios producidos en la estructura y función de las comunidades microbianas de suelos contaminados por efecto del inoculante y de las variaciones en las condiciones abióticas. • Incursionar en el estudio de los mecanismos moleculares presentes en las bacterias degradadoras de PAH aisladas de suelos de la Patagonia semiárida y seleccionadas como inoculantes por su adaptación a las condiciones ambientales típicas de la región (resistencia a la desecación, déficit de nutrientes, entre otros).

La capacidad de las leguminosas de establecer una asociación simbiotica con bacterias de suelo es de fundamental importancia para la incorporación de nitrógeno a los ecosistemas, particularmente en sistemas agronómicos. En el presente trabajo de tesis se estudió la dinámica de la asociación de transcriptos (mRNAs) y miRNAs a complejos traduccionales durante las etapas tempranas de la simbiosis. Para ello, inicialmente, se puso a punto de la técnica de purificación por afinidad de ribosomas y polisomas (TRAP) en Medicago truncatula. Se cuantificó la variación de los niveles de asociación a polisomas de quince mRNAs en respuesta a la inoculación con su simbionte Sinorhizobium meliloti. Se identificó un grupo de genes, cuyos mRNAs no varían significativamente a nivel de abundancia celular, pero que se regulan positivamente a nivel de su asociación a polisomas en respuesta al rizobio. Este grupo incluyó genes que codifican receptores de tipo quinasas requeridos para la infección bacteriana o la organogénesis del nódulo y factores de transcripción de la familia GRAS y NF-Y. Posteriormente, se evaluaron los niveles de asociación a polisomas de los mRNAs seleccionados en los tejidos específicos de la raíz involucrados en la formación de nódulos: epidermis, córtex y floema. Este análisis permitió identificar mRNAs que se asocian diferencialmente a polisomas en los distintos tipos celulares durante las etapas tempranas de la simbiosis. Por otro lado, se evaluó la presencia de pequeños RNAs (sRNAs) en los complejos traduccionales purificados mediante TRAP. Los sRNAs seleccionados, incluyendo miRNAs de 21 y 22 nts y tasiRNAs, se encontraron asociados a complejos traduccionales. En particular, los niveles de miR169 presentes en polisomas disminuyeron significativamente en respuesta a la inoculación. Esta dismunución se vió acompañada de un incremento en la asociación a polisomas de su gen blanco, NF-YA1, y de los niveles de la proteína en las raíces inoculadas. Estos resultados indican que tanto los mRNAs como los miRNAs estarían sometidos a un reclutamiento diferencial a polisomas y expone la importancia de la traducción selectiva durante la simbiosis. La extensión de la técnica TRAP a M. truncatula abre la posibilidad de profundizar este nivel de regulación tanto a nivel de raíz completa como de tipos celulares específicos en asociaciones simbióticas como la nodulación y la micorrización arbuscular. El presente trabajo de tesis contribuye a sustentar la relevancia de los niveles de regulación post-transcripcional en los cambios de la expresión génica que ocurren durante el establecimiento de una asociación simbiótica de importancia ecológica y agronómica.

Las proteasas aspárticas típicas de plantas (o tipo pepsina) han sido escasamente estudiadas en comparación con sus contrapartes de origen no vegetal. Una excepción a esta afirmación, lo constituyen las cardosinas (Cynara cardunculus) usadas en la manufactura de quesos y la fitepsina (Hordeum vulgare), que al día de hoy continúa siendo una de las pocas proteasas de esta clase caracterizada estructuralmente y por tanto, el modelo utilizado en esta área. Una de las principales razones por las cuales las PAs de plantas no han sido objeto de mayor cantidad de estudios es su escasa abundancia natural. Ésto resulta especialmente cierto en el caso de sus precursores, los cuales contienen el llamativo dominio PSI (inserto específico de plantas), único entre las PAs. En un intento por identificar nuevas fuentes vegetales de PAs típicas, extractos de flores de varias especies pertenecientes a la familia Asteraceae que crecen en Argentina fueron probados en ensayos de coagulación de leche. Una de las especies que mostró esta capacidad coagulante sugiriendo por tanto la presencia de PAs, fue Cirsium vulgare -comúnmente conocido como cardo negro y considerada una maleza en los campos de nuestra región. Fundamentalmente debido a su amplia disponibilidad y a la ausencia de estudios reportados sobre sus PAs, se decidió emplear esta especie de la familia Asteraceae como material vegetal. En este contexto, el presente trabajo intenta generar un aporte al conocimiento de las PAs de origen vegetal mediante el estudio de procirsina, una proenzima de C. vulgare perteneciente a la familia A1, y del dominio PSI contenido en su secuencia.

Esta Tesis está dividida en tres partes, cuyo contenido se describe brevemente a continuación. En la primera parte se realiza un estudio detallado de la voltamperometría de polímeros conductores (Cap. II), teniendo en cuenta la existencia de corrientes capacitivas (Cap. III), y el modelado de la componente faradaica para dar cuenta de la respuesta voltamperométrica total (Cap. IV) antes de arribar al tratamiento de los datos experimentales provenientes de los experimentos de envejecimiento (Cap. II) a la luz del modelo desarrollado (Cap. V). En la segunda parte de esta Tesis se estudia el proceso de envejecimiento por otras técnicas electroquímicas y espectroelectroquímicas. Estos estudios incluyen el análisis del estado reducido de la polianilina por Espectroscopia de Impedancia Electroquímica (Cap. VI) y los cambios sufridos en los espectros de impedancia durante el envejecimiento. También se estudian las modificaciones espectrales UV-vis a través de medidas de espectrofotometría de absorción con potencial aplicado de películas de distintos polímeros conductores sobre electrodos ópticamente transparentes (Cap. VII). Y, finalmente, se estudian los espectros de emisión de fluorescencia de películas de poli-otoluidina sobre electrodos de Au y sus modificaciones con el potencial aplicado y durante el envejecimiento (Cap. VIII). La tercera y última parte de esta Tesis se dedica al estudio teórico y experimental del acoplamiento entre los fenómenos de enlace de electrones (rédox) y de enlace de protones (ácido-base) en polímeros electroactivos. Se desarrolla un modelo termodinámico estadístico para tener en cuenta los acoplamientos y se extiende el concepto de enlace a las reacciones rédox (Cap. IX). Finalmente, se presentan resultados experimentales que dan cuenta de la variación de las distribuciones de potenciales formales de polianilina con el pH y su interpretación en términos del modelo (Cap. X). El acoplamiento de enlaces de electrones y de protones también se estudia a través de la titulación ácido-base de polianilina a diferentes potenciales aplicados cuyos resultados se interpretan sobre la base del modelo termodinámico estadístico. Si bien en cada uno de los capítulos se comentan algunas conclusiones parciales, el Cap. XI está dedicado a las conclusiones más importantes así como también a las posibles perspectivas futuras de este trabajo.

El presente trabajo de Tesis Doctoral ha contemplado el estudio teórico y el desarrollo de modelos computacionales acerca de los efectos que causa el proceso de difusión superficial actuando sobre distintos tipos de estructuras de alta razón de aspecto. Tal estudio presenta un intrínseco interés en diversas áreas de la nanociencia y la nanotecnología, involucrando de manera interdisciplinaria aspectos físicos y químicos.

Al momento de iniciar los estudios que dieron lugar a la presente Tesis Doctoral, la identificación de organismos del cBc en nuestro país presentaba serias limitaciones. Los métodos utilizados a nivel hospitalario eran las técnicas bioquímicas de rutina y los estudios de resistencia a antimicrobianos se hacían empleando los métodos de determinación de CIM convencionales. La epidemiología del cBc en Argentina era muy poco conocida y las metodologías de identificación basadas en técnicas de PCR (PCR-recA primers EE) se encontraban limitadas a un solo nosocomio. Asimismo, en los principales centros de atención de FQ del país se registraba en el año 2004 un aumento considerable de aislamientos de bacterias cuya tipificación era compatible con miembros de cBc. Esta situación fue motivo de gran preocupación en los centros de salud debido a que la identificación del cBc, a nivel de género, solía demorar entre 3–7 días debido a la naturaleza de las técnicas fenotípicas disponibles y en consecuencia esto implicaba una retraso en el inicio del tratamiento antimicrobiano y de las prácticas de aislamiento de los pacientes. En este contexto era de suma necesidad contar con un método rápido, económico y confiable que permitiera la identificación de los principales patógenos respiratorios recuperados de muestras de pacientes FQ y en especial de organismos del cBc. Esta situación motivó a Servicios de Bacteriología de hospitales locales (Hospital de Niños y Rossi de La Plata) a requerir de nuestro Instituto la posibilidad de desarrollar nuevas estrategias de identificación de estos organismos. Ese año 2004 se registró un importante aumento en el número de aislados del cBc en una sala de pacientes FQ del Hospital de Niños de La Plata. Los aislados no pudieron ser discriminados a nivel de especie por el servicio de bacteriología local. A partir de esta situación de base los objetivos generales de este trabajo fueron desarrollar métodos rápidos, sencillos y precisos que permitieran la discriminación e identificación de especies estrechamente relacionadas del cBc y de BNF presentes en infecciones pulmonares de pacientes FQ. Para este objetivo se decidió estudiar la aplicación de nuevas tecnologías fisicoquímicas basadas en la espectroscopía FT-IR y la espectrometría de masa MALDI-ToF. Asimismo se consideró evaluar la acción de antimicrobianos comúnmente empleados en el tratamiento de infecciones pulmonares causadas por el cBc empleando la metodología convencional y el modelo de crecimiento en biofilm. En particular se propuso estudiar en detalle los siguientes ítems: 1.- Desarrollar el empleo de la espectroscopía FT-IR y métodos de análisis multivariantes (análisis de cluster y redes neuronales artificiales) como herramienta para la discriminación e identificación de especies pertenecientes al cBc y BNF relevantes en infecciones pulmonares de pacientes con FQ. 2.- Evaluar el uso de la espectrometría de masa MALDI-ToF mediante detección de biomarcadores específicos y análisis multivariante que conduzcan a la discriminación e identificación de especies pertenecientes al cBc y BNF relevantes en FQ. 3.- Determinar el perfil de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos de especies del cBc procedentes de centros nosocomiales y del ambiente por test convencionales. 4.- Evaluar el efecto de los agentes antimicrobianos en cultivos en biofilms de aislados clínicos y ambientales del cBc.

Se estudió un proceso biohidrometalúrgico de recuperación de metales de pilas alcalinas y de cinc-carbón agotadas en una planta piloto constituida por dos biorreactores air-lift donde se produce medio ácido reductor mediante las bacterias acidófilas Acidithiobacillus thiooxidans, este medio se mezcla con las pilas en el reactor de lixiviación donde se extraen cinc y manganeso. La solución de estos metales se traslada al reactor de recuperación donde se obtiene el producto final del proceso: cinc y manganeso en forma de sales, óxidos o metales dependiendo del proceso de recuperación utilizado: electrólisis o extracción líquido-líquido. La productividad máxima de los biorreactores fue de 25mMH<SUP>+</SUP>/día, equivalente a una producción mensual de 51 moles de H<SUP>+</SUP>. La eficiencia máxima de lixiviación para el cinc fue 100% y para el manganeso, 60%. En los ensayos de electrólisis, el cinc se depositó en el cátodo con un 90% de pureza y el MnO2 en el ánodo, con una pureza de un 82%. En la extracción líquido-líquido, utilizando Cyanex 272 (ácido bis-2,4,4-trimetilpentil fosfínico), la eficiencia de extracción fue 90% para el cinc y 10% para el manganeso. Los óxidos de manganeso obtenidos en este proceso pueden ser utilizados como catalizadores para la eliminación de COVs.

El objetivo del presente trabajo es estudiar el encapsulamiento de ciprofloxacina en matrices de alginato y su liberación empleando diversas condiciones experimentales. En particular: 1) Estudiar las condiciones ambientales de encapsulamiento de ciprofloxacina, a través de la modificación de los principales efectores: pH y calcio(II). 2) Caracterización morfológica de las microesferas de alginato conteniendo la ciprofloxacina. 3) Estudiar las características de liberación controlada de ciprofloxacina en las siguientes condiciones experimentales, a saber: • pH estomacal (1.2 ) y pH intestinal (7.4) • temperatura (30 ºC) • fuerza iónica (10 a 200 mM NaCl)

Los objetivos del presente trabajo han sido: 1.- Desarrollar una matriz biopolimérica mediante métodos de gelificación con capacidad de almacenar enrofloxacina. 2.- Realizar ensayos de encapsulación en distintas condiciones experimentales (Ej. pH, temperatura). 3.- Estudiar los perfiles de liberación de la droga a partir de la formulación matricial elegida en condiciones de simulación gastrointestinal, a saber: pHs 1.2 y 7.4; Temperatura 37ºC en ambos pHs. La finalidad de este trabajo es poder reducir los efectos secundarios y los niveles de toxicidad de la enrofloxacina mediante un sistema efectivo de liberación controlada de la droga basado en biopolímeros inteligentes y mediante la aplicación de un mecanismo de autoensamblado.

Los métodos de liberación controlada y sostenida de moléculas constituyen una nueva estrategia de desarrollo en la industria farmacéutica que permite reducir dosis, frecuencias de administración y toxicidad de fármacos cuyas dosis terapéuticas presentan elevada toxicidad y/o importantes efectos secundarios. Este es el caso de fármacos utilizados para tratamientos de cáncer, cuya administración apropiada sigue presentando hoy en día un desafío para la industria farmacéutica y la medicina. En el presente trabajo se postula desarrollar vehículos más eficientes para el transporte y liberación de moléculas de interés biológico de uso humano y altamente tóxicas empleadas en el tratamiento de patologías agudas y crónicas. Se propone el empleo de biopolímeros naturales para su utilización como matrices transportadoras y el estudio de pruebas de concepto a escala de laboratorio, con la finalidad de una potencial aplicación en el ámbito farmacéutico. Se realizarán estudios con un fármaco seleccionado, Doxorrubicina, una molécula de uso anticancerígeno perteneciente a la familia de las antraciclinas con elevada toxicidad, y de amplio uso en tratamientos oncológicos, para desarrollo de nuevos sistemas de administración de fármacos. Se trabajará sobre diferentes polímeros biológicos naturales, como: alginatos (producidos por algas), pectinas y gomas con el objeto de desarrollar matrices capaces de contener el fármaco modelo. Se explorará el desarrollo de microesferas generadas por gelación iónica en diferentes condiciones de trabajo. Se caracterizarán y evaluarán sistemas seleccionados, empleándose técnicas de microscopía, espectroscopía vibracional (FTIR y RAMAN) y análisis reológicos. Se analizarán las capacidades de almacenamiento y condiciones de entrecruzamiento, estabilidades en medios simulados al fluido gástrico e intestinal así como las cinéticas de liberación bajo estas condiciones.