Annona hypoglauca Mart. foi coletada em área inundada da Floresta Amazônica, próximo à Manaus (Brasil). Os alcalóides foram obtidos do extrato bruto do caule por partição ácido-base, e a partir do resíduo dessa extração foi realizada a partição com solventes de diferentes polaridades, originando as frações livres de alcalóides. A partir da análise de CG-EM dos alcalóides totais foi possível caracterizar sete alcalóides aporfínicos (actinodafinina, anonaina, glaucina, isoboldina, isodomesticina, nornuciferina e roemerina) e possivelmente duas protoberberinas (esculerina e caseadina). Os alcalóides totais foram fracionados em coluna cromatográfica e posteriormente purificados em placa cromatográfica preparativa permitindo o isolamento de dois alcalóides aporfínicos: actinodafinina e isoboldina. As estruturas desses produtos naturais foram definidos com base em espectros de dados, incluindo 1H RMN, 13C RMN, 13C DEPT e CG-EM. Pela primeira vez a ocorrência da actinodafinina esta sendo reportada em uma espécies de Annona. O extrato bruto, as frações livres de alcalóides, os alcalóides totais e suas frações foram submetidos a avaliação da atividade antibacteriana por microdiluição e atividade citotóxica in vitro frente a células de tumores humanos. Para todos os extratos testados, somente os alcalóides totais e suas frações apresentaram atividade frente a bactérias Gram +. No ensaio de citotoxicidade com linhagens de células de tumores, o extrato bruto foi capaz de inibir o crescimento de todas as linhagens celulares testadas, apresentando efeito letal para a linhagem de Câncer de Cólon (KM-12), enquanto as frações livres de alcalóides demonstraram baixa atividade. Por outro lado, as frações livres de alcalóides apresentaram atividade mais pronunciada para a linhagem de Câncer de Pulmão (NCIH-460) do que os alcalóides. Assim, a atividade citotóxica encontrada no extrato bruto é decorrente do sinergismo ou complementação entre os componentes das frações alcaloídicas e não alcaloídicas, isto é, nenhuma das frações isoladamente é responsável pela atividade observada no extrato bruto. / Annona hypoglauca Mart. was collected in the flooded areas of the Amazonian Forest near Manaus (Brazil). The alkaloids were obtained from the stems crude extract by acid-base partitioning and the remaining alkaloid-free extract was partitioned with organic solvents of different polarity. The GC/MS analysis of the total alkaloids allowed the identification of seven aporphine alkaloids (actinophanine, anonaine, glaucine, isoboldine, isodomesticine, nornuciferine and roemerine) and possibly two proberberine alkaloids (scoulerine and caseadine). The total alkaloids were fractionated by column chromatography and further purified by preparative thin-layer chromatography allowing the isolation of two aporphine alkaloids: actinodaphnine and isoboldine. The structures of these natural products were defined based on their spectral data, including 1H NMR, 13C NMR, 13C DEPT and CG/MS. This is the first report for the occurrence of actinodaphnine in Annona species. The crude extract, alkaloid-free organic extracts, total alkaloids and its fractions were tested for their antibacterial activity by the microdilution broth assay and cytotoxic activity against in vitro tissue culture cells of human. From all the extracts assayed, only the total alkaloids and their fractions showed a relevant antibacterial activity against Gram positive organisms. In the cytotoxicity assay with human tumor cell lines, the crude extract was able to inhibit the growth of all cell lines tested, with a lethal effect for the colon cancer (KM-12) cell line. The evaluation of this activity with the total alkaloid and alkaloid-free fractions indicated selectivity for the different cellular lines. The alkaloid fraction presented high growth inhibition for the colon cancer cell line (KM-12), while the alkaloid-free fractions displayed lower activity. On the other hand, the alkaloid free fractions showed a higher activity for the lung cancer cell line (NCIH-460) than the total alkaloids. Thus, the cytotoxic activity found in the crude extract is the result of the synergism or complementary activity among the components of the alkaloid and alkaloid-free fractions, e.g, none of the fractions separately is responsible for the activity observed in the crude extract.

O presente trabalho apresenta a determinacao da estrutura tridimensional da L-aminoacido oxidase do veneno de Bothrops atrox (BatroxLAAO) e sua avaliacao como potencial agente biotecnologico. Quanto a caracterizacao estrutural, a enzima BatroxLAAO (6 mg/mL) foi submetida a varios screenings e, por meio destas variacoes, obtivemos um resultado ideal para o crescimento dos monocristais sob a condicao de 0,05 M de sulfato heptahidratado de zinco, 15% (v/v) de Polietilenoglicol monometil eter 550, controle de pH 5 com 0,1M de cacodilato de sodio. A utilizacao de parafina e silicone resultou na melhora dos cristais, revelando cristais unicos e de coloracao amarela, o que permitiu o melhor crescimento e difracao desses cristais, a 2,3 .. Estes dados permitiram a determinacao de estrutura terciaria de BatroxLAAO e, portanto, melhor entendimento dos mecanismos de atuacao da mesma. A proteina foi obtida, atraves de passos cromatograficos, com rendimento medio de 1,54% do veneno bruto. Esta apresentou acentuada inibicao da proliferacao celular de celulas tumorais HL-60, JURKAT, PC12 e B16F10, principalmente nas maiores concentracoes (50 e 100 Êg/mL). Ainda, o tratamento de celulas PBMC com BatroxLAAO, demonstrou baixa citotoxicidade em relacao ao tratamento das celulas tumorais. A viabilidade celular da Leishmania sp. foi analisada apos o tratamento com BatroxLAAO. A adicao de BatroxLAAO diretamente as formas promastigotas de diferentes especies de Leishmania resultou em morte dos parasitas de forma dose-dependente. As especies L. major e L. donovani foram as mais susceptiveis ao efeito toxico de BatroxLAAO. O efeito toxico apresentado pela BatroxLAAO foi quase completamente abolido pela adicao de catalase, sugerindo que a liberacao de H2O2 esta diretamente envolvida com o efeito da enzima. A atividade bactericida foi avaliada pela inibicao do crescimento das cepas de E. coli e S. aureus apos tratamento com a BatroxLAAO. A proteina (37,5 Êg/mL) apresentou alta atividade fungicida contra Candida albicans, com 100% da inibicao do crescimento das cepas. Foi avaliada a atividade tripanomicida, onde BatroxLAAO mostrou-se potencialmente ativa sobre T. cruzi. Foram realizados experimentos para a producao de anticorpo monoclonal (anti-BatroxLAAO). O anticorpo produzido apresentou reatividade ate diluicao 1:60000. No entanto, apos a realizacao do teste de ELISA com o anticorpo produzido e outras L-aminoacidos oxidases de diferentes venenos de serpentes, averiguamos que o anti-BatroxLAAO nao tem especificidade unica, ocorrendo reatividade para todos os venenos e proteinas testadas. Foram realizados ensaios in vivo para a deteccao da expressao dos genes FAS, BAX e BCL2. Os dados obtidos sugerem que BatroxLAAO apresenta potencial biotecnologico bastante evidente nas acoes leishmanicida e fungicida, bem como na atividade antitumoral, in vitro, mostrando-se um composto com potencial agente terapeutico. / This work presents the determination of three-dimensional structure of L-amino acid oxidase from Bothrops atrox (BatroxLAAO) and its evaluation as a potential biotechnology agent. Regarding the structural characterization, BatroxLAAO (6 mg / mL) underwent multiple screenings, and through these variations, we got an ideal result for the single crystals growth under condition of 0.05 M zinc sulfate heptahydrate, 15 % (v / v) polyethylene glycol monomethyl ether 550, pH control: 5.0 with 0.1 M sodium cacodylate. The use of paraffin and silicone resulted in the improvement of the crystals, revealing single and yellow crystals, which allowed better growth and diffraction of these crystals, to 2.3 . These data allowed the determination of tertiary structure BatroxLAAO and therefore better understanding of action mechanisms of this protein. The protein was obtained using three chromatographic steps, with an average yield of 1.54% from crude venom. This showed marked inhibition of cell proliferation on tumor cells as HL-60, Jurkat, PC12 and B16F10, especially at higher concentrations (50 and 100 g / mL). Also, treatment of PBMC cells with BatroxLAAO showed low cytotoxicity in comparison to the treatment on tumor cells. Cell viability of Leishmania sp. was analyzed after treatment with BatroxLAAO. The addition of BatroxLAAO directly to promastigotes forms of different species of Leishmania resulted in a dose-dependent death. The species L. major and L. donovani were more susceptible to the toxic effect of BatroxLAAO. The toxic effect presented by BatroxLAAO was almost completely abolished by the addition of catalase, suggesting that the release of H2O2 is directly involved with the effect of this enzyme. The bactericidal activity was evaluated by inhibiting the strains growth of E. coli and S.aureus after treatment with BatroxLAAO. The protein (37.5 g / mL) showed high fungicidal activity against Candida albicans with 100% growth inhibition of strains. We evaluated the trypanocidal activity, where BatroxLAAO proved to be potentially active against the T. cruzi parasite. Experiments were carried out for production of monoclonal antibody (anti-BatroxLAAO). The antibody showed reactivity produced by dilution until 1:60000. However, after performing the ELISA assay with the antibody produced and other L-amino acidoxidases from different snake venoms, we found that anti-BatroxLAAO did not present unique specificity, BatroxLAAO reacted with all poisons and proteins tested. Experiments, in vivo, were performed to detect the gene expression of FAS, BAX and BCL2. These data suggest that BatroxLAAO presented quite evident biotechnologic potential as leishmanicidal, fungicidal and antitumoral, in vitro, agent. Further studies are needed to confirm the potential therapeutic use of this protein.

Os venenos de serpentes são ricos em proteínas, enzimas e peptídeos biologicamente ativos. Diversas enzimas tais como fosfolipases A2 (PLA2s), metaloproteases (MP), L-aminoácido oxidases (LAAOs) são responsáveis pelo quadro clínico do envenenamento ofídico. Atualmente, o isolamento e a caracterização funcional e estrutural destas enzimas têm auxiliado na compreensão do mecanismo de ação destas toxinas e nas formas alternativas de tratamento. Além disso, estas enzimas se tornaram valiosas ferramentas de aplicação biotecnológica, na busca de novos fármacos de interesse na clínica médica. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar bioquímica e funcionalmente a L-aminoácido oxidase do veneno de Bothrops atrox. O isolamento da LAAO de B. atrox (LAAOBatrox) envolveu três etapas cromatográficas: a exclusão molecular em Sephadex G-75, troca iônica em ES-502N utilizando CLAE e, por último, a cromatografia de afinidade com uso da Lentil-Lectina, conferindo um alto grau de pureza à proteína confirmado por SDS-PAGE. Após a caracterização bioquímica, a LAAOBatrox demonstrou ser uma glicoproteína com 12% de açúcar, massa molecular relativa de 67.000 e pI de 4,4 confirmando seu caráter ácido pela composição em aminoácidos, predominando Asx (Ácido aspártico ou asparagina) e Glx (Ácido glutâmico ou glutamina). LAAOBatrox apresentou especificidade de substrato para L-Met e L-Leu. Com o seqüenciamento dos peptídeos trípticos internos e em comparação com as LAAOs de outros venenos, a LAAOBatrox apresentou homologia de 100% com LAAOs isoladas de B. moojeni e B. jararacussu e apresentou sequenciamento N-terminal de ADDN-NPLEE-NIRRDD que é homólogo ao das LAAOs já descritas. A LAAOBatrox apresentou atividade edematogênica moderada quando comparada ao veneno bruto, atividade coagulante baixa sobre o plasma humano citratado, atividade de agregação plaquetária sendo que 25µg/mL foi capaz de agregar aproximadamente 100% de plaquetas, onde o efeito obtido pela proteína pode ser devido à liberação de H2O2, sendo que a catalase foi adicionada ao meio tratado com LAAOBatrox e o efeito de agregação plaquetária obtido foi próximo à 0%. LAAOBatrox apresentou efeito citotóxico sobre diferentes linhagens tumorais: B16F10 onde as células apresentaram 70% de morte por apoptose e PC12 que apresentaram uma viabilidade celular de 20% após o tratamento com a enzima. LAAOBatrox não apresentou efeito citotóxico significativo sobre células normais. Portanto, a LAAOBatrox consiste de uma enzima multifuncional que poderá servir como ferramenta para investigação dos processos celulares que estão envolvidos no envenenamento. / Snake venoms are rich in proteins, enzymes and biological active peptides. Many enzymes, like phospholipases A2, metalloproteinases, L-amino acid oxidases are responsible by clinical aspects of ophidian poisoning. Nowadays, isolation and the functional and structural characterizations of these enzymes have been useful to elucidate their mechanisms of action. Besides, these enzymes have great value for biotechnology on searching of new molecules for medicine development. The aim of this work was isolate Lamino acid oxidase from B. atrox venom (LAAOBatrox) and characterize biochemical and functionally LAAOBatrox. The isolation consisted of 3 chromatographic steps: molecular exclusion using a G-75 Sephadex column, ion exchange using ES-502N column in HPLC and affinity chromatography with Lentil-Lectin column. Afterward, LAAOBatrox was analyzed by SDS-PAGE to confirm an expected high purity level. Biochemical characterization showed LAAOBatrox is a glycoprotein of 12% sugar-containing with relative molecular weight of 67000, pI estimated in 4,4 pointing to acid character due to its amino acids composition, rich for Asx and Glx residues. LAAOBatrox displays high specificity to hydrophobic L-amino acids (best substrates: L-Met and L-Leu). The Nterminal amino acid sequence (ADDN-NPLEE-NIRRDD) and the internal peptide sequences showed close structural homology to other snake venom L-amino acid oxidades, presenting 100% homology to LAAO from B. moojeni and B. jararacussu. This enzyme induces moderate edema compared to crude venom, low coagulating activity in human plasma and 100% of in vitro platelet aggregation induction with 25 g/mL, but this can be due to H2O2 production by LAAOs once added catalase has inhibited aggregation induced by LAAOBatrox and the effect was close to 0%. LAAOBatrox presents citotoxicity effect for tumor cell lines: 70% of death by apoptosis in B16F10 and 20% cellular viability for PC12, after LAAOBatrox treatment. LAAOBatrox did not display citotoxicity effect in normal cells (peripheral blood mononuclear cells). Thus, LAAOBatrox is a multifunctional enzyme of huge potential for investigation of cellular processes involved on poisoning and also for developing new medicines.

Submitted by Ana Hilda Fonseca (anahilda@ufba.br) on 2016-09-08T14:57:09Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Síntese_4_aril_3,4_diidrocumarinas_corrigida_final.pdf: 2298956 bytes, checksum: c56efe2a43dfa29764b57a22d7ac1966 (MD5) / Approved for entry into archive by Vanessa Reis (vanessa.jamile@ufba.br) on 2016-09-08T15:04:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_Síntese_4_aril_3,4_diidrocumarinas_corrigida_final.pdf: 2298956 bytes, checksum: c56efe2a43dfa29764b57a22d7ac1966 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T15:04:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_Síntese_4_aril_3,4_diidrocumarinas_corrigida_final.pdf: 2298956 bytes, checksum: c56efe2a43dfa29764b57a22d7ac1966 (MD5) / CNPq / As 4-aril-3,4-di-hidrocumarinas são produtos naturais estruturalmente e biogeneticamente relacionados aos flavonóides que exibem diferentes atividades biológicas. Neste trabalho foram sintetizados inicialmente oito derivados de 4-aril- 3,4-di-hidrocumarina, com rendimentos baixo a moderados (4-69%). Estes derivados foram obtidos através de reações de condensação entre derivados de fenóis e de ácidos cinâmicos, utilizando o ácido polifosfórico como catalisador. A partir da 4-aril- 3,4-diidrocumarinas (10a) foram obtidos derivados acetilados, metilado e base de Mannich, empregando métodos clássicos. Dentre as 4-aril-3,4-di-hidrocumarinas obtidas seis são inéditas na literatura (10f-g, 55b-c e 60). Utilizando-se a mesma metodologia empregada no preparo das 4-aril-3,4-di-hidrocumarinas foi também sintetizada as cumarinas herniarina (44a), 5-hidroxi-cumarina (44b) e a umbeliferona (44c) com rendimentos de moderados a bons (42-82%). Todas as substâncias preparadas foram caracterizadas por métodos espectroscópicos. As 4-aril-3,4-di- hidrocumarina obtidas tiveram sua citotoxicidade e capacidade antioxidante avaliadas. Apenas 10a e 10c apresentaram atividade oxidante considerável, com destaque para este último que demonstrou atividade comparável aos padrões, ácido gálico e quercetina. Nos testes de citotoxicidade contra Artemia salina, os compostos apresentaram atividade moderada, destacando-se como ativo o novo composto 3f (CL50 = 96,86µg/mL). / The 4-aryl-3,4-di-hydrocoumarins are natural products biogenetical and structurally related to flavonoids that exhibit different biological activities. In this work were synthesized initially eight derivatives of 4-aryl-3,4-di-hydrocoumarins with low to moderate yields (4-69%). These derivatives were obtained by condensation reactions between phenols and cinnamic acid derivatives, using polyphosphoric acid as catalyst. From the 4-aryl-3,4-di-hydrocoumarins (10a) were obtained acetylated derivatives, methylated and Mannich base, using classical methods. 4-aryl-3,4-di- hydrocoumarins obtained, six of them were new compounds (10f-g, 55b-c and 60). Using the same methodology used in the preparation of 4-aryl-3,4-di-hydrocoumarins was also synthesized coumarins herniarin (44a), 5-hydroxy-coumarin (44b) and umbelliferone (44c) with modest to good yields (42 -82%). All substances prepared were characterized by spectroscopic methods. The 4-aryl-3,4-di-hydrocoumarins had obtained their cytotoxicity and antioxidant capacity evaluated. Only 10a and 10c showed considerable oxidant activity, especially the last one who showed activity comparable to standards, gallic acid and quercetin. In tests of cytotoxicity against Artemia salina, the compounds showed moderate activity, particularly the new activity compound 10f (LC50 = 96.86 mg / mL).

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-17T20:18:57Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Danielle Cardoso de Alencar.pdf: 4414519 bytes, checksum: 63828fc402ffad2e9f1fd8bc7b49b74c (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-20T13:46:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Danielle Cardoso de Alencar.pdf: 4414519 bytes, checksum: 63828fc402ffad2e9f1fd8bc7b49b74c (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-20T13:51:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Danielle Cardoso de Alencar.pdf: 4414519 bytes, checksum: 63828fc402ffad2e9f1fd8bc7b49b74c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-20T13:51:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Danielle Cardoso de Alencar.pdf: 4414519 bytes, checksum: 63828fc402ffad2e9f1fd8bc7b49b74c (MD5) Previous issue date: 2010-12-09 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This paper presents the results of studies of the profile alkaloids in thin layer chromatography (TLC), the species Xylopia aromatica, X. excellens, X. benthamii, Annona sericea, A. ambotay, Anaxagorea brevipes, rollinia exsucca, Duguetia ulei and Ephedranthus amazonicus (Annonaceae), found in the vicinity of the Campus of the Amazon and the phytochemical and biological species Ephedranthus amazonicus R. E. Fries, Annonaceae plant belonging to the family that is distributed throughout the Amazon region is known as “envira-dura”. For the chromatographic profile of the alkaloid fractions of the species studied can be observed the presence of oxoaporphine alkaloids liriodenine and O-metylmoschatoline, regarded as one of the markers of the family Annonaceae. Preliminar analysis by FIA-ESI-IT-MS of alkaloid fractions from leaves and twigs of E. anazonicus indicated the presence of alkaloids O-metilmoschatoline and annamontine leaves, liriodenine and lisicamine in twigs, isomoschatoline and 9-metoxy-isomoschatoline in both parts of the plant, in agree with the TLC data. Other MS/MS and LC/MS analyses are necessaries for the validation of these results. Phytochemical study of methanolic extract of leaves and twigs of Ephedranthus amazonicus led to the isolation of oxoaporphine alkaloids O-metylmoschatoline, liriodenine and isomoschatoline. The identification of isolated compounds was performed by means of spectroscopic analysis (1H and 13C 1D and 2D) and comparison with literature data. The extracts and fractions of E. amazonicus tests were done to evaluate its biological activity. In cytotoxicity test on Artemia salina all extracts and fractions showed themselves active. The methanol extacts, the alkaloid fractions and isolated compounds showed antioxidant active by testing ORACFL. / Neste trabalho são apresentados os resultados dos estudos do perfil alcalóidico, em cromatografia de camada delgada (CCD), das espécies Xylopia aromatica, X. excellens, X. benthamii, Annona sericea, A. ambotay, Anaxagorea brevipes, Rollinia exsucca, Duguetia ulei e Ephedrantus amazonicus (Annonaceae), encontradas nos arredores do Campus da Universidade Federal do Amazonas e o estudo fitoquímico e biológico da espécie Ephedrantus amazonicus R. E. Fries, planta pertencente à família Annonaceae que se encontra distribuída em toda Região Amazônica sendo conhecida popularmente como “envira-dura”. Pelo perfil cromatográfico das frações alcaloídicas das espécies analisadas pode-se observar a presença dos alcalóides oxoaporfínicos liriodenina e O-metilmoschatolina, considerados como uns dos marcadores da família Annonaceae. Análises preliminares por FIA-ESI-IT-MS das frações alcaloídicas das folhas e galhos finos de E. amazonicus indicou a presença dos alcalóides O-metilmoschatolina nas folhas, liriodenina, lisicamina nos galhos finos, isomoschatolina e 9-metoxi-isomoschatolina em ambas partes da planta, em acordo com os dados das análises em CCD. Outras análises de EM/EM e CL/EM são necessários para validação destes resultados. O estudo fitoquímico do extrato metanólico das folhas e galhos finos de Ephedranthus amazonicus conduziu ao isolamento dos alcalóides oxoaporfínicos O-metilmoschatolina, liriodenina e isomoschatolina. A identificação das substâncias isoladas foi realizada por meio de análises espectroscópicas (RMN 1H e de 13C 1D e 2D) e por comparação com dados da literatura. Os extratos e frações de E. amazonicus foram submetidos a ensaios para avaliar sua atividade biológica. Em teste de citotoxicidade frente à Artemia salina todos os extratos e frações apresentaram-se ativos. Os extratos metanólicos, as frações alcaloídicas e os compostos isolados apresentaram capacidade antioxidante pelo ensaio ORACFL.

Submitted by Lúcia Brandão (lucia.elaine@live.com) on 2015-07-15T17:46:24Z No. of bitstreams: 1 Tese - André Luis Rüdiger.pdf: 13443546 bytes, checksum: f45078022552e0a3713a149b282b0569 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-20T18:00:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - André Luis Rüdiger.pdf: 13443546 bytes, checksum: f45078022552e0a3713a149b282b0569 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-20T18:03:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - André Luis Rüdiger.pdf: 13443546 bytes, checksum: f45078022552e0a3713a149b282b0569 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-20T18:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - André Luis Rüdiger.pdf: 13443546 bytes, checksum: f45078022552e0a3713a149b282b0569 (MD5) Previous issue date: 2012-11-01 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / PHYTOCHEMICAL AND CITOTOXIC STUDY OF BURSERACEAE OLEORESINS. The Burseraceae family includes approximately 700 specimens distributed in 19 genres, and many of these specimens do not present phytochemical studies. Interested on describing the chemical composition, evaluate the cytotoxic activity and isolate substances of chemical and cytotoxic interest, this work has been divided in three parts: Determination of the extraction in hexane chemical profiles; cytotoxicity evaluation of oleoresins against HCT-8 (collon), MDA/MB-435 (breast) and SF-295 (glioblastom); and isolation of substances present in the oleoresins. The isolated substances were identified by mass spectrometry techniques (GC-MS and ESI-IT-MS) and nuclear magnetic resonance (NMR). In the volatile compounds profile it was possible to observe that among the monoterpenes, the p-cymene was detected more times, in 11 out 23 specimens evaluated. The highest concentration of this compound was observed in Protium apiculatum (2.4%), however the compound mostly found in this specimen is αpinene (5.1%). Among the sesquiterpenes, the compound that presented highest concentration was the junenol, in P. cf. rubrum (23.9%) and P. cf. ferrugineum (11.3%) being isolated and elucidated. The samples with the most complex sesquiterpenic profile were P. tenuifolum and Tetragastris panamensis, with common detection of sesquiterpenes of bisabolane, cadinane, cubebane, eudesmane, guaiane and muurulane series. The total ion chromatograms evaluations showed the presence of α- and β-amyrin in all the samples, confirming the presence of these triterpenes as family markers. In P. cf. ferrugineum, it has been observed the absence of α- and β-amyrone, and it was the differential of this specimen among other samples. About the triterpenes, glutinol (first description in the genres studied) and the multiflorenol (first description in the family) were detected. The chemometric analysis resulted in five distinct cluster (C-1 to C-5), where C-1 presented high concentration of α- and β-amyrone and absence of brein and maniladiol; C-2, having potentially producers of new triterpene and volatile compound specimens; C-3 with medium concentration among the variables analyzed; C-4 with high concentration of brein and maniladiol; and C-5, having α- and β-amyrin high concentration specimens. Te cititoxicity assays showed that two extracts in hexane (P. cf. rubrum e Trattinnickia peruviana - HrTPE) showed inhibition against HCT-8 (93.08 % for both specimens) and SF-295 (93.46 e 86.34%, respectively) tumor cells lines. In the extracts in acetate and acetyl, inhibition for P. giganteum var giganteum and Trattinnickia glaziovii against HCT-8 (88.7 e 92.9%, respectively) and MDAM B-435 (97.8 e 96.2%, respectively) lines were observed. HrTPE was submitted to fractioning, being identified the β-amyradienol. From the extract in ethyl acetate of P. paniculatum var. modestum, breine and maniladiol triterpenes in binary mixture, 3-hydroxy-tirucalla-8,24-diene-21-oic acid, pure and in binary mixture with 3-hydroxy-tirucalla-7,24-dieno-21-oic acid were isolated. In the P. bahianum ethyl acetate extract, the ursolic and oleanolic acids were isolated. From the Tetragastris panamensis ethyl acetate extract, an unpublished triterpene (3-oxo-triptocallic B acid) and two triterpenes decribed for the first time in the Burseraceae family (triptocallic B and 3-oxo-katononic acids) were isolated. A 2,3-seco-isobriononico acid biosynthesis from multiflorenol proposal was presented. The family chemosystematics has been discussed. / A família Burseraceae compreende aproximadamente 700 espécies distribuídas em 19 gêneros, sendo que várias destas espécies não apresentam estudos fitoquímicos. Com interesse em descrever a composição química, avaliar a atividade citotóxica e isolar substâncias de interesse químico e citotóxico, o trabalho foi dividido em três partes: determinação do perfil químico dos extratos em hexano; avaliação da citotoxicidade de extratos das oleorresinas contra as linhagens HCT-8 (cólon), MDA/MB-435 (melanoma) e SF-295 (glioblastoma); e isolamento de substâncias presentes nas oleorresinas. As substâncias isoladas foram identificadas pelas técnicas de espectrometria de massas (CG-EM e EMCIESI) e ressonância magnética nuclear (RMN). No perfil dos compostos voláteis observou-se que dentre os monoterpenos, o p-cimeno foi detectado mais vezes, em 11 das 23 espécies avaliadas. A maior concentração deste composto foi observada em Protium apiculatum (2,4%), contudo o componente majoritário nesta espécie é o α-pineno (5,1%). Dentre os sesquiterpenos o componente que apresentou maior concentração foi o junenol, em P. cf. rubrum (23,9%) e P. cf. ferrugineum (11,3%) sendo isolado e elucidado. As amostras com perfil sesquiterpênico mais complexo foram P. tenuifolum e Tetragastris panamensis, com detecção em comum de sesquiterpenos das séries bisabolano, cadinano, cubebano, eudesmano, guaiano e muurulano. As avaliações dos cromatogramas de íons totais demonstraram a presença dos α- e β-amirina em todas as amostras, confirmando a presença destes triterpenos como marcadores desta família. Em P. cf. ferrugineum , observou-se a ausência de α- e β-amirona, o que diferenciou esta espécie das demais amostras. Dentre os triterpenos, foram detectados o glutinol (primeira descrição nos gêneros estudados) e o multiflorenol (primeira descrição na família). A análise quimiométrica resultou em cinco agrupamentos distintos (C-1 a C-5), onde o C-1 apresentou alta concentração de α- e β-amirona e ausência de breina e maniladiol; o C-2, com espécies potencialmente produtoras de novos triterpenos e de compostos voláteis; o C-3 com concentrações médias entre as variáveis analisadas; o C-4 com concentração elevada de breina e maniladiol; e o C-5, das espécies com alta concentração de α- e β-amirina. Os ensaios de citotoxicidade demonstraram que dois extratos em hexano (P. cf. rubrum e Trattinnickia peruviana - HrTPE) apresentaram inibição contra as linhagens de células tumorais HCT-8 (93,08 % para ambas as espécies) e SF-295 (93,46 e 86,34%, respectivamente). Nos extratos em acetato de etila foram observadas inibições por P. giganteum var giganteum e Trattinnickia glaziovii contra as linhagens HCT-8 (88,7 e 92,9%, respectivamente) e MDAM B-435 (97,8 e 96,2%, respectivamente). HrTPE foi submetido a fracionamento, sendo isolado o β-amiradienol. Do extrato em acetato de etila de P. paniculatum var. modestum foram isolados os triterpenos breina e maniladiol em mistura binária, o ácido 3-hidroxitirucalla-8,24-dieno-21-óico puro e em mistura binária com 3-hidroxitirucalla-7,24-dieno-21-óico. No extrato em acetato de etila de P. bahianum foram isolados os ácidos ursólico e oleanólico. Do extrato em acetato de etila de Tetragastris panamensis foram isolados um triterpeno inédito (ácido 3-oxo- triptocálico B) e dois triterpenos descritos pela primeira vez na família Burseraceae (ácidos triptocálico B e 3-oxo-katononico). Uma proposta de biossíntese do ácido 2,3-seco-isobrionônico a partir do multiflorenol foi apresentada. A quimiossistemática da família foi discutida.

O presente trabalho apresenta a determinacao da estrutura tridimensional da L-aminoacido oxidase do veneno de Bothrops atrox (BatroxLAAO) e sua avaliacao como potencial agente biotecnologico. Quanto a caracterizacao estrutural, a enzima BatroxLAAO (6 mg/mL) foi submetida a varios screenings e, por meio destas variacoes, obtivemos um resultado ideal para o crescimento dos monocristais sob a condicao de 0,05 M de sulfato heptahidratado de zinco, 15% (v/v) de Polietilenoglicol monometil eter 550, controle de pH 5 com 0,1M de cacodilato de sodio. A utilizacao de parafina e silicone resultou na melhora dos cristais, revelando cristais unicos e de coloracao amarela, o que permitiu o melhor crescimento e difracao desses cristais, a 2,3 .. Estes dados permitiram a determinacao de estrutura terciaria de BatroxLAAO e, portanto, melhor entendimento dos mecanismos de atuacao da mesma. A proteina foi obtida, atraves de passos cromatograficos, com rendimento medio de 1,54% do veneno bruto. Esta apresentou acentuada inibicao da proliferacao celular de celulas tumorais HL-60, JURKAT, PC12 e B16F10, principalmente nas maiores concentracoes (50 e 100 Êg/mL). Ainda, o tratamento de celulas PBMC com BatroxLAAO, demonstrou baixa citotoxicidade em relacao ao tratamento das celulas tumorais. A viabilidade celular da Leishmania sp. foi analisada apos o tratamento com BatroxLAAO. A adicao de BatroxLAAO diretamente as formas promastigotas de diferentes especies de Leishmania resultou em morte dos parasitas de forma dose-dependente. As especies L. major e L. donovani foram as mais susceptiveis ao efeito toxico de BatroxLAAO. O efeito toxico apresentado pela BatroxLAAO foi quase completamente abolido pela adicao de catalase, sugerindo que a liberacao de H2O2 esta diretamente envolvida com o efeito da enzima. A atividade bactericida foi avaliada pela inibicao do crescimento das cepas de E. coli e S. aureus apos tratamento com a BatroxLAAO. A proteina (37,5 Êg/mL) apresentou alta atividade fungicida contra Candida albicans, com 100% da inibicao do crescimento das cepas. Foi avaliada a atividade tripanomicida, onde BatroxLAAO mostrou-se potencialmente ativa sobre T. cruzi. Foram realizados experimentos para a producao de anticorpo monoclonal (anti-BatroxLAAO). O anticorpo produzido apresentou reatividade ate diluicao 1:60000. No entanto, apos a realizacao do teste de ELISA com o anticorpo produzido e outras L-aminoacidos oxidases de diferentes venenos de serpentes, averiguamos que o anti-BatroxLAAO nao tem especificidade unica, ocorrendo reatividade para todos os venenos e proteinas testadas. Foram realizados ensaios in vivo para a deteccao da expressao dos genes FAS, BAX e BCL2. Os dados obtidos sugerem que BatroxLAAO apresenta potencial biotecnologico bastante evidente nas acoes leishmanicida e fungicida, bem como na atividade antitumoral, in vitro, mostrando-se um composto com potencial agente terapeutico. / This work presents the determination of three-dimensional structure of L-amino acid oxidase from Bothrops atrox (BatroxLAAO) and its evaluation as a potential biotechnology agent. Regarding the structural characterization, BatroxLAAO (6 mg / mL) underwent multiple screenings, and through these variations, we got an ideal result for the single crystals growth under condition of 0.05 M zinc sulfate heptahydrate, 15 % (v / v) polyethylene glycol monomethyl ether 550, pH control: 5.0 with 0.1 M sodium cacodylate. The use of paraffin and silicone resulted in the improvement of the crystals, revealing single and yellow crystals, which allowed better growth and diffraction of these crystals, to 2.3 . These data allowed the determination of tertiary structure BatroxLAAO and therefore better understanding of action mechanisms of this protein. The protein was obtained using three chromatographic steps, with an average yield of 1.54% from crude venom. This showed marked inhibition of cell proliferation on tumor cells as HL-60, Jurkat, PC12 and B16F10, especially at higher concentrations (50 and 100 g / mL). Also, treatment of PBMC cells with BatroxLAAO showed low cytotoxicity in comparison to the treatment on tumor cells. Cell viability of Leishmania sp. was analyzed after treatment with BatroxLAAO. The addition of BatroxLAAO directly to promastigotes forms of different species of Leishmania resulted in a dose-dependent death. The species L. major and L. donovani were more susceptible to the toxic effect of BatroxLAAO. The toxic effect presented by BatroxLAAO was almost completely abolished by the addition of catalase, suggesting that the release of H2O2 is directly involved with the effect of this enzyme. The bactericidal activity was evaluated by inhibiting the strains growth of E. coli and S.aureus after treatment with BatroxLAAO. The protein (37.5 g / mL) showed high fungicidal activity against Candida albicans with 100% growth inhibition of strains. We evaluated the trypanocidal activity, where BatroxLAAO proved to be potentially active against the T. cruzi parasite. Experiments were carried out for production of monoclonal antibody (anti-BatroxLAAO). The antibody showed reactivity produced by dilution until 1:60000. However, after performing the ELISA assay with the antibody produced and other L-amino acidoxidases from different snake venoms, we found that anti-BatroxLAAO did not present unique specificity, BatroxLAAO reacted with all poisons and proteins tested. Experiments, in vivo, were performed to detect the gene expression of FAS, BAX and BCL2. These data suggest that BatroxLAAO presented quite evident biotechnologic potential as leishmanicidal, fungicidal and antitumoral, in vitro, agent. Further studies are needed to confirm the potential therapeutic use of this protein.

Os venenos de serpentes são ricos em proteínas, enzimas e peptídeos biologicamente ativos. Diversas enzimas tais como fosfolipases A2 (PLA2s), metaloproteases (MP), L-aminoácido oxidases (LAAOs) são responsáveis pelo quadro clínico do envenenamento ofídico. Atualmente, o isolamento e a caracterização funcional e estrutural destas enzimas têm auxiliado na compreensão do mecanismo de ação destas toxinas e nas formas alternativas de tratamento. Além disso, estas enzimas se tornaram valiosas ferramentas de aplicação biotecnológica, na busca de novos fármacos de interesse na clínica médica. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar bioquímica e funcionalmente a L-aminoácido oxidase do veneno de Bothrops atrox. O isolamento da LAAO de B. atrox (LAAOBatrox) envolveu três etapas cromatográficas: a exclusão molecular em Sephadex G-75, troca iônica em ES-502N utilizando CLAE e, por último, a cromatografia de afinidade com uso da Lentil-Lectina, conferindo um alto grau de pureza à proteína confirmado por SDS-PAGE. Após a caracterização bioquímica, a LAAOBatrox demonstrou ser uma glicoproteína com 12% de açúcar, massa molecular relativa de 67.000 e pI de 4,4 confirmando seu caráter ácido pela composição em aminoácidos, predominando Asx (Ácido aspártico ou asparagina) e Glx (Ácido glutâmico ou glutamina). LAAOBatrox apresentou especificidade de substrato para L-Met e L-Leu. Com o seqüenciamento dos peptídeos trípticos internos e em comparação com as LAAOs de outros venenos, a LAAOBatrox apresentou homologia de 100% com LAAOs isoladas de B. moojeni e B. jararacussu e apresentou sequenciamento N-terminal de ADDN-NPLEE-NIRRDD que é homólogo ao das LAAOs já descritas. A LAAOBatrox apresentou atividade edematogênica moderada quando comparada ao veneno bruto, atividade coagulante baixa sobre o plasma humano citratado, atividade de agregação plaquetária sendo que 25µg/mL foi capaz de agregar aproximadamente 100% de plaquetas, onde o efeito obtido pela proteína pode ser devido à liberação de H2O2, sendo que a catalase foi adicionada ao meio tratado com LAAOBatrox e o efeito de agregação plaquetária obtido foi próximo à 0%. LAAOBatrox apresentou efeito citotóxico sobre diferentes linhagens tumorais: B16F10 onde as células apresentaram 70% de morte por apoptose e PC12 que apresentaram uma viabilidade celular de 20% após o tratamento com a enzima. LAAOBatrox não apresentou efeito citotóxico significativo sobre células normais. Portanto, a LAAOBatrox consiste de uma enzima multifuncional que poderá servir como ferramenta para investigação dos processos celulares que estão envolvidos no envenenamento. / Snake venoms are rich in proteins, enzymes and biological active peptides. Many enzymes, like phospholipases A2, metalloproteinases, L-amino acid oxidases are responsible by clinical aspects of ophidian poisoning. Nowadays, isolation and the functional and structural characterizations of these enzymes have been useful to elucidate their mechanisms of action. Besides, these enzymes have great value for biotechnology on searching of new molecules for medicine development. The aim of this work was isolate Lamino acid oxidase from B. atrox venom (LAAOBatrox) and characterize biochemical and functionally LAAOBatrox. The isolation consisted of 3 chromatographic steps: molecular exclusion using a G-75 Sephadex column, ion exchange using ES-502N column in HPLC and affinity chromatography with Lentil-Lectin column. Afterward, LAAOBatrox was analyzed by SDS-PAGE to confirm an expected high purity level. Biochemical characterization showed LAAOBatrox is a glycoprotein of 12% sugar-containing with relative molecular weight of 67000, pI estimated in 4,4 pointing to acid character due to its amino acids composition, rich for Asx and Glx residues. LAAOBatrox displays high specificity to hydrophobic L-amino acids (best substrates: L-Met and L-Leu). The Nterminal amino acid sequence (ADDN-NPLEE-NIRRDD) and the internal peptide sequences showed close structural homology to other snake venom L-amino acid oxidades, presenting 100% homology to LAAO from B. moojeni and B. jararacussu. This enzyme induces moderate edema compared to crude venom, low coagulating activity in human plasma and 100% of in vitro platelet aggregation induction with 25 g/mL, but this can be due to H2O2 production by LAAOs once added catalase has inhibited aggregation induced by LAAOBatrox and the effect was close to 0%. LAAOBatrox presents citotoxicity effect for tumor cell lines: 70% of death by apoptosis in B16F10 and 20% cellular viability for PC12, after LAAOBatrox treatment. LAAOBatrox did not display citotoxicity effect in normal cells (peripheral blood mononuclear cells). Thus, LAAOBatrox is a multifunctional enzyme of huge potential for investigation of cellular processes involved on poisoning and also for developing new medicines.

Orientador: André Luiz Barboza Formiga / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T06:44:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Profirio_DanieldeMoraes_M.pdf: 7198649 bytes, checksum: 018efc71d59b6427976118e0cc5f772a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Neste trabalho realizou-se a síntese de três ligantes contendo a unidade pirrolil-imina e de um complexo de Au(III). Os ligantes foram sintetizados partindo-se do pirrol-2-carboxaldeído e etilenodiamina ou orto-fenilenodiamina, obtendo-se assim o N,N'-bis(pirrol-2-il-metileno) etano-1,2-diamina (pyren), o N,N'-bis(pirrol-2-il-metileno)benzeno-1,2-diamina (bis-pyrophen), o N-(pirrol-2-il-metileno)benzeno-1,2-diamina (monopyrophen) e o complexo [Au(pyren)]PF6 como produtos. Os compostos foram caracterizados por análise elementar, MS, espectroscopia no IV e UV-Visível, RMN de H, C e HMBC H-N, cálculos teóricos por DFT e TD-DFT. Foram realizados também ensaios antibacterianos e citotóxicos com o complexo [Au(pyren)] e com o ligante pyren, sendo que o complexo apresentou maior atividade em ambos os ensaios comparado ao ligante. Com isso um mecanismo de ação via interação com o DNA foi investigado por estudos de fluorescência, ensaios de competição com brometo de etídio e espectroscopia de dicroísmo circular, revelando que o DNA é um possível alvo biológico do complexo / Abstract: In this work the syntheses of three ligands containing the pyrrolyl-imine unit and a Au(III) complex were performed. The ligands were synthesized starting from pyrrole-2-carboxaldehyde and ethylenediamine or ortho-phenylenediamine, to obtain N,N¿-bis (pyrrol-2-yl-methylene)ethane- 1,2-diamine (pyren), N,N¿-bis(pyrrol-2-yl-methylene)benzene-1,2-diamine (bis-pyrophen), N-(pyrrol-2-yl-methylene)benzene-1,2-diamine (mono-pyrophen) and the complex [Au(pyren)]PF6 as products. The compounds were characterized by elemental analysis, MS, IR, UV-Visible, H, C and (H-N) HMBC NMR spectroscopies and theoretical calculations by DFT and TD-DFT. Cytotoxic and antibacterial assays with [Au(pyren)] and the free ligand pyren were performed, and the complex showed a higher activity in both cases in comparison to the ligand. A mechanism of action via interaction with DNA was investigated by fluorescence techniques, competition studies with ethidium bromide and circular dichroism spectroscopy, showing that DNA is a potential biological target for the complex / Mestrado / Quimica Inorganica / Mestre em Química

Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-05T12:53:18Z No. of bitstreams: 2 tese - 25-03-13.pdf: 2653654 bytes, checksum: bede8978fec54acad5daaad33d93837e (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T12:53:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 tese - 25-03-13.pdf: 2653654 bytes, checksum: bede8978fec54acad5daaad33d93837e (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / Infecções bacterianas têm aumentado drasticamente nos últimos anos, afetando milhões de pessoas em todo mundo, resultando em elevadas taxas de morbidade e mortalidade, especialmente nos países em desenvolvimento. A resistência microbiana resulta na busca de novos agentes antimicrobianos, mais potentes e menos tóxicos. O avanço nas pesquisas de novas substâncias terapeuticamente úteis para cura ou controle dessas enfermidades tem resultado na produção de novos fármacos com largo espectro de ação biológica. Derivados tiazolidínicos e tiazólicos, têm se destacado por apresentarem propriedades bioativas. A literatura refere-se aos compostos tiazolidínicos e tiazólicos como heterociclos potencialmente ativos, com ação antimicrobiana e antiproliferativa. Com este potencial, e por apresentarem, aplicação em síntese orgânica, derivados da tiazolidina-2,4-diona, da 4-tioxo-tiazolidina-2-ona e tiazólicos foram obtidos por substituição de hidrogênios do anel heterocíclico através da reação de alquilação com cloretos de benzila, tionação com reativo de Lawesson e condensação com aldeídos aromáticos nas posições 3, 4 e 5 respectivamente. Os derivados tiazólicos foram produzidos por reação de ciclização da tiouréia com haletos de acetofenonas substituídas, em meio ácido com pH ajustado. As reações seguintes ocorreram por condensação de benzaldeídos substituídos com o grupo amina da posição 2 do anel tiazólico. Após a purificação, os derivados apresentaram rendimentos variados entre 20 e 94% e foram caracterizados por métodos espectroscópicos convencionais como RMN1H, RMN13C, IV e Análise elementar, revelando consistência com as estruturas esperadas. Os derivados 5-arilideno-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (IIIa-f) apresentaram relevante atividade antimicrobiana em comparação com as séries da 5-(arilideno substituído)-tiazolidina-2,4-diona (IVa-f), 3-benzil-substituído-tiazolidina-2,4-diona (Va-b) e 5-arilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (VIa-g) sintetizadas. Isto demonstrou a importância do bioisosterismo na síntese orgânica. Apesar de não realizadas as curvas com IC50, dos derivados tiazólicos, alguns revelaram importante ação inibitória celular (citotoxicidade) para células proliferativas derivadas de carcinomas humanos como: HEP-2 (epidermóide de laringe) HT29 (de cólon), MCF- 7 (de mama) e NCI H-292 (de pulmão).