O aumento da incidência da doença huanglonbing (HLB) nos pomares brasileiros tem contribuído significativamente para o aumento do custo de produção de laranja no Brasil, devido à suscetibilidade de todas as variedades cultivadas. O HLB é associado às bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus e Candidatus Liberibacter americanus, transmitidas pelos psilídeos Diaphorina citri e Trioza erytreae. No Brasil, o inseto vetor responsável pela rápida disseminação da doença é o psilídeo Diaphorina citri. Os principais métodos de controle do HLB são a eliminação de plantas sintomáticas, uso de mudas sadias e controle do vetor. O uso de plantas geneticamente modificadas pode ser uma alternativa ao uso excessivo de inseticidas para controle do inseto vetor. Sendo assim, pode-se adotar uma nova tecnologia que se baseia no uso de RNAs de interferência (RNAi) para o silenciamento de genes específicos do inseto vetor. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do silenciamento dos genes calreticulina (DcCRT), lacase (DcLAC) e Snf7 (DcSNF7) de Diaphorina citri por RNA de interferência via alimentação em folhas destacadas de Murraya paniculata que absorveram solução contendo dsRNA de silenciamento. A princípio, foi avaliada a expressão dos genes candidatos em diferentes estádios fenológicos dos insetos. Em seguida, foram realizados bioensaios de sobrevivência e silenciamento, com as doses 0, 5, 25 e 50µg de dsRNA. A sobrevivência dos insetos foi avaliada ao longo de 144 horas, enquanto que os insetos utilizados na análise de expressão gênica foram coletados 12, 24, 48, 72 e 96h após o início da alimentação. Para os genes DcCRT, relacionado à quelatização de íons cálcio, e DcLAC, relacionado à gelificação oxidativa do estilete, ambos envolvidos no processo alimentar do inseto, também foi observado o efeito das doses de dsRNA na quantidade de alimento ingerido, 120h após o início da alimentação. Além disso, também foi realizado bioensaio com dsRNA Cy3-labbled, para verificar a distribuição do dsRNA absorvido. A expressão dos genes candidatos, de modo geral, se manteve uniforme ao longo dos estádios de desenvolvimento dos insetos, exceto para o gene DcLAC que apresentou maior expressão em adultos recém emergidos do que nos demais estádios avaliados. Nos bioensaios com dsRNA de silenciamento, observou-se fenótipo letal apenas com o silenciamento do gene DcSnf7, 144 horas após o início da alimentação. Durante o período avaliado, foi constatada redução na expressão gênica apenas de DcCRT, após 12h de alimentação e DcLAC após 96h de alimentação com seus respectivos dsRNA de silenciamento. Além disso, a dose de 5µg de dsRNA foi suficiente para causar tal efeito de silenciamento gênico. No bioensaio para quantificação da alimentação, observou- se redução na excreção de aminoácidos nos insetos alimentados com 5µg de dsRNA, em ambos os genes candidatos (DcCRT e DcLAC) 120h após o início da alimentação. Adicionalmente, a análise de distribuição de dsRNA pela folha mostrou que há absorção do dsRNA pela folha destacada, permitindo a alimentação pelo inseto. Dessa forma, conclui-se que os genes estudados apresentam potencial para o controle do psilídeo Diaphorina citri, via silenciamento gênico por RNAi. / The increase in the incidence of huanglonbing disease (HLB) in Brazilian orchards has contributed to increase of orange production costs in Brazil, due to the susceptibility of all cultivated variety of orange. HLB is associated with the Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus and Candidatus Liberibacter americanus bacteria, transmitted by the psyllids Diaphorina citri and Trioza erytreae. In Brazil, the insect vector responsible for the rapid spread of the disease is Diaphorina citri. The most important methods of HLB control are the elimination of symptomatic plants, the use of healthy nursery trees, and vector control. The use of genetically modified plants may be an alternative to the excessive use of insecticides to control the insect vector. Therefore, a new technology based on using RNAs of interference (RNAi), for silencing specific genes of the insect vector can be used. Thus, the aim of this work was to evaluate the effect of silencing calreticulin (DcCRT), laccase (DcLAC) and Snf7 (DcSNF7) genes in Diaphorina citri by interference RNA through feeding in leaves of Murraya paniculata that absorbed a solution containing dsRNA of silencing. At first, the expression of the candidate genes in different phenological stages of the insects was evaluated. Survival and silencing bioassays were then performed at doses of 0, 5, 25 and 50 µg of dsRNA. Insect survival was evaluated over 144 hours, while the insects used in gene expression analysis were collected 12, 24, 48, 72 and 96 hours after feeding. For the DcCRT genes, associated to the calcium ion chelation, and DcLAC, related to the oxidative gelling of the stylet, both involved in the insect feed process, the effect of the doses of dsRNA on the amount of food ingested, 120h after the beginning of feeding was observed. In addition, a bioassay with Cy3-labbled dsRNA was also performed to verify the distribution of absorbed dsRNA. The expression of the candidate genes generally remained uniform throughout the stages of insect development, except for the DcLAC gene that showed greater expression in newly emerged adults than in the other evaluated stages. In the bioassays with dsRNA for gene silencing, a lethal phenotype was observed only with the silencing of the DcSnf7 gene, 144 hours after the beginning of feeding. During the evaluated period, there was a reduction in the gene expression only of DcCRT, after 12h of feed and DcLAC after 96h of feeding with their respective silencing dsRNA. Additionally, the dose of 5µg of dsRNA was enough to cause this gene silencing effect. In the bioassay for feeding quantification, a reduction in amino acid excretion was observed in insects fed with 5 µg of dsRNA, in both candidate genes (DcCRT and DcLAC) 120 h after the beginning of feeding. In addition, the analysis of dsRNA distribution by the leaf showed that there is absorption of the dsRNA by the detached leaf, allowing feeding by the insect. Thus, we conclude that the genes studied have potential for the control of the psyllid Diaphorina citri, through gene silencing mediated by RNAi.

A citricultura brasileira é a maior do mundo, sendo uma das principais culturas produzidas no Brasil, no entanto há 5 anos esta vem sofrendo com a chegada da morte súbita do citros, principalmente no sul do Triângulo Mineiro e norte de São Paulo. Com o objetivo de avaliar o estado nutricional de plantas em estágios de sintomatologia da morte súbita do citros e fazer o acompanhamento da fertilidade do solo nessas áreas para fim de comparação da eficiência de absorção dos nutrientes, foram conduzidos dois experimentos em um pomar comercial situado no município de Frutal -MG. Utilizaram-se duas variedades de citros, “Pêra Rio” e “Natal”, sobre o limoeiro “Cravo” ambas com 14 anos. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado com quatro tratamentos (plantas sadias e em três estágios da morte súbita) e quatro repetições, sendo dispostos em parcelas subdivididas no tempo. As plantas com morte súbita foram diagnosticadas pelos sintomas visuais. As coletas tiveram inicio no dia 24 de junho de 2003 e terminaram dia 13 de dezembro do mesmo ano, e foram realizadas em intervalos regulares de 35 dias. Em cada coleta foram separadas as folhas, galhos, casca do tronco e raízes de cada planta para se determinar a concentração dos nutrientes, com o solo também foi determinado o teor nutricional do mesmo. Na variedade “Pêra Rio”, o comportamento dos nutrientes foram os seguintes: nas folhas as concentrações de fósforo, potássio, enxofre e boro diminuíram com o avanço da doença e a de zinco aumentou; nos galhos as concentrações de nitrogênio, fósforo, potássio diminuíram e as de cobre, ferro, manganês e zinco aumentaram; na casca do tronco o ferro e o manganês diminuíram e finalmente nas raízes as concentrações de nitrogênio, cálcio, enxofre, boro, ferro e zinco diminuíram. Na variedade “Natal”, o comportamento dos nutrientes foi um pouco diferente: nas folhas a concentração de potássio diminuiu com o avanço da doença; nos galhos as concentrações de nitrogênio, fósforo, potássio diminuíram e a de manganês aumentou; na casca do tronco o potássio e o boro diminuíram e o magnésio e manganês aumentaram e finalmente nas raízes as concentrações enxofre, boro e zinco diminuíram. Quanto ao solo, este não influenciou nas alterações nutricionais que ocorreram com as plantas, pois com a evolução da doença os teores permaneceram inalterados / The Brazilian culture of citrus is the greater of the world, it is one of the main cultures produced in Brazil, however it has been for 5 years suffering with the arrival of the sudden death in citrus, mainly in the south of the Triângulo Mineiro and north of São Paulo. With the objective to evaluate the nutritional condition of plants in levels of symptoms in the sudden death of citrus and making the accompaniment of the soil fertility soil in these areas with purpose of comparison of the efficiency nutrients absorption nutrients, two experiments in a commercial orchard situated in the city of Frutal - MG had been lead. Two varieties of citrus had been used, “Pêra Rio” and “Natal”, in the lemon tree “Cravo” both with 14 years. The experimental design was entirely randomized with four treatments (healthy plants and in three levels of sudden death) and four repetitions, in split plot in time. The plants with sudden death had been diagnosised by the visual symptoms. The assessments had begun in day 24 of June of 2003 and finished December 13 of this year, and had been carried through regular intervals of 35 days. In each assessments the leaves, twigs, rind of the trunk and roots had been separate to determine the nutrients concentration were determined the nutritional content of the soil either. In the variety “Pera Rio”, the behavior of the nutrients had been the following ones: in leaves the concentrations of phosphorus, potassium, sulphur and boron had diminished with the advance of the illness, and zinc was increased. In the twigs the concentrations of nitrogen, phosphorus, potassium had diminished and of copper, iron, manganese and zinc had increased. In the rind of the trunk the iron and the manganese had diminished and finally in the roots the concentrations of nitrogen, calcium, sulphur, boron, iron and zinc had diminished. In the variety “Natal”, the behavior of the nutrients was a little different of “Pêra Rio”: in leaves the potassium concentration diminished with the advance of the illness. In the twigs the concentrations of nitrogen, phosphorus, potassium had diminished and manganese was increased. In the rind of the trunk the potassium and the boron had diminished and the magnesium and manganese had increased and finally in the roots the concentrations sulphur, boron and zinc had diminished. The soil didn't influence in the nutritionals alterations that had occurred with the plants, with the evolution of the illness the content had remained unchanged

Estudos das interações de fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) e outros microrganismos da rizosfera têm documentado o efeito do FMA nas populações destes microrganismos e vice-versa. Espécies do gênero Trichoderma são usadas no controle biológico de patógenos de raiz. Este fungo produz uma série de enzimas extracelulares que degradam a parede de células fúngicas, sendo este um importante fator de biocontrole. Bactérias promotoras do crescimento de plantas, como algumas Pseudomonas do grupo fluorescente, também podem atuar no biocontrole de patógenos de raiz, produzindo substâncias antagônicas ou sideróforos. Além disso, é conhecida a importância da matéria orgânica como fator de melhoramento do solo, suprimindo patógenos do solo e da rizosfera. Uma das principais doenças de citros é a podridão de raiz causada por Phytophthora parasitica, que ocorre na sementeira. Assim, os objetivos foram estudar as interações que ocorrem na rizosfera e na planta hospedeira quando da presença concomitante de P. parasitica, FMAs e agentes de controle biológico, e, avaliar o efeito de diferentes substratos em tais interações microbianas, utilizando-se o porta-enxerto limoeiro Cravo (Citrus limonia). Com o objetivo de selecionar bactérias eficientes no controle do fungo causador de doença de raiz de citros, P. parasitica, foram realizados 3 experimentos in vitro (meio B de King, meio cenoura e sementes de trigo) e um in vivo, nos quais foram utilizados 69 isolados de Pseudomonas spp. e um isolado de P. parasitica. Outro experimento teve finalidade de observar a interação na planta em substrato inerte, sendo os tratamentos: com e sem FMA (Glomus intraradices com pré-colonização- GI pré ou G. intraradices sem a pré-colonização- GI), com e sem os agentes de controle biológico (T. harzianum e B. subtilis) e com e sem o patógeno (P. parasitica). Um segundo experimento de interação em esquema fatorial 3 x 3 x 2 constou de 2 agentes de controle biológico (T. harzianum e B. subtilis) e um controle (sem agente) X 2 FMAs (G. intraradices e G. etunicatum) e uma testemunha (sem FMA) X com e sem P. parasitica com inoculação anterior, posterior e concomitante do FMA e dos agentes de controle biológico. Um último experimento foi montado como fatorial 2 x 2 x 2 x 3: com e sem T. harzianum X com e sem G. intraradices X com e sem P. parasitica X 3 substratos (adição de 2 tipos de matéria orgânica-esterco e plantmax e sem adição de matéria orgânica). Para o experimento in vitro, os isolados bacterianos A5, 52B, I5, I6, I7 E 73 foram antagônicos ao patógeno nos três experimentos realizados. A maioria dos isolados bacterianos, 78%, mostrou um certo controle do patógeno in vivo, já que a massa da matéria fresca das raízes não foi afetada pela presença de P. parasitica. No experimento empregando substrato inerte (areia) houve tendência de controle da Phytophthora por todos os tratamentos realizados. A colonização radicular nas plantas sem patógeno foi significativamente maior quando realizada a inoculação prévia do FMA (GI pré). Trichoderma diminuiu significativamente a colonização do FMA, quando inoculado previamente. No segundo experimento de interação, o crescimento da planta foi favorecido pela inoculação do FMA e pelos agentes de controle biológico inoculados anterior ou concomitante ao FMA, observando-se que estes antagonistas não afetaram a colonização radicular. Houve tendência de controle da doença nos tratamentos 1° Tri/GE, 1° GI/Tri, GI+ Tri, 1° GI/Bac e somente Trichoderma e Bacillus. No último experimento realizado o crescimento das plantas colonizadas por G. intraradices e GI+ Tri, tanto na ausência como na presença de Phytophthora, foi significativamente maior, nos três substratos empregados. As plantas micorrizadas, tanto na presença quanto na ausência de Trichoderma, controlaram P. parasitica / Studies on interactions of arbuscular mycorrhizal fungus (AMF) and other rhizospheric microorganisms have shown the effect of AMF on these microorganisms and vice versa. Species of the genus Trichoderma have been used to control root pathogens. This fungus produces some extracellular enzymes that degrade fungal cell wall, what is considered an important factor of biocontrol. Plant growth-promoting rhizobacteria, such as some Pseudomonas of the fluorescent group, can act in root pathogens biocontrol, producing antagonist substances or siderophoros. Besides, it is known the importance of organic matter as a factor of soil improvement, decreasing soil and rhizosphere pathogens. One of the major citrus diseases is the root rot caused by Phytophthora parasitica. Our purposes were to study the interactions that may occur in rhizosphere and host plant in the presence of P. parasitica, AMFs and biological control agents; to evaluate the effect of different substrates in this microbe interaction and to select rhizospheric bacteria to control P. parasitica in vitro (B King media, carrot media and wheat seeds) and in vivo, using Citrus limonia. The first experiment had the purpose of evaluating the microbe interactions in plants, using an inert substrate, testing the effect of AMF (Glomus intraradices inoculated at seed nursery- GI before transplanting, or, G. intraradices inoculated at transplanting- GI), biological control agent (Trichoderma harzianum and Bacillus subtilis) and the pathogen (P. parasitica). A second experiment had a factorial 3x3x2 completely randomized design, where the factors were: biological control agents (T. harzianum, B. subtilis and no agent), AMFs (G. intraradices, G. etunicatum and no AMF), P. parasitica (with and without), with previous, afterwards and concurrent inoculation of AMF and biological control agent. A last experiment had a factorial 2x2x2x3 completely randomized design, where the factors were: T. harzianum (with or without), G. intraradices (with or without), P. parasitica (with or without), substrates (soil with addition of 2 kinds of organic matter- dairy manure and plantmax- and no addition). The plant growth was enhanced by AMF and biological control agents inoculated previously or concurrently with AMF, observing that these antagonists did not affect the radicular colonization. There was disease control in treatments 1° Tri/GE, 1° GI/Tri, exclusively with Trichoderma and Bacillus inoculation. In vitro assays showed that Pseudomonas sp isolates 80S, A5 and I6 were antagonists to the pathogen. Most of the bacteria isolates, 78%, showed pathogen control in vivo and root weight was not affected by the presence of P. parasitica. When using inert substrate (sand) all treatments controlled P. parasitica. The radicular colonization with no pathogen inoculation was significantly higher with previous AMF inoculation. Trichoderma decreased significantly the AMF colonization when it was inoculated previously. Colonized plants by G. intraradices and GI+ Tri, inoculated or not with P. parasitica, showed a significantly higher growth in the 3 substrates tested. The mycorrhizal plants, in the presence or absence of Trichoderma, controlled P. parasitica.

A Mancha Preta dos Citros ou Pinta Preta (MPC), causada pelo fungo Guignardia citricarpa, vem provocando graves e crescentes prejuízos econômicos à cultura, nos últimos 20 anos. O presente trabalho foi desenvolvido no Centro de Citricultura 'Sylvio Moreira' (CCSM) do Instituto Agronômico de Campinas, no município de Cordeirópolis-SP. Procurou-se detectar possíveis diferenças entre dez clones de laranjeira 'Pêra' (Citrus sinensis L. Osbeck) e cinco variedades afins, quanto à suscetibilidade à MPC. Os clones de 'Pêra' avaliados foram: Vimusa; EEL; GS 2000 (IAC 2000); Olímpia 15161; Bianchi; R. Gullo 1569/244; Dibbern C.V.; Premunizada 1743/82; e as variedades afins foram: Corsa Tardia, Lamb Summer, Ovale 968, Ovale San Lio 969, e Redonda C.N, enxertados em limoeiro 'Cravo', instalados desde 1980, no CCSM. Os trabalhos experimentais incluíram investigações sobre a avaliação e distribuição da severidade dos sintomas nas plantas; indução de estruturas 'in vitro', em folhas previamente autoclavadas; indução de estruturas reprodutivas do fungo em folhas maduras destacadas; e quantificação da densidade de colonização de G. citricarpa, através de isolamento. A comparação entre os diferentes clones também foi realizada através de estudos de correlação entre a severidade dos sintomas da doença e das variáveis ou dados biométricos, que seguem: queda de folhas, desenvolvimento vegetativo (porte) e penetração da luz no interior das plantas). Quanto aos frutos, a severidade foi correlacionada com: cor, formato, formas da base e do ápice, ângulo e achatamento, espessura do epicarpo, do mesocarpo e da casca e por fim com os dados de qualidade do suco (Brix, Acidez e Ratio). Não houve diferenças significativas entre os dez clones de laranjeira 'Pêra' e as cinco variedades afins quanto à quantificação da incidência e severidade da MPC no campo, e à densidade de colonização natural das folhas (isolados/cm2). A incidência e a severidade dos sintomas da doença são maiores na parte baixa das plantas, até 1 metro de altura, e menor acima de 2 metros, podendo-se salientar que há influência na infecção dos frutos pelos ascósporos (sexuais) e picnidiósporos (assexuais), através de respingos d'água. Ocorreu uma diferenciação entre as variedades quanto à capacidade reprodutiva de G. citricarpa em folhas mortas in vitro e quanto à indução de estruturas do fungo, através da porcentagem de área das folhas ocupadas por elas. Não houve correlação das características externas dos frutos como: coloração da casca, formato, forma da base, forma do ápice, ângulo e achatamento da região basal e espessura da casca, do mesocarpo e do epicarpo, com a severidade da doença. Não houve correlação das características internas dos frutos como: sólidos solúveis (ºBrix), acidez total, e relação sólidos solúveis: acidez (ratio), com severidade da doença. Portanto, a Mancha Preta dos Citros não interfere nas qualidades organolépticas dos frutos, e sim, no aspecto visual dos mesmos / Citrus Black Spot (CBS), caused by Guignardia citricarpa, has prompted serious economic damages to the citrus industry in the last 20 years. The present work was developed at the Centro de Citricultura 'Sylvio Moreira' (CCSM) of the Instituto Agronômico de Campinas, in Cordeirópolis-SP. Evaluations were conducted to detect differences among ten 'Pêra' sweet orange Citrus sinensis (L.) Osbeck clones and five related varieties in regard to their susceptibility to CBS. The 'Pêra' sweet orange clones evaluated were: Vimusa, EEL, GS 2000 (IAC 2000), Olímpia 15161, Bianchi, R Gul10 1569/244, Dibbern c.v., Premunizada 1743/82; and the related varieties were: Corsa Tardia, Lamb's Summer, Ovale 968, Ovale San Lio 969, and Redonda C.N. Trees were budded on Rangpur lime are planted in 1980, at the CCSM. Studies investigated the evaluation severity of symptoms and distribution on the plants; induction of structures in vitro in leaves previously autoclaved; induction of fungus reproductive structures in mature leaves; and quantified density of colonization of G. citricarpa by means of isolation. The comparison among different clones was also accomplished by determining correlations between the severity of disease symptoms and the variables: leaf drop, vegetative growth, and light penetration insíde the plants. In regard to fruit, the severity was correlated with: color; fruit shape; base and apex shape; angle and flattening; epicarp, mesocarp and peeI thickness; and with juice quaIity (soluble solids and soluble solids to acidity ratio). The relationship for quantification of severity of CBS incidence in the field and the density of natural leaves colonization (isolates/cm2 was not significant. The incidence and the severity of the disease symptoms are greater in the low part of the plants, up to 1 meter height, and smaller above 2 meters, probably because of the influence of fruit infection by ascospores (sexual) and pícnidiospores (asexual) through water splash. Differentiation among the varieties was detected based on the reproductive capacíty of G. citricarpa on dead leaves in vitro and also based on the induction of fungus structures, as evaluated by the percentage of area of the leaves occupied by them. There was not a significant correlation for fruit externaI characteristics, such as peeI color, fruit shape, base and apex shape, basaI area angle and flattening, and peeI thickness of either mesocarp and epicarp with the severity of disease. Similarly there was not a correlation for fruit internal characteristics such as soluble solids, total acidity, and soluble solids to acidity (ratio), with the severity of disease. Therefore, the CBS of the fruit does not interfere on the fluit organoleptic quality. However, visual aspect of fruit ís severeIy depressed

Lippia alba (mill) N. E. Br. ex Britt l Wilson - Verbenaceae - é relatada como uma planta medicinal com efeito fungitóxico para vários fungos fitopatogênicos e entre esses Colletotrilhum gloeosporioides (penz), causador da doença"queda de frutos jovens de citros". Testes realizados a partir de duas formas de L. alba - forma 1 (F1) e forma 2 (F2) mantidos em contato com gotas de suspensão de conídios de C. glocosponcides, sobre superfície de poliestireno durante diferentes períodos de tempo, demonstraram que substância(s) presente(s) em folhas secas das duas formas de L. alba altera(m) o padrão de germinação dos conídios, aumentado o comportamento e a largura do tubo germinativa e impedindo a formação do apressório. A não formação de apressórios pelos conídios foi também demonstrada a partir do contato de extratos acetônicos, etanólicos e hexânicos com gotas de suspensão de esporos em lâminas de poliestireno. Utilizando-se esses extratos, sobre meio BDA em placas de Petri, verificou-se também o efeito dos mesmos sobre o crescimento micelial de C. gloeosporioides. O extrato etanólico mostrou-se como e mais eficiente na redução do crescimento micelial, enquanto que o extrato aquoso não exibiu efeito algum nesse sentido. Através de bioensaios para frações fungitóxicas, pelo uso de placas de cromato-grafia delgada, demonstrou-se também o efeito fungitóxico dos extratos provenientes das duas formas de L.alba. Com o aparecimento de diferentes zonas de inibição do crescimento de L. gloeosporioides, comprovando-se o efeito fungitóxico de todos os extratos inclusive o aquoso, para as duas formas de L. alba. A quantificação de proteínas e carboidratos totais, bem como análise de macro e micronutrientes realizadas nas folhas secas das duas formas de L. alba não forneceram evidências para se efetuar correlações sobre o papel desses compostos na atividade fungistática apresentada / not available

O objetivo desta pesquisa foi caracterizar o comportamento reprodutivo do minador-dos-citros, Phyllocnistis citrella Stainton, 1856 (Lepidoptera: Gracillariidae), como suporte para o isolamento, identificação e síntese do seu feromônio sexual, visando fornecer subsídios para racionalização de controle desta praga dentro de um contexto de Manejo Integrado das Pragas de citros. O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia de Insetos do Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola da Escola Superior de Agricultura"Luiz de Queiroz (ESALQ), Piracicaba, da Universidade de São Paulo (USP). Através de uma criação de P. citrella, utilizando-se como planta hospedeira, mudas de limão cravo (em tubetes) foi possível a obtenção de insetos virgens, indispensáveis para o tipo de pesquisa proposta. Determinou-se que o horário de acasalamento de P. citrella, é logo ao amanhecer, entre adultos de um e dois dias de idade e com uma duração de cópula de 50 min. Ficou caracterizado o seu hábito crepuscular de postura, pois a oviposição de P. citrella se deu nas duas primeiras horas após o início da escotofase. Machos e fêmeas de P. citrella apresentaram um sincronismo na emergência, com uma proporção macho:fêmea de 1:1 e portanto, uma razão sexual igual a 0,5. Concluiu-se que as fêmeas de P. citrella são responsáveis pela atração sexual e que existe um feromônio sexual mediando o acasalamento desta espécie / not available

A citricultura brasileira ocupa lugar de destaque no agronegócio nacional, sendo o país o maior produtor de laranja e suco de laranja do mundo. A faia (Fagus sylvatica) é uma das principais espécies das florestas na Europa, sendo usada como ornamental e por possui alto valor econômico devido à produção de madeira. Um dos principais entraves no cultivo dessas espécies é a ocorrência de doenças principalmente as causadas por espécies de Phytophthora que além de causar grandes prejuízos, os métodos de controle são difíceis e onerosos. Existem trabalhos na literatura que apontam os fosfitos como alternativa sustentável, eficaz e economicamente viável para o controle de doenças causadas por oomicetos. Entretanto, o Comitê de Ação a Resistência à Fungicidas (FRAC) classifica os fosfitos, como produtos com ingrediente ativo sem mecanismo de ação definido. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar o produto comercial à base de fosfito de potássio, Phytogard® no controle das doenças causadas por Phytophthora nicotianae em citros e Phytophthora plurivora em faia, bem como avaliar através de análises bioquímicas se esse produto induz resistência em plântulas de citros. Além disso, foram realizados estudos in vitro para avaliar o efeito direto do Phytogard® sobre o desenvolvimento de P. nicotianae e P. plurivora e verificar os possíveis mecanismos de ação desse produto sobre esses patógenos. Foram utilizadas plântulas de citros e faia que foram aspergidas com diferentes concentrações de Phytogard® e, posteriormente, inoculadas com os patógenos. Foram avaliadas a incidência das doenças, o consumo de água e a quantidade de DNA dos patógenos nos tecidos das raízes dos hospedeiros. Ao final do experimento, foram realizadas análises bioquímicas dos tecidos das plântulas de citros. Nos experimentos in vitro, o micélio dos patógenos foi exposto a concentrações crescentes de Phytogard® sendo determinado o crescimento micelial, produção de massa fresca de micélio e de zoósporos. Avaliou-se a perda de eletrólitos, peroxidação de lipídios e a atividade da enzima β-1,3 glucanase do micélio exposto ao produto. Foi avaliada também a morfologia das hifas tratadas ou não com o Phytogard® através da técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Os resultados mostraram que o Phytogard®, em todas as concentrações aplicadas controla de maneira preventiva as doenças causadas por P. nicotianae e P. plurivora em citros e faia, respectivamente. Em citros, o produto altera a atividade de algumas proteínas relacionadas à patogênese, mas não é possível concluir que o controle seja mediado por indução de resistência. O Phytogard® inibe o crescimento micelial e a produção de zoósporos de P. nicotianae e P. plurivora. Além disso, o produto modifica a morfologia das hifas, atua na permeabilidade de membrana e na síntese de parede celular do micélio dos patógenos. / The Brazilian citrus production is important to national agribusiness, and the country is the largest orange and orange juice world producer. Beech (Fagus sylvatica) is one of the main forest species in Europe and is used as ornamental and also it has a high economic value due to the production of wood. One of the main problems in the cultivation of these species is the occurrence of diseases, mainly caused by Phytophthora species. Besides causing extensive damage control methods are difficult and costly. There are studies in the literature that show phosphites as a sustainable alternative, effective and economically viable for the control of diseases caused by oomycetes. However, the Fungicide Resistance Action Committee (FRAC), classifies the phosphites as products with the active ingredient with no defined mode of action. In this context, this work aimed to evaluate the commercial product based on potassium phosphite Phytogard® on the control of diseases caused by Phytophthora nicotianae in citrus plants and Phytophthora plurivora in beech plants and evaluate through biochemical assays whether this product induces resistance in citrus seedlings. In addition, in vitro studies were carried out to evaluate the direct effect of Phytogard® on the development of P. nicotianae and P. plurivora and to understand the possible mode of action of the product on these pathogens. Citrus seedlings were sprayed with different concentrations of Phytogard® and then inoculated with the pathogen. We evaluated the diseases incidence, water uptake and the amount of pathogens DNA in the host roots. At the end of the experiment, biochemical assays with citrus seedlings were made. In in vitro experiments, the pathogen mycelium was exposed to increasing concentrations of Phytogard® and mycelial growth, production of fresh mycelium and zoospores by these pathogens were determined. We also evaluated the electrolyte leakage, lipid peroxidation and the β-1,3 glucanase activity in the mycelium exposed to the product. It was also evaluated the hyphae morphology from mycelium treated or not with Phytogard® by using scanning electron microscopy. The results showed that in all concentrations of Phytogard® preventively controled diseases caused by P. nicotianae and P. plurivora in citrus and beech plants, respectively. In citrus, the product changed the activities of some pathogenesis-related proteins, but it is not possible to conclude that the control was mediated by resistance induction. The Phytogard® inhibited mycelial growth and zoospore production by P. nicotianae and P. plurivora. Furthermore, the product modified the hyphae morphology, changed membrane permeability and mycelium cell wall synthesis in the pathogens.

A transformação genética é uma alternativa ao melhoramento convencional de citros que permite a modificação de genótipos pela introdução de um ou mais genes oriundos de organismos semelhantes ou filogeneticamente distantes do hospedeiro. Os genes transferidos para espécies de interesse devem ser controlados por promotores, os quais regulam a expressão gênica de forma temporal, espacial e na magnitude desejada. Na maioria dos casos, os genes são expressos de forma constitutiva utilizando o promotor CaMV35S isolado do Vírus do Mosaico da Couve Flor. No entanto, o desenvolvimento de novas abordagens de transformação de plantas (cisgenia e intragenia), que fazem o uso de genes e sequências regulatórias derivadas da mesma espécie ou espécies relacionadas, requer a disponibilidade de elementos genéticos, incluindo promotores constitutivos, isolados de citros. Assim, o objetivo do trabalho foi clonar e caracterizar promotores constitutivos de Citrus sinensis. Para isso, a região promotora dos genes Fator de elongação 1-α (CsEF1), Gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase C2 (CsGAPC2) e Cyclofilina (CsCYC) foi isolada e avaliados pela fusão ao gene repórter uidA. A funcionalidade dos três promotores foi confirmada por ensaio histoquímico da atividade GUS em folhas, caules e raízes de plantas transgênicas de citros cv. \'Hamlin\'. A análise de RT-qPCR mostra que a expressão do gene uidA sob controle dos promotores CsCYC, CsGAPC2 e CsEF1 correspondeu a uma atividade aproximada de 64%, 58% e 47%, respectivamente em comparação com o promotor CaMV35S. A análise in silico dos promotores CsGAPC2, CsCYC e CsEF1 mostra que a atividade de cada um é controlada por uma série de putativos elementos cis-regulatórios. A sequência completa e versões truncadas originadas a partir de deleções em cada promotor foram fundidas ao gene uidA e analisadas em plantas transgênicas de Nicotiana benthamiana pelo ensaio histoquímico e fluorimétrico da atividade GUS. As análises de deleções não causaram perda de função dos promotores em estudo, mas afetaram a expressão gênica nos promotores CsGAPC2 e CsEF1. Os promotores isolados representam bons candidatos a serem utilizados em trabalhos de transformação genética de citros. / Genetic transformation is an alternative to citros conventional breeding that allows the modification of genotypes by the introduction of one or more genes derived from different organisms that can not be crossed by natural means. The transferred genes to the species of interest are controlled by promoters, which regulate a gene expression temporally, spatially and in the desired magnitude. In most cases, the introduced genes have been constitutively expressed using the CaMV35S promoter obtained from the cauliflower mosaic virus. However, the development of novel plant transformation approaches (cisgenesis and intragenesis) imply the use of genetic material from the same species or from closely related species capable of sexual hybridization, which requires the isolation of genetic elements, including citros constitutive promoters. The objective of this study was clone and characterize Citrus sinensis constitutive promoters. For this, the promoter region of the genes Elongation Factor 1-α (CsEF1), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase C2 (CsGAPC2) and Cyclofiline (CsCYC) was isolated and evaluated by fusion to the uidA reporter gene. The functionality of three promoter was confirmed by histochemical GUS assay in leaves, stems and roots of transgenic citrus plants cv. \'Hamlin\'. RT-qPCR analysis revealed that uidA gene expression under control of the CsCYC, CsGAPC2 and CsEF1 promoters was approximately 64%, 58% and 47% expression compared with the CaMV35S promoter. In silico analysis of the CsGAPC2, CsCYC and CsEF1 promoters displays their activity is controlled by a series of putative cis-regulatory elements. The full length promoter and truncated versions originated from deletions in promoters sequences were fused to the uidA gene and analyzed in Nicotiana benthamiana transgenic plants by histochemical and fluorimetric GUS assay. Deletion analysis did not cause loss of function on any of the promoters, but affected the gene expression on CsGAPC2 and CsEF1 truncated versions. The isolated promoters represent good candidates to be used in citros genetic transformation.

O parasitoide Ageniaspis citricola Logvinovskaya é o principal agente de controle biológico do minador-dos-citros Phyllocnistis citrella Stainton. No entanto, com a detecção do huanglongbing houve um aumento no uso de inseticidas nos pomares cítricos e não se conhece seus efeitos à A. citricola. Desta maneira, estudou-se o efeito letal de cinco inseticidas e a persistência aos 3, 7, 10, 17 e 24 dias após a pulverização em mudas de citros mantidas em casa de vegetação ao parasitoide A. citricola, nas dosagens especificadas (g i.a. L-1): imidacloprido 0,04 (Provado&reg; 200 SC), clorpirifós 0,72 (Lorsban&reg; 480 BR), bifentrina 0,02 (Talstar&reg; 100 EC), beta-ciflutrina 0,0125 (Turbo&reg; 50 EC), abamectina 0,0054 (Vertimec&reg;), bem como o efeito subletal no parasitismo em fêmeas expostas por 24 horas aos resíduos de abamectina. Imidacloprido, clorpirifós, bifentrina e beta-ciflutina foram considerados nocivos para adultos de A. citricola (M > 75%), enquanto que, abamectina foi considerado inócuo (M < 25%). Com base na duração do efeito nocivo, clorpirifós e beta-ciflutrina foram considerados de vida curta (< 5 dias), enquanto que, imidacloprido foi levemente persistente (5-15 dias) e bifentrina moderadamente persistente (16-30 dias). Abamectina não alterou a taxa de parasitismo de A. citricola, mas alterou substancialmente a razão sexual (0,11) quando comparado ao tratamento controle (0,5). Os resultados indicam que deve-se ter cautela em recomendar os produtos avaliados, observando-se o efeito residual daqueles produtos considerados nocivos à A. citricola, de forma a explorar a seletividade ecológica. Abamectina, embora inócua a adultos do parasitoide, pode levar a uma redução populacional de A. citricola, devendo-se realizar estudos de campo para elucidar essa questão. / Ageniaspis citricola Logvinovskaya is the main biological control agent of Phyllocnistis citrella Stainton. However, with the huanglongbing report, there was an increase in the use of insecticides in citrus orchards and the effects on A. citricola are not known. Thus, we studied the lethal effects of five insecticides and the persistence on 1, 3, 7, 10, 17 and 24 days post application in seedlings of citrus kept in greenhouse, using the specified dosages (g a.i. L-1): imidacloprid 0.04 (Provado&reg; 200 SC), chlorpyriphos 0.72 (Lorsban&reg; 48 BR), bifenthrin 0.02 (Talstar&reg; 10 EC), beta-cyfluthrin 0.0125 (Turbo&reg; 5 EC), abamectin 0.0054 (Vertimec&reg; 18 EC), as well as the sublethal effect on the parasitism by females exposed to residues of 24 hours of abamectin. Imidacloprid, chlorpyriphos, bifenthrin and beta-cyfluthrin were considered harmful to A. citricola (M > 75%) and abamectin were considered harmless (M < 25%). Chlorpyriphos and beta-cyfluthrin were considered of short life (< 5 days), imidacloprid slightly persistent (5-15 days) and bifenthrin moderately persistent (16-30 days). Abamectin did not affect the parasitism by A. citricola, but the sex ratio, with a sex ratio of 0.11 against 0.5 of the control. The results indicate that we must be careful to recommend the evaluated insecticides, observing the persistence of those classified as harmful to A. citricola, as a manner to explore the ecological selectivity. Even though considered harmless to adult parasitoids, abamectin can lead to population reduction of A. citricola, being necessary field studies to confirm that situation.

O inseto vetor Diaphorina citri Kuwayama 1907 (Hemiptera: Liviidae) é considerado a principal praga da citricultura mundial. O controle desta praga é feito quase exclusivamente com inseticidas químicos, existindo a demanda por alternativas mais sustentáveis de controle. O desenvolvimento de um bioproduto a base de fungo entomopatogênico pode ser uma alternativa promissora para o manejo integrado de D. citri em pomares comerciais de citros. Assim, esse estudo teve como objetivo viabilizar a utilização do fungo entomopatogênico Isaria fumosorosea ESALQ-1296 para o controle de D. citri, avaliando: 1- a ação de adjuvantes na adesão e germinação de I. fumosorosea em ninfas e adultos de D. citri; 2- a relação entre a viabilidade dos conídios e a mortalidade de D. citri; 3- o efeito da umidade relativa do ar e da radiação ultravioleta na eficácia de I. fumosorosea em condições de laboratório; 4- o período entre a aplicação de fungicidas químicos e I. fumosorosea em campo; 5- a seletividade de I. fumosorosea aos inimigos naturais Tamarixia radiata e Ceraeochrysa cincta em condições de laboratório; 6- o volume de calda adequado para as aplicações de I. fumosorosea para o controle de D. citri em pomares comerciais; 7- a eficiência de I. fumosorosea no manejo de D. citri e seu efeito em outras espécies de artrópodes em dois sistemas de produção de citros. Análises por microscopia eletrônica de varredura revelaram que a adição dos adjuvantes KBRAdj e Silwet L-77 acelerou o desenvolvimento dos conídios de I. fumosorosea na cutícula de todos os estágios do inseto em comparação com o Tween 80. As formulações de I. fumosorosea com KBRAdj 0,075% apresentaram melhor desempenho no controle de D. citri em todos os níveis de umidade, mas especialmente em períodos de baixa umidade relativas (&le;50%) e sob exposição à radiação UV-B (> 2 horas) em relação a aplicação com Tween. Os fungicidas Kumus&reg; DF, Kocide&reg; WDG, Nativo&reg;, Flint 500&reg; WG não influenciaram no desempenho do entomopatógeno quando esses foram pulverizados um dia antes ou após a aplicação do fungo sobre os adultos de D. citri. Nos estudos de seletividade foi demonstrado que a maioria das misturas de I. fumosorosea com os adjuvantes foi inócua para os adultos de T. radiata e as larvas neonatas de C. cincta. Em pomares comerciais, foi demostrado que as aplicações de I. fumosorosea foram mais eficientes no volume de 60 mL.m-3 de área de copa. Na área com produção orgânica de citros foi verificado que as aplicações de I. fumosorosea reduziram significativamente a população natural de D. citri e do ácaro da leprose (Brevipalpus spp.). Já na área com produção convencional de citros foi observado que as pulverizações de I. fumosorosea reduziram significativamente a população do ácaro da falsa ferrugem (Phyllocoptruta oleivora) e a população de D. citri foi extremamente baixa em todos os tratamentos. As aplicações de I. fumosorosea não apresentaram efeitos negativos nas populações dos predadores joaninhas, crisopídeos e hemerobídeos. Portanto, conclui-se que a utilização do fungo I. fumosorosea no manejo de D. citri pode ser uma tática sustentável para minimizar as aplicações sistemáticas de pesticidas, diminuindo seus impactos no agroecossistema. / The insect vector Diaphorina citri Kuwayama 1907 (Hemiptera: Liviidae) is the main citrus pest in the world. The control of this pest is done almost exclusively with chemical insecticides, and there is a demand for more sustainable control alternatives. The development of a bioproduct based on entomopathogenic fungi may be a promising alternative for the integrated management of D. citri in commercial citrus orchards. The objective of this study was to evaluate important parameters to increase efficiency of applications of the entomopathogenic fungus Isaria fumosorosea ESALQ-1296 for the control of D. citri. The following studies have been developed: 1- the action of adjuvants on adhesion and germination of I. fumosorosea on nymphs and adults of D. citri; 2- the relationship between the conidia viability and the mortality of D. citri; 3- the effect of relative air humidity and ultraviolet radiation on the efficacy of I. fumosorosea under laboratory conditions; 4 - the period between the application of chemical fungicides and I. fumosorosea in field; 5- the selectivity of I. fumosorosea to the natural enemies Tamarixia radiata and Ceraeochrysa cincta under laboratory conditions; 6 - the volume of syrup suitable for I. fumosorosea applications for the control of D. citri in commercial orchards; 7- the efficiency of I. fumosorosea to management of D. citri and its effect against other species of arthropods in two systems of citrus production. Scanning electron microscopy analysis revealed that the addition of the adjuvants KBRAdj and Silwet L-77 accelerated the development of I. fumosorosea conidia on the cuticle of all stages of the insect compared to Tween 80. The formulations of I. fumosorosea with KBRAdj 0.075% showed better performance in controling D. citri at all moisture levels, but especially in periods of low relative humidity (&le;50%) and exposure to UV-B radiation (> 2 hours) compared to Tween application. The fungicides Kumus&reg; DF, Kocide&reg; WDG, Nativo&reg;, Flint 500&reg; WG did not influence the performance of the entomopathogen when they were sprayed the day before or after application of the fungus on D. citri adults. In the selectivity studies, it was shown that most of the mixtures of I. fumosorosea with the adjuvants were innocuous for the adults of T. radiata and the neonates of C. cincta. In commercial orchards, it was demonstrated that I. fumosorosea applications were more efficient in the volume of 60 mL.m-3 of leaves. In the area with organic citrus production it was verified that I. fumosorosea applications significantly reduced the natural population of D. citri and the false spider mite (Brevipalpus spp.). In the area with conventional citrus production it was observed that sprays of I. fumosorosea significantly reduced the population of the false rust mite (Phyllocoptruta oleivora) and D. citri population was extremely low in all treatments. The applications of I. fumosorosea did not present negative effects in the populations of the ladybirds, lacewings and hemerobide predators. Therefore, it is concluded that the use of I. fumosorosea fungus in the management of D. citri can be a sustainable tactic to minimize the systematic applications of pesticides, reducing their impacts on the agroecosystem.