A mitocôndria é a organela citoplasmática responsável pelo maior sistema produtor de energia, a fosforilação oxidativa (OXPHOS). Foi proposto que em células tumorais a hiper-regulação da glicólise em condições normais de oxigênio (Efeito Warburg), está associada a defeitos na OXPHOS e pode regular o fenótipo tumoral, por exemplo, o potencial metastático da célula por meio da indução de vias pseudohipóxicas durante a normóxia. Estudos recentes mostraram que vários tipos de tumores possuem mutações somáticas em seu genoma mitocondrial, o que pode alterar as funções da OXPHOS levando a troca de metabolismo energético nas células tumorais e induzindo a tumorigênese. Diante disto, o presente trabalho avaliou a instabilidade do genoma mitocondrial em etapas bem definidas da progressão do câncer colorretal. O DNA genômico foi extraído de amostras de adenoma, adenocarcinoma, tecido adjacente e sangue periférico de nove pacientes diagnosticados com Câncer colorretal. O genoma mitocondrial foi amplificado e sequenciado para que fossem feitas as buscas por mutações nas amostras de sangue periférico, adenomas e adenocarcinoma. Foi também medido o número de cópias relativas do mtDNA. Foram encontradas um total de 233 mutações, das quais 162 foram em comum entre os três tecidos avaliados. As amostras de adenocarcinoma foram as que apresentaram uma maior média de mutações por amostra (44,6), seguidas dos adenoma (40,2) e do sangue periférico (34). As amostras de adenocarcinoma apresentaram uma maior instabilidade do mtDNA refletidas a partir de um maior número de mutações somáticas (tanto do tipo InDel como mutações de uma única base), mutações não sinônimas com maior patogenicidade, maior número de mutações em heteroplasmia e com taxa de heteroplasmia elevada. Já as amostras de adenoma apresentaram instabilidade dos seus mtDNA intermediários entre o tecido não tumoral e tumoral, refletindo bem a etapa de modificação celular no qual esses tecidos se encontram. Na análise do número de cópias relativas, as amostras de adenocarcinoma tiveram diminuição no número de cópias relativas quando comparadas com tecido adjacente (p= 0,01) e com adenomas (p= 0,04). Em síntese, o presente trabalho sugere que a instabilidade do genoma mitocondrial parece ter um papel importante no desenvolvimento de tumores colorretais. / The mitochondrion is a cytoplasmic organelle responsible for the major energy producing system, which is the oxidative phosphorylation enzyme pathway (OXPHOS). It was proposed that glycolysis up-regulation during normal oxygen conditions (Warburg effect) may induce defects in the mitochondrial respiration and regulate tumoral phenotypes, for example, metastatic potential through the induction of pseudohipoxic pathways during normoxia. Recent studies have shown that many kinds of tumors have mtDNA somatic mutations, which could alter the OXPHOS functions, leading to changes in glucose metabolismo and improvind tumorigenesis. This study analyzed the mitochondrial genome instability of well defined stages of colorectal cancer. Genomic DNA was extracted from adenoma, adenocarcinoma, adjacente tissue and peripheral blood of patients diagnosed with Colorectal cancer. The mitochondrial genome was amplified and sequenced for mutations screening in adenoma, adenocarcinoma e blood samples. It was also analyzed the relative mtDNA copy number. It was find a total of 233 mutations, which 162 were in common among the three analyzed tissues. The adenocarcinoma samples presented a greater mutation mean per sample (44.6) followed by adenomas samples (40.2) and blood samples (34). The adenocarcinoma samples also shown a greater mitochondrial genome instability refleted by increased of somatic mutations (InDels and single nucleotide variation), non sinonimous mutations with higher patogenicity, increased number of heteroplasmatic mutations and higher heteroplasmatic levels. The adenoma samples showed intermadiate instability of its mtDNA, which well reflects the intermediate stage of cellular modifications of this tissue. The mtDN copy number analysis shown that the adenocarcinoma samples presented decreased number of mtDNA content when compared with adjacente tissue (p= 0.01) and adenoma samples (p= 0.04). In summary the presente study suggests that the mitochondrial genomic instability seems to play an importante role in colorectal tumorigenesis.

La phosphatidylinositol-3 kinase (PI3-K) est un complexe comportant une sous-unité catalytique (C) et régulatrice (R). En ce qui concerne la classe I, cinq isoformes R (p85α, p55α, p50α, p85β et p55γ) et quatre isoformes C (p110α, p110β, p110δ et p110γ) sont connues. Plusieurs études ont souligné les rôles cruciaux de la voie PI3-K/Akt dans une panoplie de processus cellulaires, dont la survie. De plus, cette voie est l’une des plus altérées dans plusieurs types de cancers, dont le cancer colorectal (CCR). Par ailleurs, il est bien établi que l’acquisition d’une résistance à l’anoïkose constitue une étape cruciale et limitante dans la progression de plusieurs types de cancers, incluant une fois de plus le CCR. Nous avons précédemment démontré que les complexes isoformes PI3-K sont engagés/recrutés par la signalisation intégrines FAK/Src de suppression d’anoïkose et, conséquemment, exercent des rôles distincts dans la survie cellulaire des entérocytes normaux selon leur état de différenciation. Ainsi, l’hypothèse de recherche de la présente étude est que les complexes isoformes PI3-K contribuent sélectivement à l’acquisition d’une résistance à l’anoïkose, et ce, chez les cellules CCR humaines. Les objectifs principaux sont les suivants : 1) Établir le profil des complexes isoformes PI3-K chez des lignées cancéreuses colorectales humaines exhibant différents degrés de résistance à l'anoïkose (modéré à fortement élevé); et 2) Déterminer fonctionnellement les contributions des complexes isoformes PI3-K identifiés dans le maintien de résistance à l'anoïkose. Nos résultats indiquent que : 1) il existe des distinctions entre les profils de complexes isoformes PI3-K prédominants chez des cellules CCR exhibant différents degrés de résistance à l’anoïkose; 2) Ces complexes PI3-K peuvent jouer ou non des rôles dans la survie cellulaire, et ce, peu importe le degré de résistance à l’anoïkose exhibé; 3) les distinctions de profils de complexes isoformes ne semblent pas corrélées avec la progression de résistance à l’anoïkose; 4) il y aurait un mécanisme anormal de compensation entre les isoformes par rapport aux complexes formés et fonctions spécifiques chez les cellules CCR; et 5) une implication de la voie MEK/Erk compliquerait d’autant plus l’investigation des rôles des complexes PI3-K chez les cellules exhibant un degré élevé de résistance à l’anoïkose. Somme toute, cela laisse entrevoir que la progression dans la résistance à l’anoïkose implique une complexité plus importante qu’anticipée, chez les cellules CCR. / Abstract : The Phosphatidylinositol-3 kinase (PI3-K) is a lipid kinase enzyme complex formed of a catalytic (C) and a regulatory (R) subunit. To date, class I PI3-K members include five R (p85α, p55α, p50α, p85β et p55γ) and four C (p110α, p110β, p110δ et p110γ). Many studies already highlighted the crucial roles of the PI3-K/Akt pathway in many, if not all, cell processes, including cell survival. Moreover, PI3-K/Akt constitutes one of the most altered pathways in cancer, including in colorectal cancer (CRC). Incidentally, it is well established that the acquisition of anoikis resistance constitutes a crucial and limiting step in the progression of many cancers, including once again, in CRC. We have already demonstrated that PI3-K isoform complexes are selectively engaged by the anoikis-suppressing integrins/FAK/Src signaling and that this translates in distinct roles in normal enterocytes survival, according to their state of differentiation. This establishes a basis for the working hypothesis of the present report which is that PI3-K isoform complexes distinctly contributes to the acquisition and maintenance of anoikis resistance in human CRC cells. The main goals were as follows: 1) To establish the expression profiles of PI3-K isoform complexes in human CRC cells displaying differing anoikis resistance degrees; and 2) To define the functional contributions of said PI3-K isoform complexes in the maintenance of anoikis resistance. Our results indicate that 1) the expression profiles of PI3-K isoform complexes are distinct between human CRC cells displaying differing anoikis resistance degrees; 2) these PI3-K isoform complexes can perform, or not, roles in cell survival regardless of the anoikis resistance degree displayed; 3) the observed distinctions of the expression profiles of PI3-K isoform complexes do not correlate with the progression of anoikis resistance; 4) there seems to be an abnormal compensation mechanism between the various PI3-K isoforms linked not only with the nature of the complexes that are formed, but to their specific functions as well; and 5) the MEK/Erk pathway seems implicated in a cross-talk signaling loop, the nature of which further complexifies the investigation of the roles of PI3-K isoform complexes in human CRC cells displaying differing anoikis resistance degrees. Taken together, these observations suggest a more complex network of interactions than previously thought in human CRC cells.

L’irinotecan est un agent anticancéreux majeur utilisé dans le traitement du cancer du côlon où il agit à la fois comme un agent causant des dommages à l’ADN et un inhibiteur de l’angiogenèse. L’activité de l’irinotécan dans les cancers colorectaux est limitée par le développement d’une résistance acquise au médicament. Le but de ce travail est de caractériser l’influence d’une exposition prolongée à l’irinotécan sur la biologie des cellules cancéreuses colorectales in vivo et in vitro. Résultats majeurs : Nous avons exposé les cellules de cancer colorectal, HT-29 (LOH) et HCT-116 (MSI), au SN-38 (le métabolite actif de l'irinotécan) pendant un an. Ceci a permis de sélectionner des cellules résistances à l’irinotécan et ceci de manière stable. Une caractérisation plus approfondie a révélé que la résistance acquise à l’irinotécan était accompagnée d’altérations multiples, y compris la diminution de la formation de complexes clivables et de cassures double brins. Nos études ont montré des changements inattendus dans la distribution du cycle cellulaire et la vitesse de croissance des deux lignées résistantes. La pertinence in vivo de nos modèles cellulaires a ensuite été confirmée dans des modèles de xénogreffe.D’autres résultats basé sur l’inhibition de l’angiogenèse montrent que l'exposition prolongée à l’irinotécan est accompagnée d’une modification majeure de la voie HIF, VEGF / VEGFR dans les cellules tumorales. Ces travaux ont permis d’identifier des modifications biologiques dans les cellules résistantes susceptibles de les rendre plus résistantes ou sensibles à d’autres classes d’agents anticancéreux afin de proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques.Ce travail est financé par l’Institut National du Cancer / Colorectal cancer (CRC) is one of the most common tumors and a leading cause of cancer death worldwide. Until recently, fluorouracil in combination with leucovorin was the only effective systemic treatment for CRC. During the last few years, four new treatments have been approved for advanced CRC including the topoisomerase I (topo I) inhibitor irinotecan, the epidermal growth factor receptor (EGFR)-directed monoclonal antibody cetuximab and the vascular endothelial growth factor (VEGF)-directed monoclonal antibody bevacizumab. Unfortunetly their clinical activity is often limited by the development of resistance. Several lines of experimental evidence suggest a functional interaction between topo I and EGFR. Furthermore, topo I can regulate hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1alpha), a key regulator of cellular response to hypoxia, leading to VEGF production.We propose to study the EGFR-signaling pathway on the cellular response to cytotoxic agents with the topo I inhibitor irinotecan/SN-38 as model.Resistant cells were obtained by culturing HT-29 and HCT-116 cells in increasing concentrations of irinotecan. After obtaining, their drug resistance was 5 to 25 times increased compared to the parental cells. We first showed that the proliferation of the two resistant cell lines was slower than the sensitive ones. We were able to confirm it with different in vitro and in vivo experiment. It is interesting to notice that topo I expression was unchanged in our resistant cell lines. We then demonstrated that the resistant cells are less affected by the formation of DNA strand breaks (led by SN38) than the sensitive ones. Moreover, the EGFR expression is increased in the resistant cell lines. We also shown by western blot and ELISA that resistance development comes along with an increase of VEGF.Our data should provide important clues on the irinotecan acquired resistant cells and should help to set up new combinations for colorecal cancer treatment.

La voie de signalisation WNT/PCP, couramment associée à la polarité planaire cellulaire, joue un rôle fondamental dans la morphogenèse chez les vertébrés. Parmi les différents composants protéiques de la voie WNT/PCP, on retrouve la protéine tyrosine kinase 7 (PTK7), dont les fonctions restent encore très peu décrites. Au cours de ma thèse, j’ai montré que PTK7 interagissait avec le récepteur tyrosine kinase ROR2. Ce complexe, après fixation du ligand WNT5A, induit la migration de fibroblastes embryonnaires murins via l’activation de JNK. Au cours du développement embryonnaire du xénope, Ptk7 interagit de manière fonctionnelle avec Ror2, et contrôle l’expression de la protocadhérine Papc ainsi que la morphogénèse. De plus, en utilisant une approche de Tissue MicroArray, réalisée sur des patients atteints de cancers colorectaux, j’ai pu montrer que PTK7 était retrouvé surexprimé chez 34% des patients, et que cette surexpression était un facteur de mauvais pronostic. Dans des lignées cellulaires issues de cancers colorectaux, la suppression de PTK7 par shRNA entraine une diminution de la migration des cellules tumorales, mais n’impacte pas leur prolifération et leur résistance aux drogues anticancéreuses. Dans un modèle de xénogreffe murin, la suppression de PTK7 induit une diminution du développement tumoral et l’expression de ce dernier, dans des cellules négative pour PTK7, entraine une augmentation de l’apparition de métastases chez les animaux injectés. Ce travail apporte de nouveaux éclaircissements sur le du récepteur PTK7 dans la voie de signalisation WNT/PCP, et le définit comme potentiel biomarqueur et cible thérapeutique dans le cancer colorectal. / The non-canonical WNT/planar cell polarity (WNT/PCP) pathway plays important roles in morphogenetic processes in vertebrates. Among WNT/PCP components, protein tyrosine kinase 7 (PTK7) is a tyrosine kinase receptor with poorly defined functions lacking catalytic activity. We show that PTK7 associates with receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2 (ROR2) to form a heterodimeric complex in mammalian cells and physically and functionally interact with the non-canonical WNT5A ligand, leading to JNK activation and cell movements. In the Xenopus embryo, Ptk7 functionally interacts with Ror2 to regulate protocadherin papc expression and morphogenesis. Furthermore, we show that Ptk7 is required for papc activation induced by Wnt5a and that Wnt5a stimulates the release of the Ptk7 intracellular domain, which can translocate into the nucleus and activate papc expression. Moreover, using a Tissue MicroArray produced from CRC patients we correlated PTK7 expression with pathological features and patient outcome. PTK7 was significantly up-regulated in CRC tissue, and its overexpression was found in 34% of patients. In CRC cell lines, shRNA PTK7 reduced migration, but did not affect cell proliferation and resistance to drugs. In a xenograft mouse model, downregulation of PTK7 led to reduced tumor growth, whereas its overexpression in PTK7-negative cancer cells led to increased metastatic events. This work reveals novel molecular mechanisms of action of PTK7 in non-canonical WNT/PCP signaling that may promote cell and tissue movements and define PTK7 expression as a potential prognostic biomarker and a novel therapeutic target in CRC.

Notre équipe étudie les HSP, et notamment HSP110. Les HSP sont des chaperons impliqués dans le repliement des protéines nouvellement synthétisées et dénaturées. Les HSP sont surexprimées lors des stress et participent à la survie des cellules par leurs propriétés anti-apoptotiques et anti-agrégations. HSP110 est surexprimée dans le cancer colorectal et est associée à un mauvais pronostic. L’expression d’un mutant d’HSP110, nommé HSP110DE9, a été mise en évidence dans les cancers colorectaux de type MSI. Celui-ci y agit comme un dominant négatif, en se liant à HSP110 et en inhibant ses fonctions. Son expression sensibilise les cellules cancéreuses à la chimiothérapie et est associée à un bon pronostic chez les patients.Je me suis tout d’abord intéressé au rôle d’HSP110 dans la régulation de la voie oncogénique STAT3. Son activation est en effet associée à un mauvais pronostic, par l’induction de gènes impliqués dans la prolifération et la survie. La protéine HSP110 favorise la prolifération des cellules colorectales cancéreuses à travers cette voie. HSP110DE9 en revanche l’inhibe. Je me suis ensuite intéressé au rôle d’HSP110 sur la polarisation des macrophages dans le cancer colorectal. Celle-ci peut être sécrétée par les cellules cancéreuses et induit une polarisation pro-tumorale des macrophages. HSP110DE9, en bloquant la sécrétion d’HSP110, conduit en revanche à une polarisation pro-inflammatoire. L’effet d’HSP110 sur la polarisation implique le récepteur TLR4.L’ensemble de ces résultats montrent le rôle d’HSP110 dans la progression tumorale. HSP110 apparaît comme une cible thérapeutique dans le traitement du cancer colorectal. / Our team studies HSPs, including HSP110. HSPs are chaperones involved in the folding of newly synthesized and denatured proteins. HSPs are overexpressed under stress conditions and are involved in cell survival thanks to their anti-apoptotic and anti-aggregation functions. HSP110 is overexpressed in colorectal cancer and is associated with a poor prognosis. The expression of a mutant HSP110, named HSP110DE9, has been shown in MSI colorectal cancer. This one was shown to act there as a dominant negative, by binding HSP110 and inhibiting its functions. Its expression sensitizes cancer cells to chemotherapy and is associated with a better prognosis for patients.I was first interested in HSP110 role in regulating the oncogenic STAT3 pathway. Its activation is associated with a poor prognosis, as it induces the transcription of genes involved in proliferation and survival. HSP110 favors colorectal cancer cell proliferation through this pathway. Conversely, HSP110DE9 inhibited it.I then focused on the role of HSP110 on macrophage polarization in colorectal cancer. HSP110 can be secreted by cancer cells and induces a pro-tumoral macrophage polarization. In contrast, HSP110DE9, by inhibiting HSP110 release, leads to a pro-inflammatory polarization. HSP110 effect on macrophage polarization involve the TLR4 receptor.All these results show HSP110 role in tumor progression. HSP110 appear as a therapeutic target in the treatment of colorectal cancer.

Les cancers colorectaux (CCR) constituent un véritable problème de santé publique. En France, en 2015, ils se situent au 3ème rang des cancers et au 2ème rang des décès par cancer, en raison d’un diagnostic souvent tardif et de réponses variables aux thérapeutiques. L’amélioration des tests de dépistage ces vingt dernières années n’a pas significativement réduit la morbi/mortalité liée au CCR et une meilleure caractérisation des différents sous-types moléculaires reste importante pour l’identification de nouveaux biomarqueurs. Les tumeurs colorectales sont hétérogènes tant sur le plan clinico-pathologique que moléculaire, issues de différentes voies de cancérogenèse. Les tumeurs de la voie festonnée représentent 20 à 30% des CCR. Elles sont caractérisées par une instabilité épigénétique (CpG Island Methylation Phenotype, CIMP), une instabilité microsatellitaire (MSI) et des mutations fréquentes du gène BRAF. Sur le plan phénotypique, ce sont des tumeurs volontiers mucisécrétantes surexprimant les mucines MUC2 et MUC5AC. L’identification précoce de leurs précurseurs reste actuellement un enjeu, d’autant que la séquence carcinogénétique des tumeurs festonnées serait particulièrement rapide.Dans cette étude, nous avons déterminé les caractéristiques clinico-pathologiques et moléculaires d’une série de cancers et polypes colorectaux et évalué l’intérêt des gènes de mucines MUC2 et MUC5AC pour classer les polypes festonnés et identifier les lésions précurseurs des cancers CIMP/MSI.L’étude a porté sur 418 CCR et 330 polypes coliques, incluant 218 polypes festonnés et 112 adénomes conventionnels, dont nous avons déterminé le profil moléculaire (mutations KRAS/BRAF, MSI, CIMP, méthylation MGMT, MLH1), ainsi que le profil d’expression et de méthylation des gènes de mucines MUC2 et MUC5AC. Les résultats ont été comparés aux données cliniques et anatomo-pathologiques.Nous montrons que l’hypométhylation du gène MUC5AC est un marqueur spécifique des CCR CIMP/MSI, indépendant des données clinico-pathologiques. De plus, nous montrons que l’hypométhylation de MUC5AC est un évènement précoce qui est spécifiquement associé aux polypes hyperplasiques de type microvésiculaire (MVHP) et adénomes festonnés sessiles (SSA), suggérant une filiation entre ces deux lésions, qui seraient les précurseurs des CCR CIMP/MSI. L’hypométhylation de MUC5AC était par ailleurs très spécifique des lésions festonnées mutées BRAF, CIMP ou MSI.En conclusion, nos résultats suggèrent un rôle de la mucine MUC5AC dans le développement des tumeurs coliques de la voie festonnée. L’hypométhylation du gène MUC5AC est un évènement précoce qui pourrait avoir un intérêt pour le diagnostic des polypes festonnés, en particulier lorsque la morphologie est ambiguë, et pour l’identification précoce des lésions à potentiel malin. De plus, nos résultats suggèrent que certains MVHP pourraient progresser en SSA et en CCR CIMP/MSI, d’où l’importance de réaliser des biopsies des polypes festonnés lors de l'endoscopie afin de repérer le sous-type microvésiculaire parmi les polypes hyperplasiques colorectaux, qui pourrait, bénéficier d’une surveillance minimale. / Colorectal cancer (CRC) is a major public health problem yet it remains the third most common and the second deadliest cancer for both men and women in the United States and in Europe, owing to diagnosis at advanced stage and variable response to the treatments. However, the incidence and mortality appear to be steadily declining in countries with programmatic screening and it remains critical to characterize CRC molecular subtypes to identify new biomarkers. CRC display a wide clinicopathological and molecular heterogeneity and arise from different carcinogenesis pathway. Approximately 20% to 30% of CRC occur by the means of the serrated neoplasia pathway. CRC from the serrated pathway are associated with frequent epigenetic instability (CIMP, CpG island methylator phenotype) which causes most sporadic microsatellite instability (MSI) CRC through epigenetic inactivation of MLH1 and frequent BRAF mutation. CRC from the serrated pathway frequently display a mucinous pattern and are prone to express secreted mucins MUC2 and MUC5AC. Early identification of serrated pathway precursor lesions is currently challenging since the progression to adenocarcinoma in this pathway is particularly brief.We assessed in this study clinicopathological and molecular features of colorectal carcinomas and polyps and we analyzed the interest of mucin genes MUC2 and MUC5AC to classify serrated polyps and to identify the precursor lesions of CIMP/MSI carcinomas._x000D_A series of 418 CRC and 330 polyps was included in the study, with 218 serrated polyps and 112 conventional adenomas. We assessed the molecular profile (KRAS/BRAF mutations, MSI, CIMP, MGMT methylation, MLH1) and the expression and methylation profile of MUC2 and MUC5AC genes and further correlation with clinical and pathological data were performed.We show that MUC5AC hypomethylation is a specific marker of CIMP/MSI CRC, independently of other clinical or pathological factors. We show moreover than MUC5AC hypomethylation is an early event of carcinogenesis, specific to microvesicular hyperplastic polyps (MVHP) and sessile serrated adenoma (SSA) suggesting a filiation between these two lesions and also a progression of MVHP to SSA, SSA with dysplasia, and then to MSI/CIMP CRC. MUC5AC hypomethylation was moreover highly specific of BRAF mutated, CIMP or MSI serrated lesions.In conclusion, our results suggest that the MUC5AC mucin is involved/plays a role in the development/progression of colorectal tumors of the serrated pathway. MUC5AC hypomethylation occurs early during carcinogenesis and may be of interest for the diagnosis of serrated polyp especially in the presence of ambiguous morphology and to early detection of polyps carrying a malignant potential. Our results suggest moreover that some MVHP may progress to SSA and CIMP/MSI CRCs highlighting the importance to perform biopsy of serrated polyps during endoscopy to identify microvesicular subtype among colorectal hyperplastic polyps, which could require a minimal surveillance.

Les dommages de l’ADN, induits par les traitements de chimiothérapie, sont responsables de l’induction de la sénescence, un arrêt définitif du cycle cellulaire dépendant des voies p53-p21 et p16-Rb. L'efficacité de cette suppression n’est pas optimale en raison d’une hétérogénéité de réponse à la chimiothérapie. Dans cette étude, nous avons analysé l’échappement à la sénescence en réponse à l’irinotécan, un traitement des cancers colorectaux. Dans les cellules LS174T, le processus de sénescence est induit mais des cellules conservent leurs capacités prolifératives et l’exercent après l’élimination du traitement. Les cellules proliférantes (PLD) et sénescentes (PLS) forment un mélange hétérogène appelé cellules persistantes (PLCs). Alors qu’elles sont constituées d’une part importante de cellules sénescentes, les PLCs sont capables de former des tumeurs in vivo, de manière comparable aux cellules parentales. De façon intéressante, le traitement est également associé à l’augmentation de l’agressivité caractérisée par la croissance en faible adhérence. L’émergence des PLD et la résistance à l’anoikis sont dépendantes de l’expression des protéines Mcl-1, Bcl-xL et p21. L’enrichissement des PLD et PLS, réalisé par cytométrie en flux, a permis d’identifier les PLS comme nécessaires à la résistance à l’anoikis. Les PLS pourraient donc créer un environnement favorable à la transformation de cellules non touchées par le traitement. Alors que le rôle de Mcl-1 et Bcl-xL dans chaque population reste à déterminer, l’utilisation d’inhibiteurs de ces protéines combinés à l’irinotécan pourrait limiter l’hétérogénéité de réponse à la chimiothérapie et l’agressivité tumorale. / Activated by chemotherapy, senescence is a suppressive response which prevents cell cycle progress through activation of the p53-p21 and p16-Rb signaling pathways. However, despite the efficiency of this suppression, cancer cells can emerge to induce clinical relapse. In this study, we analyzed senescence escape in response to irinotecan, one of the first line treatment used in colorectal cancer. After treatment, senescence is induced in LS174T cell but a subpopulation of cells finally resume proliferation. Persistent cells (PLCs) are composed of an heterogenous mixture of senescent (PLS) and dividing cells (PLD). In spite of PLS, PLCs are able to grow in vivo as efficiently as parental LS174T cells. Importantly, persistence induced the emergence of more transformed cells characterized by the ability to grow in low adhesion conditions. PLD emergence and anoikis resistance depend on Mcl-1, Bcl-xL and p21. PLD and PLS enrichment, by flow cytometry, allowed us to identify PLS as essential for anoikis resistance. Our results suggest that PLS establish a favorable environment for the transformation of unaffected cells. Mcl-1 and Bcl-xL role in each population remains to be determined, but inhibitors of these protein used in combination with irinotecan should restrict the heterogeneity of the response and tumoral aggressiveness.

Le renouvellement de l’épithélium intestinal repose sur la prolifération incessante de cellules souches intestinales (CSI) capables de régénérer l’intégralité de l’épithélium en 3 à 5 jours. Des altérations de ces dernières sont à l’origine de la transformation tumorale. L’étude des mécanismes impliqués dans la protection des CSI face à différents stress est donc essentielle pour mieux comprendre l’homéostasie et les pathologies intestinales. Dans un modèle de souris prédisposées à développer des tumeurs suite à la perte du gène Apc, notre équipe a pu précédemment démontrer une activation de l’autophagie nécessaire à la croissance tumorale. Nos travaux visent à étudier le rôle de ce processus catabolique dans l’homéostasie des CSI. Pour ce faire, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés et des cultures d’organoïdes afin d’étudier les effets de l’inhibition de l’autophagie dans l’homéostasie intestinale et en particulier dans les CSI.Nos travaux indiquent que l’inhibition de l’autophagie par l’invalidation du gène Atg7 conduit à une activation de p53 et de l’apoptose spécifique des CSI. L’invalidation simultanée du gène Tp53 empêche la mort des CSI déficientes en autophagie. De plus, au long terme, ces souris développent des tumeurs, contrairement aux souris invalidées uniquement pour les gènes Atg7 ou Tp53. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’inhibition de l’autophagie sensibilisait les CSI à l’apoptose suite à une accumulation de dommages cytotoxiques. Par une analyse d’expressions géniques des CSI issues de cryptes contrôles et invalidées pour le gène Atg7, nous avons mis en évidence une altération des réponses associées au stress oxydant et à la réparation de l’ADN. Confirmant ces signatures, nous avons observé des dommages de l’ADN dans les cryptes déficientes en autophagie et un défaut de réparation de ces dommages suite à une irradiation. Nous observons également une accumulation d’espèces réactives de l’oxygène dans les CSI déficientes en autophagie associée à une atténuation de la réponse antioxidante médiée par NRF2. Des traitements antibiotiques à large-spectre ou antioxydants améliorent la survie des CSI déficientes en autophagie et soutiennent l’influence des espèces réactives de l’oxygène et de la flore intestinale sur la mort des CSI. Nos travaux indiquent donc un rôle important de l’autophagie dans la protection et le maintien des CSI, de par son contrôle des espèces réactives de l’oxygène, du microenvironnement bactérien et des voies de réparation de l’ADN. / The renewal of the intestinal epithelium relies on the continuous proliferation of stem cells capable of regenerating the entire epithelium every 3 to 5 days. These intestinal stem cells (ISC) are thought to be the cell of origin for colorectal cancer. Thus, characterizing the mechanisms involved the protection of ISC against different stresses is key to understanding both intestinal homeostasis and tumor development. In tumoral tissue from mice predisposed to intestinal tumor development following the loss of the tumor suppressor gene Apc, our laboratory previously showed an upregulation of autophagy required for tumor growth. Our work aims to understand the role this catabolic mechanism in the homeostasis of ISC. To this end, we use genetically modified mouse models and intestinal organoid culture to study the effects of autophagy inhibition in intestinal homeostasis and in particular in ISC.We found that the inhibition of autophagy upon deletion of the gene Atg7 results in p53 activation and apoptosis of ISC specifically. The simultaneous deletion of Tp53 prevents the death of autophagy-deficient ISC. Moreover, over time, mice deficient for both Atg7 and Tp53 develop tumors, contrary to those deficient for either Atg7 or Tp53 alone. We therefore hypothesized that the inhibition of autophagy sensitizes ISC to p53-mediated apoptosis as a result of accumulated pro-tumorigenic damages. Transcriptomic analysis on sorted control or Atg7-deficient ISC revealed aterations in oxidative stress and DNA damage responses. Confirming these signatures, we observed DNA damages in autophagy-deficient crypts along with a defect in the repair of induced damages following irradiation. We additionally observed an accumulation of reactive oxygen species in autophagy-deficient ISC linked to a downregulation of the NRF2-mediated antioxidant response. Wide-spectrum antibiotic or antioxidant treatments improve the survival of autophagy-deficient ISC and support the contribution of both reactive oxygen species and the intestinal microbiota to the death of ISC. Our work therefore reveals we find an important function of autophagy in the integrity and maintenance of ISC by controlling reactive oxygen species, the microbial microenvironment and DNA repair pathways.

Le cancer colorectal (CRC) est l'un des cancers les plus agressifs. Afin de rechercher de nouveaux marqueurs de progression de ce cancer, des puces tout transcriptome et épissage, ainsi que des puces microARNs, ont été précédemment utilisées au laboratoire.Dans une première partie, l’analyse des données transcriptomiques a permis de trouver un ensemble de transcrits dérégulés dans les adénomes et dans le CRC, dont la surexpression de TIMP1, associée à la diminution de rétention de l’intron 3, par rapport à la muqueuse normale. Ce transcrit aberrant n’est pas sujet au mécanisme de dégradation active des ARNm («Nonsense-Mediated mRNA Decay »). Nous avons alors analysé les mécanismes d’épissage de TIMP1, ce qui nous a conduits à identifier hnRNPA1 comme un régulateur important, à la fois in vitro et in vivo, de la rétention de l’intron 3 de TIMP1, via sa fixation au début de l’exon 4. Le rôle de TIMP1i3 (+) dans la progression du CRC reste à identifier.Dans une seconde partie, l’analyse des données de la puce microARNs (miRs) a permis de trouver un ensemble de miRs dérégulés dans les CRC. Nous avons sélectionné des gènes codant des facteurs d’épissage dont l’expression était modifiée au cours de la progression cancéreuse, en tant que cibles possibles de certains de ces miRs. Six interactions ont été montrées (PRMT5/miR145; SRSF6/miR375; RBMX/miR23a; RBMX/miR24; RBMX/miR125a5p; SRSF11/miR143).En utilisant la technique de « Luciferase Reporter Gene Assay » couplée à la mutagenèse dirigée, nous avons montré que le miR145 régule négativement l’expression de PRMT5 par interaction avec la région 3’ non traduite du gène. Du fait du contrôle de la machinerie d’épissage des ARN prémessagers par PRMT5, nous proposons que miR145 pourrait être un régulateur général de l’épissage. / Colorectal cancer (CRC) is one of the most vaggressive cancers in the world. In order to look for new markers in progression of this cancer, all transcriptome and splice chips, as well as microRNA chips, have been previously used in the laboratory.In the first part of my thesis, transcriptomic data analysis revealed a set of deregulated transcripts in adenoma and in CRC, including overexpression of TIMP1, associated with the decrease of intron 3 retention, compared to normal mucosae. This aberrant transcript is not subject to the active mechanism of mRNAs degradation ("Nonsense-Mediated mRNA Decay"). Then we analysed the splicing mechanisms of TIMP1, which led us to identify hnRNPA1 as a major regulator, both in vitro and in vivo, of TIMP1 intron 3 retention via its binding in the beginning of exon 4. TIMP1i3 (+) role in the progression of CRC remains to be identified.In a second part, the analysis of microRNA data (miRs) revealed a set of deregulated miRs in CRC. The aim was to identify target genes for these miRs.We selected genes encoding splice factors whose expression was modified during cancer progression as possible targets for some of these miRs. Six interactions were shown (PRMT5/miR145; SRSF6/miR375; RBMX/miR23a; RBMX/miR24; RBMX/miR125a5p; SRSF11/miR143).Using the "Luciferase Reporter Gene Assay" technique coupled with site directed mutagenesis, we have shown that miR145 negatively regulated the expression of PRMT5 by interaction with its 3’untranslated translated region. Due to the control of the premessenger RNA splicing machinery by PRMT5, we propose that miR145 could be a general splicing regulator.

Le cancer colorectal (CCR) est le premier cancer digestif dans les pays occidentaux. Malgré les progrès thérapeutiques réalisés au cours des deux dernières décennies, la survie relative à 5 ans ne dépasse pas 56%, et s’abaisse à 11,3% pour les patients métastatiques. Le pronostic est lié au stade de développement de la maladie au moment du diagnostic. Les décès sont en rapport avec une résistance primaire de la masse tumorale aux thérapies, ou la survenue de récidive, en rapport avec une maladie microscopique résiduelle, non contrôlée par les thérapies systémiques adjuvantes. Le travail réalisé au sein de notre laboratoire portant sur deux voies de signalisation met en leurs rôles dans le CCR : les neurotrophines (NTs, facteurs de croissance impliqués dans la survie des cellules cancéreuses) et l’autophagie (processus de recyclage cellulaire impliqué dans la résistance au stress). Le but de cette étude a été d’analyser la part de ces deux voies dans la survie des cellules du cancer colo-rectal et l’impact de leur inhibition sur le devenir cellulaire et l’évolution tumorale. L’étude a été menée sur deux lignées cellulaires provenant du même patient : SW480 (tumeur primaire) et SW620 (invasion ganglionnaire), aussi utilisées pour la réalisation de greffes sous cutanées sur le modèle murin Nude. De plus, la présence de principales protéines des NTs (TrkB) et de l’autophagie (LC3) a été analysée dans les tissus de patients. Des travaux précédents menés sur des cultures de CCR ont montré que la surexpression de TrkB était associée à la survie cellulaire. Nous avons donc choisi d’inhiber la voie des NTs avec le K252a (100nM). Sur culture cellulaire de CCR, in vitro, l’inactivation de la voie PI3K / AKT, induit une activation de l’autophagie. A l’opposé, le blocage du flux autophagique par une approche pharmacologique (avec la chloroquine, CQ ; 25µM) ou par une approche transcriptomique (siRNA anti-ATG5) induit une suractivation de la signalisation des NTs, via le couple TrkB/BDNF. Ainsi, les deux voies de survie se compensent mutuellement et la double inhibition permet l’amélioration de l’effet des simples traitements. L’utilisation des deux inhibiteurs in vivo induit une réduction spectaculaire du volume tumoral (voire même la disparition dans certains cas). Finalement, la présence de la forme active du TrkB (phospho TrkB) et de la forme active de la LC3 (LC3II), démontrant l’activation de ces deux voies dans les tissus de patients, a été observée. L’ensemble de ces résultats montre que l’activation des voies des NTs et de l’autophagie contribue à la survie des cellules de CCR. L’approche qui consiste à la double inhibition des NTs et de l’autophagie pourrait être un point majeur pour le développement de nouvelles thérapies dans le CCR. / Colorectal cancer (CRC) is the first digestive cancer in occidental countries. Despite effective therapies, cases of resistance and/or recurrence exist. Our laboratory works on two signaling pathways regulating balance between survival and cell death: neurotrophins (NTs, growth factors involved in cancer cells survival) and autophagy (cellular recycling involved in stress resistance). The aim of this study was to investigate relationship between these two pathways and the impact of their inhibition on cell fate and tumor evolution.Studies were performed on two CRC cell lines derived from the same patient: SW480 (primary tumor) and SW620 (node invasion), also used for subcutaneous xenografts on Nude mouse model. In addition, presence of major proteins of NTs (TrkB) and autophagy (LC3) were assessed in patient’s tissues.Previous work showed that TrkB overexpression is associated with pro-survival signaling in CRC cell. So, we choose to inhibit NTs pathway with K252a (100 nM). As expected, inactivation of the PI3K / AKT pathway was observed and CRC cells were able to activate autophagy. At the opposite, blocking autophagic flux by pharmacologic approach (chloroquine; CQ; 25µM) or by transcriptomic approach (siRNA against ATG5) induced over-activation of the NTs pathway, via TrkB/BDNF. Thus, both survival pathways compensate each other. Moreover, dual inhibition allowed improving the effect of single treatment through a significant reduction of metabolic activity. The using of both inhibitors in vivo induces a spectacular reduction of tumor volume (or even disappearance in some cases). Presence of active form of TrkB (phospho TrkB) and active form of LC3 (LC3-II) demonstrating activation of these two pathways, in patient’s tissues have been observed. Taken together, our results showed that activation of NTs and autophagy contribute to CRC cell survival. The approach consisting of dual inhibition of NTs and autophagy could be a major point for new CRC therapies development.