It has been hypothesized that tumours are caricatures of normal tissue organization, where a minority cell population, the ‘stem cell’ of cancer, holds the exclusive ability for tumour propagation. These cancer stem cells (CSCs), or tumour-initiating cells, possess extensive self-renewal ability, through which they ensure maintenance of the tumourigenic clone. Such cells have been identified in various cancers, including colorectal, and have been proposed to be the source of tumour re-initiation following therapy. An important and currently unanswered question in solid tumours is whether all CSCs are equal or whether there is a gradient of potency within the CSC compartment. Using primary human colon tumour cells and sensitive in vivo functional assays, we have determined that colon CSCs are not uniform; rather, they vary with respect to their proliferative capacity, which is also linked to their response to chemotherapy. These findings hold therapeutic implications for colorectal cancer treatment since all types of CSCs must be eradicated to remove the risk of tumour relapse. While the CSC model may provide attractive answers to some challenging questions, it remains controversial. Ascertaining the importance of CSCs will come from targeted CSC therapies. Here we demonstrate that human colorectal CSC function is dependent on the self-renewal regulator BMI-1. Down-regulation of BMI-1 inhibits the ability of colorectal tumour-initiating cells to self-renew resulting in the abrogation of their tumourigenic potential. Treatment of primary colorectal cancer xenografts with small molecule BMI-1 inhibitors resulted in colorectal tumour-initiating cell loss with long-term and irreversible impairment of tumour growth. Targeting the BMI-1 related self-renewal machinery provides the basis for a new therapeutic approach in the treatment of colorectal cancer. Collectively, we have advanced the CSC field in two areas of importance. We show for the first time that the CSC pool encompasses a gradient of proliferative potential linked to chemotherapeutic response. Second, we provide critical proof for the clinical relevance of CSCs by inhibiting tumour growth through targeting of the self-renewal machinery. This body of work significantly advances our understanding of colorectal tumour-initiating cells.

It has been hypothesized that tumours are caricatures of normal tissue organization, where a minority cell population, the ‘stem cell’ of cancer, holds the exclusive ability for tumour propagation. These cancer stem cells (CSCs), or tumour-initiating cells, possess extensive self-renewal ability, through which they ensure maintenance of the tumourigenic clone. Such cells have been identified in various cancers, including colorectal, and have been proposed to be the source of tumour re-initiation following therapy. An important and currently unanswered question in solid tumours is whether all CSCs are equal or whether there is a gradient of potency within the CSC compartment. Using primary human colon tumour cells and sensitive in vivo functional assays, we have determined that colon CSCs are not uniform; rather, they vary with respect to their proliferative capacity, which is also linked to their response to chemotherapy. These findings hold therapeutic implications for colorectal cancer treatment since all types of CSCs must be eradicated to remove the risk of tumour relapse. While the CSC model may provide attractive answers to some challenging questions, it remains controversial. Ascertaining the importance of CSCs will come from targeted CSC therapies. Here we demonstrate that human colorectal CSC function is dependent on the self-renewal regulator BMI-1. Down-regulation of BMI-1 inhibits the ability of colorectal tumour-initiating cells to self-renew resulting in the abrogation of their tumourigenic potential. Treatment of primary colorectal cancer xenografts with small molecule BMI-1 inhibitors resulted in colorectal tumour-initiating cell loss with long-term and irreversible impairment of tumour growth. Targeting the BMI-1 related self-renewal machinery provides the basis for a new therapeutic approach in the treatment of colorectal cancer. Collectively, we have advanced the CSC field in two areas of importance. We show for the first time that the CSC pool encompasses a gradient of proliferative potential linked to chemotherapeutic response. Second, we provide critical proof for the clinical relevance of CSCs by inhibiting tumour growth through targeting of the self-renewal machinery. This body of work significantly advances our understanding of colorectal tumour-initiating cells.

L'existence d'une immunité anti-tumorale a longtemps été controversée. Aujourd'hui, de nombreuses études ont montré des réponses anti-tumorales spécifiques. Les lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) jouent un rôle dans l'inhibition de la croissance des tumeurs et sont associés à un meilleur pronostic. Cependant, la présence d'une tumeur malgré le système immunitaire met en évidence des mécanismes d'échappement. J'ai tout d'abord participé à la caractérisation de la valeur pronostic de marqueurs lymphocytaires. La densité de l'infiltrat lymphocytaire T, en particulier les lymphocytes T mémoires, et leurs localisations au niveau du centre et du front de progression de la tumeur sont associées au devenir clinique des patients. Ces paramètres permettent une classification des patients à risque élevé de récidive bien plus significative que les paramètres anatomopathologiques. En étudiant plus précisément ces paramètres, nous avons montré l'altération progressive des réponses immunitaires anti-tumorales lors de l'envahissement des ganglions ou d'organes à distance. Je me suis donc intéressée aux marques de cytotoxicité en relation avec les différentes sous-populations T helper. Nous avons à nouveau trouvé des clusters fonctionnels mais seuls les réponses Th1, cytotoxique et Th17 sont associées au pronostic des patients. Les patients avec une forte réponse Th1 ou cytotoxique sont de bon pronostic tandis que ceux avec une forte réponse Th17 sont de mauvais pronostic. La combinaison de ces paramètres est plus discriminante pour déterminer les patients à risque de récidive. Les microARNs interviennent dans de nombreux processus biologiques physiologiques (dont le système immunitaire) et physiopathologiques (dont le cancer). J'ai étudié leurs profils d'expression dans des colons sains et tumoraux. Ces profils sont différents, avec des sur-expressions et sous-expressions de certains microARNs. J'ai également observé l'association de certains microARNs au devenir clinique de patients mais aussi à des marqueurs du système immunitaire. L'ensemble des travaux réalisés montre l'importance de la réaction immunitaire adaptative pour l'établissement du pronostic des patients atteints de cancers colorectaux. Son évaluation en routine permettrait de mieux orienter les patients vers une stratégie thérapeutique adaptée.

Rationale/Objective: Excess lung cancer risks associated with exposure to inhaled radon decay products among uranium miners has well been established. Although ingestion is also a potentially important route of exposure, the relationship between ingested radon decay products and gastrointestinal cancer risks are not well examined. The objective of this study is to determine the relationship between exposure to radon decay products and the incidence and mortality of gastrointestinal (esophagus, stomach, and colorectal) cancer among men employed as uranium miners in Ontario. Secondly, to determine whether the duration of exposure (dose rate), years since last exposure and age at first exposure modify these associations. Methods: A cohort of miners who had ever worked in an Ontario uranium mine between 1954 and 1996 was created using the Mining Master File and the National Dose Registry. Cumulative radon exposures measured in Working Level Months (WLM) were previously estimated for each miner. Cancer diagnoses (1964-2004) and cancer deaths (1954-2004) occurring in Ontario were determined by probabilistic record linkage with the Ontario Cancer Registry. To calculate person-years at risk, non-cancer deaths were also ascertained from the Ontario mortality file for the period between 1954 and 2004. Poisson regression methods for grouped data were used to estimate the relative risks (RR) and 95% Confidence Intervals (CI) by exposure level. Results/Conclusions: The final cohort consisted of 28,273 Ontario uranium miners. By the end of 2004, 34 miners had been diagnosed with esophageal cancer, 86 with stomach cancer, and 359 with colorectal cancer. There were 40 deaths due to esophageal cancer, 69 from stomach cancer, and 176 from colorectal cancer. When comparing the highest cumulative exposure category (>40 WLM) to the referent group (0 WLM), significant increases in both stomach (RRIncidence= 2.30, 95% CI;1.02-5.17 and RRMortality=2.90, 95% CI;1.11-7.63) and colorectal cancers (RRIncidence =1.56, 95% CI;1.07-2.27 and RRMortality =1.74, 95% CI;1.01-2.99) after adjusting for age at risk and period effects. However, no relationships were observed for esophageal cancer. Suggestive evidence of modifying effects of these associations by duration of employment (dose rate) and years since last exposure for colorectal cancer was also observed.

Type II diabetes and hyperinsulinemia are associated with increased risks of developing colorectal cancer (CRC). Detailed mechanisms underlying this correlation, however, are yet to be explored. The present study demonstrates that insulin increases the expression of proto-oncogenes c-Myc and cyclin D1 via both translational and transcriptional mechanisms. We show here that insulin stimulates c-Myc gene translation via an Akt/PKB-dependent mechanism involving the mTOR signaling pathway. More importantly, we show for the first time that transcriptional stimulation of c-Myc and cyclin D1 expression by insulin involves a novel Akt/PKB-independent signal crosstalk between insulin and canonical Wnt signaling pathways. We then identified p21-activated protein kianse 1 (PAK-1) as a novel mediator for insulin and Wnt/beta-catenin (b-cat) molecular crosstalk, involving MEK/ERK signaling. Furthermore, we found that insulin treatment leads to increased b-cat phosphorylation at Ser675, and this is associated with increased b-cat nuclear content and increased b-cat interaction with Tcf/Lef-binding elements (TBEs) of the human c-Myc gene promoter. Lastly, we demonstrated that insulin signaling directly alters the expression levels of components of the Wnt signaling pathway, including fizzled homology 4 (Fdz-4) and TCF7L2 (=TCF-4). This study not only demonstrated the existence of signaling crosstalk between insulin and canonical Wnt signaling pathways at multiple levels, it reveals molecular mechanisms for observed correlation between CRC and hyperinsulinemia. The growing evidence implicating PAK-1 in various human tumorigenesis has emerged PAK-1 as a potential therapeutic target. Our discovery of PAK-1 functioning as a novel central mediator for insulin and Wnt signaling crosstalk in intestinal cells suggests that PAK-1 may potentially be a good target candidate for treating patients with CRC, especially those who have Type II diabetes or experience hyperinsulinemia.

Introducció: El càncer colorectal és un dels càncers més freqüentes del nostre país així com en la majoria de societats occidentals. Els factors mebiambientals juguen un paper determinant en el seu desenvolupament. Els nutrients i específicament els greixos, estarien entre els factors més destacats.Tot i que a Groenlàndia, Finlàndia i algunes zones mediterrànies, les dietes tenen un alt contingut en greix, la incidència de càncer colorrectal és relativament baixa en comparació amb la resta de països occidentals. Una important diferència dietètica és l'elevat consum de peix i oli de peix (ric en els àcids grassos n-3, eicosapentaeonic (EPA) i docosahexaenoic (DHA)) en el cas del països nòrdics i l'oli de oliva (ric en àcid oleic C18:1, n-9) a la conca mediterrània. La tesi es basa en la hipòtesi que "l'oli de peix i el d'oliva són capaços de modular el desenvolupament del càncer colorrectal.Objectius: L'objectiu de l'estudi va ser avaluar els mecanismes pels quals aquests olis realitzaven aquesta modulació i la implicació dels àcids grassos presents en aquests.Resultats: Per respondre els objectius plantejats es van utilitzar dues estratègies d'estudi. La primera es basa en estudis in vitro amb línies cel·lulars d'adenocarcinoma colorectal, Caco-2 i Ht-29. L'altra es basa en l'estudi de l'efecte dels diferents nutrients en un model animal d'inducció de la carcinogènesi colorectal. L'oli de peix i l'oli d'oliva indueixen la diferenciació en cèl·lules Caco-2. Com a resultat de la diferenciació aquestes cèl·lules comencen a expressar els enzims Sucrasa-Isomaltasa i la Dipeptidilpeptidasa IV.La regulació de l'homeòstasi del teixit colònic depèn d'una estreta relació entre la proliferació cel·lular i l'apoptosi o mort cel·lular programadaMitjançant estudis d'incorporació de timidina tritiada, hem demostrat que l'oli de peix té un important efecte inhibidor de la proliferació de les cèl·lules Caco-2 i HT-29. Sembla ser, que aquests efectes són deguts als àcids grassos n-3 EPA i DHA presents en l'oli de peix. L' efecte modulador del desenvolupament del càncer colorectal per part de l'oli de peix i del d'oliva té la seva major incidència en la inducció de l'apoptosi. L'índex d'apoptosi s'ha determinat analitzant els canvis morfològics de les cèl·lules (amb tinció DAPI). L'oli de peix, l'oli d'oliva, així com el DHA, l'EPA i l'àcid oleic són capaços d'incrementar l'apoptosi de forma molt significativa. Aquests efectes estan relacionats amb una molt ràpida inhibició de l'expressió de COX-2. L'expressió de la proteïna antipopotòtica Bcl-2 disminueix després de disminuir COX-2, fet que suggereix la implicació d'aquests dos gens en els efectes antineoplàstics produïts per aquests àcids grassos. Per altra banda es va demostrar una clara implicació de la proteïna pro-apoptòtica BAX, ja que a l'administrar un inhibidor d'aquesta, es produïa una disminució significativa de l'apoptosi.L'oli de peix i el d'oliva tenen un important efecte protector en la inducció de la carcinogènesi colorectal en animals tractats amb azoximetà. Els animals que van rebre una dieta amb oli de peix o d'oliva, com a font principal de greix, presentaven un major índex d'apoptosi. Per altra banda, l'oli de peix podria tenir un efecte preventiu al ser capaç d'incidir en la renovació de l'epiteli sa, incrementant l'apoptosi d'aquestes cèl·lules.Conclusions: L'oli de peix és capaç de modular de forma clara el desenvolupament del càncer colorectal incidint directament en els processos de diferenciació cel·lular, proliferació i apoptosi. L'oli de peix podria tenir un efecte preventiu del desenvolupament del càncer colorrectal al modificar la regeneració de l'epiteli colònic sa. L'oli d'oliva pot modular el desenvolupament del càncer colorrectal encara que no tingui el seu efecte en la totalitat dels mecanismes estudiats. / Introduction: Colorectal cancer is one of the most frequent cancers in our country as well as in most of the occidental societies. Environmental factors play a crucial role on its development. Nutrients and in concrete fat seems to be one of the most determinant components. Although relatively high fat diets are consumed in Greenland, Finland and some Mediterranean areas, colorectal cancer incidence remains relatively low there. An important difference between these regions and the rest of the western countries is the much higher consumption of fish and fish oil (rich in the n-3 fatty acids eicosapentaenoic, C20:5 and docosahexaenoic, C22:6) in the case of the Northern countries, and fish and olive oil (containing mostly oleic acid, C18:1, n-9) down in the Mediterranean basin.The hypothesis of our study was if "fish oil and olive oil are able to modulate the colorectal cancer development".Aims: The objectives of this study were to evaluate the mechanisms implicated in the modulation of cancer by these oils and determine the implications of its fatty acids.Results: In order to answer the objectives mentioned above we followed two study strategies. First, we performed: in vitro studies using adenocarcinoma cell lines, Caco-2 and Ht-29. The other one is the study of the effects of several nutrients in an animal model of carcinogenesis induction . Fish oil and olive oil induced the differentiation of Caco-2 cells. As a result of this differentiation, the cells began to express Sucrase-Isomaltase and Dipeptydilpeptidase IV enzymes.Homeostasis regulation of colonic tissue depends on a tightly relationship between cell proliferation and cell loss, through apoptosis.With [3H] thymidine incorporation studies, we demonstrated that fish oil has an important inhibitor effect on the proliferation of Caco-2 and HT-29 cells. It seems that this effect is caused by EPA i DHA (n-3 fatty acids present in fish oil). The most important effect on the development of colorectal cancer by fish oil and olive oil is the induction of apoptosis. To determine the Apoptotic index we evaluated cell morphologic changes by DAPI staining.Fish oil, olive oil, as well as DHA, EPA and oleic acid are able to increase apoptosis in a significant manner. These effects are related to a very fast inhibition of the expression of COX-2. Antipoptotic Bcl-2 protein expression decreases after Cox-2 expression inhibition, suggesting that these two genes are implicated in the antineoplastic effects. On the other hand, we demonstrated a clear implication of the proapoptotic protein BAX, because when an inhibitor of BAX was added, apoptosis significantly decreased.Fish oil and olive oil have an important protective effect in the induction of colorectal carcinogenesis in animals which received an azoximethane treatment. Animals fed with fish oil and olive oil as a principal source of fatty acids in its diet, showed a higher apoptotic index. On the other hand, fish oil may have a preventive effect due to an acceleration of the turnover of colonic epithelia through the induction of apoptosis of these cells. Conclusions: Fish oil can modulate the development of colorectal cancer in cellular differentiation, proliferation and apoptosis processes. Fish oil could have a preventive effect on the development of colorectal cancer modifying the regeneration of normal colonic epithelial. Olive oil could modulate the development of colorectal cancer although not having effects in all of the studied mechanisms.

En aquest treball hem estudiat marcadors relacionats amb el desenvolupament embrionari del colon humà com són "Sonic hedgehog" i els membres de la família CEACAM comparant els seus nivells d'expressió en mostres de colon humà embrionari, teixit tumoral i teixit normal del propi pacient de pacients diagnosticats de càncer colorectal."Sonic hedgehog" (Shh) és un morfogen que s'expressa durant les etapes inicials de l'embriogènesi. Te un paper important en les primeres fases de l'organogènesi de cervell, pulmó, pàncrees i de l'aparell gastrointestinal. Shh també presenta expressió en molts tumors d'origen endodèrmic, però el seu paper en el desenvolupament del càncer colorectal no estava encara estudiat.En el present treball hem realitzat un anàlisi morfològic de colons embrionaris , detecció per inmunohistoquímica i RT-qPCR per examinar l'expressió de Shh en colons d'entre 7 i 11 setmanes de desenvolupament així com també en teixit tumoral i normal del mateix pacient, de 63 pacients diagnosticats de càncer colorectal.Els nostres resultats ens indiquen que l'expressió de Shh comença durant la setmana 7 de desenvolupament embrionari i es detecta a la zona de l'endoderma intestinal adjacent al mesènquima. Els nivells més elevats d'expressió de mRNA Shh es detecten a la setmana 9 de desenvolupament i mitjançant inmunohistoquímica, localitzem aquesta expressió tant a epiteli intestinal com a la zona del mesènquima.Nivells baixos es detecten durant la setmana 11 de desenvolupament i, mitjançant inmunohistoquímica, aquesta expressió es detecta de manera lleu a la base de les criptes i en teixit muscular.En colon humà embrionari, l'expressió de Shh és elevada en el moment de l'organització de l'endoderma embrionari (setmana 9) i l'expressió de Shh és baixa en el moment de la diferenciació del teixit del colon (setmana 11).Mitjançant RT-qPCR veiem que els nivells de mRNA Shh en teixit tumoral són molt més elevats que els obtinguts en el cas del teixit normal (p=0.00001). Elevats nivells d'expressió s'associen amb estadis inicials (I-II) del desenvolupament d'un càncer colorectal (p=0.02).Shh pot tenir un paper important tant en l'organització embrionària del colon humà com en les primeres etapes del desenvolupament d'un càncer colorectal.Els membres de la família CEACAM (CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM67 i CEACAM8) són proteïnes de membrana que participen en processos d'immunitat i adhesió.Mitjançant RT-qPCR detectem expressió de CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6 i CEACAM7 en embrions d'entre 7 i 11 setmanes de desenvolupament. Els nivells de CEACAM6 van augmentant progressivament a mida que augmenta l'edat de l'embrió; és a dir, els seus nivells augmenten a mida que va augmentant el grau de diferenciació cel·lular de les cèl·lules que formen el colon humà embrionari.En el cas de l'anàlisi d'expressió de CEACAM5 observem que existeixen diferencies significatives entre els nivells d'expressió en teixit tumoral respecte al teixit normal (p=0.00008) i valors significatius respecte al temps a la progressió (p=0.001) i supervivència (p=0.006). / We have studied some markers related with colon development in human embryos, Shh and CEA family members, to compare their mRNA expression levels in human embryonary colon samples with adult tumor and matched normal tissue from patients affected by colorectal cancer. Sonic hedgehog (Shh) is a morphogene expressed during the early phases of embryogenesis and in the foregut development. It plays an important role in the organogenesis of the brain, lung, pancreas and gastrointestinal system. Shh is also expressed in several tumors of endodermic origin. In the present study, we used morphological analysis, real-time quantitative PCR, and immunohistochemical staining to examine Shh expression in the colon of human embryos of 7 to 11 weeks. Our results show that Shh begins to be expressed in the human colon at 7 weeks, when it is found only in the cells of the endodermal epithelium. The highest levels of Shh expression are observed at 9 weeks, in the endodermal epithelium and in the mesenchyme. At 11 weeks, the colon is morphologically differentiated, and only low levels of Shh expression are detected at the base of the colon crypts. We conclude that in the human embryonic colon, Shh is upregulated at the time of the greatest structural organization and downregulated when the colon has acquired greater morphological differentiation. We used real-time quantitative PCR to assess Shh mRNA expression levels in tumor and matched normal tissue from 57 colorectal cancer patients and correlated the results with patient clinicopathological characteristics. Shh expression levels were higher in tumor tissue than in normal tissue from the same patient (P=0.00001). Higher levels of Shh expression were associated with early stage disease (P=0.02). Shh overexpression may influence the development of colorectal cancer.CEA family members are membrane proteins involved in immunity and adhesion. Using RT-qPCR we have detected expression of CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7 in colon of human embryos between 7-11 weeks of development. mRNA CEACAM6 level increases progressively with embryonic age. CEACAM5 analysis show that high mRNA levels in tumor tissues compared with levels in normal tissues of the same patient are related with a low progression of the tumor and a higher survival.

INTRODUCCIÓ: Des de 1989, un ampli cos de literatura s'ha ocupat dels aspectes biològics i alteracions de p53, romanent encara un cert grau de controvèrsia pel que fa al valor com a factor pronòstic en càncer colorectal, de l'estudi d'aquesta proteïna. P21 i p27, inhibidors de CDKs, han estat també objecte de diverses publicacions referents al seu valor com a factors pronòstics al llarg de la passada dècada, amb conclusions igualment diverses. Ciclina E, cofactor de CDK2 durant la fase G1 del cicle, es troba expressada a uns nivells molt superiors als fisiològics en molts tumors, però la seva expressió en còlon s'ha associat més aviat a estats d'infiltració incipient que no pas a estadis avançats. El seu valor com a factor pronòstic és, novament, motiu de controvèrsia.HIPÒTESI: L'estudi d'algunes proteïnes reguladores del cicle cel.lular en càncer colorectal, ha d'aportar informació pronòstica complementària a l'estadi de Dukes.OBJECTIUS: Identificació de perfils fenotípics en l'adenocarcinoma colorectal que puguin aportar informació pronòstica suplementària a l'estudi anàtomo-patològic habitual, mitjançant l'anàlisi integrat de mutacions de p53, del polimorfisme AA 72 Arg/Pro de p53, i d'expressió de p53, p21, p27 i ciclina E. MATERIAL I MÈTODES: Sèrie consecutiva de 185 adenocarcinomes colorectals ressecats electivament. Anàlisi mutacional del exons 5-8 de p53 mitjançant PCR-SSCP i seqüenciació, i del polimorfisme Arg/Pro 72 de p53 mitjançant PCR- SSCP. Anàlisi mitjançant immunohistoquímica (IHQ) sobre seccions parafinades, de sobreexpressió de p53 i d'expressió de p21, p27 i ciclina E. Repetició de la IHQ de p21 i p27 en un array tissular.RESULTATS. Major freqüència de mutacions de p53 en els tumors GG (arg72) que en els CC (pro72) o GC. Les mutacions de p53 localitzades en L3 i LSH es van associar a pitjor supervivència global(p = 0.04; ajustada per Dukes < 0.01). La sobreexpressió IHQ de p53 va correlacionar amb l'estadi de Dukes, però no amb supervivència. Els tumors amb mutacions de p53 inhibidores de p73 van mostrar en l'anàlisi multivariant una pitjor supervivència global que els tumors amb altres mutacions (p= 0.04). En el grup de tumors GG, els carcinomes amb aquestes mutacions van tendir a una pitjor supervivència global (p= 0.08). Dins del grup de tumors GG, aquells amb mutació en L3 i LSH van mostrar al ajustar per Dukes, pitjor supervivència global que els tumors amb p53 salvatge o amb altres mutacions (p= 0.005). Aquesta correlació no es va observar dins el grup GC-CC. L'expressió IHQ de p21 es va associar a millor supervivència. També es va associar a millor supervivència lliure de malaltia en el grup de pacients que havien rebut tractament amb quimioteràpia. Els carcinomes amb mutació hot spot en L3 i LSH de p53 i pèrdua d'expressió p21 van mostrar pitjor supervivència global, fins i tot ajustant per Dukes. L'expressió de p27 va correlacionar amb millor supervivència global però de manera dependent a l'estadi de Dukes.Els carcinomes amb alt percentatge d'expressió de ciclina E van mostrar inesperadament, millor supervivència global. A més, els carcinomes amb expressió dèbil de ciclina E en més d'un 12% de nuclis van mostrar millor supervivència que aquells amb expressió nul.la o molt intensa d'aquesta proteïna.Finalment, en una sèrie de 146 adenocarcinomes curativament ressecats, l'anàlisi dels codons 245, 248, 273 i 282 de p53, i l'anàlisi IHQ de p21, es van mostrar com uns bons marcadors de supervivència global.CONCLUSIONS: En càncer colorectal, l'anàlisi dels codons 245, 248, 273 i 282 de p53, aporta informació pronòstica sobre supervivència global independent de l'estadi de Dukes.L'estudi de p21 mitjançant IHQ en carcinomes colorectals completament ressecats, és un mètode d'anàlisi senzill i econòmic, amb valor pronòstic independent de l'estadi de Dukes, i podria ser utilitzat en la pràctica assistencial. / ASSESSMENT OF THE VALUE AS PROGNOSTIC MARKERS IN COLORECTAL CANCER OF P53, P21, P27 AND CYCLIN E.ABSTRACTINTRODUCTION: The value as prognostic markers in colorectal cancer of p53, p21, p27 and cyclin E still remains controversial.HIPOTHESIS: The study of some proteins that regulate the cell cycle should give prognostic information, complementary to the Dukes' stage.AIMS: To identify phenotypical profiles in the colorectal adenocarcinoma which could give prognostic information complementary to the usual pathological study, by means of an integral analysis of p53, with assessment of mutations, protein overexpression and the AA 72 Arg/Pro polymorphism of p53, and expression analysis of p21, p27 and cyclin E. MATERIAL AND METHODS: A consecutive series of 185 colorectal cancers electively extirpated. Mutational analysis of the exons 5-8 of p53 by means of PCR-SSCP and sequencing and of the 72 Arg/Pro polymorphism by PCR-SSCP. Expression analysis by means of immunohistochemistry (IHC) on whole paraffin sections of p53, p21, p27 and cyclin E. Repetition of the IHC analysis of p21 and p27 on tissue-array sections.RESULTS: It was observed a greater frequency of p53 mutations in GG tumours (Arg 72) than in CC or GC tumours. The mutations of p53 located at the L3 loop and the LS &#61537;-helix motif was associated to a clear worse overall survival (p<0.01 adjusted by Dukes).P53 overexpression assessed by means of IHC correlated with Dukes'stage but not with survival. The tumours with mutations of p53 which inhibit p73 showed, at the multivariant analysis, a worse overall survival than the tumours with other p53 mutations (p= 0.04). Among the GG tumours, those with these mutations of p53 tended to a worse overall survival (p= 0.08). Also, in the group of GG tumours, those with p53 mutations at L3 and LSH showed, adjusting by Dukes, a worse overall survival than the tumours with other p53 mutations or wild type protein.P27 expression correlated with a better overall survival but in a depending mode with the Dukes'stage.Finally, in a series of 146 curatively extirpated tumours, the analysis of the codons 245, 248, 273 and 282, and the analysis of p21 expression by means of IHC showed to be good prognostic markers for overall survival.CONCLUSIONS: In colorectal cancer, the study of the codons 245, 248, 273 and 282 of p53, and the analysis of p21 expression, give prognostic information about overall survival independently of the Dukes'stage.

Les cèl·lules de càncer colorectal adquireixen el fenotip tumoral mitjançant l'acumulació de mutacions en gens específics. Les mutacions més prevalents en el càncer de còlon es produeixen en el gen APC i indueixen l'acumulació de beta-catenina nuclear. Però la transcripció depenent de beta-catenina no és l'únic requeriment per la progressió del càncer colorectal ja que la inhibició de l'activitat gamma-secretasa redueix la tumorigènesi en ratolins APCmin/+. En canvi, l'activació de Notch a l'intestí resulta en un bloqueig de la diferenciació de cèl·lules secretores i una expansió dels progenitors immadurs.A més dels factors de transcripció, existeixen complexes multiproteics, que inclouen corepressors nuclears (NCoRs), com N-CoR i SMRT, i deacetilases d'histones (HDAC) responsables dels silenciament específic de grups de gens, mitjançant el qual regulen processos cel·lulars molt important com són la diferenciació cel·lular, el desenvolupament embrionari i l'homeòstasi tissular.La via de transducció de la senyal d'NFkappaB està implicada en la resposta immune i inflamatòria així com en el desenvolupament de tumors de mama, fetge, i intestí. Aquesta via s'activa, en resposta a estímuls, a través del complex IKK, que fosforila el repressor d'NFkappaB, IkappaB, induint la seva degradació pel proteosoma, la translocació a nucli d'NFkappaB i l'activació del programa gènic corresponent.Recentment s'han identificat altres funcions per a les proteïnes IKKs, diferents a les anteriorment descrites. Algunes d'aquestes funcions tenen lloc a nivell de la cromatina i inclouen, entre d'altres, la fosforilació de la H3 y la fosforilació del repressor nuclear SMRT.Treballs previs del nostre laboratori demostren que tant la IKKalpha com la IKKbeta és recluten al promotor de hes1 i herp2 en resposta a l'activació per TNFalpha. Aquest reclutament coincideix amb l'alliberament de complexes repressors formats per IkappaBalpha y HDACs, així com amb l'activació transcripcionals d'aquests gens.L'objectiu principal de la meva tesi ha estat determinar si les IKK juguen algun paper en la regulació dels gens diana de Notch en les cèl·lules de càncer colorectal, i si aquest és el cas, determinar quins són els mecanismes d'activació de les IKK en aquestes cèl·lules i les seves implicacions en el desenvolupament del procés tumoral. Els nostres resultats demostren que les cèl·lules de càncer de còlon presenten una activació anòmala d'IKKalpha a nivell nuclear fosforila al repressor transcripcional SMRT. Hem descrit que en aquestes cèl·lules, la IKK es troba associada de forma específica als promotors de gens de la família de Notch tals com hes1, herp2 i hes5, coincidint amb l'alliberament del repressor SMRT d'aquest promotors i amb la seva activació transcripcional. La inhibició de l'activitat IKK restableix l'associació d'SMRT als promotors reprimint la seva activació. Això és concomitant amb una disminució de la proliferació i un increment de l'apoptosi en les cèl·lules de càncer de còlon. El tractament amb inhibidors de la IKK disminueix el creixement de tumors implantats en ratolins immunodeprimits. A més, també hem demostrat que l'activitat IKKalpha nuclear de les cèl·lules de càncer de còlon també fosforila el repressor N-CoR, un homòleg d'SMRT, induint el seu export al citoplasma cel·lular.Actualment, el projecte està focalitzat en determinar els mecanismes que indueixen l'activació de la IKKalpha en el càncer colorectal. Els resultats més recents indiquen que en les cèl·lules de càncer de còlon podria haver una forma truncada de la proteïna, que no té els dominis necessaris pel seu manteniment a citoplasma però que conserva el domini quinasa intacte. Els nostres esforços es centren en caracteritzar bioquímicament aquesta forma així com en determinar la seva funció pro-tumorogènica. Tenim alguns resultats preliminars que suggereixen que la forma truncada de la IKKalpha podria ser el resultat de la degradació parcial pel proteosoma, dependent d'ubiqüitinació, de la IKKalpha sencera (FL-IKKalpha). Les dades que tenim suggereixen que les característiques bioquímiques d'aquesta forma truncada d'IKKalpha difereixen de les de la FL-IKKalpha, i que això determina que les seves funcions siguin també diferents. En aquest sentit, creiem que mentre FL-IKKalpha és qui forma part del complex de quinases reguladores de la via NFkappaB, la IKKalpha truncada podria ser la responsable de la fosforilació de repressors nuclears. Més important encara, creiem que aquesta forma truncada coopera amb K-Ras més eficientment que la forma sencera en la generació de focus de transformació en cèl·lules NIH-3T3, suggerint que la forma truncada de la IKKalpha té potencial tumorigènic. / Colorectal cancer cells accumulate multiple mutations in specific sets of genes. Mutation of adenomatous polyposis coli (APC) that leads to the accumulation of nuclear beta-catenin, is the most prevalent event in these multistep process. However, not only beta-catenindependent transcription is required for colorectal cancer progression, because abrogation of the Notch pathway prevents tumorigenesis in APCmin/+ mice whereas activation of Notch results in the expansion of the progenitor compartment in the intestine.NFkappaB signalling pathway is involved in inflammatory and immune response as well as in tumour development in breast, liver and intestine. The NFkappaB signalling pathway is activated in response to different stimuli that induce the activation of the IKK complex, that phosphoylates the NFkappaB inhibitor, IkappaBalpha permitting the NFkappaB-dependent transcription.Recently, chromatin associated functions for IKK have been described, resulting in the transcriptional activation of NFkappaB dependent and independent genes.We have described that colorectal tumour cells have and aberrant nuclear IKKalpha activity that phosphorylates Nuclear Co-repressors (NCoRs), inducing its cytoplasmic export and the derepression of different genes, among them the Notch target genes: hes1, herp2 and hes5, that are related with the maintenance of the undifferentiated phenotype of intestinal cells.In addition, we have demonstrated that IKK activity restores the normal expression of these Notch target genes and decrease the proliferation of tumour cells "in vitro" and "in vivo". However, the IKK inhibitors can not be used as therapeutically agents due to their toxicity derived from the total inhibition of NFkappaB signalling. For this reason is crucial to define the tumorigenic properties of IKK proteins, in order to specifically inhibit them, without affecting the IKK physiological role.Nowadays, the project is focused in determining how the IKKalpha is activated in colorectal cancer. Our preliminary results suggest that colorectal cancer cells contain a truncated form of IKKalpha that when becomes activated preferentially localizes in the nucleus and differs from the full-length form in several biochemical and functional properties. This truncated IKKalpha does not participate in the activation of NFkappaB but displays specific activities that have been associated with cancer such as phosphorylation of the nuclear co-repressors. Moreover, expression of the truncated IKKalpha, but not the full-length IKKalpha, increases the transformation capacity of k-ras in NIH-3T3, suggesting a tumorigenic potential for this IKKalpha isoform.

Human telomerase is a reverse transcriptase which synthesizes telomeric repeat sequences at the ends of chromosomes. The telomerase enzyme has two essential subunits to be functional which are called telomerase reverse transcriptase (hTERT) and human telomerase RNA (hTR). Telomerase uses its RNA subunit as a template for the addition of hexameric repeats at the ends of chromosomes. The activity of telomerase has been detected in immortal cells but not in most normal somatic cells. Therefore, its activity could serve as diagnostic or prognostic marker in malignancies. Telomeres are heterochromatic DNA sequences bound by a number of telomere binding proteins in order to maintain the stability of chromosomes. Protection of telomere 1(POT1) is a single stranded telomere binding protein which is thought to have significant role in the recruitment of telomerase to telomeres. The objective of the current study to investigate telomerase activity and gene expression of hTERT and hPOT1 in human colorectal cancer tissues. The activity of telomerase was examined in colorectal tumors and normal adjacent specimens by and improved telomeric repeat amplification protocol (TRAP)-Silver Staining Assay. The expression levels of hTERT and hPOT1 genes was analysed by qPCR. The results showed that colorectal cancer tumors showed significantly high telomerase activity whereas normal adjacent tissues were found to be telomerase negative. Among clinicopathological parameters / the stage, histological type, distant metastasis and lymph node metastasis status of tumors were found to show significant differences in terms of telomerase activity. Moreover, the expression of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) was found to be overexpressed in tumor tissues compared to normal adjacent tissues. Likewise, colorectal tumors expressed high level of hPOT1 compared to normal tissues. Both the expression of hTERT and hPOT1 correlated with telomerase activity. It can be concluded from the results of the current study that high telomerase activity and overexpression of hTERT and hPOT1, may indicate that they could serve as diagnostic or prognostic indicators in colorectal cancer.