Submitted by Maykon Nascimento (maykon.albani@hotmail.com) on 2016-04-19T19:29:13Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Brunelli da Ros Peruch.pdf: 2030986 bytes, checksum: e3a8a297af1545064ffae36bc7953baa (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barros (patricia.barros@ufes.br) on 2016-06-27T18:02:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Brunelli da Ros Peruch.pdf: 2030986 bytes, checksum: e3a8a297af1545064ffae36bc7953baa (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T18:02:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Brunelli da Ros Peruch.pdf: 2030986 bytes, checksum: e3a8a297af1545064ffae36bc7953baa (MD5) / FAPES / Introdução. O acidente vascular encefálico (AVE) é classicamente caracterizado como um déficit neurológico atribuído a uma lesão focal aguda do sistema nervoso central (SNC), por causa vascular, sendo uma das principais causas de invalidez e morte mundial. De todos os casos, 87% são de origem isquêmica. Os principais fatores de risco associados são idade, raça, aterosclerose, hiperlipidemia, tabagismo e outros. Até a presente data a terapia medicamentosa aprovada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e pelo Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento do AVE isquêmico agudo é a utilização da classe dos agentes trombolíticos ativadores da fibrinólise. Várias citocinas parecem desempenhar um papel na neurogênese e/ou regeneração neuronal. Recentemente, estudos demonstraram que o fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) possui efeitos neuroprotetores em camundongos submetidos à isquemia cerebral, porém seus efeitos frente ao aumento do estresse oxidativo e à hipercolesterolemia/aterosclerose, uma das principais causas de AVE, ainda é desconhecido e foi o objeto deste estudo. Métodos. Foram utilizados camundongos knockout para a apolipoproteína E (ApoE-/-) e C57BL/6 machos, adultos jovens, com idade variando entre 12-14 semanas e pesando em média 28 g divididos em três grupos: controle ApoE-/-, tratado G-CSF ApoE-/- e controle C57BL/6. Todos os animais foram submetidos a oclusão das artérias carótidas comuns direita (temporária) e esquerda (permanente) seguida de administração de solução glicosada 5% (controles) e G-CSF 100μg/kg/dia (tratado) logo após e 24h depois da cirurgia. No terceiro dia após a oclusão os animais foram sacrificados e foi obtido o peso úmido do baço, coletada amostra de sangue e extraído o cérebro. As comparações estatísticas foram realizadas por teste t de Student e ANOVA de 1 via, seguida do post hoc de Fisher. Resultados e Discussão. A contagem de leucócitos circulantes no grupo G-CSF ApoE-/- apresentou-se estatisticamente superior (6661±1059 céls/mm3) quando comparado ao grupo controle ApoE-/- (4044±610 céls/mm3) e ao grupo controle C57BL/6 (3965±409 céls/mm3) evidenciando o efeito sistêmico do G-CSF no recrutamento e maturação de granulócitos sanguíneos. Na dosagem do colesterol total plasmático o G-CSF não reverteu a hipercolesterolemia dos animais ApoE-/-. A área macroscópica de infarto cerebral foi significativamente menor no grupo ApoE-/- tratado com G-CSF (0,03±0,01 cm2) quando comparado com o grupo ApoE-/- controle (0,18±0,03 cm2). Observou-se ainda diferença significativa quando comparamos a área de infarto do grupo controle C57BL/6 (0,08±0,02 cm2) com o grupo controle ApoE-/-. A força muscular, medida através do teste do agarre (grip force), estava significativamente diminuída nos animais controle ApoE-/- 48h pós-cirurgia quando comparados aos controles pré-cirúrgicos (de 97,9±9,8g para 70,69±10,62g), enquanto que no grupo G-CSF ApoE-/- a força registrada antes da cirurgia foi preservada no pós-cirúrgico. No ensaio para o estresse oxidativo plasmático o tratamento com G-CSF não alterou os parâmetros nos grupos ApoE-/- (controle = 23,76 ± 3,36 vs G-CSF = 23,0 ± 3,20 μMC-T/mg) que estavam estatisticamente aumentados quando comparados ao grupo controle C57BL/6 (3,97 ±1,22 μMC-T/mg). O teste do TUNEL (TdT-mediated-dUtp Nick End Labeling), para evidenciar a morte celular tecidual mostrou relação de células positivas/negativas menor no grupo tratado ApoE-/- quando comparado ao grupo controle ApoE-/-. A imunomarcação de neurônios e receptores de G-CSF mostrou estimulo a sobrevivência neuronal e maior presença de receptores no grupo tratado quando comparado ao controle. Conclusão. Nossos achados estão de acordo com a literatura e contribuem para evidenciar o efeito neuroprotetor do G-CSF, fortemente ligado a propriedade antiapoptótica, em modelo de isquemia cerebral global mesmo na presença do principal fator de risco para o AVE, a aterosclerose/hipercolesterolemia, e do aumento do estresse oxidativo. / Introduction. The stroke is classically characterized as a neurological deficit attributed to an acute focal lesion of the central nervous system (CNS), for vascular cause, and a major cause of disability and death worldwide. In all cases, 87% are ischemic. The main risk factors are age, race, atherosclerosis, hyperlipidemia, smoking, and others. To date drug therapy approved by the National Health Surveillance Agency (ANVISA) and the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute ischemic stroke is the use of the class of thrombolytic agents activators of fibrinolysis. Several cytokines appear to play a role in neurogenesis and /or neuronal regeneration. Recent studies have demonstrated that granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) has neuroprotective effects in mice subjected to cerebral ischemia, but its effects opposite to increased oxidative stress and hypercholesterolemia/atherosclerosis, a major cause of stroke, although is unknown and was the object of this study. Methods. Were used apolipoprotein E knockout (ApoE-/-) and C57BL/6 mice, male, young adults, aged between 12-14 weeks and weighing on average 28 g divided into three groups: control ApoE-/-, treated G-CSF ApoE-/- and control C57BL/6. All animals underwent occlusion of common carotid arteries (temporary) and left (standing) then administration of glucose solution 5% (controls) and G-CSF 100μg/kg/day (treated) just after and 24 hours following surgery. On the third day after occlusion the animals were sacrificed and the wet weight was obtained from the spleen, blood sample collected and extracted the brain. Statistical comparisons were performed by test t Student's and ANOVA 1 way, followed by Fisher's post hoc. Results and discussion. The count of circulating leukocytes in the G-CSF ApoE-/- group was statistically higher (6661 ± 1059 cells/ mm3) compared to the control ApoE-/- group (4044 ± 610 cells/mm3) and the control C57BL/6 group (3965 ± 409 cells/mm3) highlighting the systemic effect of G-CSF in the recruitment and maturation of blood granulocytes. In the measurement of plasma total cholesterol G-CSF did not reverse the hypercholesterolemia in ApoE-/- animals. The macroscopic area of cerebral infarction was significantly lower in group ApoE-/- treated with G-CSF (0.03 ± 0.01 cm2) compared with the group ApoE-/- control (0.18 ± 0.03 cm2). There was also significant difference in the infarcted area of control C57BL/6 group (0.08 ± 0.02 cm2) with the control ApoE-/- group. Muscle strength, measured by the grip test, was significantly reduced in ApoE-/- control animals 48 hours after surgery compared to preoperative controls (97.9 ± 9.8g for 70.69 ± 10,62g), while the group G-CSF ApoE-/- force recorded before surgery was preserved after surgery. In the assay for oxidative stress plasma treatment with G-CSF did not change the group parameters in ApoE-/- (control = 23,76±3,36 vs G-CSF = 23,0±3,20 μMC-T/mg) which was statistically increased compared to the C57BL/6 control group (3.97 ± 1.22 μMC-T/mg). The test TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End Labeling), to show the tissue cell death was related to positive cells/negative less in the group treated ApoE-/- as compared to the control group ApoE-/-. The immunostaining of neurons and G-CSF receptor showed stimulation for neuronal survival and increased presence of receptors in the treated group compared to the control. Conclusion. Our findings are in agreement with the literature and contribute to highlight the neuroprotective effect of G-CSF, strongly linked to antiapoptotic property in global cerebral ischemia model even in the presence of the major risk factor for stroke, atherosclerosis/hypercholesterolemia, and of increased oxidative stress.

A fototerapia com laser em baixa intensidade tem sido utilizada na odontologia em várias patologias bucais para o controle de dor e cicatrização. O objetivo do estudo foi comparar o efeito da fototerapia no crescimento de fibroblastos de polpa dentária humana usando irradiações com energia total aplicada de uma vez ou fracionada. Após a determinação da metodologia, a linhagem celular FP5 (1 x 103 células por poço) cresceu em placas de cultivo de 96 poços (1 para cada grupo experimental) em déficit nutricional (meio suplementado com 5 % de SFB). A irradiação laser foi realizada com laser de diodo InGaAlP (comprimento de onda 685 nm, 40mW, área do feixe 0,0028cm2) usando a técnica pontual, no modo contínuo e em contato. As energias totais foram aplicadas em irradiações únicas de 0,12 J (G1), 0,24J (G2), 0,36 J (G3). Essas energias totais foram fracionadas em múltiplas irradiações de 0,12 feitas com intervalos de 6 horas: duas para G4 e três para G5. Grupos não irradiados de células cultivadas em déficit nutricional (5 % SFB, G6) e em condições nutricionais regulares (10 % SFB, G7) foram usadas como controles negativo e positivo respectivamente. O número de células foi indiretamente obtido pela mensuração da atividade celular mitocondrial 24 horas após a primeira irradiação. Os dados em quadruplicata foram comparados pelo teste ANOVA complementado pelo teste de Tukey (p <= 0,05). Houve diferença significante entre os grupos. O controle positivo (G7) apresentou número de células significantemente maior quando comparado ao controle negativo (G6). Esse número foi similar aos dos grupos submetidos a irradiações múltiplas (G4 e G5). Os grupos irradiados uma única vez (G1 a G3) apresentaram número de células significantemente menores que aqueles do controle positivo e dos grupos com múltiplas irradiações. Com base na metodologia empregada concluiu-se que o fracionamento das energias de irradiação potencializa o efeito bioestimulador da fototerapia com laser em baixa intensidade no crescimento de fibroblastos de polpa dentária humana. / Phototherapy with low intensity lasers has been used in dentistry in several oral pathologies for pain and healing control. The aim of this study was to compare the effect of phototherapy on human dental pulp fibroblasts growth using irradiations with whole energy delivered at once or fractioned. After the determination of the methodology, the FP5 cell line (1x 103 cells per well) was grown in 96 wells-microtritation plates (one for each experimental group) in nutritional deficit (medium supplemented with 5% fetal bovine serum-fbs). Laser irradiation was carried out with an InGaAlP diode laser (?-685nm, 40 mW, spot size 0.028 cm2) using the punctual technique, at continuous mode and in contact. The whole energies were delivered in single irradiations of 0.12J (G1), 0.24J (G2), 0.36J (G3). These whole energies were fractioned in multiple irradiations of 0.12J done with 6h-intervals: two for G4 and three for G5. Non-irradiated groups of cell cultured in nutritional deficit (5% fbs; G6) and in nutritional regular condition (10 % fbs; G7) were used as negative and positive controls, respectively. The number of cells was indirectly assessed by measuring the cell mitochondrial activity 24 hours after the first irradiation. The data from four replicates were compared by the ANOVA complemented by the Tukey\'s test (p <= 0.05). There were significant differences amongst the groups. The positive control (G7) presented significantly higher number of cells when compared to the negative control (G6). This number was similar to those of multiple irradiation groups (G4 and G5). The single irradiated groups (G1 to G3) presented cell numbers significantly smaller than those of positive control and multiple irradiated groups. Under the conditions of this study it was concluded that multiple irradiations of fractioned energies improve the biostimulatory effect of the phototherapy with low intensity laser on the growth of dental pulp fibroblasts.

A fototerapia com laser em baixa intensidade tem sido utilizada na odontologia em várias patologias bucais para o controle de dor e cicatrização. O objetivo do estudo foi comparar o efeito da fototerapia no crescimento de fibroblastos de polpa dentária humana usando irradiações com energia total aplicada de uma vez ou fracionada. Após a determinação da metodologia, a linhagem celular FP5 (1 x 103 células por poço) cresceu em placas de cultivo de 96 poços (1 para cada grupo experimental) em déficit nutricional (meio suplementado com 5 % de SFB). A irradiação laser foi realizada com laser de diodo InGaAlP (comprimento de onda 685 nm, 40mW, área do feixe 0,0028cm2) usando a técnica pontual, no modo contínuo e em contato. As energias totais foram aplicadas em irradiações únicas de 0,12 J (G1), 0,24J (G2), 0,36 J (G3). Essas energias totais foram fracionadas em múltiplas irradiações de 0,12 feitas com intervalos de 6 horas: duas para G4 e três para G5. Grupos não irradiados de células cultivadas em déficit nutricional (5 % SFB, G6) e em condições nutricionais regulares (10 % SFB, G7) foram usadas como controles negativo e positivo respectivamente. O número de células foi indiretamente obtido pela mensuração da atividade celular mitocondrial 24 horas após a primeira irradiação. Os dados em quadruplicata foram comparados pelo teste ANOVA complementado pelo teste de Tukey (p <= 0,05). Houve diferença significante entre os grupos. O controle positivo (G7) apresentou número de células significantemente maior quando comparado ao controle negativo (G6). Esse número foi similar aos dos grupos submetidos a irradiações múltiplas (G4 e G5). Os grupos irradiados uma única vez (G1 a G3) apresentaram número de células significantemente menores que aqueles do controle positivo e dos grupos com múltiplas irradiações. Com base na metodologia empregada concluiu-se que o fracionamento das energias de irradiação potencializa o efeito bioestimulador da fototerapia com laser em baixa intensidade no crescimento de fibroblastos de polpa dentária humana. / Phototherapy with low intensity lasers has been used in dentistry in several oral pathologies for pain and healing control. The aim of this study was to compare the effect of phototherapy on human dental pulp fibroblasts growth using irradiations with whole energy delivered at once or fractioned. After the determination of the methodology, the FP5 cell line (1x 103 cells per well) was grown in 96 wells-microtritation plates (one for each experimental group) in nutritional deficit (medium supplemented with 5% fetal bovine serum-fbs). Laser irradiation was carried out with an InGaAlP diode laser (?-685nm, 40 mW, spot size 0.028 cm2) using the punctual technique, at continuous mode and in contact. The whole energies were delivered in single irradiations of 0.12J (G1), 0.24J (G2), 0.36J (G3). These whole energies were fractioned in multiple irradiations of 0.12J done with 6h-intervals: two for G4 and three for G5. Non-irradiated groups of cell cultured in nutritional deficit (5% fbs; G6) and in nutritional regular condition (10 % fbs; G7) were used as negative and positive controls, respectively. The number of cells was indirectly assessed by measuring the cell mitochondrial activity 24 hours after the first irradiation. The data from four replicates were compared by the ANOVA complemented by the Tukey\'s test (p <= 0.05). There were significant differences amongst the groups. The positive control (G7) presented significantly higher number of cells when compared to the negative control (G6). This number was similar to those of multiple irradiation groups (G4 and G5). The single irradiated groups (G1 to G3) presented cell numbers significantly smaller than those of positive control and multiple irradiated groups. Under the conditions of this study it was concluded that multiple irradiations of fractioned energies improve the biostimulatory effect of the phototherapy with low intensity laser on the growth of dental pulp fibroblasts.

A produção de biofármacos segue um crescente interesse industrial e social. Atualmente existem vários tipos de tratamento contra o câncer, porém, a maioria desses tratamentos não atua unicamente no alvo terapêutico. Um estudo realizado por pesquisadores do Instituto Butantan identificou uma proteína com ação anticoagulante e antitumoral, codificada por um gene proveniente das glândulas salivares do carrapato Amblyoma cajennense . Esse gene foi inserido em um plasmídeo e expresso com sucesso na bactéria Escherichia coli BL21DE3. Estudos pré-clínicos mostraram que a injeção in vivo de Amblyomin-X reduziu a formação de massa tumoral induzida por células de melanoma B16F10 em camundongos. Este trabalho contempla o estudo das condições de cultivo para obtenção da proteína Amblyomin-X com a linhagem Escherichia coli BL21DE3 recombinante em biorreatores. Para se determinar a melhor condição de biossíntese da proteína recombinante Amblyomin-X estabeleceu-se uma estratégia de cultivo para a etapa de crescimento do microrganismo e estudaram-se três diferentes fatores na etapa posterior à do crescimento microbiano, ou seja, na etapa de biossíntese da proteína: i) a concentração do indutor IPTG (Isopropil &#946;-D-1-tiogalactopiranosídeo) no momento de indução da proteína; ii) a temperatura de cultivo durante a etapa de biossíntese da proteína; e iii) a concentração celular no início da etapa de biossíntese da proteína. Para a realização dos ensaios foi proposto um planejamento experimental delineamento composto central rotacional (DCCR) escolhido para os três fatores em estudo e resultou na condução de 17 ensaios. Os ensaios foram realizados com a estratégia de condução proposta, mantendo o valor de &#956x entre 0,20 e 0,23 h-1 na etapa de batelada alimentada, o que possibilitou atingir a concentração celular desejada com a formação de ácido acético em concentrações não inibitórias. Como resultado do planejamento experimental, a obtenção dos valores ótimos dos fatores para a etapa de produção da proteína: temperatura de 38 &#176;C, concentração celular de 35,27 g/L e concentração do indutor IPTG de 0,10 mM resultou em um protocolo de processo que obteve 8,07 g/L de proteína recombinante, valor máximo obtido e validado. / The production of biopharmaceuticals follows an increasing industrial and social interest. Currently there are several types of cancer treatment, however, most of these treatments do not only act on the therapeutic target. A study by researchers at the Butantan Institute identified a protein with anticoagulant and antitumor action, encoded by a gene from the salivary glands of the Amblyoma cajennense tick. This gene was inserted into a plasmid and successfully expressed on the bacterium Escherichia coli BL21DE3. Preclinical studies have shown that the in vivo injection of Amblyomin-X reduced the tumor mass formation induced by B16F10 melanoma cells in mice. This work includes the study of the culture conditions to obtain Amblyomin-X protein with the recombinant Escherichia coli strain BL21DE3 in bioreactors. In order to determine the best biosynthesis condition of the recombinant Amblyomin-X protein, a culture strategy was established for the growth stage of the microorganism and three different factors were studied in the post-microbial growth stage, that is, in the biosynthesis stage of the protein: i) the concentration of the IPTG (Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside) inducer at the time of induction of the protein; ii) the culture temperature during the protein biosynthesis step; and iii) the cell concentration at the beginning of the protein biosynthesis step. For the accomplishment of the tests it was proposed an experimental design - central rotational compound design (DCCR) - chosen for the three factors under study and resulted in the conduction of 17 tests. The tests were performed with the proposed conduction strategy, maintaining the value of &#181; &x between 0.20 and 0.23 h-1 in the fed batch stage, which allowed to reach the desired cellular concentration with the formation of acetic acid in non-inhibitory concentrations. As a result of the experimental design, obtaining the optimum values of the factors for the protein production step: temperature of 38 &#176;C, cell concentration of 35.27 g/L and concentration of the IPTG inductor of 0.10 mM resulted in a process protocol which obtained 8.07 g / L of recombinant protein, maximum value obtained and validated.

A menopausa, fenômeno fisiológico que ocorre em todas as mulheres, em média, aos 51 anos, é acompanhada em cerca de 80% dos casos de sintomas como fogachos, secura vaginal, irritabilidade e insônia, que interferem na qualidade de vida e na produtividade socioeconômica das mulheres, além de predispô-las a doenças crônico-degenerativas, como arteriosclerose, obesidade e distúrbios cardiovasculares. A terapia de reposição hormonal à base de estrógenos, que visa reduzir os incômodos da menopausa, está associada ao aumento do risco de câncer de mama e do endométrio, como foi demonstrado em estudos científicos. Considerando que as mulheres orientais, consumidoras de soja, apresentam doenças crônico-degenerativas e câncer em taxas inferiores às dos países ocidentais, as isoflavonas da soja têm sido testadas em estudos clínicos e experimentais, porém com obtenção de dados até contraditórios. O presente estudo investigou o efeito da administração crônica de isoflavonas de soja no útero, mamas e tecidos adiposo e ósseo de ratas ovariectomizadas. Quarenta ratas Wistar adultas foram distribuídas em quatro grupos experimentais: a) ovariectomizadas: grupo ISO, recebendo isoflavonas de soja (100mg/kg/dia/v.o.); b) ovariectomizadas: grupo BE, recebendo benzoato de estradiol (10g/kg/dia/s.c.); c) ovariectomizadas: grupo OVX, recebendo salina (0,1ml/100g/dia/v.o.); d) controles: grupo FO, recebendo salina (0,1ml/100g/dia/v.o.). Antes e durante os 90 dias de tratamento, foram analisados os esfregaços vaginais, para acompanhamento do ciclo estral, determinação do peso corporal e do consumo de ração semanal. Após esse período, os animais foram anestesiados e o sangue coletado para análise de estradiol e progesterona séricos, por radioimunoensaio; e lipidograma e glicose, por espectrofotometria. Posteriormente, os animais foram sacrificados e necropsiados, coletando-se o útero, mamas, gordura intra-abdominal e fêmur para macroscopia e pesagem. Os tecidos selecionados para o estudo foram corados em HE, analisados por microscopia óptica e histomorfometria, visando investigar alterações do crescimento celular (software V.S NIH Image-J; imagens digitais-optronicos CCD). No grupo tratado com isoflavonas, o peso corporal diminuiu em relação OVX, no qual ocorreu aumento de peso em comparação aos animais falso-operados. O exame macroscópico revelou que o útero diminuiu de peso nas ratas do grupo ISO, semelhante às do OVX. Além disso, a histopatologia das glândulas endometriais não mostrou alterações entre os grupos ISO e OVX. Contudo, o grupo BE apresentou proliferação glandular, pseudoestratificação epitelial, frequentes mitoses típicas, metaplasia escamosa, infiltrado eosinofílico e hidrométrio. A concentração de estradiol no grupo ISO foi semelhante à do OVX. Porém, no grupo BE, o estradiol e o peso uterino apresentaram-se aumentados em relação ao OVX. Não foram observadas diferenças na histomorfometria mamária entre os grupos. Houve redução no peso do tecido adiposo abdominal no grupo ISO, comparado com o OVX, sem identificação de alterações morfológicas significativas, apenas hipotrofia celular, confirmada pela histomorfometria. Apesar de não ter havido diferenças na concentração de glicose, colesterol total e triglicerídeos, entre os grupos, o colesterol-HDL apresentou aumento no grupo ISO. Não houve diferença na densitometria do fêmur entre os grupos avaliados. Esses resultados indicam que o tratamento crônico com isoflavonas de soja, na dose testada, não induz mudanças significativas no útero, mamas e tecidos adiposo e ósseo, sugerindo segurança no tratamento, sem risco para o desenvolvimento de câncer. / Menopause, physiological phenomenon that occurs in all women, average age 51, is accompanied by about 80% of cases symptoms such as hot flashes, vaginal dryness, irritability and insomnia, which affect the quality of life and socioeconomic productivity women's, and predispose them to chronic degenerative diseases such as atherosclerosis, obesity and cardiovascular disorders. The hormone replacement therapy based on estrogen, which aims to reduce the discomforts of menopause is associated with an increased risk of endometrial and breast cancer, as has been shown in scientific studies. Whereas that women, consuming soy, had lower rates of chronic degenerative diseases and cancer at rates lower than those of Western countries, soy isoflavones have been tested in clinical and experimental studies, but with contradictory results. The present study investigated the effect of chronic administration of soy isoflavones on the uterus, breast, bone and adipose tissues from ovariectomized rats. Forty female Wistar rats were divided into four groups: a) ovariectomized: ISO group receiving soy isoflavones (100mg/kg/dia/vo); b) ovariectomized: EB group receiving estradiol benzoate (10&#956;g/kg/dia/sc); c) ovariectomized: OVX group receiving saline (0.1 ml/100g/dia/vo); d) controls: FO group, receiving saline (0.1 ml/100g/dia/vo). Before and during the 90 days of treatment vaginal smears were analyzed to monitor the estrous cycle, given the body weight and food intake monitored weekly. After this period, the animals were anesthetized and blood was collected for analysis of serum estradiol and progesterone serum by radioimmunoassay, and lipid and glucose by spectrophotometry. Subsequently, the animals were euthanized and necropsied, collecting the uterus, breasts, intra-abdominal fat and femur for macroscopic exam and weighing. The tissues selected for the study were stained with HE and analyzed by light microscopy and histomorphometry, in order to investigated possible changes in cell growth (NIH Image software VS-J;-optronics CCD digital images). In the group treated with isoflavones a decrease in body weight decreased compared OVX in which there was an increase in weight compared to the false-operated animals. Macroscopically, the uterus weight was lower in ISO group, similar to the OVX group. Furthermore, no change was showed in the histopathology of endometrial glands between ISO and OVX groups. The EB group showed glandular proliferation, pseudo-stratified epithelium, frequent mitoses typical squamous metaplasia, and eosinophilic infiltrate and hidrometry. The estradiol concentration in the ISO group was similar to OVX. However, EB group showed increase in estradiol and uterine weight in relation to OVX. No differences in mammary histomorphometry were observed among the four groups. Fat abdominal tissue weight was lower in ISO group compared with OVX group but, no morphological changes were seen on microscopy, only a cellular hipertrophy confirmed by histomorphometry. Although there were no differences in the glucose concentration, total cholesterol and triglycerides among groups, the cholesterol-HDL was increased in the group ISO. There was no difference in femur density among the groups. These results indicate that chronic treatment with soy isoflavones, at the tested dose did not induce significant changes in the uterus, breast, bone and adipose tissues, suggesting safety in handling without risk for development of cancer.

A menopausa, fenômeno fisiológico que ocorre em todas as mulheres, em média, aos 51 anos, é acompanhada em cerca de 80% dos casos de sintomas como fogachos, secura vaginal, irritabilidade e insônia, que interferem na qualidade de vida e na produtividade socioeconômica das mulheres, além de predispô-las a doenças crônico-degenerativas, como arteriosclerose, obesidade e distúrbios cardiovasculares. A terapia de reposição hormonal à base de estrógenos, que visa reduzir os incômodos da menopausa, está associada ao aumento do risco de câncer de mama e do endométrio, como foi demonstrado em estudos científicos. Considerando que as mulheres orientais, consumidoras de soja, apresentam doenças crônico-degenerativas e câncer em taxas inferiores às dos países ocidentais, as isoflavonas da soja têm sido testadas em estudos clínicos e experimentais, porém com obtenção de dados até contraditórios. O presente estudo investigou o efeito da administração crônica de isoflavonas de soja no útero, mamas e tecidos adiposo e ósseo de ratas ovariectomizadas. Quarenta ratas Wistar adultas foram distribuídas em quatro grupos experimentais: a) ovariectomizadas: grupo ISO, recebendo isoflavonas de soja (100mg/kg/dia/v.o.); b) ovariectomizadas: grupo BE, recebendo benzoato de estradiol (10g/kg/dia/s.c.); c) ovariectomizadas: grupo OVX, recebendo salina (0,1ml/100g/dia/v.o.); d) controles: grupo FO, recebendo salina (0,1ml/100g/dia/v.o.). Antes e durante os 90 dias de tratamento, foram analisados os esfregaços vaginais, para acompanhamento do ciclo estral, determinação do peso corporal e do consumo de ração semanal. Após esse período, os animais foram anestesiados e o sangue coletado para análise de estradiol e progesterona séricos, por radioimunoensaio; e lipidograma e glicose, por espectrofotometria. Posteriormente, os animais foram sacrificados e necropsiados, coletando-se o útero, mamas, gordura intra-abdominal e fêmur para macroscopia e pesagem. Os tecidos selecionados para o estudo foram corados em HE, analisados por microscopia óptica e histomorfometria, visando investigar alterações do crescimento celular (software V.S NIH Image-J; imagens digitais-optronicos CCD). No grupo tratado com isoflavonas, o peso corporal diminuiu em relação OVX, no qual ocorreu aumento de peso em comparação aos animais falso-operados. O exame macroscópico revelou que o útero diminuiu de peso nas ratas do grupo ISO, semelhante às do OVX. Além disso, a histopatologia das glândulas endometriais não mostrou alterações entre os grupos ISO e OVX. Contudo, o grupo BE apresentou proliferação glandular, pseudoestratificação epitelial, frequentes mitoses típicas, metaplasia escamosa, infiltrado eosinofílico e hidrométrio. A concentração de estradiol no grupo ISO foi semelhante à do OVX. Porém, no grupo BE, o estradiol e o peso uterino apresentaram-se aumentados em relação ao OVX. Não foram observadas diferenças na histomorfometria mamária entre os grupos. Houve redução no peso do tecido adiposo abdominal no grupo ISO, comparado com o OVX, sem identificação de alterações morfológicas significativas, apenas hipotrofia celular, confirmada pela histomorfometria. Apesar de não ter havido diferenças na concentração de glicose, colesterol total e triglicerídeos, entre os grupos, o colesterol-HDL apresentou aumento no grupo ISO. Não houve diferença na densitometria do fêmur entre os grupos avaliados. Esses resultados indicam que o tratamento crônico com isoflavonas de soja, na dose testada, não induz mudanças significativas no útero, mamas e tecidos adiposo e ósseo, sugerindo segurança no tratamento, sem risco para o desenvolvimento de câncer. / Menopause, physiological phenomenon that occurs in all women, average age 51, is accompanied by about 80% of cases symptoms such as hot flashes, vaginal dryness, irritability and insomnia, which affect the quality of life and socioeconomic productivity women's, and predispose them to chronic degenerative diseases such as atherosclerosis, obesity and cardiovascular disorders. The hormone replacement therapy based on estrogen, which aims to reduce the discomforts of menopause is associated with an increased risk of endometrial and breast cancer, as has been shown in scientific studies. Whereas that women, consuming soy, had lower rates of chronic degenerative diseases and cancer at rates lower than those of Western countries, soy isoflavones have been tested in clinical and experimental studies, but with contradictory results. The present study investigated the effect of chronic administration of soy isoflavones on the uterus, breast, bone and adipose tissues from ovariectomized rats. Forty female Wistar rats were divided into four groups: a) ovariectomized: ISO group receiving soy isoflavones (100mg/kg/dia/vo); b) ovariectomized: EB group receiving estradiol benzoate (10&#956;g/kg/dia/sc); c) ovariectomized: OVX group receiving saline (0.1 ml/100g/dia/vo); d) controls: FO group, receiving saline (0.1 ml/100g/dia/vo). Before and during the 90 days of treatment vaginal smears were analyzed to monitor the estrous cycle, given the body weight and food intake monitored weekly. After this period, the animals were anesthetized and blood was collected for analysis of serum estradiol and progesterone serum by radioimmunoassay, and lipid and glucose by spectrophotometry. Subsequently, the animals were euthanized and necropsied, collecting the uterus, breasts, intra-abdominal fat and femur for macroscopic exam and weighing. The tissues selected for the study were stained with HE and analyzed by light microscopy and histomorphometry, in order to investigated possible changes in cell growth (NIH Image software VS-J;-optronics CCD digital images). In the group treated with isoflavones a decrease in body weight decreased compared OVX in which there was an increase in weight compared to the false-operated animals. Macroscopically, the uterus weight was lower in ISO group, similar to the OVX group. Furthermore, no change was showed in the histopathology of endometrial glands between ISO and OVX groups. The EB group showed glandular proliferation, pseudo-stratified epithelium, frequent mitoses typical squamous metaplasia, and eosinophilic infiltrate and hidrometry. The estradiol concentration in the ISO group was similar to OVX. However, EB group showed increase in estradiol and uterine weight in relation to OVX. No differences in mammary histomorphometry were observed among the four groups. Fat abdominal tissue weight was lower in ISO group compared with OVX group but, no morphological changes were seen on microscopy, only a cellular hipertrophy confirmed by histomorphometry. Although there were no differences in the glucose concentration, total cholesterol and triglycerides among groups, the cholesterol-HDL was increased in the group ISO. There was no difference in femur density among the groups. These results indicate that chronic treatment with soy isoflavones, at the tested dose did not induce significant changes in the uterus, breast, bone and adipose tissues, suggesting safety in handling without risk for development of cancer.

Gliomas are the most common form of primary intracranial malignancy, among which astrocytomas are the most frequent. Ectodermal-cortex protein 1 (ENC 1), also known as Nuclear Restricted Protein/Brain (NRP/B), was first characterized as a protein which interacts with the cytoskeleton by binding to actin through Kelch-like domains, being related to neural fate specification during development of the nervous system. The first chapter of this thesis confirms ENC1 as a tumor suppression properties by a genomic edition approach, analyses ENC1 expression in a set of patient glioma samples and describes the correlation these data with patients survival and progression-free survival, concluding that ENC1 expression may constitute a biomarker for glioma aggressiveness. The second chapter refers to the identification and in vitro characterization of the LHTNELQ peptide, which was selected by the Phage Display method using human glioblastoma cells. This new peptide is able to be internalized by these cells and features as a new tool for the development of glioma therapeutics. The third chapter report an alternative method to generate growth curves of adherent cell cultures, which is based on the CFSE fluorescence decay over time. It is an alternative method to determine growth curves of cultured cells, with smaller variation among technical replicates than that of counting-based methods. / Gliomas são a forma mais comum de malignidades primárias intracranianas, dentre os quais os astrocitomas são os mais frequentes. A proteína Ectodermal-neural cortex 1 (ENC1), também conhecida como Nuclear Restricted Protein/Brain (NRP/B), foi primeiramente caracterizada como uma proteína que interage com o citoesqueleto por meio de ligação à actina através de domínios Kelch-like, sendo relacionada com diferenciação neuronal durante o desenvolvimento do sistema nervoso. O primeiro capítulo desta tese descreve confirmação da capacidade supressora tumoral de ENC1 por abordagem de edição genômica, analisa a expressão de ENC1 em um conjunto de amostras de pacientes com gliomas e correlaciona esses dados com tempo de sobrevida geral e sobrevida livre de progressão tumoral nos pacientes, concluindo que a expressão de ENC1 pode ser utilizada como um biomarcador da agressividade do glioma. O segundo capítulo apresenta a identificação e caracterização in vitro do peptídeo LHTNELQ, que foi selecionado pela metodologia de Phage display utilizandose de células de glioblastoma humano. Este novo peptídeo é capaz de internalizar-se nestas células e figura como uma nova ferramenta para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para glioblastomas. No terceiro capítulo propõe-se um método alternativo para gerar curvas de crescimento celular de cultura aderente, o qual é baseado no decaimento da fluorescência do reagente CFSE ao longo do tempo. Tratase de um método alternativo para a determinação de curvas de crescimento de culturas aderentes, com menor variação entre as réplicas técnicas do que os métodos baseados em contagem das células.

O desenvolvimento do câncer cervical depende da exposição ao HPV, fator necessário, mas não suficiente. Outras bactérias, tais como ureaplasmas, têm sido associadas como cofatores. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença de ureaplasmas em mulheres com lesão cervical, e observar alterações em PHK causadas pela infecção por ureaplasmas. 140 swabs vaginais foram coletados. O material foi submetido a PCR para a detecção de HPV, Mollicutes, U. urealyticum, U. parvum e seus sorotipos, e outras bactérias de importância ginecológica; e qPCR para U. urealyticum e U. parvum. Também foi realizada a infecção de ureaplasmas em PHK transformados com HPV. As células foram contadas e realizou-se a dosagem das citocinas IL1-&beta;, IL-6 e TNF-&alpha;. HPV, Mollicutes, U. parvum, sorotipos 1 e 6 de U. parvum, T. vaginalis e G. vaginalis, além de alguns fatores socioeconômicos, foram associados com lesão cervical. Verificou-se maior carga de U. parvum entre mulheres com lesão. Houve diminuição do número de células e maior liberação de IL-6 e TNF-&alpha; nos grupos infectados. Com os resultados obtidos neste estudo, foi possível verificar uma associação entre os ureaplasmas e HPV no início das lesões cervicais, contudo mais estudos precisam ser realizados para aprimorar essa hipótese. / The development of cervical cancer depends on the exposure to HPV, necessary factor, but not enough. Other bacteria, such as ureaplasmas, have been associated as cofactors. The aim of this study was to evaluate the presence of ureaplasmas in women with cervical injury, and observe changes in PHK infected by ureaplasmas. 140 vaginal swabs were collected. The material was subjected to PCR for detection of HPV, Mollicutes, Ureaplasma urealyticum, U. parvum (and serotypes) and other bacteria gynecological importance; qPCR for U. urealyticum and U. parvum was made. PHK transformed by HPV was infected by ureaplasma. Cells were counted and it was done titration of IL1-&beta;, IL-6 and TNF-&alpha;. HPV, Mollicutes, U. parvum, serotypes 1 and 6 U. parvum, T. vaginalis and G. vaginalis, and some socioeconomic factors were associated with cervical injury. Besides this, it was detected higher load U. parvum among women with injury. There was decrease in cell number and increased release of IL-6 and TNF-&alpha; in infected groups. With the results of this study, we found an association among HPV and ureaplasmas at the beginning of cervical lesions, but more studies are needed to enhance this hypothesis.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rogerioleonebuchaim_tese.pdf: 3407631 bytes, checksum: 87786b69303a26860816554562d2cdab (MD5) Previous issue date: 2004-05-17 / The present study was aimed at examining the biocompatibility of anionic collagen matrices, their local bone response following implantation in surgically-created bone defects and also the influence of the collagen fiber orientation in the neoformed bone tissue. Seventy two rats ( Rattus norvegicus albinus ) were used in this experiment. The animals were divided into four experimental groups: Group 1 (control), without implants; Group 2, pericardium medullar implants, 12 hours; Group 3, medullar implants of tendon, 24 hours, with the bigger axes of collagen fibers parallel to the bigger axes of the tibia; and Group 4, medullar implants of tendon, 24 hours, with the bigger axes of collagen fibers perpendicular to the bigger axes of the tibia. After the experimental surgery, the evolution of the repair process was microscopically evaluated in 7, 15 and 30 days post-surgery. The results demonstrated the implanted matrices to be biocompatible and to function as a scaffold inducing the formation of bone, mainly in Group 4. At first, the cellularity follows the arrangement of collagen fibers, obtaining a growing multidirectional arrangement, suggesting that the direction and the orientation are related to the direction and to the magnitude of the stress applied to the bone. / Este estudo apresentou como objetivo, examinar a biocompatibilidade de matrizes de colágeno aniônico, sua resposta óssea local após implantação em defeitos ósseos criados cirurgicamente e a influência da orientação das fibras colágenas no tecido ósseo neoformado. Foram utilizados 72 ratos (Rattus norvegicus albinus) divididos em 4 grupos experimentais de 6 animais cada: Grupo 1 (controle), sem implante; Grupo 2, implante medular pericárdio 12 horas; Grupo 3, implante medularde tendão 24 horas, com o maior eixo de suas fibras colágenas direcionados paralelamente ao maior eixo da tíbia e , Grupo 4, implante medular de tendão 24 horas, com o maior eixo de suas fibras colágenas direcionadas perpendicularmente ao maior eixo da tíbia. A evolução do processo de reparo, após a cirurgia experimental, foi avaliada microscopicamente com 7, 15 e 30 dias pós-operatórios. Os resultados demosntraram que as matrizes implantadas são biocompatíveis e funcionam como uma matriz tridimensional induzindo a formação de osso, maior no grupo 4. a celularidade, inicialmente, acompanha o arranjo das fibras colágenas, adquirindo um arranjo multidirecional crescente, sugerindo que a direção e a orientação estão relacionadas com a direção e a magnitude do stress aplicado sobre o osso.

O desenvolvimento do câncer cervical depende da exposição ao HPV, fator necessário, mas não suficiente. Outras bactérias, tais como ureaplasmas, têm sido associadas como cofatores. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença de ureaplasmas em mulheres com lesão cervical, e observar alterações em PHK causadas pela infecção por ureaplasmas. 140 swabs vaginais foram coletados. O material foi submetido a PCR para a detecção de HPV, Mollicutes, U. urealyticum, U. parvum e seus sorotipos, e outras bactérias de importância ginecológica; e qPCR para U. urealyticum e U. parvum. Também foi realizada a infecção de ureaplasmas em PHK transformados com HPV. As células foram contadas e realizou-se a dosagem das citocinas IL1-&beta;, IL-6 e TNF-&alpha;. HPV, Mollicutes, U. parvum, sorotipos 1 e 6 de U. parvum, T. vaginalis e G. vaginalis, além de alguns fatores socioeconômicos, foram associados com lesão cervical. Verificou-se maior carga de U. parvum entre mulheres com lesão. Houve diminuição do número de células e maior liberação de IL-6 e TNF-&alpha; nos grupos infectados. Com os resultados obtidos neste estudo, foi possível verificar uma associação entre os ureaplasmas e HPV no início das lesões cervicais, contudo mais estudos precisam ser realizados para aprimorar essa hipótese. / The development of cervical cancer depends on the exposure to HPV, necessary factor, but not enough. Other bacteria, such as ureaplasmas, have been associated as cofactors. The aim of this study was to evaluate the presence of ureaplasmas in women with cervical injury, and observe changes in PHK infected by ureaplasmas. 140 vaginal swabs were collected. The material was subjected to PCR for detection of HPV, Mollicutes, Ureaplasma urealyticum, U. parvum (and serotypes) and other bacteria gynecological importance; qPCR for U. urealyticum and U. parvum was made. PHK transformed by HPV was infected by ureaplasma. Cells were counted and it was done titration of IL1-&beta;, IL-6 and TNF-&alpha;. HPV, Mollicutes, U. parvum, serotypes 1 and 6 U. parvum, T. vaginalis and G. vaginalis, and some socioeconomic factors were associated with cervical injury. Besides this, it was detected higher load U. parvum among women with injury. There was decrease in cell number and increased release of IL-6 and TNF-&alpha; in infected groups. With the results of this study, we found an association among HPV and ureaplasmas at the beginning of cervical lesions, but more studies are needed to enhance this hypothesis.