Le nicotinamide est une vitamine fournie par l'alimentation et utilisée en thérapie dans le traitement de certaines pathologies humaines. Chez Leishmania, un protozoaire parasite responsable des leishmanioses, cette vitamine présente une action toxique contre le parasite et une action synergique avec l'antimoine, la principale molécule utilisée dans le traitement des leishmanioses. En recherchant le mode d'action de cette vitamine, nous avons observé qu'elle était en réalité un précurseur essentiel à la synthèse du NAD+ chez le parasite, un cofacteur responsable de la plupart des réactions d'oxydoréduction chez tous les êtres vivants. Leishmania étant en effet dépourvu des voies de synthèse de novo du NAD+, il doit le générer à partir de précurseurs qu'il importe depuis son environnement (nicotinamide, nicotinamide riboside, acide nicotinique). Cette auxotrophie du parasite pour le NAD+ révèle donc un rôle ambivalent du nicotinamide, à la fois toxique à fortes concentrations et pourtant essentiel à sa survie en tant que précurseur majeur du NAD+. À partir des bases de données, nous avons reconstitué l'ensemble de la voie de synthèse du NAD+ chez Leishmania. Parmi les enzymes impliquées, nous avons identifié une nicotinamidase qui n'a pas d'homologue chez les mammifères, et qui assure la conversion du nicotinamide en acide nicotinique, première étape à la synthèse du NAD+. Cette enzyme étant un candidat intéressant pour le développement de molécules ciblant spécifiquement le parasite, nous avons réalisé la caractérisation fonctionnelle de ce gène. Son inactivation induit une diminution importante de la concentration en NAD+ chez le parasite et provoque un arrêt de la prolifération en culture, ainsi qu'une incapacité des mutants à établir une infection durable chez la souris. L'obtention de la structure de la nicotinamidase de L. infantum nous offre désormais la possibilité de développer des inhibiteurs spécifiques contre cette nouvelle cible thérapeutique. / Nicotinamide is a vitamin provided by food that is already used in human therapy. In Leishmania protozoan parasites, this molecule shows toxic activity against parasites and has synergistic activity with antimonials, the main drugs used to treat leishmaniasis. By investigating the mode of action of this cheap vitamin, we discovered that nicotinamide is in fact the main precursor of NAD+ synthesis in Leishmania, a redox cofactor essential for all living cells. Leishmania are indeed devoid of a de novo NAD+ pathway and must synthesize it by scavenging precursors from their environment (nicotinamide, nicotinic acid and nicotinamide riboside). This NAD+ auxotrophy reveals a mixed pattern of activity of nicotinamide in Leishmania, i.e. toxic at high concentrations but also essential for parasite survival through its role in NAD+ synthesis. All enzymes of the Leishmania NAD+ salvage pathway were then identified from genome databases. We focused on a putative nicotinamidase, which has no homolog in mammals and governs the conversion of nicotinamide to nicotinic acid, the first step in the NAD+ salvage pathway. Since this enzyme could be considered as an attractive therapeutic target to develop specific parasite inhibitors, we performed a functional analysis of the corresponding gene. Targeted deletion of the nicotinamidase encoding gene induced a marked drop in parasite NAD+ content and a phenotype with strongly delayed growth. Additionally, these mutants are unable to establish durable infections in mice. The crystal structure of the nicotinamidase from L. infantum will allow us to develop specific inhibitors against this new therapeutic target.

Ces dernières décennies, on a assisté à l’augmentation du nombre de technologies et de concepts permettant l’analyse des interactions intermoléculaires. Dans ce contexte, les puces à fluorescence restent les plus fréquemment utilisées. Cependant, cette technologie bien que très sensible et multiplexée, ne permet pas d’avoir accès aux paramètres cinétiques, indispensables au calcul des constantes d’affinité et la recherche de systèmes alternatifs s’impose. Dans cette optique, la résonance plasmonique de surface par imagerie (SPRi) est considérée comme une véritable option. Cette technologie se caractérise par l’absence de marquage et permet de suivre en temps réel d’infimes variations de masses consécutives à des interactions intermoléculaires sur la surface du prisme. L’obtention de constantes d’affinité est ainsi possible. En revanche, la SPRi présente un certain nombre de limites, principalement au niveau de la sensibilité et du multiplexage. Les objectifs de la thèse ont ainsi consisté à combler en partie ces différentes limites. La chimie de greffage basée sur l’utilisation d’oligonucléotides modifiés par un thiol a permis d’améliorer le multiplexage et de déposer plus de 1000 spots par cm² sur la surface d’or du prisme. Dans le même temps, la modification de la surface avec des colloïdes d’or et des dendrimères a permis pour des interactions ADN/ADN, d’atteindre une limite de détection de 2 nM (d’où un gain de 200%). En parallèle de ces travaux, diverses applications biologiques ont été effectuées. Une première étude a consisté à rechercher des ligands spécifiques des structures G-quadruplex des télomères. Une seconde étude s’est portée sur le complexe de partition bactérien. Par des études de criblage les bases impliquées dans l’interaction avec une protéine indispensable à la partition du plasmide F chez E.coli ont été identifiées. L’ensemble de ces travaux ont montré le fort potentiel de la SPRi et les applications potentielles qui en découlent sont nombreuses. / During the last decades a large number of technologies have been developed to analyze intermolecular interactions. In this context, the fluorescence biochips remain the most frequently used. Although this technology is very sensitive and multiplexed, it does not allow access to the kinetic parameters, essential to the calculation of the constants of affinity. Therefore, the research for alternative systems is essential. In this way, the Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi) is considered as an opportunity. It is an optical detection process that can occur when a polarized light hits a prism covered by a thin metal layer. Under certain conditions free electrons at the surface of the biochip absorb incident light photons and convert them into surface plasmon waves. Perturbations at the surface of the biochip, such as an interaction between probes immobilized on the chip and targets, induce a modification of resonance conditions which can be measured. It is a label free technology which allows intermolecular interactions in real time and gives access to the kinetics parameters. However, SPRi is limited in sensitivity and multiplexing. The objectives of my PhD were to circumvent these various limits. Thus, we validated the immobilization of DNA probes on gold surface using thiol-modified oligonucleotide probes. Deposition carried out on non-modified gold surface, does not require electrical stimulation and expensive specific robotic devices. The thiol modification of the probes was shown to be very stable at room temperature, contrary to pyrrole and diazonium probes that need to be prepared just prior to their spotting. We demonstrate that thiol-modified oligonucleotide probes spotted on a gold surface of the SPRi-prisms are very robust and reproducible. We also demonstrated that this simple chemistry is compatible with high density arrays fabrication bearing more than 1000 spots using a classical spotter. Furthermore, the modification of the prism surface with gold colloids and dendrimers allowed for DNA/DNA interactions, to reach a detection limit of 2 nM. In parallel of this work, various biological applications were carried out and validate our previous developments. A first study was to screen G-quadruplex specific ligands to inhibit telomerase activity. We demonstrated that SPRi technology is particularly well adapted to the screening of interaction of small molecules with DNA probes and is sensitive enough to permit distinction between interactions with different DNA structures. The second study was on the bacterial partition complex. We study the DNA binding requirement involved in SopB-sopC specific interactions and analysed at the nucleotide level the bases involved in the binding efficiency and essential for the partition All this PhD work improved the SPRi technology and demonstrated its great potential in biological applications.

L'objectif de ce travail a été l'utilisation d'une méthodologie de formulation des formes à libération prolongée. Le choix de «matrices hydrophiles» a été fait en raison de l'intérêt et de l'importance des travaux qui lui sont consacrés, mais surtout en raison de la possibilité d'utilisation de la technologie simple de fabrication des comprimés par compression directe.Le principe actif choisi est le diclofenac de sodium, un anti-inflammatoire largement utilisé dont la molécule est tombée dans le domaine public. Utilisé  à raison de 100 mg par comprimé. La première partie bibliographique résume l'intérêt des formes à libération prolongée, décrit les différentes formes galéniques existantes pour la voie orale et fait le point sur les formules et les propriétés des agents matriciels hydrophiles parmi les plus utilisés, notamment les éthers de celluloses, hydroxypropymethylcellulose (METOLOSES®) (1). Dans la partie expérimentale, nous avons réalisé les différentes étapes nécessaires au développement d'une forme à libération prolongée qui correspondant aux étapes classiques  de pré-formulation, formulation et optimisation. Dans une première étape d'essais préliminaires  nous avons étudiés le comportement d'un point de vue pharmacotechnique des matières premières utilisés seuls et en mélange. Ce qui a permis de faire des orientations en ce qui concerne les différents types de METOLOSES, la nature du diluant, et leurs concentrations. Dans une deuxième étape, nous avons réalisé un premier plan d'expériences de criblage des facteurs, qui permet de déterminer le poids de chacun et leurs éventuelles interactions. Ce qui nous a permis de conclure sur l'effet des différents facteurs en formulation. Dans une troisième étape, nous avons réalisé un deuxième plan d'expériences d'optimisation de la formulation  en utilisant un plan composite centré constitué de 9 expériences ce qui a permis de sélectionner une zone de formules optimales. Enfin, la réalisation d'une formule optimale nous a permis de confirmer les résultats obtenus dans les travaux de développement et dont l'objectif été une libération sur 12 heures. / The objective of this work was the use of a formulation methodology of prolonged release dosage forms. The choice of “hydrophilic matrices” was done because of the interest and the numbered works which is devoted to it, but also for the use of a simple manufacture technology by direct compression. The selected active pharmaceutical ingredient is one of the most largely used nonsteroidial anti-inflammatory drug, the sodium diclofenac which is out of patent and used at 100 Mg per tablet. The first bibliographical part summarizes the interest of the prolonged release dosage forms, described the existing oral dosage forms and gives a progress report on the formulas and the properties of hydrophilic matrices agents among most used, in particular the cellulose ethers, hydroxypropymethylcellulose (METOLOSES®) (1). In the experimental part, we carried out the various steps necessary to the development of a prolonged release dosage form which correspond to the traditional steps of pre-formulation, formulation and optimization. In a first step of pharmaceutics preliminary tests we studied the behavior of raw materials used alone and in mixture. What made orientations with regard to the various types of METOLOSES, the nature of diluents, and their concentrations. In a second step, we carried out a first screening factors experimental design, which enabled us to conclude on the effect of the various factors in formulation. In a third step, we carried out a second optimization experimental design using a centered composite plan consisted of 9 experiments which lead us to define a space design of optimal formulas. Lastly, the manufacture of a formula from the design space enabled us to confirm the results to development work and for which the objective was a sustained release over 12 hours.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires sécrètent du Cl- via le canal CFTR. La fibrose kystique est une maladie génétique fatale causée par des mutations de ce canal. La mutation la plus fréquente en Amérique du Nord, ∆F508, met en péril la maturation de la protéine et affecte les mécanismes d’activation du canal. Au cours des dernières années, plusieurs molécules ont été identifiées par criblage à haut débit qui peuvent rétablir l’activation de protéines CFTR mutées. Ces molécules sont nommées potentiateurs. Les canaux K+ basolatéraux, dont KCa3.1, jouent un rôle bien documenté dans l’établissement d’une force électromotrice favorable à la sécrétion de Cl- par CFTR dans les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires. Il a par exemple été démontré que l’application de 1-EBIO, un activateur de KCa3.1, sur des monocouches T84 résulte en une augmentation soutenue de la sécrétion de Cl- et que cette augmentation était réversible suite à l’application de CTX, un inhibiteur de KCa3.1(Devor et al., 1996). Dans le cadre d’une recherche de potentiateurs efficaces en conditions physiologiques et dans un contexte global de transport trans-cellulaire, il devient essentiel de considérer les effets des potentiateurs de CFTR sur KCa3.1. Une caractérisation électrophysiologique par la méthode du patch clamp et structurelle via l’utilisation de canaux modifiés par mutagenèse dirigée de différents potentiateurs de CFTR sur KCa3.1 fut donc entreprise afin de déterminer l’action de ces molécules sur l’activité de KCa3.1 et d’en établir les mécanismes. Nous présentons ici des résultats portant sur les effets sur KCa3.1 de quelques potentiateurs de CFTR possédant différentes structures. Un criblage des effets de ces molécules sur KCa3.1 a révélé que la genisteine, le SF-03, la curcumine et le VRT-532 ont des effets inhibiteurs sur KCa3.1. Nos résultats suggèrent que le SF-03 pourrait agir sur une protéine accessoire et avoir un effet indirect sur KCa3.1. La curcumine aurait aussi une action inhibitrice indirecte, probablement via la membrane cellulaire. Nos recherches sur les effets du VRT-532 ont montré que l’accessibilité au site d’action de cette v molécule est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1. L’absence d’effets inhibiteurs de VRT-532 sur le mutant constitutivement actif V282G indique que cette molécule pourrait agir via l’interaction CaM-KCa3.1 et nécessiter la présence de Ca2+ pour agir. Par ailleurs, un autre potentiateur de CFTR, le CBIQ, a des effets potentiateurs sur KCa3.1. Nos résultats en canal unitaire indiquent qu’il déstabilise un état fermé du canal. Nos travaux montrent aussi que CBIQ augmente la probabilité d’ouverture de KCa3.1 en conditions sursaturantes de Ca2+, ainsi que son affinité apparente pour le Ca2+. Des expériences où CBIQ est appliqué en présence ou en absence de Ca2+ ont indiqué que l’accessibilité à son site d’action est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1, mais que la présence de Ca2+ est nécessaire à son action. Ces résultats sont compatibles avec une action de CBIQ déstabilisant un état fermé du canal. Finalement, des expériences en Ba2+ nous ont permis d’investiguer la région du filtre de sélectivité de KCa3.1 lors de l’action de CBIQ et nos résultats pointent vers une action de CBIQ dans cette région. Sur la base de nos résultats nous concluons que CBIQ, un potentiateur de CFTR, aurait un effet activateur sur KCa3.1 via la déstabilisation d’un état fermé du canal à travers une action sur sa ‘gate’ au niveau du filtre de sélectivité. De plus, les potentiateurs de CFTR ayant montré des effets inhibiteurs sur KCa3.1 pourraient agir via la membrane ou via une protéine accessoire du canal ou sur l’interaction CaM-KCa3.1. Dans l’optique de traitements potentiels de la fibrose kystique, nos résultats indiquent que le CBIQ pourrait être un potentiateur efficace pusiqu’il est capable de trimuler à la fois KCa3.1 et CFTR. Par contre, dans les cas du VRT-532 et du SF-03, une inhibition de KCa3.1 pourraient en faire des potentiateurs moins efficaces. / Airway epithelial cells are the site of Cl- secretion through CFTR. Cystic fibrosis is a fatal genetic disease caused by mutations in CFTR. The most frequent mutation in North America (∆F508) results in impaired maturation and altered channel gating of the protein. In the last years, several small molecules were identified by high throughput screening that could restore mutated CFTR function. Compounds addressing CFTR gating defects are referred to as potentiators. The basolateral K+ channel KCa3.1 has been documented to play a prominent role in establishing a suitable driving force for CFTR-mediated Clsecretion in airway epithelial cells. It has been shown, for example, that the application of 1-EBIO on T84 monolayers results in a sustained increase of Clsecretion and that this current can be reversed by application of CTX, a KCa3.1 inhibitor (Devor et al., 1996). Thus, in a global approach of transepithelial transport, the research for physiologically relevant CFTR potentiators should also consider their effects on the KCa3.1 channel. Electrophysiological patch clamp measurements and channel structural modification by site directed mutagenesis were used to characterize the action of CFTR potentiators on KCa3.1 and study their molecular mode of action. In this work we present results on the effects on KCa3.1 of several CFTR potentiators of different structures. We observed that the CFTR potentiators genistein, curcumin, SF-03 and VRT-532 could inhibit KCa3.1 activity at concentrations known to activate CFTR. Our results suggest that SF- 03 could act indirectly on KCa3.1 through a mechanism involving an accessory protein. Curcumin would also have an indirect inhibitory effect, probably mediated by the plasma membrane, as documented for other ion channels. A detailed study of VRT-532 revealed that this molecule has access to its binding site in a state independent manner, and is poorly effective on the V282G mutant of KCa3.1, which is constitutively active. These results suggest that VRT-532 could act through the CaM/KCa3.1 complex and require the presence of Ca2+ to inhibit channel activity. In contrast, CBIQ, another CFTR potentiator, succeeded to activate KCa3.1. Our results in single channel show that CBIQ vii destabilizes a non conducting state of the channel. We also showed that this molecule increases the apparent Ca2+ affinity as well as the channel open probability, even in saturating Ca2+ conditions. Experiences in which Ba2+ was used as a probe were also performed to determine if the action mechanism of CBIQ involves an effect on the selectivity filter. Our results showed that Ba2+ could displace CBIQ from its interacting site, suggesting that the increases in channel activity induced by CBIQ could result from a change in the energetics of the channel at the level of the selectivity filter. On the basis of our results, we conclude that CBIQ, a CFTR potentiator, could activate KCa3.1 by destabilizing a non conducting state of the channel, probably through an action near the selectivity filter region. Also, CFTR potentiators having an inhibitory effect on KCa3.1 are likely to act through the plasmic membrane, the CaM/KCa3.1 interaction or an accessory protein of the channel. In a perspective of future treatments for CF, our results indicate that CBIQ could be an efficient potentiator since this product stimulates KCa3.1 as well as CFTR. Conversly, the VRT-532 and SF-03 could be less efficient than on CFTR alone, due to their inhibition of KCa3.1.

Les virus exploitent la machinerie cellulaire de l’hôte de façon très variée et plusieurs types vont même jusqu’à incorporer certaines protéines cellulaires. Nous avons récemment effectué la première analyse protéomique du virion mature de l’Herpès simplex de type 1 (HSV-1), ce qui nous a permis de déterminer que jusqu’à 49 protéines cellulaires différentes se retrouvaient dans ce virus (Loret, S. et al. (2008). "Comprehensive characterization of extracellular herpes simplex virus type 1 virions." J Virol 82(17): 8605-18.). Afin de déterminer leur importance dans le cycle de réplication d’HSV-1, nous avons mis au point un système de criblage nous permettant de quantifier le virus produit et relâché dans le milieu extracellulaire en utilisant un virus marqué à la GFP ainsi que des petits ARN interférents (pARNi) ciblant spécifiquement ces protéines cellulaires. Cette approche nous a permis de démontrer que 17 des protéines identifiées précédemment jouaient un rôle critique dans la réplication d’HSV-1, suggérant ainsi que leur incorporation dans le virus n’est pas aléatoire. Nous avons ensuite examiné le rôle d’une de ces protéines, DDX3X (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked), une protéine multifonctionnelle connue pour son implication dans les cycles de réplication de plusieurs virus humains. À l’aide de pARNi ainsi que de différentes lignées cellulaires, dont une lignée DDX3X thermosensible, nous avons démontré que l’inhibition de DDX3X résultait en une diminution du nombre de capsides intracellulaires et induisait une importante diminution de l’expression des gènes viraux. Nous avons aussi démontré que la fraction de DDX3X incorporée dans le virion contribuait activement au cycle infectieux d’HSV-1. Ces résultats confirment l’intérêt de notre approche afin d’étudier les interactions hôte-pathogène en plus de démontrer la contribution des protéines cellulaires incorporées à HSV-1 dans l’infection virale. / Viruses exploit the cellular machineries in many ways and several viruses specifically incorporate host proteins. To understand their biological relevance, we recently performed the first comprehensive characterization of the mature herpes simplex virus type 1 (HSV-1) in which up to 49 distinct cellular proteins were identified by mass spectrometry. In the present study, we sought to identify which of these cellular factors are critical for the HSV-1 life cycle. To this end, we performed a functional screen using small interfering RNA (siRNA) and a GFP-tagged virus, which indicated that at least 17 of the virion-incorporated host proteins alter HSV-1 proliferation in cell culture. Interestingly, these include several Rab GTPases and other intracellular transport components as well as proteins involved in signal transduction, gene regulation and immunity. Among them, the DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked protein (DDX3X) is a multifunctional molecule previously linked to several other viruses. Its relevance for HSV-1 was further confirmed with different siRNA reagents and cell lines, including a DDX3X thermosensitive cell line. We found that DDX3X inactivation reduced intracellular capsid abundance via a strong inhibition of viral gene expression. We also report evidence that the pool of DDX3X present in the mature virions actively contributes to HSV-1 life cycle. Altogether, this highlights a powerful and biologically relevant approach to characterize host-pathogen interactions and points to the important contribution host proteins within mature viral particles.

La transglutaminase microbienne (Microbial transglutaminase : MTG) est fortement exploitée dans l’industrie textile et alimentaire afin de modifier l’apparence et la texture de divers produits. Elle catalyse la formation de liaisons iso-peptidiques entre des protéines par l’entremise d’une réaction de transfert d’acyle entre le groupement γ-carboxamide d’une glutamine provenant d’un substrat donneur d’acyle, et le groupement ε-amino d’une lysine provenant d’un substrat accepteur d’acyle. La MTG est tolérante à un large éventail de conditions réactionnelles, ce qui rend propice le développement de cette enzyme en tant que biocatalyseur. Ayant pour but le développement de la MTG en tant qu’alternative plus soutenable à la synthèse d’amides, nous avons étudié la réactivité d’une gamme de substrats donneurs et accepteurs non-naturels. Des composés chimiquement diversifiés, de faible masse moléculaire, ont été testés en tant que substrats accepteurs alternatifs. Il fut démontré que la MTG accepte une large gamme de composés à cet effet. Nous avons démontré, pour la première fois, que des acides aminés non-ramifiés et courts, tels la glycine, peuvent servir de substrat accepteur. Les α-acides aminés estérifiés Thr, Ser, Cys et Trp, mais pas Ile, sont également réactifs. En étendant la recherche à des composés non-naturels, il fut observé qu’un cycle aromatique est bénéfique pour la réactivité, bien que les substituants réduisent l’activité. Fait notable, des amines de faible masse moléculaire, portant les groupements de forte densité électronique azidure ou alcyne, sont très réactives. La MTG catalyse donc efficacement la modification de peptides qui pourront ensuite être modifiés ou marqués par la chimie ‘click’. Ainsi, la MTG accepte une variété de substrats accepteurs naturels et non-naturels, élargissant la portée de modification des peptides contenant la glutamine. Afin de sonder le potentiel biocatalytique de la MTG par rapport aux substrats donneurs, des analogues plus petits du peptide modèle Z-Gln-Gly furent testés; aucun n’a réagi. Nous avons toutefois démontré, pour la première fois, la faible réactivité d’esters en tant que substrats donneurs de la MTG. L’éventuelle amélioration de cette réactivité permettrait de faire de la MTG un biocatalyseur plus général pour la synthèse d’amides. Mots clés: Lien amide, biocatalyse, biotransformation, transglutaminase, arrimage moléculaire, criblage de substrats, ingénierie de substrats. / Microbial transglutaminase (MTG) is used extensively in the food and textile industry to alter the appearance and texture of products. MTG catalyses the formation of isopeptide linkages between proteins by an acyl transfer reaction between the γ-carboxamide group of a glutamine ‘acyl-donor’ substrate, and the ε-amino group of a lysine ‘acyl-acceptor’ substrate. MTG is tolerant to a broad range of reaction conditions and is therefore suitable for further development as a biocatalyst. Toward developing MTG as a “green” alternative for amide synthesis, we have investigated a range of non-native donor and acceptor substrates to probe the scope of MTG reactivity. Small, chemically varied compounds were tested as alternative acyl-acceptor substrates. We observed a broad acceptor specificity. We show, for the first time, that very short-chain alkyl-based amino acids such as glycine can serve as acceptor substrates. The esterified α-amino acids Thr, Ser, Cys and Trp – but not Ile – also show reactivity. Extending the search to non-natural compounds, an aromatic ring was observed to be beneficial for reactivity, although ring substituents reduced reactivity. Overall, bonding of the amine to a less hindered carbon increases reactivity. Importantly, very small amines carrying either the electron-rich azide or the alkyne groups required for click chemistry were highly reactive as acceptor substrates, providing a ready route to minimally modified, ‘clickable’ peptides. These results demonstrate that MTG is tolerant to a variety of chemically varied natural and non-natural acceptor substrates, which broadens the scope for modification of glutamine-containing peptides. To further probe the biocatalytic potential of MTG in terms of the donor substrate, smaller analogues of the model substrate Z-Gln-Gly were tested. We did not find product formation with substrates smaller than the model substrate. We observed, for the first time, trace esterase activity with MTG. Future improvement of this activity would render MTG a more attractive, general biocatalyst for amide bond formation.

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs. 10% des cas sont des cas familiaux et l’étude de ces familles a mené à la découverte de plusieurs gènes pouvant causer la SLA, incluant SOD1, TARDBP et FUS. L’expansion de la répétition GGGGCC dans le gène C9orf72 est, à ce jour, la cause la plus connue de SLA. L’impact de cette expansion est encore méconnu et il reste à déterminer si la toxicité est causée par un gain de fonction, une perte de fonction ou les deux. Plusieurs gènes impliqués dans la SLA sont conservés entre le nématode Caenorhabditis elegans et l’humain. C. elegans est un vers transparent fréquemment utilisé pour des études anatomiques, comportementales et génétiques. Il possède une lignée cellulaire invariable qui inclue 302 neurones. Aussi, les mécanismes de réponse au stress ainsi que les mécanismes de vieillissement sont très bien conservés entre ce nématode et l’humain. Donc, notre groupe, et plusieurs autres, ont utilisé C. elegans pour étudier plusieurs aspects de la SLA. Pour mieux comprendre la toxicité causée par l’expansion GGGGCC de C9orf72, nous avons développé deux modèles de vers pour étudier l’impact d’une perte de fonction ainsi que d’un gain de toxicité de l’ARN. Pour voir les conséquences d’une perte de fonction, nous avons étudié l’orthologue de C9orf72 dans C. elegans, alfa-1 (ALS/FTD associated gene homolog). Les vers mutants alfa-1(ok3062) développent des problèmes moteurs causant une paralysie et une dégénérescence spécifique des neurones moteurs GABAergiques. De plus, les mutants sont sensibles au stress osmotique qui provoque une dégénérescence. D’autre part, l’expression de la séquence d’ARN contenant une répétition pathogénique GGGGCC cause aussi des problèmes moteurs et de la dégénérescence affectant les neurones moteurs. Nos résultats suggèrent donc qu’un gain de toxicité de l’ARN ainsi qu’une perte de fonction de C9orf72 sont donc toxiques pour les neurones. Puisque le mouvement du vers peut être rapidement évalué en cultivant les vers dans un milieu liquide, nous avons développé un criblage de molécules pouvant affecter le mouvement des vers mutants alfa-1 en culture liquide. Plus de 4 000 composés ont été évalués et 80 ameliore la mobilité des vers alfa-1. Onze molécules ont aussi été testées dans les vers exprimant l’expansion GGGGCC et huit diminuent aussi le phénotype moteur de ces vers. Finalement, des huit molécules qui diminent la toxicité causée par la perte de fonction de C9orf72 et la toxicité de l’ARN, deux restaurent aussi l’expression anormale de plusieurs transcrits d’ARN observée dans des cellules dérivées de patient C9orf72. Avec ce projet, nous voulons identifier des molécules pouvant affecter tous les modes de toxicité de C9orf72 et possiblement ouvrir de nouvelles avenues thérapeutiques / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder affecting the motor neurons. 10% of the cases are familial and using those families, many genes were shown to be involved in ALS pathogenesis, including SOD1, TARDBP and FUS. The GGGGCC repeat found in the first intron of C9orf72 is, to this day, the most common genetic cause of ALS. Many hypotheses have been speculated to explain the toxicity of the pathogenic GGGGCC repeat, including loss and gain of function mechanisms. Many proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) are evolutionarily conserved in the worm Caenorhabditis elegans. C. elegans is a transparent nematode widely used for anatomical, behavioural and genetic studies. It possesses an invariant cell lineage that includes 302 neurons in the adult nematode. Also, cellular stress responses and survival mechanisms are genetically regulated and conserved from the nematode and human. Therefore, our group, and others, have used C. elegans to model different aspects of neurodegenerative diseases including ALS. To better understand the toxicity caused by the GGGGCC repeat expansion in C9orf72, we have developed two C. elegans models to understand either the impact of the loss of function of C9orf72 or the gain of toxicity of the RNA containing the GGGGCC repeat. To understand the loss of function, we have characterized the orthologue of C9orf72 in C. elegans, alfa-1 (ALS/FTD associated gene homolog). Mutant alfa-1 worms exhibit motor impairments leading to paralysis and neurodegenereation of the GABAergic neurons. Mutant worms are also sensitive to osmotic stress which can lead to increased neurodegeneration. On the other part, exposure of C. elegans neurons to the RNA containing the GGGGCC repeat causes also motor problem and degeneration affecting the motor neurons. Therefore, our data suggest that both loss of function of C9orf72 and toxic gain of function are detrimental to neurons. Since motor dysfunctions in worms can be easily accessed in liquid culture, we have screened more than 4,000 FDA approved compounds in the alfa-1(ok3062) worms. 80 molecules were shown to improve alfa-1 impaired function and eleven of those were also tested for their effect to reduce the neurotoxicity caused by the GGGGCC repeat RNA. Eight molecules were shown to affect both types of neurotoxicity. Finally, from these eight molecules that can improveboth types of toxicity, two were shown to restore the abnormal RNA expression observed in C9orf72 patient-derive cells. With this project, we aimed to identify molecules that can affect the loss of C9orf72 toxicity and the toxic gain of RNA function containing the GGGGCC repeat to hopefully open new therapeutic avenues for ALS patients.

Le récepteur tyrosine kinase Axl a été découvert en 1988. Depuis, son implication dans les phénomènes de cancérisation a été mis en lumière. Ce récepteur est surexprimé, entre autres, dans les lignées cellulaires du cancer du pancréas et du cancer du sein triple négatif. Le succès des inhibiteurs de kinase contre les cancers (imatinib, erlotinib …) nous a poussés à nous focaliser sur la conception d'inhibiteurs du domaine kinase de la protéine Axl afin d'élaborer de nouveaux anticancéreux. Pour ce faire, nous avons décidé de modéliser le domaine kinase de la protéine Axl en conformations dites ‘active' et ‘inactive'. Les modèles ont ensuite été validés par différentes méthodes : des méthodes de bioinformatique structurale mais aussi par amarrage comparatif et par criblage virtuel focalisé. Sur la base de ces modèles, une chimiothèque virtuelle focalisée a été construite et amarrée dans les modèles d'Axl. J'ai ensuite effectué la synthèse chimique de 15 des ligands conçus à l'étape précédente et ciblant la conformation ‘inactive' du domaine kinase d'Axl. Aucun de ces ligands n'est apparu actif dans les tests in vitro. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la chimie des noyaux 4- et 7-azaindoles. Ces travaux ont permis la synthèse de 12 ligands dirigés contre les conformations ‘inactives' des domaines kinases d'Abl et de Src dont certains ont montré une activité prometteuse. Parallèlement, un criblage a très large échelle a été publié et nous avons utilisé ces nouveaux résultats pour réévaluer l'existence d'une conformation -inactive' – de type « DFG-out » - du domaine kinase d'Axl. Ces travaux permettront la conception de nouveaux ligands ciblant efficacement Axl. / The receptor tyrosine kinase Axl was discovered in 1988. Latter on, its involvement in the cancer development was highlighted. Axl is overexpressed in pancreatic cancer and triple-negative breast cancer cell lines. The success of kinase inhibitors (imatinib, erlotinib ...) led us to focus on the design of inhibitors targetting the kinase domain of Axl. As a guide, we modeled the protein-kinase domain in its active and inactive conformations to perform structure-based drug design. The models were then validated by different methods: structural bioinformatics, comparative docking and focused virtual screening. A virtual chemical library was built and docked into Axl models.Then, I synthetized 15 chemical compounds targetting the ‘inactive' conformation of the kinase domain of Axl. However, none were active in an in vitro assay. Then we were interested in the chemistry of 4 and 7-azaindole cores. This work led to the synthesis of 12 ligands among which several showed promising activity against the ‘inactive' conformation of the kinase domains of Abl and Src.Meanwhile, a large-scale screening was published and we used that new data to re-evaluate the modeling of a "DFG-out" inactive conformation of Axl.

Les ARN (Acide RiboNucléique) remplissent de nombreuses fonctions clés dans le vivant. Ils peuvent être support de l'information génétique, régulateurs de celle-ci. Visualiser ces molécules au sein d'une cellule représenterait une étape importante vers une meilleure compréhension de la régulation de l'expression des gènes. Les ARN fluorogènes tels que Spinach et Mango sont des outils extrêmement prometteurs pour atteindre cet objectif. Cependant ces deux ARN fluorogènes présentent une brillance limitée. La Compartimentation in vitro assistée par microfluidique (µCIV) est un outil très prometteur dont notre groupe a démontré l’efficacité pour l’évolution d’ARN. Dans le cadre de cette thèse, la µCIV a été adaptée à la sélection d'aptamères d'ARN fluorogènes pour en améliorer les propriétés (surtout la brillance). De plus, l’utilisation conjointe du séquençage haut débit a permis l’optimisation très rapide et semi-automatisée à la fois d’aptamères mais aussi de biosenseurs fluorogènes. Ainsi, cette thèse a permis de mettre en place et d’exploiter des technologies de criblage robustes pour la découverte de nouveaux aptamères d'ARN et de biosenseurs. / RNA is a key molecule in gene expression and its regulation. Therefore, being able to monitor RNA through live-cell imaging would represent an important step toward a better understanding of gene expression regulation. RNA-based fluorogenic modules are extremely promising tools to reach this goal. To this end, two light-up RNA aptamers (Spinach and Mango) display attractive properties but they suffer from a limited brightness. Since previous work in the group demonstrated the possibility to evolve RNA using microfluidic-assisted in vitro compartmentalization (µIVC), this technology appeared to be well suited to improve light-up aptamers properties by an evolution strategy. Therefore, the µIVC procedure was adapted to fluorogenic RNA aptamers to improve their properties (especially the brightness). Finally, using µIVC in tandem with high-throughput sequencing (NGS) allowed further developing the technology into a more integrated and semi-automatized approach in which RNAs and biosensors are selected by µIVC screening and the best variants identified by a bioinformatics process upon NGS analysis. To summarize, this thesis allowed establishing robust µIVC screening workflows for the discovery of novel efficient light-up RNA aptamers as well as metabolites biosensors.