Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-04-17Bitstream added on 2014-06-13T19:22:37Z : No. of bitstreams: 1 lima_rca_dr_jabo.pdf: 689333 bytes, checksum: b8de9b1893e535c64bce7067077a1c6b (MD5) / A criptosporidiose é uma enfermidade de veiculação hídrica, possui como agravante a dificuldade de prevenção da contaminação ambiental e ausência de medidas terapêuticas eficazes. Com acentuada importância na bovinocultura, ocasiona inflamação e atrofia das vilosidades intestinais resultando em perda da superfície de absorção. O presente estudo teve como objetivo caracterizar molecularmente a infecção por Cryptosporidium spp. em bezerros do Município de Formiga, região Centroeste de Minas Gerais. Um total de 300 amostras de fezes de bezerros holandeses, nelore e sem raça definida, foram avaliadas pela técnica de coloração contraste negativo de verde malaquita e por meio da reação de nested-PCR para amplificação de fragmentos de DNA da subunidade 18S do gene do RNA ribossômico. Ocorrência de 5,33% (16/300) pelo verde malaquita e 4,66% (14/300) pela PCR foram observadas, sendo que por meio da caracterização molecular foram identificadas as espécies Cryptosporidium andersoni e Cryptosporidium ryanae. Os bezerros infectados apresentavam baixa eliminação de oocistos de Cryptosporidium spp. Não houve sendo que não houve relação da positividade com todas as variáveis estudadas. No sequenciamento foi encontrado as espécies de C. andersoni e C. ryanae, inclusive parasitando bezerros em faixas etárias, não relatadas na literatura. Estas duas espécies de Cryptosporidium, caracterizados molecularmente (Nested-PCR), no presente estudo, são descritas pela primeira vez parasitando bovinos do estado de Minas Gerais, Brasil / Cryptosporidiosis is a waterborne disease, has as aggravating the difficulty of preventing environmental contamination and the absence of effective therapeutic measures. With pronounced importance to the cattle, causes villous atrophy and inflammation resulting in loss of intestinal absorption surface. The present study aimed to characterize molecularly infection by Cryptosporidium spp. calves in the City of Formiga, Midwest region of Minas Gerais. A total of 300 stool samples from Holstein calves, and Nelore breed were evaluated by negative contrast staining of malachite green and through the reaction of nested-PCR for amplification of DNA fragments of the 18S subunit of the RNA gene ribosomal. Occurrence of 5.33% (16/300) for malachite green and 4.66% (14/300) were observed by PCR, and by molecular characterization were identified species Cryptosporidium andersoni and Cryptosporidium ryanae. Calves infected had lower elimination of Cryptosporidium spp. There was no positive relationship with all the variables. Sequencing were found in the species C. andersoni and C. ryanae, including parasitizing calves in age, not reported in the literature. These two species of Cryptosporidium, molecularly characterized (nested PCR), the present study describes for the first time parasitizing cattle in the state of Minas Gerais, Brazil

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-08Bitstream added on 2014-11-10T11:57:46Z : No. of bitstreams: 1 000791056.pdf: 1521345 bytes, checksum: 03c061fa4f15b07c0492cc0bf73a460a (MD5) / Os objetivos deste trabalho foram comparar os métodos de diagnóstico por ensaio imunoenzimático (ELISA) de captura e reação em cadeia da polimerase (nested-PCR) à análise morfológica utilizando a técnica de centrífugo-flutuação em água-éter seguida de coloração de Kinyoun modificada (microscopia) para estimar a taxa de eliminação de oocistos de Cryptosporidium spp. na população de gatos domiciliados na zona urbana do Município de Araçatuba, São Paulo. O potencial zoonótico do coccídio isolado em fezes deste hospedeiro foi investigado por meio de caracterização molecular. Um total de 138 amostras fecais foi colhido de forma aleatória simples e proporcional à população de gatos de cada uma das sete áreas censitárias pertencentes à zona urbana do município. Não houve discordância entre ELISA de captura e microscopia (p = 1,0000) nem entre nested-PCR e microscopia (p = 0,1094); entretanto, o grau de concordância variou de substancial (Kappa = 0,7948) a moderado (Kappa = 0,4647), respectivamente, entre estes métodos. Especificidade da nested-PCR e do ELISA de captura foi semelhante; entretanto, a nested-PCR apresentou menor sensibilidade, justificada pela associação entre a intensidade da densidade óptica e a amplificação da subunidade 18S do rRNA. Detectamos oocistos de Cryptosporidium spp. em 9,4% das amostras por pelo menos dois métodos diagnósticos. Com intervalo de 95% de confiança, estimamos que a taxa de eliminação de oocistos desse protozoário na população felina do município variou de 4,5% a 14,3%. Todos os isolados sequenciados apresentaram 100% de similaridade com Cryptosporidium felis. Concluímos que gatos domiciliados possam contribuir para a contaminação ambiental de um município, ainda que C. felis não seja o principal agente etiológico da criptosporidiose em seres humanos / The aim of this work was to compare the diagnostic methods by capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and polymerase chain reaction (nested-PCR) to morphological analysis using the technique of flotation in water-ether followed by modified Kinyoun staining (microscopy) to estimate the shedding rate of Cryptosporidium spp. in stool samples of cats domiciled in urban area of municipality of Araçatuba, São Paulo State. Zoonotic potential of coccidian isolated in feces was investigated by molecular characterization. A total of 138 stool samples were collected random and proportionally from to cat population in each of the seven census areas belonging to the urban area. There was no disagreement between capture ELISA and microscopy (p = 1.0000) or between nested-PCR and microscopy (p = 0.1094); however, the degree of agreement varied from substantial (Kappa = 0.7948) to moderate (Kappa = 0.4647), respectively, in these diagnostic methods. Specificity of nested-PCR and ELISA capture were similar; however, the nested-PCR showed lower sensitivity, justified by the association between the intensity of the optical density and amplification of 18S rRNA subunit. We detected Cryptosporidium spp. in 9.4% of the samples by at least two diagnostic methods. With the 95% confidence, we estimate that shedding rate of Cryptosporidium oocysts ranged from 4.5% to 14.3% in the feline population of Araçatuba. All isolates sequenced showed 100% similarity with Cryptosporidium felis. We conclude that cats domiciled can contribute to environmental contamination of a municipality, although C. felis is not the primary etiologic agent of cryptosporidiosis in humans

Orientador: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca:Sandra Valéria Inácio / Banca:Jancarlo ferreira Gomes / Resumo: Cryptosporidium spp. é um protozoário que completa seu ciclo biológico na superfície de células epiteliais do trato gastrintestinal, respiratório e urinário de mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes. Foi incluído na Iniciativa das Doenças Negligenciadas da Organização Mundial da Saúde (OMS) por sua estreita relação à população com baixo poder aquisitivo e precárias condições de saneamento básico. Esse gênero de parasito causa doença clínica e subclínica em Psitaciformes, com detecção de Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium baileyi, Cryptosporidium galli e dos genótipos I, II, III, IV e V. A calopsita é um dos psitacídeos mais vendidos atualmente, sendo frequentemente encontrada em residências. O contato próximo com humanos é motivo de preocupação, uma vez que pode ser reservatório desse coccídio intestinal, sendo imprescindível atentar para medidas de prevenção, controle e diagnóstico dessa enfermidade parasitária. Os métodos baseados na microscopia são mais utilizados para o diagnóstico de Cryptosporidium spp., por serem menos onerosos. No entanto, apenas a caracterização molecular é capaz de identificar a espécie de Cryptosporidium spp. Em relação ao tratamento dessa enfermidade em aves, é importante ressaltar que ainda não há quimioterapia efetiva disponível. Boas condições de higiene e saneamento básico são essenciais, a fim de prevenir e controlar surtos dessa enfermidade em humanos e animais. / Abstract: Cryptosporidium spp. is protozoa that complete their biological cycle on the surface of epithelial cells of the gastrointestinal, respiratory and urinary tract of mammals, birds, reptiles, amphibians and fish. This parasite was included in the World Health Organization's Neglected Diseases Initiative because of its close relationship to the population with low purchasing power and poor basic sanitation conditions. This infection causes clinical and subclinical disease in Psitaciformes with detection of Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium baileyi, Cryptosporidium galli and genotypes I, II, III, IV and V. The cockatiel is one of the best selling psittacines currently found in homes. Close contact with humans is cause for concern, since they may be reservoirs of this coccidia, being essential to watch for measures of prevention, control and diagnosis of this parasitic disease. The methods based on the microscopy are more used for the diagnosis of cryptosporidiosis, because they are less expensive. However, only molecular characterization is able to identify the species of Cryptosporidium spp. in relation to the treatment of this disease in poultry, it is important to emphasize that there is still no effective chemotherapy available. Good hygiene and basic sanitation conditions are essential, in order to prevent and control disease in animals and animals. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-08-09Bitstream added on 2014-06-13T18:31:12Z : No. of bitstreams: 1 aquino_mcc_me_araca.pdf: 684677 bytes, checksum: 7318d697f23b509c8008184e6a67c272 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / om o objetivo de determinar a ocorrência e caracterizar molecularmente a infecção por Cryptosporidium spp. em bezerros bubalinos do Estado de São Paulo, Brasil, foram colhidas 222 amostras fecais de animais da raça Murrah, com até seis meses de idade. As amostras foram avaliadas pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada e por meio da reação em cadeia da polimerase tipo nested (nPCR) para amplificação de fragmentos de DNA da subunidade 18S do gene do RNA ribossômico e sequenciamento dos fragmentos amplificados. Pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada, foi detectada positividade de 8,1% (18/222), e pela nPCR, foi observada amplificação em 48,2% (107/222) das amostras, das quais 63 foram sequenciadas. A análise das sequências obtidas mostrou que a espécie mais frequente nesses animais foi Cryptosporidium ryanae, em bezerros bubalinos a partir de cinco dias de idade. A espécie zoonótica Cryptosporidium parvum foi detectada em apenas um animal e um genótipo incomum, similar a Cryptosporidium sp. W20486, foi encontrado, pela primeira vez em búfalos / With the aim of determining the occurrence and molecularly characterizing infection by Cryptosporidium spp. in buffalo calves from São Paulo State, Brazil, 222 fecal samples were collected from Murrah animals aged up to six months. The samples were assessed by means of modified Ziehl-Neelsen technique and nested polymerase chain reaction (nPCR) for amplification of DNA fragments from subunit 18S of the gene of ribosomal RNA and sequencing of the amplified fragments. The modified Ziehl-Neelsen technique indicated 8.1% positivity (18/222), while nPCR revealed amplification for 48.2% (107/222) samples, of which 63 were sequenced. The analysis of the obtained sequences showed that the most frequent species in these animals was Cryptosporidium ryanae, present in buffalo calves from five days of age. The zoonotic specie Cryptosporidium parvum was detected in only one animal, and an uncommon genotype, similar to that of Cryptosporidium sp. W20486, was found for the first time in buffaloes

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-12Bitstream added on 2014-06-13T18:55:51Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_fp_me_araca.pdf: 209460 bytes, checksum: 16f297129399701b5967432ef69fe128 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Um total de 196 amostras fecais de bezerros leiteiros mestiços, de 7 a 30 dias de idade de ambos o sexos foram colhidas em 31 propriedades com o objetivo de determinar a ocorrência de Cryptosporidium na região Noroeste do Estado de São Paulo, assim como caracterizar molecularmente as espécies envolvidas nesta parasitose. Realizou-se a análise microscópica pela técnica de coloração negativa com verde malaquita em todas as amostras de fezes. Para identificação molecular de Cryptosporidium, utilizou-se a reação de nested PCR, utilizando primers específicos para amplificação de fragmentos do gene codificador da subunidade 18S do RNA ribossômico e do gene da glicoproteína GP 60, submetendo o produto da PCR a sequenciamento e análise filogenética. Por meio de exame de fezes, foi observada positividade de 2% (4/196), por meio de microscopia, e de 10,7% (21/196) pela nested PCR. Como resultado do sequenciamento, foram identificadas quatro espécies de Cryptosporidium: C. parvum (subtipo IIa15G2R1) C. ryanae, C. bovis e C. andersoni. Esta descoberta de C. parvum subtipo IIaA15G2R1 na região estudada ilustra a utilidade da subtipagem. Embora estes resultados iniciais baseados em subtipos com GP60 sejam úteis para compreender a dinâmica de transmissão das espécies de Cryptosporidium, o número de amostras analisadas é relativamente pequeno e muito mais ainda pode ser pesquisado. É interessante notar que as informações de tipagem molecular com o gene 18S rRNA e a subtipagem com o gene GP60, permitem que os epidemiologistas possam rastrear as fontes de surtos das diferentes espécies de Cryptosporidium. / A total of 196 fecal samples from crossbred calves, 7-30 days old of both sexes were collected in 31 properties with the objective of determining the prevalence of Cryptosporidium in the northwestern region of São Paulo, as well as characterizing the molecular species involved in this parasite. We performed microscopic analysis by the technique of negative staining with malachite green in all stool samples. For molecular identification of Cryptosporidium, we used the reaction of nested PCR using specific primers for amplification of gene fragments coding for the 18S subunit ribosomal RNA gene and the glycoprotein GP 60 by subjecting the PCR product sequencing and phylogenetic analysis. By stool examination, positivity was observed 2% (4 / 196) by means of microscopy, and 10.7% (21/196) by nested PCR. As a result of sequencing, we identified four species of Cryptosporidium: C. parvum (subtype IIa15G2R1) C. Ryanair, C. bovis and C. andersoni. This discovery of C. IIaA15G2R1 parvum subtype in the studied region illustrates the usefulness of subtyping. Although based on these initial results with GP60 subtypes are useful for understanding the transmission dynamics of the species of Cryptosporidium, the number of samples is relatively small and much more can still be searched. It is interesting to note that the information of molecular typing with 18S rRNA gene and subtyping with the GP60 gene, allow epidemiologists can track sources of outbreaks of different species of Cryptosporidium.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-12-13Bitstream added on 2014-06-13T19:55:43Z : No. of bitstreams: 1 teixeira_wfp_me_araca.pdf: 257034 bytes, checksum: 74c2e0dcd5f52341aac3382521691e4d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi padronizar a reação de Imunofluorescência direta (IFD) para detecção de oocistos de Cryptosporidium parvum em amostras fecais de bezerros. Os anticorpos policlonais anti-C. parvum foram produzidos em dois coelhos adultos da raça Nova Zelândia, e titulados por meio do ensaio imuno-enzimático indireto (ELISA). A fração de imunoglobulina G (IgG) foi purificada a partir do soro do coelho imunizado, utilizando-se diálise em sulfato de amônio seguida de cromatografia em coluna de DEAE celulose e conjugação com isotiocianato de fluoresceína. Por meio da IFD padronizada, foi testada a reatividade cruzada do conjugado produzido contra outras espécies de Cryptosporidium (C. andersoni e C. serpentis) e com outros agentes etiológicos presentes em fezes de bovinos (Escherichia coli, Eimeria sp. e Candida sp.). A IFD foi comparada à microscopia com contraste de fase em solução de Sheather (MCF), avaliando a capacidade de detecção de oocistos de Cryptosporidium sp. em alíquotas de fezes de bezerro inoculadas com oocistos de C. parvum, e em amostras fecais de bezerros naturalmente infectados provenientes de 37 propriedades leiteiras da região de Araçatuba, SP. Nas amostras comprovadas como positivas, foi ainda feita uma análise semi-quantitativa de oocistos de Cryptosporidium sp., visualizados por campo de microscopia em ambas as técnicas. O conjugado anti-C. parvum apresentou reatividade com C. andersoni e C. serpentis. A IFD foi utilizada com sucesso para detecção de oocistos de C. parvum em fezes de bezerros, apresentando sensibilidade para detecção de até 104 oocistos em 3 g de fezes. Entre as 300 amostras fecais de bezerros naturalmente infectados, 19,67% (59/300) foram positivas para a presença de oocistos de Cryptosporidium sp. pela IFD, apresentando diferença estatisticamente significante (p<0.05) em relação às amostras positivas pela MCF / The objective of this experiment was to standardize the direct immunofluorescence assay (DIF) for detection of Cryptosporidium parvum oocysts in fecal samples of calves. The anti-C. parvum polyclonal antibodies were produced in two adult rabbits of New Zealand breed, and titrated by an indirect enzyme-linked immunosorbent (ELISA). The immunoglobulin G (IgG) was purified from the serum of immunized rabbits by dialysis in ammonium sulfate followed by column chromatography on DEAE cellulose, and conjugated with fluorescein isothiocyanate. Using DIF the anti-C. parvum conjugate was tested for the presence of cross-reactivity against other species of Cryptosporidium (C. andersoni and C. serpentis), and other infectious agents present in cattle fecal samples (Escherichia coli, Eimeria sp. and Candida sp.). A comparison between the DIF and phase contrast microscopy in Sheather solution (MCF) was accomplished for evaluation of the efficiency of both techniques for detection of Cryptosporidium sp. oocysts in fecal samples of calves seeded with C. parvum oocysts, and in fecal samples from naturally infected calves from 37 dairy farms in the region of Araçatuba, SP. A semi-quantitative analysis of Cryptosporidium sp. oocysts per microscopic field was accomplished for both techniques. The anti-C. parvum conjugate showed cross-reactivity with C. andersoni and C. serpentis oocysts. The DIF has been used successfully in the detection of C. parvum oocysts in fecal samples of calves, with sensitivity for detecting 104 oocysts in 3 g of fecal samples. Among the 300 fecal samples from naturally infected calves, 19.67% (59/300) were positive for Cryptosporidium oocysts by DIF, with significant statistical difference (p <0.05) when compared to the number of positive samples by MCF

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-30. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:09Z : No. of bitstreams: 1 000870502.pdf: 1430602 bytes, checksum: eba1658f28dab4763efaa8eafcf24462 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The eimeriosis is an important parasitic disease in rabbits, that can host 11 species of Eimeria. Cryptosporidiosis is a zoonotic disease that can be transmitted through food, drinking water and by contact with infected animals and people. The objective of this study was to verify the occurrence of Eimeria spp. and Cryptosporidium spp. in fecal samples of rabbits, perform their molecular classification and relate the presence of the parasites to the different categories in the Brazilian farms. Fecal samples (n = 514) were collected from 21 farms. The oocysts were purified and visualized by microscopy. Fifty five samples positive for Eimeria spp. using microscopy were subjected to polymerase chain reaction (PCR) for amplification of a partial fragment of the ITS1 region of the rRNA gene of Eimeria spp. and the 18S rRNA and the gp60 glycoprotein genes of Cryptosporidium spp.. The microscopy revealed positivity of 19.45% (100/514) for Eimeria spp. and 1.56% (8/514) for Cryptosporidium spp.. The PCR identified E. exigua (14.5%), E. flavescens (61.8%), E. intestinalis (16.36%), E. irresidua (16.4%), E. magna (50.9 %), E. media (3.6%), E. perforans (36.4%), E. piriformis (20.0%), E. stiedai (7.3%) and E. vejdovskyi (7.3 %). Higher positivity was observed in mini rabbits 33.17% (69/208), young rabbits 46.67% (35/75) and in lactating females 24.47% (23/94). Seven samples were positive by PCR (12.73%; 7/55) for Cryptosporidium spp.. Molecular analysis revealed Cryptosporidium cuniculus (18S rRNA) and C. cuniculus subtype VbA21 (gp60) in young rabbits and in does

Submitted by Vinícius da Silva Camargo null (viniciuscamargo.biologo@yahoo.com.br) on 2018-02-06T00:15:46Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Vinicius FINAL.pdf: 523374 bytes, checksum: fa2400897eda6d16d5e9d42d2da8984e (MD5) / Approved for entry into archive by Isabel Pereira de Matos null (isabel@fmva.unesp.br) on 2018-02-07T13:04:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 camargo_vs_me_araca_int.pdf: 523374 bytes, checksum: fa2400897eda6d16d5e9d42d2da8984e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-07T13:04:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 camargo_vs_me_araca_int.pdf: 523374 bytes, checksum: fa2400897eda6d16d5e9d42d2da8984e (MD5) Previous issue date: 2017-12-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este trabalho teve como objetivos determinar a ocorrência e realizar a caracterização molecular de Cryptosporidium spp. e comparar três métodos de detecção deste protozoário em amostras fecais de canários (Serinus canaria) criados em cativeiro nas regiões Sul e Sudeste do Brasil. Um total de 498 amostras foi purificado por centrífugo-flutuação em solução de Sheather. A detecção de Cryptosporidium spp. foi realizada utilizando três métodos de diagnóstico: análise microscópica pela coloração negativa com verde malaquita, nested PCR (gene 18S rRNA), seguida de sequenciamento dos fragmentos amplificados, e PCR em duplex em tempo real (gene 18S rRNA) específica para detecção de Cryptosporidium galli e Cryptosporidium genótipo III de aves. A positividade para Cryptosporidium spp. (total de amostras positivas em pelo menos um método de diagnóstico) obtida pela análise microscópica, nested PCR e PCR duplex em tempo real foi de 13,3% (66/498). As taxas de positividade para Cryptosporidium spp. foram 2,0% (10/498) e 4,6% (23/498) por microscopia e nested PCR, respectivamente. O sequenciamento de 20 amostras amplificadas pela nested PCR identificou C. galli (3,0%;15/498), Cryptosporidium genótipo I de aves (0,8%; 4/498) e Cryptosporidium avium (0,2%; 1/498). A PCR duplex em tempo real revelou positividade de 7,8% (39/498) para C. galli e 2,4% (12/498) para Cryptosporidium genótipo III de aves. A análise microscópica diferiu significativamente da nested PCR para detecção de Cryptosporidium spp. A PCR duplex em tempo real apresentou maior sensibilidade que a nested PCR/sequenciamento para detectar as espécies/genótipos gástricos de Cryptosporidium. / This study used several diagnostic methods to examine the occurrence of and molecularly characterize Cryptosporidium spp. in captive canaries (Serinus canaria) in southern and southeastern Brazil. A total of 498 samples were purified by centrifugal-flotation using Sheather's solution. Cryptosporidium spp. diagnosis was performed using three diagnostic methods: malachite green negative staining, nested PCR targeting the 18S rRNA gene, followed by sequencing the amplified fragments, and duplex real-time PCR targeting the 18S rRNA specific to detect Cryptosporidium galli and Cryptosporidium avian genotype III. The overall positivity for Cryptosporidium spp. (total samples positive in at least one protocol) from the microscopic analysis, nested PCR and duplex real-time PCR protocol results was 13.3% (66/498). The positivity rates were 2.0% (10/498) and 4.6% (23/498) for Cryptosporidium spp. by microscopy and nested PCR, respectively. Sequencing of 20 samples amplified by nested PCR identified C. galli (3.0%; 15/498), Cryptosporidium avian genotype I (0.8%; 4/498) and Cryptosporidium avium (0.2%; 1/498). Duplex real-time PCR revealed a positivity of 7.8% (39/498) for C. galli and 2.4% (12/498) for avian genotype III. Malachite green negative staining differed significantly from nested PCR in detecting Cryptosporidium spp.. Duplex real-time PCR was more sensitive than nested PCR/sequencing for detecting gastric Cryptosporidium in canaries. / FAPESP: 15/26334-8

Orientador: Alvimar José da Costa / Coorientador: Antônio Sérgio Ferraudo / Banca: Kátia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Gilson Pereira de Oliveira / Banca: Claudio Alessandro Massamitsu Sakamoto / Banca: Welber Daniel Zanetti Lopes / Resumo: A criptosporidiose é uma enfermidade de veiculação hídrica, possui como agravante a dificuldade de prevenção da contaminação ambiental e ausência de medidas terapêuticas eficazes. Com acentuada importância na bovinocultura, ocasiona inflamação e atrofia das vilosidades intestinais resultando em perda da superfície de absorção. O presente estudo teve como objetivo caracterizar molecularmente a infecção por Cryptosporidium spp. em bezerros do Município de Formiga, região Centroeste de Minas Gerais. Um total de 300 amostras de fezes de bezerros holandeses, nelore e sem raça definida, foram avaliadas pela técnica de coloração contraste negativo de verde malaquita e por meio da reação de nested-PCR para amplificação de fragmentos de DNA da subunidade 18S do gene do RNA ribossômico. Ocorrência de 5,33% (16/300) pelo verde malaquita e 4,66% (14/300) pela PCR foram observadas, sendo que por meio da caracterização molecular foram identificadas as espécies Cryptosporidium andersoni e Cryptosporidium ryanae. Os bezerros infectados apresentavam baixa eliminação de oocistos de Cryptosporidium spp. Não houve sendo que não houve relação da positividade com todas as variáveis estudadas. No sequenciamento foi encontrado as espécies de C. andersoni e C. ryanae, inclusive parasitando bezerros em faixas etárias, não relatadas na literatura. Estas duas espécies de Cryptosporidium, caracterizados molecularmente (Nested-PCR), no presente estudo, são descritas pela primeira vez parasitando bovinos do estado de Minas Gerais, Brasil / Abstract: Cryptosporidiosis is a waterborne disease, has as aggravating the difficulty of preventing environmental contamination and the absence of effective therapeutic measures. With pronounced importance to the cattle, causes villous atrophy and inflammation resulting in loss of intestinal absorption surface. The present study aimed to characterize molecularly infection by Cryptosporidium spp. calves in the City of Formiga, Midwest region of Minas Gerais. A total of 300 stool samples from Holstein calves, and Nelore breed were evaluated by negative contrast staining of malachite green and through the reaction of nested-PCR for amplification of DNA fragments of the 18S subunit of the RNA gene ribosomal. Occurrence of 5.33% (16/300) for malachite green and 4.66% (14/300) were observed by PCR, and by molecular characterization were identified species Cryptosporidium andersoni and Cryptosporidium ryanae. Calves infected had lower elimination of Cryptosporidium spp. There was no positive relationship with all the variables. Sequencing were found in the species C. andersoni and C. ryanae, including parasitizing calves in age, not reported in the literature. These two species of Cryptosporidium, molecularly characterized (nested PCR), the present study describes for the first time parasitizing cattle in the state of Minas Gerais, Brazil / Doutor

Orientador: Marcelo Vasconcelos Meireles / Banca:Juliana Peloi Vides / Banca:Heito Flávio Ferrari / Banca: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca:Cáris Maroni Nunes / Resumo: O presente trabalho objetivou a identificação e caracterização molecular de isolados de Cryptosporidium em amostras fecais de cães e gatos, bem como o desenvolvimento de uma reação em cadeia pela polimerase (PCR) em tempo real para detecção específica de Cryptosporidium canis em amostras fecais de cães. Trezentas amostras fecais de gatos e 367 amostras fecais de cães foram colhidas nas cidades de Araçatuba e Jaboticabal (SP) e submetidas aos processos de purificação e extração de DNA. "Nested" PCR (nPCR) para o gene 18S do rRNA foi realizada para identificação de Cryptosporidium spp., seguido de seqüenciamento dos fragmentos amplificados. Uma reação de PCR em tempo real para um fragmento parcial do gene HSP70 foi padronizada para a detecção de Cryptosporidium canis em amostras fecais de cães. A positividade para Cryptosporidium spp. pela nPCR em amostras de gatos foi de 11,33% (34/300), e em amostras cães foi de 10,4% (38/367). A PCR em tempo real resultou em 15,3% (58/367) de amostras positivas para C. canis. Foi possível a identificação por meio de seqüenciamento de três amostras positivas para C. felis e seis amostras positivas para C. canis. Foi observada uma maior positividade em filhotes quando comparados a cães adultos. A sensibilidade analítica da PCR em tempo real foi de uma cópia de DNA de C. canis por reação e não foi observada amplificação inespecífica de DNA de outras espécies de Cryptosporidium. Conclui-se que cães e gatos das regiões estudad... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract:This study aimed the identification and molecular characterization of Cryptosporidium isolate s in stool samples from dogs and cats, as well as the development of a polymerase chain reaction (PCR) in real time to specific detection of Cryptosporidium canis in fecal samples from dogs. Three hundred fecal samples from cats and 367 fecal samples from dogs were collected in the cities of Araçatuba and Jaboticabal (SP) and subjected to the processes of purification and DNA extraction. Nested PCR (nPCR) for the 18S rRNA gene was performed for identification of Cryptosporidium spp., f ollowed by sequencing of the amplified fragments. A real time PCR to a partial fragment of the HSP70 gene was standardized for detection of Cryptosporidium canis in dogs fecal samples. The positivity for Cryptosporidium spp. by nPCR in cats samples was 11.33% (34/300), and in d og samples was 10.4% (38/367). The real - time PCR resulted in 15.3% (58/367) of samples positive for C. canis . The sequencing of the amplified fragments allowed the identification of three samples positive for Cryptosporidium felis and six samples positive for C. canis . A higher positivity was observed in pup pie s and kittens when compared to adult animals . The analytical sensitivity of real - time PCR was 1 copy of DNA of C. canis and was not observed DNA amplification for other species of Cryptosporidium . We c oncluded that dogs and cats n of the investigated regions can present infected for zoonotic species of Cryptosporidium and the real - time PCR developed in this work is a sensitive and specific method for detection of C. canis in fecal samples from dogs / Doutor