Durante la fertilización el núcleo del espermatozoide queda inmerso en el citoplasma del ovocito, y seguidamente, se transforma en el pronúcleo masculino. La formación del pronúcleo masculino se refiere al proceso de recambio de las proteínas básicas (polipéptidos especializados) que compactan el DNA (cromatina espermática) por histonas de tipo somático y/o embrionarias. Éste recambio es un prerequisito para que la interacción (recombinación) entre ambos genomas parentales ocurra a fin de generar una cromatina potencialmente activa. De forma habitual, estos cambios bioquímicos que se producen durante la remodelación de la cromatina espermática son referidos al proceso de descondensación del núcleo espermático.En particular, la remodelación de la cromatina del espermatozoide de Xenopus laevis ha sido ampliamente estudiada. En ovocitos y huevos de Xenopus se ha demostrado que la nucleoplasmina (NPL) es responsable de remover y recambiar las proteínas específicas (X e Y) del núcleo espermático por las histonas somáticas H2A y H2B siendo el resultado la reconstitución de una cromatina somática en el pronúcleo masculino. Por otro lado, la NPL es activa en remodelar la cromatina de los espermatozoides de diversas especies, tales como: Drosophila, algunos invertebrados marinos (es el caso de Mytilus y Spisula), peces (Salmón y Caballa), e incluso es capaz de remodelar la cromatina del espermatozoide humano. En Drosophila, Mytilus y Spisula se han identificado las proteínas responsables de la descondensación de la cromatina espermática de sus respectivas especies. La caracterización de éstas proteínas establece similitud con la NPL de Xenopus y por esta razón han sido referidas como NPL-like. Sobre estos antecedentes se ha planteado que la NPL de Xenopus tendría un rol funcional universal y sería el modelo de molécula responsable de la remodelación de la cromatina del espermatozoide.Dependiendo de la naturaleza de las proteínas específicas o especializadas que se asocian al DNA para su compactación; la cromatina espermatica puede organizarse entre dos tipos extremos: como núcleohistona (las proteínas especializadas son histonas o histonas modificadas) o como núcleoprotamina (las proteínas especializadas son del tipo de las protaminas). Entre estos dos tipos, la cromatina espermática puede organizarse en una amplia variedad de formas considerando que los polipéptidos especializados corresponde a un grupo de proteínas diversas; éstos tipos de cromatina podrían ser referidos a un amplio grupo intermedio. Considerando éste breve análisis sobre la organización de la cromatina espermática es evidente que el modelo de la remodelación de la cromatina espermática mediada por la NPL o NPL-like ha sido planteado sobre la remodelación de la cromatina espermática del tipo núcleoprotamina. Un antecedente adicional se refiere al hecho que la NPL es muy poco eficiente en remodelar la cromatina espermática de Rana catesbeiana, la cual corresponde a un tipo de cromatina organizada como núcleohistona. En base a estas consideraciones, el objetivo de está Tesis fue determinar la presencia de una molécula tipo NPL en los ovocitos de Holothuria tubulosa (Echinodermata), la cromatina espermática de ésta especie se organiza en forma de núcleohistona con la presencia adicional de una proteína específica denominada 0. La hipótesis general que se plantea es que los mecanismos y las moléculas responsables de la remodelación de la cromatina espermática deben ser diferentes dependiendo del tipo de organización de la cromatina del espermatozoide.Los resultados demuestran que los extractos de ovocitos de Holothuria tubulosa exhaustivamente fraccionados no contienen NPL o NPL-like. Pero alternativamente identificamos y caracterizamos en forma parcial una proteína que funcionalmente in-vitro es responsable de la remoción de la proteína específica 0 del núcleo espermático, y en ésta situación produce descondensación de la cromatina del espermatozoide. Ésta proteína ha sido denominada PR0 por su actividad funcional como proteína que remueve la 0 espermática. Por otro lado, la NPL de Xenopus es incapaz de remodelar la cromatina del espermatozoide de Holothuria tubulosa, pero es capaz de remodelar la cromatina espermática que contiene protamina típica (núcleoprotamina). Por lo contrario, la PR0 no remodela la cromatina de tipo núcleoprotamina.La conclusión principal de la Tesis es que el ovocito de Holothuria tubulosa debe poseer un mecanismo de remodelación de su cromatina espermática diferente y alternativo al descrito en Xenopus laevis. Los mecanismos de remodelación de la cromatina espermática podrían estar relacionados con las proteínas especializadas que organizan la cromatina del núcleo del espermatozoide. Por último, la carencia de NPL o NPL-like en los ovocitos de Holothuria tubulosa cuestionan el rol universal asignado a la NPL como molécula responsable de la remodelación de la cromatina del espermatozoide. / The sperm nucleus following fertilization remains into the egg cytoplasm, and subsequently, it results in sperm nuclear decondensation and formation of a functional male pronucleus. This includes the replacement of sperm nuclear basic proteins (specialized polypeptides) involved in DNA condensation in sperm nuclei (spermatic chromatin) by somatic and/or embryonic histones. This event is a prerequisite so that the interaction (recombination) among both parental genomes occurs in order to generate a functional chromatin. In a customary way, these biochemical changes that are produced during the remodeling of the spermatic chromatin are associated to the process of decondensation of the spermatic nuclei.In particular, the remodeling of the sperm chromatin of Xenopus laevis has been widely studied. In oocytes and eggs of Xenopus has been demonstrated that nucleoplasmin (NPL) is responsible for removal and replacement of the specific proteins (X and Y) of the spermatic nuclei by somatic H2A and H2B histones being the result the reconstitution of a somatic chromatin in the male pronuclei. On the other hand, NPL is active in remodeling the sperm chromatin of various kinds, such as: Drosophila, some marine invertebrates (as is the case of Mytilus and Spisula), fish (Salmon and Mackerel), and even it is able to remodel the human sperm chromatin. In Drosophila, Mytilus and Spisula have been identified the responsible proteins for the sperm chromatin decondensation of their respective kinds. The characterization of these proteins establishes similarity with the NPL of Xenopus and for this reason have been considered as NPL-like. On these precedents it has been suggested that the NPL of Xenopus would have a universal functional role and would be the responsible molecule for remodeling the sperm chromatin.Depending on the nature of the specialized or specific proteins that are associated to the DNA packing; the sperm chromatin can be organized in two extreme types: as nucleohistone (the specialized proteins are histones or modified histones) or as nucleoprotamine (the specialized proteins are of the type of the protamines). Among these two types, the spermatic chromatin can be organized in a wide variety considering that the specialized polypeptides correspond to a group of diverse proteins; these types of chromatin could be referred to as a wide intermediate group. Taking into account this short analysis on the organization of the sperm chromatin is evident that the remodeling model of the sperm chromatin mediated by the NPL or NPL-like it has been based on the remodeling of the spermatic chromatin of the type nucleoprotamine. An additional precedent is referred to cause that the NPL is very little efficient in remodeling the sperm chromatin of Rana catesbeiana, the which one corresponds to a form of chromatin organized as nucleohistone.By these considerations, the purpose of this Thesis was determined the presence of a molecule type NPL in the Holothuria tubulosa (Echinodermata) oocytes, the spermatic chromatin of this kind is organized in the form of nucleohistone with the additional presence of a specific protein named 0. The general hypothesis is that the mechanisms and the responsible molecules for the remodeling of the sperm chromatin should be different depending on the type on organization on the sperm chromatin.The results demonstrate that the extracts of Holothuria tubulosa oocytes thoroughly fractioned do not contain NPL or NPL-like. But alternatively we identify and characterize in partial form a protein that functionally in-vitro is responsible for the removal of the specific protein 0 of the spermatic nuclei, and in this situation produces decondensation of the sperm chromatin. This protein has been termed PR0 due to its functional activity as a protein that removes the spermatic 0. On the other hand, the NPL of Xenopus is unable to remodel the sperm chromatin of Holothuria tubulosa, but it is able to remodel the sperm chromatin that contains typical protamine (nucleoprotamine). On the contrary, the PR0 does not remodel the chromatin of the type nucleoprotamine.The essential conclusion of the Thesis is that the Holothuria tubulosa oocyte must possess a remodeling mechanism of its sperm chromatin different and alternative that to described for Xenopus laevis. The remodeling mechanisms of the sperm chromatin could be related to the specialized proteins that organize the sperm chromatin. Finally, the lack of NPL or NPL-like in the Holothuria tubulosa questions the universal role assigned to the NPL as responsible molecule for the remodeling of the sperm chromatin.

Drosophila telomere maintenance depends on the transposition of three specialized retrotransposons – HeT-A, TART and TAHRE (HTT). Controlling the activation and silencing of these elements is crucial to maintain telomere length homeostasis without compromising genomic instability. In this thesis, I have identified the role of different chromosomal proteins involved in creating the correct chromatin environment to achieve telomere length homeostasis and stability. JIL-1, together with HP1a and Z4, act as a boundary at the telomere-subtelomere frontier. The interplay of these proteins leads to an equilibrium in the activation/repression state of the telomere retrotransposons. Additionally, I have contributed to the finding that the HeT-A Gag protein is a key component targeting different protein complexes to the telomeres and guaranteeing genome stability. I have also been able to demonstrate that the Z4 partners DREF, TRF2 and KEN are also involved in the silencing of HTT, probably by mediating chromatin remodeling. Finally, I have identified a special subtelomere domain at the 4R telomere with different chromatin characteristics and demonstrated that SETDB1, HP1a and POF are involved in the regulation of the telomeric retrotransposons in the 4th chromosome. These results provide important insights to better understand how in Drosophila the telomere retrotransposons are orchestrated to achieve a telomere function analogous to telomerase telomeres in other eukaryotes. / El manteniment dels telòmers de Drosophila depèn de la transposició especialitzada de tres retrotransposons, HeT-A, TART i TAHRE (HTT). El control de l’activació i la repressió d’aquests elements és crucial a l’hora de mantenir la llargada telomèrica sense comprometre l’estabilitat genòmica. En aquesta tesi jo he pogut identificar el paper de diferents proteïnes cromosòmiques involucrades en crear un estat de la cromatina adient per mantenir la longitud i l’estabilitat telomèrica. JIL-1 juntament amb HP1a i Z4 ajuden a crear el llindar entre la frontera dels domini telomèric i subtelomèric. L’actuació conjunta d’aquestes proteïnes aconsegueix un estat d’equilibri activació/repressió dels retrotransposons telomèrics. A més a més, he contribuït a la descoberta de la implicació de la proteïna HeT-A Gag en el reclutament de diferents complexes proteics als telomèrs de Drosophila per poder garantir l’estabilitat telomèrica. També he pogut demostrar que altres membres dels complexes on participa Z4, com ara: DREF, TRF2 i KEN, estan també implicats en el silenciament dels retrotransposons telomèrics segurament per mitjà de la remodelació de la cromatina. Finalment he pogut demostrar que el domini subtelomèric del telòmer 4R, té una estructura cromatínica diferent a la resta dels dominis subtelomèrics dels altres cromosomes i he pogut demostrar que les proteïnes SETDB1, HP1a i POF estan implicades en la regulació de l’HTT del cromosoma 4. Els resultats d’aquesta tesi ajuden de manera substancial a comprendre com els retrotransposons telomèrics estan orquestrats per tal de poder fer una funció anàloga als telòmers de telomerasa en altres eucariotes.

No presente estudo três concentrações de N-acetil-l-cisteina (NAC) foram avaliadas no diluente equino resfriado a 5°C através da motilidade do sêmen, integridade da cromatina espermática e choque hiposmótico sobre o ejaculado em diluente Kenney na proporção 1:2 com 50% de plasma seminal. O ejaculado de nove garanhões diluído na proporção 1:2 em meio Kenney foi dividido em 4 partes iguais e suplementado com 5,0, 2,5 e 0,5mM de NAC e um grupo não suplementado (0,0mM). As avaliações foram realizadas a fresco (0h), 24 e 48h de resfriamento. A análise de motilidade nos dois experimentos foi avaliada até às 24 horas. No experimento 2, a adição de 0,5 e 5,0mM de NAC resultou em áreas de dispersão da cromatina espermática similares (59,7 e 55,5μM2, respectivamente). Entretanto, a área de dispersão da cromatina no grupo não suplementado (65,3μM2) e com 2,5mM de NAC (52,8μM2) apresentou diferença (P<0,05). O percentual de células com membrana plasmática funcional foi similar entre o grupo não suplementado e o grupo suplementado com 0,5mM de NAC (39,7 e 39,8%, respectivamente), porém superior a NAC 2,5mM (34,5%) e 5,0mM (34,2%). A motilidade progressiva dos ejaculados suplementados com NAC foram similares entre si e somente o grupo NAC 0,5mM (35,2%) apresentou similaridade de células móveis com o grupo não suplementado (36,2%). Os maiores danos à cromatina espermática no sêmen equino diluído com 50% de plasma seminal mantido resfriado a 5°C ocorrem a partir de 24h de resfriamento. A adição de 2,5 e 5,0mM de NAC comprometem a motilidade e a funcionalidade de membrana espermática equina, mas não causa efeito deletério sobre a integridade do DNA. / In this study, three concentrations of N-acetyl- l-cysteine (NAC) were evaluated by sperm motility, membrane functionality (hypo-osmotic test), and sperm chromatin integrity. the hypo-osmotic test showed only 32.4% (P <0.05) of the cells having a functional membrane 12h into the cooling process, while the fresh semen (0h) was 53.5%. The percentage of motile cells decreased within 12h of cooling from 38.9 to 19.7%, with no difference between 12 and 24h of cooling. The tests of sperm chromatin dispersion and hypo-osmotic shock revealed similarities between the periods of cooling at 24 to 48h. In Experiment 2, the nine stallion ejaculates were divided into 4 equal parts, diluted in half with Kenney milk powder supplemented with 5.0, 2.5 and 0.5mM NAC and a group not supplemented (0.0mM). The evaluations were made fresh (0h), 24 and 48h after cooling. The analysis of motility was assessed in all experiments up to 24 hours. In experiment 2, the addition of 0.5 to 5.0mM NAC resulted in areas of similar sperm chromatin dispersion (59.7 and 55.5μM2, respectively). However, the area of the chromatin dispersion between non-supplemented group=0.0mM (65.3μM2) and 2.5mM NAC (52.8μM2) differ (P <0.05). The percentage of cells with plasma membrane function were similar between the supplemented with 0.5mM NAC and non-supplemented (0.0mM) groups with (39.7 and 39.8%, respectively), but higher than 2.5mM (34.5%) and 5.0mM (34.2%). Progressive motility of ejaculates supplemented with NAC were similar, but only the group with 0.5mM NAC which resulted in 35.2% of mobile cells showed similarities with the non-supplemented group (36.2%). The greatest damage to sperm chromatin in equine semen diluted with 50% seminal plasma kept cooled to 5°C was due to 24h cooling. The addition of 2.5 and 5.0mM NAC inhibits the mobility and functionality of the equine sperm membrane, but does not cause a deleterious effect on the integrity of the DNA.

Orientador: José Buratini Júnior / Resumo: Na produção in vitro (IVP), trabalha-se com uma população de oócitos heterogênea em relação ao estágio da maturação nuclear que estes oócitos se encontram, mais especificamente o estágio de vesícula germinativa (GV), uma vez que estes são obtidos de folículos em diferentes estágios de desenvolvimento. Visto que essa heterogeneidade impacta nos resultados da IVP, torna-se necessário que os processos de seleção de oócitos e de maturação in vitro sejam adequados e articulados, para que ocorra o desenvolvimento da competência oocitária para subsequente desenvolvimento. Neste estudo, objetivou-se avaliar a população de ovócitos obtida de folículos antrais grandes, testando a hipótese de que folículos dominantes saudáveis conteriam oócitos com grau intermediário de compactação da cromatina (oócitos em GV2). Em seguida, avaliou-se a população de oócitos obtida em dia aleatório do ciclo estral após OPU e testou-se o efeito de protocolo de sincronização combinando aspiração de folículos e tratamento com FSH para homogeneizar a população e controlar a qualidade dos oócitos. Os resultados sugerem que folículos dominantes saudáveis são predominantemente compostos por oócitos com níveis intermediários de compactação da cromatina e que protocolos de sincronização de aspiração do folículo combinadas ao tratamento com FSH podem ser úteis para controlar a qualidade do oócito para OPU / IVP. / Abstract: In vitro production (IVP), a heterogeneous oocyte population is employed in relation to the stage of nuclear maturation that these oocytes are found, more specifically the germinal vesicle (GV) stage, once they are obtained from follicles in different stages of development. Since this heterogeneity impacts the results of IVP, it is necessary that the processes of oocyte selection and in vitro maturation are adequate and articulated, so that occurs development of oocyte competence for subsequent development. The objective of this study was to evaluate the oocyte population obtained from large antral follicles, testing the hypothesis that healthy dominant follicles would contain oocytes with an intermediate degree of chromatin compaction (GV2 oocytes). Then we evaluated the population of oocytes obtained at random day of the estrous cycle after OPU and tested the synchronization protocol combining follicle aspiration and FSH treatment to homogenize the population and control the quality of oocytes. The results suggest that healthy dominant follicles are predominantly composed of oocytes with intermediate levels of chromatin compaction and that follicle aspiration synchronization protocols combined with FSH treatment may be useful to control oocyte quality for OPU / IVP. / Mestre

No presente estudo três concentrações de N-acetil-l-cisteina (NAC) foram avaliadas no diluente equino resfriado a 5°C através da motilidade do sêmen, integridade da cromatina espermática e choque hiposmótico sobre o ejaculado em diluente Kenney na proporção 1:2 com 50% de plasma seminal. O ejaculado de nove garanhões diluído na proporção 1:2 em meio Kenney foi dividido em 4 partes iguais e suplementado com 5,0, 2,5 e 0,5mM de NAC e um grupo não suplementado (0,0mM). As avaliações foram realizadas a fresco (0h), 24 e 48h de resfriamento. A análise de motilidade nos dois experimentos foi avaliada até às 24 horas. No experimento 2, a adição de 0,5 e 5,0mM de NAC resultou em áreas de dispersão da cromatina espermática similares (59,7 e 55,5μM2, respectivamente). Entretanto, a área de dispersão da cromatina no grupo não suplementado (65,3μM2) e com 2,5mM de NAC (52,8μM2) apresentou diferença (P<0,05). O percentual de células com membrana plasmática funcional foi similar entre o grupo não suplementado e o grupo suplementado com 0,5mM de NAC (39,7 e 39,8%, respectivamente), porém superior a NAC 2,5mM (34,5%) e 5,0mM (34,2%). A motilidade progressiva dos ejaculados suplementados com NAC foram similares entre si e somente o grupo NAC 0,5mM (35,2%) apresentou similaridade de células móveis com o grupo não suplementado (36,2%). Os maiores danos à cromatina espermática no sêmen equino diluído com 50% de plasma seminal mantido resfriado a 5°C ocorrem a partir de 24h de resfriamento. A adição de 2,5 e 5,0mM de NAC comprometem a motilidade e a funcionalidade de membrana espermática equina, mas não causa efeito deletério sobre a integridade do DNA. / In this study, three concentrations of N-acetyl- l-cysteine (NAC) were evaluated by sperm motility, membrane functionality (hypo-osmotic test), and sperm chromatin integrity. the hypo-osmotic test showed only 32.4% (P <0.05) of the cells having a functional membrane 12h into the cooling process, while the fresh semen (0h) was 53.5%. The percentage of motile cells decreased within 12h of cooling from 38.9 to 19.7%, with no difference between 12 and 24h of cooling. The tests of sperm chromatin dispersion and hypo-osmotic shock revealed similarities between the periods of cooling at 24 to 48h. In Experiment 2, the nine stallion ejaculates were divided into 4 equal parts, diluted in half with Kenney milk powder supplemented with 5.0, 2.5 and 0.5mM NAC and a group not supplemented (0.0mM). The evaluations were made fresh (0h), 24 and 48h after cooling. The analysis of motility was assessed in all experiments up to 24 hours. In experiment 2, the addition of 0.5 to 5.0mM NAC resulted in areas of similar sperm chromatin dispersion (59.7 and 55.5μM2, respectively). However, the area of the chromatin dispersion between non-supplemented group=0.0mM (65.3μM2) and 2.5mM NAC (52.8μM2) differ (P <0.05). The percentage of cells with plasma membrane function were similar between the supplemented with 0.5mM NAC and non-supplemented (0.0mM) groups with (39.7 and 39.8%, respectively), but higher than 2.5mM (34.5%) and 5.0mM (34.2%). Progressive motility of ejaculates supplemented with NAC were similar, but only the group with 0.5mM NAC which resulted in 35.2% of mobile cells showed similarities with the non-supplemented group (36.2%). The greatest damage to sperm chromatin in equine semen diluted with 50% seminal plasma kept cooled to 5°C was due to 24h cooling. The addition of 2.5 and 5.0mM NAC inhibits the mobility and functionality of the equine sperm membrane, but does not cause a deleterious effect on the integrity of the DNA.

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No. of bitstreams: 1 silvajunior_fc_me_sjrp.pdf: 4129284 bytes, checksum: 6fbd44eda2ee6b9b62753d8e00cd09a5 (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Heteroptera é uma Subordem da Ordem Hemiptera, que possui cerca de 40 mil espécies distribuídas em oitenta famílias, dentre elas está a família Pentatomidae que se destaca por ser uma das maiores famílias com cerca de 4.100 espécies, representando, aproximadamente, 11% do total de espécies de Heteroptera. As espécies de Pentatomidae Chinavia impicticornis, Edessa meditabunda, E. collaris e Thyanta perditor foram estudadas nesse trabalho devido ao sua importância econômica, tendo em vista que são espécies fitófagas que causam grandes perdas em diversas culturas. Os machos das espécies foram coletados na região de São José do Rio Preto, os testículos foram fixados e posteriormente processados para analise em microscopia eletrônica de transmissão, os blocos obtidos foram trimados, cortados, contrastados e analisados com microscópio eletrônico de transmissão Leo – Zeiss, do Centro de Microscopia e Microanálise (IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto, SP) e com o microscópio eletrônico de transmissão Jeol JEM - 100 CXII da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP). As eletromicrografias das espécies estudadas apresentaram características ultraestruturais semelhantes às encontradas para diversos indivíduos de diferentes ordens, dentre essas características estão a formação do acrossomo, a partir de uma grande vesícula secretada pelo complexo de Golgi e que se localiza na região apical/lateral do núcleo. O núcleo, também, sofre transformações semelhantes às relatadas para grande parte dos insetos passando de um estado grande e esférico com a cromatina dispersa para um estado pequeno e fusiforme e com a cromatina extremamente condensada. Outra estrutura observada foi o adjunto do centríolo que se mostrou uma estrutura eletrondensa na região basal do núcleo. Também foi observada a migração das mitocôndrias para um polo celular e sua posterior fusão formando o complexo mitocondrial ou “Nebenkern”, que, posteriormente, se divide formando os dois derivados mitocondriais simétricos, com a presença de estruturas paracristalinas em seu interior. O padrão de microtúbulos encontrado no axonema, para todas as espécies, foi de 9+9+2, típico de insetos, sendo formado entre os derivados mitocondriais e acompanhado por estes ao longo de quase toda sua extensão. Morfologicamente, os derivados mitocondriais são diferentes entre C. impicticornis, E. meditabunda, E. collaris e T. perditor onde foi possível notar que os derivados de C. impicticornis se apresentaram grandes e arredondados, E. meditabunda pequenos e arredondados, E. collaris alongados e com extremidades arredondadas e T. perditor pequenos com uma extremidade arredondada e a outra angular podendo estas diferenças morfológicas serem características interessantes para futuros estudos filogenéticos ou sistemáticos para o grupo. Portanto, podemos concluir que a maioria das características analisadas é semelhante entre os insetos, com exceção da morfologia dos derivados mitocondriais que são diferentes, até mesmo, entre as espécies da família Pentatomidae. / Heteroptera is a suborder of the Hemiptera order, which has approximately 40,000 species distributed in eighty families, among them is the Pentatomidae family that stands out for being one of the largest families with approximately 4,100, representing approximately 11% of the total species of Heteroptera. The species of Pentatomidae Chinavia impicticornis, Edessa meditabunda, E. collaris and Thyanta perditor were studied in this work because of their economic importance, given that they are phytophagous species that cause great losses in several crops. Males of the species were collected in the region of São José do Rio Preto, the testes were fixed and then processed for analysis by transmission electron microscopy, the obtained blocks were trimmed, cut, contrasted and analyzed with transmission electron microscope Leo - Zeiss, of the Centro de Microscopia e Microanálise (IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto, SP) and the transmission electron microscope Jeol JEM - 100 CXII of Faculdade de Medicina of Ribeirão Preto (FMRP-USP). The species have similar ultrastructural characteristics to those found in many individuals of different orders, among these features is the acrosome formation from a large vesicle secreted by Golgi apparatus and located in the apical/lateral area of the nucleus. The nucleus also undergoes changes similar to those reported for most insects, passing of a great and spherical state with chromatin dispersed to a small and fusiform state and highly condensed chromatin. Another structure was observed the centriolar adjunct that showed electrodense structure in the basal region of the nucleus. We also observe the migration of mitochondria for the cell and its subsequent fusion was observed forming the mitochondrial complex or “Nebenkern”, which later splits to form two symmetrical mitochondrial derivatives, with the presence of paracrystalline structures inside. The pattern of microtubules found on the axonema, for all species was 9+9+2, typical of insects, being formed between the mitochondrial derivatives and accompanied by such over almost its entire length. Morphologically, the mitochondrial derivatives are different between C. impicticornis, E. meditabunda, E. collaris and T. perditor where it was possible to note that C. impicticornis derivatives showed large and rounded, E. meditabunda small and rounded, E. collaris elongated and rounded ends and T. perditor smaller with one rounded end and the other angled being able these morphological differences are interesting features for future phylogenetic or systematic studies for the group. Therefore, we can conclude that the analyzed characteristics are most similar among the insects, with the exception of the morphology of the mitochondrial derivatives which are different even among the species of the Pentatomidae family.

No presente estudo três concentrações de N-acetil-l-cisteina (NAC) foram avaliadas no diluente equino resfriado a 5°C através da motilidade do sêmen, integridade da cromatina espermática e choque hiposmótico sobre o ejaculado em diluente Kenney na proporção 1:2 com 50% de plasma seminal. O ejaculado de nove garanhões diluído na proporção 1:2 em meio Kenney foi dividido em 4 partes iguais e suplementado com 5,0, 2,5 e 0,5mM de NAC e um grupo não suplementado (0,0mM). As avaliações foram realizadas a fresco (0h), 24 e 48h de resfriamento. A análise de motilidade nos dois experimentos foi avaliada até às 24 horas. No experimento 2, a adição de 0,5 e 5,0mM de NAC resultou em áreas de dispersão da cromatina espermática similares (59,7 e 55,5μM2, respectivamente). Entretanto, a área de dispersão da cromatina no grupo não suplementado (65,3μM2) e com 2,5mM de NAC (52,8μM2) apresentou diferença (P<0,05). O percentual de células com membrana plasmática funcional foi similar entre o grupo não suplementado e o grupo suplementado com 0,5mM de NAC (39,7 e 39,8%, respectivamente), porém superior a NAC 2,5mM (34,5%) e 5,0mM (34,2%). A motilidade progressiva dos ejaculados suplementados com NAC foram similares entre si e somente o grupo NAC 0,5mM (35,2%) apresentou similaridade de células móveis com o grupo não suplementado (36,2%). Os maiores danos à cromatina espermática no sêmen equino diluído com 50% de plasma seminal mantido resfriado a 5°C ocorrem a partir de 24h de resfriamento. A adição de 2,5 e 5,0mM de NAC comprometem a motilidade e a funcionalidade de membrana espermática equina, mas não causa efeito deletério sobre a integridade do DNA. / In this study, three concentrations of N-acetyl- l-cysteine (NAC) were evaluated by sperm motility, membrane functionality (hypo-osmotic test), and sperm chromatin integrity. the hypo-osmotic test showed only 32.4% (P <0.05) of the cells having a functional membrane 12h into the cooling process, while the fresh semen (0h) was 53.5%. The percentage of motile cells decreased within 12h of cooling from 38.9 to 19.7%, with no difference between 12 and 24h of cooling. The tests of sperm chromatin dispersion and hypo-osmotic shock revealed similarities between the periods of cooling at 24 to 48h. In Experiment 2, the nine stallion ejaculates were divided into 4 equal parts, diluted in half with Kenney milk powder supplemented with 5.0, 2.5 and 0.5mM NAC and a group not supplemented (0.0mM). The evaluations were made fresh (0h), 24 and 48h after cooling. The analysis of motility was assessed in all experiments up to 24 hours. In experiment 2, the addition of 0.5 to 5.0mM NAC resulted in areas of similar sperm chromatin dispersion (59.7 and 55.5μM2, respectively). However, the area of the chromatin dispersion between non-supplemented group=0.0mM (65.3μM2) and 2.5mM NAC (52.8μM2) differ (P <0.05). The percentage of cells with plasma membrane function were similar between the supplemented with 0.5mM NAC and non-supplemented (0.0mM) groups with (39.7 and 39.8%, respectively), but higher than 2.5mM (34.5%) and 5.0mM (34.2%). Progressive motility of ejaculates supplemented with NAC were similar, but only the group with 0.5mM NAC which resulted in 35.2% of mobile cells showed similarities with the non-supplemented group (36.2%). The greatest damage to sperm chromatin in equine semen diluted with 50% seminal plasma kept cooled to 5°C was due to 24h cooling. The addition of 2.5 and 5.0mM NAC inhibits the mobility and functionality of the equine sperm membrane, but does not cause a deleterious effect on the integrity of the DNA.

Orientadores: Konradin Metze, Irene Gyongyver Heidemarie Lorand-Metze / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T09:21:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferro_DanielaPeixoto_M.pdf: 1415087 bytes, checksum: 6c36767b70dc498a2f9f0496b243498a (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Características da textura nuclear, realizadas por análise de imagem computadorizada, tem proporcionado informação prognóstica importante em várias neoplasias. Recentemente, a dimensão fractal (DF) da cromatina tem se mostrado um fator independente de prognóstico na leucemia linfóide aguda, no melanona maligno, em carcinomas epidermóides orais e linfomas.Neste estudo nós investigamos a influência da DF da cromatina na sobrevida de pacientes com mieloma múltiplo. Foram estudados 67 pacientes da nossa instituição tratados de acordo com o Grupo de Estudo Brasileiro de mieloma múltiplo. O diagnóstico foi feito pelos critérios do "International Myeloma Working Group". Foi realizado citogenética, eletroforese de proteínas, urina I, com a pesquisa de proteína monoclonal, avaliação da função renal e cálcio sérico. Para o estadiamento, utilizamos o índice prognóstico internacional (ISS). Para cada paciente, foram analisados pelo menos 40 núcleos de esfregaços de medula óssea corados com May-Grünwald-Giemsa. A DF foi determinada com imagens transformadas em escala de cinza pelo método Minkowski-Bouligand estendido para três dimensões. O "goodness-of-fit" da DF foi estimado pelos valores de R² em gráficos log-log. A influência dos parâmetros estudados de sobrevida dos pacientes foi analisada pelos métodos Kaplan-Meier e pela regressão de Cox. A idade média dos pacientes foi de 56 anos. Segundo o ISS, 14% dos pacientes eram do estádio I, 39% eram de estádio II e 47% eram de estádio III. A análise citogenética revelou dois pacientes com alterações do cromossomo 13, dois com translocações envolvendo o cromossomo 14 (em um caso, juntamente com -17) e um paciente com hipodiploidia. Fatores de risco adicional foram encontrados em 62% dos pacientes. Na análise univariada, tanto a DF, quanto o goodness-of-fit foram fatores prognósticos, este último após estratificação pelo ISS. Alta dimensão fractal e baixo "goodness-of-fit" indicaram um pior prognóstico. Na regressão multivariada de Cox, DF, R², ISS e aberrações cromossômicas entraram no modelo final, que mostrou-se estável em um estudo reamostragem bootstrap. Em resumo, as características fractais da cromatina em citologia de rotina revelaram informações relevantes no prognóstico dos doentes com mieloma múltiplo. / Abstract: Nuclear texture features, analyzed by computerized image analysis, has provided important prognostic information in several neoplasias. Recently, the fractal dimension (FD) of the chromatin structure has shown to be an independent prognostic factor in lymphoblastic leukemia acute,in malignant melanoma, in oral squamous cell carcinomas and linfomas. In this study we investigated the influence of the FD of chromatin on survival of patients with multiple myeloma. We studied 67 patients from our Institution treated in the Brazilian Multiple Myeloma Study Group. The diagnosis was confirmed by the criteria of International Myeloma Working Group. Was performed cytogenetic protein electrophoresis, urine I, with the research of protein monoclonal, assessment of renal function and serum calcium.The international Prognostic Index (ISS) was used for staging. For every patient, images of at least 40 nuclei from May-Grünwald-Giemsa stained bone marrow smears were analyzed. FD was determined in gray-scale transformed images by the Minkowski-Bouligand method extended to three dimensions. Goodness-of-fit of FD was estimated by the R2 values in the log-log plots. The influence of parameters studied patients survival was analyzed by Kaplan- Meier and Cox regression. Median age of the patients was 56 years. According to ISS, 14% of the patients were stage I, 39% were stage II and 47% were stage III. Cytogenetic analysis revealed two patients with alterations of chromosome 13, with two translocations involving chromosome 14 (in one case with -17) and one patient with hypodiploid. Additional risk factors were found in 62% of patients. In the univariate analysis FD as well as its goodness-of-fit were prognostic factors, the latter after stratifying for the ISS stage. Higher FD dimension or lower goodness-of-fit indicated a poor prognosis. In the multivariate Cox-regression, FD, R2, ISS stage and chromosomal aberrations entered the final model, which showed to be stable in a bootstrap resampling study. In short, fractal characteristics of the chromatin in routine cytology reveal relevant prognostic information in patients with multiple myeloma. / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Irene Gyöngyver Heidemarie Lorand-Metze / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T10:34:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vido_JoyceRico_M.pdf: 733870 bytes, checksum: d5a56d9b376e9b0ddadbf12bf5c2b264 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A contagem de blastos na medula óssea (MO) é um parâmetro essencial para a classificação e prognóstico das síndromes mielodisplásicas (SMD). No entanto, neste grupo de doenças clonais há um alto grau de atipias de células hematopoiéticas da MO podendo ser difícil classificar com precisão os blastos mielóides. Nosso objetivo foi investigar se a análise de imagem computadorizada de esfregaços de citologia de rotina corados com May-Grünwald-Giemsa seria capaz de caracterizar estas células. Precursores mielóides imaturos foram digitalizados e as imagens segmentadas de forma interativa usando esfregaços de MO: 30 casos de SMD recém-diagnosticados (15 RCMD, 11 AREB, 4 AR / ARSA) e 19 casos de MO normal. A classificação morfológica das células foi feita por consenso de dois observadores. A distribuição da cromatina nuclear foi analisada por variaveis de morfometria geomatrica, variáveis derivadas da matriz de co-ocorrência e dimensão fractal (DF) para verificar sua utilidade na classificação destas células. Entre as 15 variáveis estudadas, todas, exceto área nuclear e homogeneidade local foram capazes de distinguir os blastos de promielócitos normais. Precursores atípicos mielóides que morfologicamente lembravam mieloblastos apresentaram valores intermediários entre blastos e promielócitos de acordo com 5 variáveis e foram classificados como promielócitos por mais 7 variáveis. A área nuclear não foi significativamente diferente entre os diversos tipos de células. Precursores mielóides atípicos imaturos da MO podem ser difíceis de classificar corretamente em citologia de rotina. Eles podem ser blastos com maturação anormal ou promielócitos atípicos. Como mudanças de textura da cromatina nuclear refletem a remodelação dinâmica da cromatina, a análise das variáveis obtidas pode ser útil para classificar objetivamente precursores imaturos mielóides nas SMD / Abstract: Bone marrow (BM) blast count is an essential parameter for classification and prognosis of myelodysplastic syndromes (MDS). However, in this group of clonal disorders a high degree of atypias in bone marrow hemopoietic cells may be found so that it may be difficult to quantify precisely myeloid blasts. Our aim was to investigate whether computerized image analysis of routine cytology would be able to characterize these cells. In May-Grünwald-Giemsa stained BM smears of 30 newly diagnosed MDS (15 RCMD, 11 RAEB, and 4 RA/RARS) patients and 19 cases of normal BM, blasts, promyelocytes and atypic myeloid precursors were digitalized and interactively segmented. The morphologic classification of the cells was done by consensus of two observers. Nuclear morphometry and texture features derived from the co-occurrence matrix and fractal dimension (FD) were calculated. Among the 13 variables studied, all except nuclear area and local homogeneity were able to distinguish blasts from promyelocytes. Atypic myeloid precursors that morphologically resembled myeloblasts showed intermediate values between blasts and promyelocytes according to 5 variables and were classified as promyelocytes by another 7 variables. Nuclear area was not significantly different among the cells. BM atypical immature myeloid precursors may be difficult to classify correctly in routine cytology. They could be abnormally maturing blasts or atypical promyelocytes. As nuclear texture changes reflect chromatin remodeling dynamics, the analysis of the variables obtained by image analysis may be useful to objectively classify immature myeloid precursors in MDS / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Maria Luiza Silveira Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T21:08:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_AlbertodaSilva_D.pdf: 18240611 bytes, checksum: 0c094268046690a939c185449986f74f (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Envelhecimento pode ser definido como as mudanças sofridas por um organismo ao longo do tempo. Esse processo, em biologia, é denominado senescência. A senescência celular é um fenômeno observado em células isoladas, e tem sido estudada tipicamente em células em cultura. Sua ocorrência in vivo foi observada em alguns tecidos de mamíferos. As mudanças na estrutura e organização da cromatina que ocorrem em células senescentes incluem, aumento na resistência da cromatina à digestão por nucleases e acúmulo de modificações de histonas e proteínas associadas à heterocromatina. Embora nem todas as células em um organismo envelhecido estejam em estado de senescência, espera-se que mudanças na estrutura e organização da cromatina ocorram. A restrição calórica é a única intervenção conhecida que tem a capacidade de estender o tempo de vida em mamíferos. Após uma dieta de restrição calórica ou jejum muitos genes, cuja expressão encontra-se alterada em animais idosos, têm sua expressão restabelecida aos níveis observados em animais jovens. Acredita-se que mudanças na cromatina também possam ocorrer durante o jejum, e que induzam mudanças no nível de expressão de diversos genes. No presente trabalho, buscando-se alterações na organização da cromatina em hepatócitos de camundongo ao longo do envelhecimento ou submetidos ao jejum, observou-se um aumento das propriedades viscoelásticas da cromatina ao longo do envelhecimento, de acordo com as mudanças na habilidade dessa cromatina em formar fibras estendidas de cromatina. Essas diferenças foram acompanhadas por um desempacotamento da cromatina. Observou-se também que essa viscoelasticidade da cromatina era dependente principalmente de interações desta com a matriz nuclear, e que cópias de genes cuja atividade transcricional não é mais requerida, ou requerida em um nível menor em animais idosos, podem desligar-se temporariamente da matriz nuclear. Mudanças nas propriedades viscoelásticas da cromatina e no seu grau de compactação já haviam sido observadas previamente em animais em jejum. Apesar disso, no presente trabalho, nenhuma diferença com relação à interação dos genes rDNA com a matriz nuclear foi encontrada em animais em jejum. Contudo, independente da condição fisiológica, o DNA aderido à matriz nuclear parece ser rico em genes, enquanto as seqüências heterocromáticas, pobres em genes, geralmente são encontradas tanto associadas com a matriz nuclear quanto dissociadas desta (cuidado com essa conclusão. Está forte). Em hepatócitos de animais idosos foi observado acúmulo de marcadores heterocromáticos (modificações de histonas) e de outras proteínas (proteínas formadoras de heterocromatina e glicoproteínas presentes principalmente nos cromocentros), assim como diminuição das modificações de histonas associadas com transcrição ativa. Todas essas modificações estão relacionadas com alterações na síntese de RNA já relatadas para animais idosos, e são uma evidência de que o controle da expressão gênica, a organização e a composição da cromatina estão intimamente relacionados. Em um outro tipo celular como espermatozóides de camundongo, uma diferente organização nuclear levou a propriedades diferenciadas de sua cromatina com relação às suas propriedades viscoelásticas (aumentadas). Tais diferenças possivelmente estejam relacionadas com um padrão modificado de expressão gênica, uma vez que em espermatozóides, a atividade transcricional é nula ou quase ausente / Abstract: Aging may be defined as the changes that take place in an organism with time. This process, in biology, is called senescence. Cellular senescence is observed in isolated cells, and has been studied typically in cultured cells, but its occurrence in vivo has been shown only in some mammalian tissues. Chromatin changes that take place with cellular senescence include increase in the resistance of chromatin to nuclease digestion and accumulation of histone modifications and non-histone proteins associated with heterochromatin. Although not all cells in an aged organism are subjected to cellular senescence, it is expected that changes in the chromatin structure and organization still occur. Caloric restriction is the only intervention known to extend life span in mammals. It has been shown that many genes whose expression pattern is altered in aged animals can be reverted to the levels observed in young animals after a caloric restriction diet or complete food withdrawal. Changes in chromatin structure may occur during the starvation period to induce changes in the expression level of several genes. With the aim of screening for alterations in the chromatin organization in mouse hepatocyte nuclei with aging or following starvation, we observed an increase in the viscoelastic properties of chromatin with aging, in terms of changes in the ability of this chromatin to form extended chromatin fibers after a lysis treatment in liver imprints on histological slides. These differences were accompanied by chromatin unpackage. Most of the viscoelasticity of the chromatin were dependent on its interactions with the nuclear matrix, and copies of genes whose transcription are no longer required in aged animals, tended to detach from the nuclear matrix. Changes in the viscoelastic properties and packing degree of chromatin had been shown previously in starved animals. However, no differences regarding this feature were seen in the present work. Nevertheless, regardless the physiological condition, DNA attached to the nuclear matrix seems to be gene-rich, while heterochromatic gene-poor regions were found both attached and detached from the nuclear matrix. We observed accumulation of heterochromatic marks (histone modifications) and non-histone proteins (heterochromatin proteins and glycoproteins present mainly in the chromocenters), as well as decreased histone modifications associated with transcription in hepatocyte nuclei of aged mice. All these changes are related to altered RNA synthesis observed in aged animals and are an evidence of the strong relationship between chromatin organization, composition, and control of gene expression. In another cell type, mouse sperm cells, its nuclear organization lead to different chromatin properties regarding its viscoelastic properties (increased). These differences are possibly related to a modified pattern of gene expression since gene transcription is almost or completely absent in sperm cells / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural