El establecimiento de un reservorio latente del virus del HIV en células T CD4+ es la mayor barrera contra la erradicación de esta enfermedad. Para lograr su erradicación, se necesitaría combinar la terapia antirretroviral HAART con drogas capaces de reactivar los virus durmientes. El objetivo principal de este estudio es entender cómo se establece la latencia tras la integración del virus en el genoma, con el propósito de identificar factores involucrados que pudieran ser dianas de una nueva terapia. Hemos generado una librería de clones que contienen un minigenoma latente del virus que expresa GFP como reportero cuando se reactiva. Esta librería permite estudiar la posible relación existente entre estado de la cromatina en el lugar de integración y actividad del promotor. También hemos estudiado la implicación de la interferencia transcripcional en el establecimiento de la latencia en los clones cuya integración del HIV ha tenido lugar en genes transcripcionalmente activos. Para investigar el mecanismo de represión durante la latencia, se han llevado a cabo depleciones de factores relacionados con el reensamblaje de la cromatina y proteínas relacionadas con represión transcripcional. Finalmente, hemos buscado drogas que puedan reactivar el virus latente como posible terapia a combinar con la terapia antiretroviral. / The establishment of a latent HIV reservoir in CD4+ T cells is the main barrier to prevent the eradication of the virus and converts its infection in a chronic disease. To achieve its eradication, it would be needed to combine HAART with drugs able to reactivate the dormant viruses. The main objective of this study is to understand how latency is established after proviral integration into the genome, with the aim of identifying factors involved that could be targeted by new therapeutic approaches. We have generated a library of clones containing a latent HIV minigenome that expresses GFP as a reporter only when reactivated. This library allows the study of the relationship between the chromatin state at the site of integration and HIV promoter activity. We have also studied the implication of transcriptional interference in the establishment of latency in those clones where HIV has integrated in transcriptionally active genes. To further investigate the mechanism of transcriptional repression in latency we have performed knockdowns of known chromatin reassembly factors and repression-related proteins by using shRNA expression. Finally we have searched drugs that can reactivate the latent HIV as a possible therapy to combine with HAART.

One performed a more modern approach on such heat stress to find changes out to compact morphometry in spermatozoon head by computational analysis. One aimed in this work to assess how to compact chromatin and sperm morphometry after have risen testicular temperature, by using experimental cryptorchidism in rabbits (Oryctolagus cuniculus), as well as used 30 rabbits: wild rabbit, white, adult, located in the rabbit keeping of University of Uberaba, Uberaba (city), MG (State of Minas Gerais), Brazil. One classified the rabbits into two groups of 15. Both groups were anesthetised, but only the experimental cryptorchidism one underwent a surgical operation. One gathered semen samples within a total of 69 days. One both dyed semen smear of all rabbits by using a toluidine blue dye and afterwards analysed it with a digital microcomputer to assess compacting chromatin and sperm morphometry. Chromatin varied regarding compact intensity (Diff%), homogeneity by coefficient of variation (CV) and aberrant chromatin (AbChr). By analysing morphometrically one assessed: area, perimeter (Perim.), width (w.), length (l.), ratio width:length (w./l.), ellipsity (E.), form factor (FF), lateral symmetry (LatSym), antero-posterior symmetry (A-PSym), and Fourier descriptors with amplitude from 0 to 2. Testicular temperature rise swayed the concentration, motility, and vigour adversely. Chromatin structure becomes aberrant when affected by testicular heat stress. And spermatozoon head tends to lessen. / Uma abordagem mais moderna sobre a elevação da temperatura foi realizada, visando detectar alterações na compactação e morfometria da cabeça do espermatozoide pela análise computacional. O objetivo do trabalho foi avaliar a compactação da cromatina e a morfometria espermática após a elevação da temperatura testicular, por meio de criptorquidismo experimental, em coelhos. Foram utilizados 30 coelhos da raça Nova Zelândia, brancos, adultos, situados no coelhário da Universidade de Uberaba, Uberaba, MG, Brasil. Os coelhos foram separados em dois grupos de 15. Ambos os grupos foram anestesiados, mas somente um deles sofreu intervenção cirúrgica, o criptorquidismo experimental. Foram coletadas amostras de sêmen durante 69 dias. Esfregaços de sêmen de todos os coelhos foram corados com azul de toluidina e, posteriormente, analisados digitalmente por meio de microcomputador para avaliar a compactação de cromatina e morfometria. A cromatina foi avaliada quanto à intensidade de compactação (Dif%), homogeneidade pelo coeficiente de variação (CV) e cromatina anômala (Cr. An.). Na análise morfométrica foram avaliados: área, perímetro (Per.), largura (Larg.), comprimento (Comp.), razão largura:comprimento (L/C), elipsidade (E), fator forma (FF), simetria lateral (Sim. Lat.), simetria ântero posterior (Sim. A-P) e descritores Fourier com amplitude de 0 a 2. A elevação da temperatura testicular influenciou negativamente a concentração, motilidade, vigor, torna-se anômala a estrutura da cromatina e a cabeça do espermatozoide tende a diminuir. / Mestre em Ciências Veterinárias

Objetivo: descrever os achados de citologia de impressão em voluntários saudáveis e correlacioná-los com testes de olho seco e sintomatologia. Métodos: coleta de citologia de impressão (CI) da conjuntiva superior, inferior, nasal e temporal após anamnese, questionário de sintomas (QU) e exames clínicos biomicroscópicos, teste de Schirmer (TS), tempo de ruptura do filme lacrimal (TRFL), escores de fluoresceína (EF) e rosa bengala (ERB). Resultados: Foram examinados 78 olhos de 39 pacientes (30 mulheres, 85% brancos). Idade média foi de 36 anos (16-71 anos). Oitenta e cinco porcento dos pacientes eram assintomáticos no QU. TRFL médio foi de 13,6 segundos (70% ≥ 10 s), TS médio foi 19,2 mm (76% ≥ 6 mm), ERB foi 0-3 em 87%, EF foi zero em 75%. Biomicroscopia apresentou resultado normal em 65% dos olhos. CI foi normal em: 81% superior, 57% nasal, 87% inferior, 75% temporal. Foi encontrado padrão de cromatina snake-like em 15% das amostras superiores. Houve pouca correlação entre os testes clínicos, questionário e achados citológicos. A citologia de impressão do sítio nasal e a presença de cromatina snake-like associaram-se com alguns testes da superfície ocular, sintomas e com a idade dos pacientes. Conclusão: Nosso estudo encontrou 30% de testes clínicos anormais, sintomas e achados citológicos alterados (anormal e limítrofe) neste grupo de indivíduos normais. Os achados da conjuntiva bulbar da área de fenda e superior são os que mais apresentam alterações. Entretanto, apesar de algumas associações significativas, não houve correlação conclusiva entre testes, sintomas e citologia de impressão. / Purpose: To describe conjunctival findings of impression cytology in healthy volunteers and to correlate to dry eye tests and symptoms. Methods: superior, inferior, nasal and temporal bulbar conjunctivae impression cytology, symptoms questionnaire, slit lamp examination, Schirmer test (ST), tear film break-up time (TFBUT), fluorescein staining (FS) and rose Bengal staining (RBS) were evaluated. Results: 78 eyes of 39 patients (30 female, 85% white) were examined. Mean age was 36 years (16-71 years). Eighty-five percent of patients were asymptomatic in questionnaire. Mean TFBUT was 13.6 seconds (70% ≥ 10 sec), ST median was 19.2 mm (76% ≥ 6 mm), RBS grade was 0-3 in 87%, FS was 0 in 75%. Slit lamp examination did not reveal any alteration in 65% of the eyes. Impression cytology showed normal aspect in: 81% superior, 57% nasal, 87% inferior, and 75% temporal. Snake-like chromatin pattern was present in 15% of superior samples. There were few correlations among clinical tests, questionnaire result and cytological findings. Nasal impression cytology results and snake-like chromatin were associated with some ocular surface exams, symptoms and age of patients. Conclusion: Our study identified prevalence of 30% of abnormal clinical tests, symptoms, and altered cytological findings (abnormal and borderline) in this group of normal subjects. Impression cytology findings of exposed bulbar conjunctiva and superior conjunctiva are more often altered. Despite a few associations among tests, there was no conclusive correlation among these tests, symptoms and impression cytology results.

Objetivo: descrever os achados de citologia de impressão em voluntários saudáveis e correlacioná-los com testes de olho seco e sintomatologia. Métodos: coleta de citologia de impressão (CI) da conjuntiva superior, inferior, nasal e temporal após anamnese, questionário de sintomas (QU) e exames clínicos biomicroscópicos, teste de Schirmer (TS), tempo de ruptura do filme lacrimal (TRFL), escores de fluoresceína (EF) e rosa bengala (ERB). Resultados: Foram examinados 78 olhos de 39 pacientes (30 mulheres, 85% brancos). Idade média foi de 36 anos (16-71 anos). Oitenta e cinco porcento dos pacientes eram assintomáticos no QU. TRFL médio foi de 13,6 segundos (70% ≥ 10 s), TS médio foi 19,2 mm (76% ≥ 6 mm), ERB foi 0-3 em 87%, EF foi zero em 75%. Biomicroscopia apresentou resultado normal em 65% dos olhos. CI foi normal em: 81% superior, 57% nasal, 87% inferior, 75% temporal. Foi encontrado padrão de cromatina snake-like em 15% das amostras superiores. Houve pouca correlação entre os testes clínicos, questionário e achados citológicos. A citologia de impressão do sítio nasal e a presença de cromatina snake-like associaram-se com alguns testes da superfície ocular, sintomas e com a idade dos pacientes. Conclusão: Nosso estudo encontrou 30% de testes clínicos anormais, sintomas e achados citológicos alterados (anormal e limítrofe) neste grupo de indivíduos normais. Os achados da conjuntiva bulbar da área de fenda e superior são os que mais apresentam alterações. Entretanto, apesar de algumas associações significativas, não houve correlação conclusiva entre testes, sintomas e citologia de impressão. / Purpose: To describe conjunctival findings of impression cytology in healthy volunteers and to correlate to dry eye tests and symptoms. Methods: superior, inferior, nasal and temporal bulbar conjunctivae impression cytology, symptoms questionnaire, slit lamp examination, Schirmer test (ST), tear film break-up time (TFBUT), fluorescein staining (FS) and rose Bengal staining (RBS) were evaluated. Results: 78 eyes of 39 patients (30 female, 85% white) were examined. Mean age was 36 years (16-71 years). Eighty-five percent of patients were asymptomatic in questionnaire. Mean TFBUT was 13.6 seconds (70% ≥ 10 sec), ST median was 19.2 mm (76% ≥ 6 mm), RBS grade was 0-3 in 87%, FS was 0 in 75%. Slit lamp examination did not reveal any alteration in 65% of the eyes. Impression cytology showed normal aspect in: 81% superior, 57% nasal, 87% inferior, and 75% temporal. Snake-like chromatin pattern was present in 15% of superior samples. There were few correlations among clinical tests, questionnaire result and cytological findings. Nasal impression cytology results and snake-like chromatin were associated with some ocular surface exams, symptoms and age of patients. Conclusion: Our study identified prevalence of 30% of abnormal clinical tests, symptoms, and altered cytological findings (abnormal and borderline) in this group of normal subjects. Impression cytology findings of exposed bulbar conjunctiva and superior conjunctiva are more often altered. Despite a few associations among tests, there was no conclusive correlation among these tests, symptoms and impression cytology results.

The present study was to evaluate the reproductive performance of broiler breeders fed different levels of protein and metabolizable energy treated with three different diets, varying amounts of metabolizable energy and crude protein. In one treatment, the heavy broiler breeders were fed a diet with 13.8% CP and 2750 Kcal / kg, 22 to 66 weeks of age. In treatment two, the roosters received the same ration provides for the females, being from 22 to 36 weeks of age containing 15% CP from 36 to 60 weeks, 15.2% CP and 60 to 66 weeks, 14% CP, all diets contained 2850 Kcal / kg. In treatment three, the breeding males fed a diet with15% CP and 2700 Kcal / kg from 22 to 66 weeks is old. The semen was collected from 16 rooster each treatment in three different ages of week, 34, 38, 43, 48 and 51 weeks. The semen collected was subjected to staining protocol with toluidine blue and subsequently evaluated by computer image analysis, with measurements of area, perimeter, homogeneity and intensity of compaction of chromatin in each head of spermatozoa. The roosters fed with high protein (15%) showed improve results in terms of compression and density of the heads of sperm chromatin. This same group had values of spermatozoa size smaller, which indicates minor morphological changes. It wasn t possible to correlate the onset and fertility with other data, as in this study there was no significant difference between treatments (p >0.05). Concerning the age of the rooster, regardless of the diet used, all treatments showed changes in chromatin compaction, and the roosters fed with 13.8% crude protein and 2750 Kcal / kg, showed greater changes in chromatin compaction. This can explain the decrease in fertility, usually observed in the field after this period, in flocks of broiler breeders. / O presente estudo teve como objetivo avaliar a morfometria e a compactação de cromatina em espermatozóides de reprodutores tratados com diferentes níveis de proteínas, e comparar as análises de compactação de cromatina com fertilidade e eclodibilidade, analisando a eficiência reprodutiva de galos reprodutores de corte. No tratamento um, os galos reprodutores pesados, foram alimentados com uma ração com 13,8% de Proteína Bruta (PB) e 2750 Kcal de EM/Kg, de 22 a 66 semanas de idade. No tratamento dois, os galos receberam a mesma ração fornecida para as fêmeas, sendo das 22 a 36 semanas de idade contendo 15% de PB, das 36 a 60 semanas, 15.2% de PB e das 60 a 66 semanas, 14% de PB, todas as dietas continham 2850 de Kcal de EM/Kg. No tratamento tres, os machos reprodutores foram alimentados com uma ração 15% de PB e 2700 Kcal de EM/Kg, de 22 a 66 semanas de idade. O sêmen de 16 galos foi coletado de cada tratamento, em três idades diferentes: 34, 38, 43, 48 e 51 semanas. O sêmen coletado foi submetido a protocolo de coloração com azul de toluidina, e posteriormente avaliado por análise de imagem computacional, com mensurações da área, perímetro, homogeneidade e intensidade da compactação da cromatina dentro de cada cabeça do espermatozóide. Os galos alimentados com elevado nível de proteína (15%) apresentaram melhores resultados em relação à compactação e a homogeneidade da cromatina das cabeças dos espermatozóides. Este mesmo grupo apresentou valores de tamanho de espermatozóides menores, o que indica menores alterações morfológicas. Não foi possível correlacionar a eclosão e fertilidade com os demais dados, pois neste estudo não houve diferença significativa entre os três tratamentos (p>0.05). Em relação à idade do galo reprodutor, independente da dieta utilizada, todos os tratamentos apresentaram alterações na compactação da cromatina, sendo que os galos alimentados com 13.8% de proteína bruta e 2750 Kcal de EM/Kg, apresentaram maiores alterações na compactação da cromatina. O que pode explicar a queda na fertilidade, geralmente observada no campo, após este período, em plantéis de matrizes pesadas. / Mestre em Ciências Veterinárias

Objetivo: descrever os achados de citologia de impressão em voluntários saudáveis e correlacioná-los com testes de olho seco e sintomatologia. Métodos: coleta de citologia de impressão (CI) da conjuntiva superior, inferior, nasal e temporal após anamnese, questionário de sintomas (QU) e exames clínicos biomicroscópicos, teste de Schirmer (TS), tempo de ruptura do filme lacrimal (TRFL), escores de fluoresceína (EF) e rosa bengala (ERB). Resultados: Foram examinados 78 olhos de 39 pacientes (30 mulheres, 85% brancos). Idade média foi de 36 anos (16-71 anos). Oitenta e cinco porcento dos pacientes eram assintomáticos no QU. TRFL médio foi de 13,6 segundos (70% ≥ 10 s), TS médio foi 19,2 mm (76% ≥ 6 mm), ERB foi 0-3 em 87%, EF foi zero em 75%. Biomicroscopia apresentou resultado normal em 65% dos olhos. CI foi normal em: 81% superior, 57% nasal, 87% inferior, 75% temporal. Foi encontrado padrão de cromatina snake-like em 15% das amostras superiores. Houve pouca correlação entre os testes clínicos, questionário e achados citológicos. A citologia de impressão do sítio nasal e a presença de cromatina snake-like associaram-se com alguns testes da superfície ocular, sintomas e com a idade dos pacientes. Conclusão: Nosso estudo encontrou 30% de testes clínicos anormais, sintomas e achados citológicos alterados (anormal e limítrofe) neste grupo de indivíduos normais. Os achados da conjuntiva bulbar da área de fenda e superior são os que mais apresentam alterações. Entretanto, apesar de algumas associações significativas, não houve correlação conclusiva entre testes, sintomas e citologia de impressão. / Purpose: To describe conjunctival findings of impression cytology in healthy volunteers and to correlate to dry eye tests and symptoms. Methods: superior, inferior, nasal and temporal bulbar conjunctivae impression cytology, symptoms questionnaire, slit lamp examination, Schirmer test (ST), tear film break-up time (TFBUT), fluorescein staining (FS) and rose Bengal staining (RBS) were evaluated. Results: 78 eyes of 39 patients (30 female, 85% white) were examined. Mean age was 36 years (16-71 years). Eighty-five percent of patients were asymptomatic in questionnaire. Mean TFBUT was 13.6 seconds (70% ≥ 10 sec), ST median was 19.2 mm (76% ≥ 6 mm), RBS grade was 0-3 in 87%, FS was 0 in 75%. Slit lamp examination did not reveal any alteration in 65% of the eyes. Impression cytology showed normal aspect in: 81% superior, 57% nasal, 87% inferior, and 75% temporal. Snake-like chromatin pattern was present in 15% of superior samples. There were few correlations among clinical tests, questionnaire result and cytological findings. Nasal impression cytology results and snake-like chromatin were associated with some ocular surface exams, symptoms and age of patients. Conclusion: Our study identified prevalence of 30% of abnormal clinical tests, symptoms, and altered cytological findings (abnormal and borderline) in this group of normal subjects. Impression cytology findings of exposed bulbar conjunctiva and superior conjunctiva are more often altered. Despite a few associations among tests, there was no conclusive correlation among these tests, symptoms and impression cytology results.

O nucléolo é uma organela nuclear responsável pela produção dos ribossomos, através das Regiões Organizadoras do Nucléolo (NORs). Espécies que possuem mais de um par de cromossomos contendo NORs terão, obrigatoriamente, pelo menos um par ativo, sendo as demais NORs funcionais de acordo com a demanda celular. O mecanismo de compensação de dose é visualizado e bem estabelecido em híbridos interespecíficos, conhecido como dominância nucleolar, com a inativação de NORs de um dos parentais por outras homeólogas ativas que as dominam. A arquitetura da cromatina nas NORs e o controle da sua expressão foram estudados com o objetivo de se entender os mecanismos envolvidos no fenômeno da dominância nucleolar em espécies diplóides que possuem múltiplas NORs. A espécie modelo utilizada neste estudo foi Crotalaria juncea (Leguminosae-Papilionoideae), caracterizada por conter 2n=2x=16, e NORs no braço curto do cromossomo 1, sendo este o principal organizador do nucléolo, e no braço longo do cromossomo 4 adjacente à heterocromatina centromérica, sendo este um sítio adicional (sítio menor) e de expressão facultativa, previamente determinada. Nas raízes de C. juncea sincronizadas, observou-se que a nucleologênese tem seu início durante o final da telófase, em que os 4 sítios de genes ribossomais podem ter atividade e formar até 4 nucléolos, os quais tendem a se fundir durante a interfase. A Hibridação in situ fluorescente (FISH) permitiu estudos da arquitetura da cromatina, com a visualização dos territórios cromossômicos, onde a cromatina não está organizada de forma aleatória dentro do núcleo, e consequentemente o rDNA 45S dentro do nucléolo. Observou-se também que todos os sítios de rDNA 45S possuem diferença no tamanho do arranjo repetitivo. Assim sendo, a hierarquia de dominância está de acordo com o tamanho de cada arranjo (sítio), e estes são ativados de acordo com a demanda celular. As análises das modificações nas histonas mostraram que a H3K9Met1 apresentou marcas fracas no nucléolo, enquanto no restante da cromatina nuclear sua marcação foi intensa. Já a H3K9Met2 apresentou marcação fortemente associada à cromatina presente no nucléolo, com alguns pequenos pontos heterocromáticos dispersos no núcleo. Pela observação entende-se que ambas metilações controlam diferentes tipos de heterocromatinas, ou seja, a H3K9Met2 controla principalmente heterocromatinas associadas aos genes ribossomais, e a H3K9Met controla heterocromatinas não associadas ao rDNA. O rDNA é hiperacetilado dentro do nucléolo para a H3K14. Não foi observada marcação nucleolar para H4K8ac, mas pôde ser observadas regiões hiperacetiladas em outras regiões da cromatina. A metilação do DNA esteve diretamente associada à diferentes níveis de organização da cromatina das NORs. As heterocromatinas adjacentes ao nucléolo apareceram fortemente metiladas, enquanto a cromatina distendida dentro do nucléolo apresentou marcação dispersa, com algumas regiões mais fortemente marcadas, onde a cromatina apresentava-se mais condensada e provavelmente não associados com a cromatina ativa. As fibras estendidas permitiram uma análise de alta resolução, onde foi possível observar que regiões não metiladas apareciam intercaladas entre grandes regiões fortemente metiladas, sugerindo que estas regiões hipometiladas estão, possivelmente, associadas com as alças de transcrição dentro do nucléolo. 12 Esses resultados contribuem para o entendimento sobre o controle genético e epigenético na arquitetura da cromatina ribossomal, bem como seu controle na expressão dos genes ribossomais no genoma das plantas. / The nucleolus is a nuclear organelle responsible for the ribosomes production, by Nucleolus Organizer Regions (NORs). Species presenting more than one chromosome pair with NORs should present, one pair expressing the genes, at least; while the other pairs expressing their genes accordingly to cellular demand. Dosage compensation mechanism is visualized and well established of interspecific hybrids as a well-described phenomena named nucleolar dominance, where a NOR from one parental could lead to inactivation of a NOR from the other parental which is dominated. The chromatin architecture and expression of the NORs were studied to address the mechanism involved in the nucleolar dominance of diploid species containing multiple sites of 45S rDNA. The model species used in the present study was the crop Crotalaria juncea (Leguminosae-Papilionoideae) characterized by 2n=2x=16 chromosomes, being the main NOR mapped into chromosome 1 short arm and presenting an additional site (minor site) in the chromosome 4 long arm adjacent to a centromeric heterochromatin and facultatively expressed. Synchronized meristematic root tip cells determined to nucleologenesis starts during the late-telophase, often expressing every ribosomal gene sites, when up to four nucleoli could be observed and these become merged during interphases. FISH allowed nucleolar chromatin architecture be accessed revealing distinct chromosomal domains (territories), suggesting a non-random distribution of the 45S rDNA, even between homologous chromosomes, into the nucleolus. The 45S rDNA sites from both chromosome pairs 1 and 4 of C. juncea showed differences in their array sizes. The differences in the 45S rDNA array sizes and the order of loci expression suggest a hierarchy of dominance, a feature of nucleolar dominance; being the small RONs activated only on demand. Immunodetection of histone modifications showed different patterns to methylation distribution across the chromatin as a whole; where H3K9Met1 was found mainly distributed along the nuclear chromatin without an evident signal into nucleolus, while H3K9Met2 was detected as conspicuous dots in the nuclear chromatin and highly accumulated into the nucleolus. The results indicate different control on heterochromatin establishment and maintenance, being the modifications specific to certain chromosomal regions. Indeed, H3K9Met is a key component in the nucleolus chromatin architecture and expression. The chromatin inside the nucleolus showed a high accumulation of H3K14ac, with a weak fluorescent signal along the nucleus; on the other hand H4K8ac showed a strong signal homogenously distributed across the nuclear chromatin, but without evident signals inside the nucleolus. DNA methylation was directly associated with different levels of chromatin organization of the NORs. The heterochromatic regions associated to RON are highly methylated, while the chromatin inside the nucleolus showed weaker signals, with some bright spots probably in condensed regions and related to chromatin inactivity. Extended DNA fiber allowed a higher resolution mapping that revealed long methylated regions intermingled by nomethylated ones, being the last probably associated to transcriptional loops of rRNA genes into the nucleolus. The results presented herein contributes to a better understand about the nucleolar chromatin architecture and the genetic and epigenetic control of the ribosomal genes expression on plant genomes.

Chromatin remodeler proteins exert an important function in promoting dynamic modifications in the chromatin architecture, rendering the transcriptional machinery available to the condensed genomic DNA. Due to this central role in regulating gene transcription, deregulation of these molecular machines may lead to severe perturbations in the normal cell functions. Loss-of-function mutations in the CHD7 gene, a member of the chromodomain helicase DNA-binding (CHD) family, are the major cause of the CHARGE syndrome in humans. The disease is characterized by a variety of congenital anomalies, including malformations of the craniofacial structures, peripheral nervous system, ears, eyes and heart. In this context, several studies have already shown the importance of CHD7 for proper function of the neural stem cells (NSCs). Interestingly, we found that CHD7 mRNA levels are upregulated in gliomas, when compared to normal brain tissue, therefore, we hypothesized that CHD7 might have a role in the pathogenesis of these tumors. To investigate the possible oncogenic role of CHD7 in glioblastoma (GBM), we adopted gain- and loss-of-function approaches in adherent GBM cell lines. Using CRISPR_Cas9 genome editing, we found that CHD7 deletion suppresses anchorage-independent growth and reduces spheroid invasion in human LN-229 cells. Moreover, deletion of CHD7 delayed tumor growth and improved overall survival in an orthotopic xenograft glioma mouse model. Conversely, ectopic overexpression of CHD7 in LN-428 and A172 cells was found to increase cell motility and invasiveness in vitro and LN-428 tumor growth in vivo. RNAseq analysis showed that alterations of CHD7 expression levels promote changes in several molecular pathways and modulate critical genes associated with cell adhesion and locomotion. However, the mechanisms underlying the effects of CHD7 overexpression in glioma tissue are still not understood. Here, we also generated recombinant plasmid with functional CHD7 promoter activity reported by luciferase assay. This powerful tool should enable future studies to determine the direct targeting relationship between different signal transduction pathways and CHD7 geneexpression. In summary, our findings indicate that GBM cells expressing a high level of CHD7 may exist and contribute to tumor infiltration and recurrence. Further studies should warrant important clinical-translational implications of our findings for GBM treatment. / As proteínas remodeladoras de cromatina exercem importante papel, promovendo modificações dinâmicas na arquitetura da cromatina e dando acesso à maquinaria transcricional ao DNA genômico condensado. Devido à esta função central na regulação da transcrição gênica, a desregulação dessas máquinas moleculares pode levar a perturbações graves na função normal das células. Assim, por exemplo, mutações do tipo perda de função no gene CHD7, um membro da família \"chromodomain helicase DNA-binding\" (CHD), são a principal causa da síndrome de CHARGE em humanos. A doença é caracterizada por uma variedade de anomalias congênitas, incluindo malformações das estruturas craniofaciais, sistema nervoso periférico, orelhas, olhos e coração. Neste contexto, vários estudos já mostraram a importância da proteína CHD7 para o funcionamento normal de células-tronco neurais (NSCs). Curiosamente, descobrimos que os níveis de mRNA de CHD7 estão mais fortemente expressos em gliomas, quando comparados ao tecido cerebral normal, portanto, nós hipotetizamos que CHD7 poderia ter um papel na patogênese desses tumores. Para investigar o possível papel oncogênico de CHD7 em glioblastoma (GBM), utilizamos enfoques de ganho e perda de função em linhagens celulares aderentes de GBM. Utilizando a técnica de CRISPR_Cas9 para edição do genoma, demonstramos que a deleção do gene CHD7 suprime o crescimento independente de ancoragem e reduz a invasão de esferóides em células LN-229 humanas de GBM. Além disso, a deleção de CHD7 reduziu o crescimento do tumor e melhorou a sobrevida em modelo de injeção ortotópica xenográfica em camundongo. Por outro lado, verificou-se que a super-expressão ectópica de CHD7 nas células LN-428 e A172 aumenta não só a motilidade celular e a capacidade de invasão in vitro, mas, também, o crescimento do tumor de LN-428 in vivo. A análise de RNA-seq mostrou que o nocauteamento da sequência codificadora de CHD7 e sua super-expressão promovem alterações em diversas vias moleculares, modulando genes críticosassociados à adesão e locomoção celular. No entanto, os mecanismos subjacentes aos efeitos da super-expressão de CHD7 em tecidos de glioma ainda não são compreendidos. Neste trabalho, geramos um plasmídeo recombinante contendo um fragmento da região promotora de CHD7, o qual se mostrou funcional em ensaios de luciferase. Esta ferramenta permitirá que estudos futuros possam identificar a relação direta entre as diferentes vias de transdução de sinal e a expressão do gene CHD7. Em resumo, nossos achados indicam que células de GBM expressando um alto nível de CHD7 podem existir e contribuir para a infiltração e recorrência do tumor. Estudos posteriores deverão avaliar as possíveis implicações dos resultados apresentados neste trabalho para a translação clínica no tratamento de pacientes com GBM.

En la levadura S. cerevisiae, un incremento de la osmolaridad extracelular activa la vía de Hog1, lo que produce una compleja respuesta adaptativa. Entre las respuestas adaptativas que Hog1 coordina, está un importante cambio en el partón de expresión génica. La tesis presentada se centra en la respuesta a nivel de regulación génica, y en ella se ponen de manifiesto nuevos mecanismos por los cuales Hog1 regula la transcripción para inducir genes necesarios para la adaptación celular en respuesta a estrés osmótico. Este trabajo demuestra que Hog1 controla la iniciación y la elongación de la transcripción, interacciona con la RNA polimerasa elongando, y es reclutado en toda la región codificante de los genes que se inducen por estrés osmótico a traves del 3'UTR. Asimismo, Hog1 recluta el complejo remodelador de cromatina RSC para promover un dramático cambio en el posicionamiento de nucleosomas, permitiendo una correcta inducción de la expresión génica. / In the yeast S.cerevisiae, an increase in extra cellular osmolarity activates the Hog1 Pathway, which produces a very complex adaptive response. Among these adaptive responses coordinated by Hog1, there is an important change in the gene expression pattern. The presented Thesis focuses on the response triggered at the genomic level, showing novel mechanisms by which Hog1 regulates transcription to efficiently and properly induce a subset of genes critical for the cellular adaptation to osmotic stress. This work demonstrates that Hog1 promotes and regulates transcription not only at the initiation level, as was previously described, but it also interacts with the RNA Polymerase while elongating, and travels along the coding regions of genes induced upon osmotic stress through recognition of the 3'UTR. Furthermore, Hog1 recruits a chromatin-remodeling complex known as RSC to promote a dramatic change in nucleosome positioning of target genes, allowing a proper induction of the transcription

El NFAT5 es un factor de transcripción de la familia Rel, la cual incluye a los NFATc y los NF-[kappa]B. Hasta ahora, el NFAT5 había sido caracterizado principalmente como un factor de respuesta a estrés osmótico ya que regula la expresión de genes osmoprotectores y citoquinas en respuesta a hipertonicidad. En este trabajo hemos identificado y caracterizado una nueva función del NFAT5, la regulación de genes (TNF[alfa], IL6, iNOS) activados por la vía de los receptores de tipo Toll (TLR), importantes para la respuesta inmunitaria innata y adaptativa a una amplia variedad de estímulos patogénicos. Nuestros resultados muestran que el NFAT5 es un regulador importante en la ruta de los TLR, jugando un papel en la actividad de varios miembros de esta familia de receptores, tal y como lo hacen los factores de transcripción NF[kappa]B e IRF5. / NFAT5 is a transcription factor of the Rel family, which includes NFATc and NF-[kappa]B. NFAT5 has been mainly characterized as a hypertonicity responsive factor, since it regulates the expression of osmoprotective genes and cytokines in response to osmotic stress. In this work we have identified and characterized a novel role for NFAT5, the regulation of genes (TNF[alfa], IL6, iNOS) activated by the Toll-like receptor pathway (TLR), important for innate and adaptive immunity responses to a wide variety of pathogenic molecules. Our results show that NFAT5 is an important transcription factor of the TLR pathway, playing a role in the activity of several members of this receptor family, like other transcription factors such as NF-[kappa]B and IRF5.