Os marcadores genéticos denominados short tandem repeats (STR) são amplamente utilizados na identificação humana, tanto aqueles localizados nos cromossomos autossômicos como os encontrados no cromossomo Y. Durante a última década, muitas pesquisas demonstraram a existência de vários polimorfismos no cromossomo Y. O objetivo deste estudo foi caracterizar, na população regional, os diferentes haplótipos utilizando 12 loci (DYS19, DYS385a, DYS385b, DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438 e DYS439) e determinar as taxas de diversidade haplotípica e poder de identificação individual. A população testada foi composta por 162 pares de pais/filhos do sexo masculino. O DNA foi isolado a partir de sangue periférico, utilizando o kit comercial Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega). As regiões de interesse foram amplificadas pela PCR multiplex com oligonucleotídeos marcados com fluorescência e os produtos analisados por eletroforese capilar no analisador genético ABI 3100 (Applied Biosystems). Na amostra analisada, 151 haplótipos distintos foram encontrados, onde os dois haplótipos mais comuns apresentaram freqüências de 0,0265 e 0,0199, respectivamente. Outros 6 haplótipos distintos apresentaram freqüência de 0,0132 e a freqüência dos outros 143 haplótipos foi 0,0066 (1 ocorrência cada). Os resultados obtidos permitiram ainda a determinação de um valor de diversidade haplotípica de 0,9982 e um poder de discriminação individual de 0,9321. Além disso, após a determinação destas freqüências e das taxas estudadas foi possível comprovar que a utilização desses marcadores apresenta um alto poder de discriminação na correta identificação de indivíduos, tanto em casos de paternidade como na área forense. / The genetic markers named short tandem repeats (STR) are largely employed in human identification, those located on autosomal chromosomes as well as on Y-chromosome. During the last decade, several studies showed the occurrence of various polymorphisms on Y-chromosome. The aim of this study was to identify distinct haplotypes using 12 loci (DYS19, DYS385a, DYS385b, DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438 and DYS439) and to determine haplotype diversity rates and individual identification power. Tested population was composed by 162 pairs father-male sib. DNA was isolated from peripheral blood, using the Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega). Regions of interest were amplified by multiplex PCR with fluorescent primer and products were analyzed by capillary electrophoresis in the genetic analyzer ABI 3100 (Applied Biosystems). In the tested population, 151 distinct haplotypes were found, where frequencies of two common haplotypes were established to be 0.0265 and 0.0199, respectively. Individual frequencies of other 6 haplotypes were 0.0132 and frequency of the remaining 143 were 0.0066 (1 event each). Obtained results also allowed to determine haplotype diversity value of 0.9982 and individual discrimination power of 0.9321. Finally, results of this study indicate that application of these markers is responsible for a high discrimination power in individual identification on both paternity and forensic cases.

Submitted by Romulus Lima (romulus.lima@ufpe.br) on 2015-03-10T19:37:12Z No. of bitstreams: 2 TESE Helen Maria Barros.pdf: 2268248 bytes, checksum: 61ab6aa28739c5fc9a502e94ccaa0000 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-10T19:37:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Helen Maria Barros.pdf: 2268248 bytes, checksum: 61ab6aa28739c5fc9a502e94ccaa0000 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-01-17 / FACEPE e CAPES / A família Trichechidae pertence à ordem Sirenia, mamíferos aquáticos preferencialmente herbívoros que habitam regiões costeiras. Atualmente, esta família inclui as três espécies viventes de peixes-bois: Trichechus manatus, encontrado na costa atlântica das Américas, ocorrendo descontinuamente desde a Flórida (Estados Unidos) até o Brasil (estado de Alagoas); Trichechus inunguis, endêmico da bacia amazônica; e Trichechus senegalensis, distribuído na costa atlântica da África, do Senegal a Angola. Adicionalmente, são descritas duas subespécies de T. manatus, T. m. latirostris (peixe-boi da Flórida), que ocorre na Flórida e Golfo do México, e T. m. manatus (peixe-boi das Antilhas), encontrado no México, Caribe e Américas Central e do Sul, até o nordeste do Brasil. Esta designação subespecífica difere quanto aos dados cranianos e moleculares. Neste estudo foram usadas abordagens morfométricas geométricas e citogenéticas para avaliar a existência de variação geográfica em T. inunguis, T. m. manatus, T. m. latirostris e T. senegalensis, com o propósito de analisar variações morfológicas do crânio intra e interespecíficas, e diferenças cariotípicas em T. m. manatus e T. inunguis do Brasil. Os resultados das análises de morfometria geométrica revelaram nenhum dimorfismo sexual de tamanho e forma do crânio em nenhuma das espécies e a separação da população de T. inunguis das populações de T. senegalensis, T. m. manatus e T. m. latirostris por mudanças de forma do crânio, havendo sobreposição entre alguns destes indivíduos. T. m. manatus e T. m. latirostris apresentaram maior tamanho de crânio que T. inunguis e presença de alometria (forma relacionada com tamanho) foi observada. As análises intraespecíficas de forma do crânio mostraram a separação da população brasileira de T. m. manatus das populações do Caribe de T. m. manatus e dos Estados Unidos de T. m. latirostris, as quais sobrepuseram-se parcialmente, enquanto que em T. inunguis não houve uma clara separação entre suas populações geográficas. Também não foi observada variação de tamanho do crânio entre as populações de nenhuma das espécies. O pequeno tamanho amostral não permitiu que uma análise intraespecífica fosse realizada em T. senegalensis. Considerando que somente indivíduos do nordeste do Brasil foram amostrados e que os espécimes do Suriname e Guiana apresentaram forma do crânio mais similar àquela da população do Caribe, é sugerido a hipótese de que a foz do rio Amazonas pode ter interrompido ou estar interrompendo o fluxo gênico nas populações de T. m. manatus do Brasil, condizente com modelos de especiação alopátrica. Além disso, a população do peixe-boi antilhano do Brasil mostrou-se tão diferenciada, em relação à forma do crânio, quanto são as duas espécies bem reconhecidas de peixes-bois (T. inunguis e T. senegalensis). Os resultados das análises cromossômicas também revelaram diferenças cariotípicas estruturais entre T. m. manatus (2n = 48) do Brasil e as populações do peixe-boi antilhano de Porto Rico e do peixe-boi da Flórida, reforçando as conclusões obtidas pela morfometria geométrica e sugerindo o isolamento reprodutivo da população do Brasil. A análise citogenética da população brasileira de T. inunguis (2n = 56) revelou a presença de um par cromossômico heteromórfico e polimórfico com relação à morfologia acrocêntrica e submetacêntrica, mostrando um padrão que pode ser indicativo de evolução cromossômica recente, devido à existência de variantes cariotípicas heterozigotas. Em adição, não foi verificada a presença de sítios teloméricos intersticiais nos cromossomos de T. inunguis e T. m. manatus pela técnica de hibridização in situ fluorescente. Os resultados obtidos neste estudo para a população brasileira de T. m. manatus suportam a evidência preliminar dos dados de DNA mitocondrial e estas conclusões combinadas não coincidem com a designação subespecífica de T. manatus atualmente aceita, baseada em medidas lineares do crânio.

Orientadores: Antonia Paula Marques-de-Faria, Iscia Lopes Cendes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:46:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camargo_MariaEugeniaRibeirode_M.pdf: 5663240 bytes, checksum: da16953f8e521ccd08401398ff5c4a82 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Entre as etiologias genéticas da deficiência mental (DM), um grupo vem sendo objeto de atenção especial, o do retardo mental ligado ao X (RMLX), no qual entre 25 a 40% correspondem a casos da síndrome do X Frágil (SXF). Tal denominação se relaciona à presença de um sítio frágil na região Xq27.3, representado genotipicamente por FRAXA, causado pela variação do número de cópias de uma repetição instável de trinucleotídeos CGG na extremidade 5' não traduzida do gene FMR-l. Ainda na região Xq27-28 estão localizados os sítios frágeis FRAXE e FRAXF. O objetivo principal deste projeto foi implantar a técnica e realizar a análise molecular, utilizando o método da PCR, para triagem da mutação por expansão de trinuc1eotídeos, e o de Southem blot para análise da mutação completa e pré-mutação relacionadas a SXF, em indivíduos do sexo masculino com DM de etiologia não esclarecida, apresentando ou não quadro clínico sugestivo da SXF, nos quais a análise citogenética para tal alteração se mostrou negativa. A análise molecular da repetição CGG, em um total de 54 indivíduos, revelou apenas um (1,9%) com o alelo expandido de aproximadamente 7,OKb; 51 (94,4%) apresentaram apenas alelos de tamanhos normais, variando entre 5 e 54 repetições CGG e, em dois indivíduos (3,7%), os resultados se mostraram inconclusivos. A análise do tamanho normal da repetição trinucleotídica polimórfica (CGG)n, em 49 mulheres do grupo controle, mostrou que 65,3% destas são heterozigotas, apresentam dois alelos CGG normais de tamanhos diferentes. Como protocolo de investigação diagnóstica em indivíduos com DM idiopática, a associação do exame de cariótipo rotineiro à triagem por PCR da SXF possibilitou uma cobertura satisfatória das principais causas de RM. A implementação das técnicas da PCR e de Southem blot para a SXF representou um passo fundamental para que o laboratório de Genética Molecular do Departamento de Genética Médica da UNICAMP possa oferecer mais este serviço à população, tendo em vista a importância dessa condição como etiologia da DM / Abstract: mong the mental deficiencies of genetic origin the group of X-linked mental retardation (XLMR) has got special attention. lnside this group 25 to 40% corresponds to cases of ftagile X syndrome (FXS). This designation is related to the presence of a ftagile site in the Xq27.3 region, genotypically represented by FRAXA, that is caused by thevariation in the number of copies of an instable repetition of CGG trinucleotides at the 5' untranslated region ofthe FMR-l gene. The FRAXE and FRAXF sites are both located inside the region Xq27-28. The main aim of this project is to setup a reliable method to perform the molecular analysis using the PCR technique in order to screen the trinucleotides expansion mutation, and the Southem blot analysis to identify the pre- and complete mutation related to FXS in males with mental deficiency of unknown origino This group of males was chosen because there was no clinical pattem indicative of FXS and the cytogenetic analysis for such alteration was negative. The molecular analysis of the CGG repetition for a total of 54 subjects showed only one (1.9 %) individual with an expanded allele of around 7.0 kb; 51 (94.4 %) showed normal size alleles,varying between 5 and 54 CGG repetitions, and for two individuals (3.7 %) the results were inconclusive. The analysis of the normal size of the polymorphic trinucleotides repetition (CGG)n in 49 women ftom the control group showed that 65.3 % of them as eterozygotes for the normal allele,with two normal CGG alleles of different sizes. As a protocol for the diagnosis of individuais with idiopathic MO, the association of the routine cariotype examination together with PCR screening for FXS became a satisfactory tool to identifythe principal causes for MR. The implementation of the PCR and Southem blot techniques for the diagnosis of FXS represented an important step for the Molecular Genetic laboratory of the Medical Genetic Department at UNICAMP to offer one more service to the general population, keeping in mind the importance of identifying the FXS condition as a possible origin for the MO / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Solange Bento Farah / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T23:03:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sartorato_EdiLucia_M.pdf: 4685693 bytes, checksum: fda73fd184d9bf0a8e374de113c67c42 (MD5) Previous issue date: 1994 / Mestrado / Genetica Humana / Mestre em Ciências Biológicas

Este trabalho teve o objetivo de estimar a frequência de deficiência mental causada por mutações no cromossomo X entre pacientes do sexo masculino, que constituem casos isolados de deficiência mental. A estratégia adotada foi a determinação do padrão de inativação do cromossomo X nas mães dos afetados, com base (a) nas indicações de que desvios extremos do padrão casual de inativação do cromossomo X têm alta probabilidade de estar relacionados à presença de mutações do cromossomo X e (b) na observação de que a frequência desses desvios está significantemente aumentada em mulheres certamente portadoras de mutações que causam deficiência mental de herança ligada ao X. A vantagem seletiva das células que possuem o alelo não mutado no cromossomo X ativo é uma explicação para tais desvios extremos da inativação do cromossomo X, raramente encontrados na população geral. Selecionamos 115 meninos portadores de deficiência mental moderada a grave associada a outros sinais clínicos, não característicos de síndrome conhecida e que tinham cariótipos normais e teste negativo para a síndrome do cromossomo X frágil; suas genitoras concordaram com a participação no estudo. Esses pacientes foram encaminhados ao Serviço de Aconselhamento Genético do Laboratório de Genética Humana, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, por diferentes serviços médicos, para diagnóstico e orientação quanto a riscos de recorrência na família. O padrão de inativação do cromossomo X nas mães dos afetados foi investigado, com base na metilação diferencial dos alelos do gene AR (Androgen Receptor gene) , no cromossomo X ativo e inativo. As mães de 100 desses meninos se revelaram heterozigóticas quanto à repetição polimórfica CAG do gene AR, requisito do teste para determinar o padrão de inativação do cromossomo X. Onze mulheres (11%) apresentaram desvios extremos do padrão de inativação do X (≥ 98:2), frequência significativamente maior (P = 0.0001; teste exato de Fisher) do que aquela que a literatura registra, em estudo utilizando o mesmo ensaio, entre mulheres adultas da população geral (0,017; IC 95% = 0,007 0,034). A raridade de desvios tão extremos na população geral permite admitir que as mães dos afetados que apresentam tais desvios sejam portadoras de mutação no cromossomo X, que causa a deficiência mental em seus filhos. Sendo assim, estimamos em 11% a frequência de deficiência mental em nossa amostra de 100 meninos casos isolados de deficiência mental (IC 95% = 0,056 0,188), sem incluir a síndrome do X frágil, responsável por 2,5% a 3% da deficiência mental no sexo masculino. Essa nossa estimativa para a proporção de deficiência mental moderada grave ligada ao X entre indivíduos do sexo masculino com DM é da mesma ordem de grandeza daquelas relatadas na literatura, baseadas (a) na frequência da síndrome do X frágil em coortes de homens com deficiência mental e entre famílias com deficiência mental de herança ligada ao X ou (b) nas inferências da prevalência de deficiência mental e de deficiência mental causada por mutações no cromossomo X na população geral masculina. Entretanto, a frequência por nós determinada deve ser uma subestimativa, considerando que os desvios extremos do padrão de inativação ocorrem em apenas um terço das portadoras obrigatórias de mutações que causam deficiência mental com herança ligada ao X. Com base nos resultados deste estudo, consideramos indicada a avaliação do padrão de inativação do cromossomo X em mães de indivíduos do sexo masculino, casos isolados de deficiência mental. A detecção de desvio extremo da inativação deve ser considerada indicativa de deficiência mental de herança ligada ao X, constituindo subsídio para o aconselhamento genético da família e podendo levar á identificação da mutação causadora da deficiência mental. / Nearly a third of obligate carriers of mutations causative of X-linked mental retardation (XLMR) have been reported to have extreme X-inactivation skewing in peripheral blood cells, compared to their non-carrier relatives. Selective advantage of cells with the non-mutated allele on the active X chromosome would explain this skewing. Based on these findings, we used the pattern of X-inactivation in mothers of mentally retarded boys, as a parameter to evaluate the frequency of XLMR among non-familial cases. To determine the X-inactivation pattern in these women, we investigated the methylation status of the AR (Androgen Receptor) alleles in blood cells. We selected 115 boys with moderate to severe mental retardation of unknown cause, who had normal karyotypes and tested negative for fragile X syndrome; the mothers of 100 of these boys were found to be heterozygous for the polymorphic CAG repeat of the AR gene, a requisite of the X-inactivation assay. Eleven women (11%) had extremely skewed X-inactivation (≥ 98:2), a frequency significantly higher (P = 0.0001; Fisher exact test) than the frequency reported for adult women from the general population (1.7%; 95% CI = 0.007 0,034). Assuming that every mother with extremely skewed X-inactivation is a carrier of an X-chromosome mutation that causes mental retardation in her son, the frequency of XLMR in our sample of 100 boys is 11% (95% CI = 0,056 0,188), the fragile X syndrome being excluded. Although these figures are quite in agreement with previous estimations of the frequency of XLMR among mentally retarded men, they might be an underestimation, when it is taken into account that only about a third of obligate carriers of XLMR mutations have highly skewed X inactivation.

Este trabalho teve o objetivo de estimar a frequência de deficiência mental causada por mutações no cromossomo X entre pacientes do sexo masculino, que constituem casos isolados de deficiência mental. A estratégia adotada foi a determinação do padrão de inativação do cromossomo X nas mães dos afetados, com base (a) nas indicações de que desvios extremos do padrão casual de inativação do cromossomo X têm alta probabilidade de estar relacionados à presença de mutações do cromossomo X e (b) na observação de que a frequência desses desvios está significantemente aumentada em mulheres certamente portadoras de mutações que causam deficiência mental de herança ligada ao X. A vantagem seletiva das células que possuem o alelo não mutado no cromossomo X ativo é uma explicação para tais desvios extremos da inativação do cromossomo X, raramente encontrados na população geral. Selecionamos 115 meninos portadores de deficiência mental moderada a grave associada a outros sinais clínicos, não característicos de síndrome conhecida e que tinham cariótipos normais e teste negativo para a síndrome do cromossomo X frágil; suas genitoras concordaram com a participação no estudo. Esses pacientes foram encaminhados ao Serviço de Aconselhamento Genético do Laboratório de Genética Humana, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, por diferentes serviços médicos, para diagnóstico e orientação quanto a riscos de recorrência na família. O padrão de inativação do cromossomo X nas mães dos afetados foi investigado, com base na metilação diferencial dos alelos do gene AR (Androgen Receptor gene) , no cromossomo X ativo e inativo. As mães de 100 desses meninos se revelaram heterozigóticas quanto à repetição polimórfica CAG do gene AR, requisito do teste para determinar o padrão de inativação do cromossomo X. Onze mulheres (11%) apresentaram desvios extremos do padrão de inativação do X (≥ 98:2), frequência significativamente maior (P = 0.0001; teste exato de Fisher) do que aquela que a literatura registra, em estudo utilizando o mesmo ensaio, entre mulheres adultas da população geral (0,017; IC 95% = 0,007 0,034). A raridade de desvios tão extremos na população geral permite admitir que as mães dos afetados que apresentam tais desvios sejam portadoras de mutação no cromossomo X, que causa a deficiência mental em seus filhos. Sendo assim, estimamos em 11% a frequência de deficiência mental em nossa amostra de 100 meninos casos isolados de deficiência mental (IC 95% = 0,056 0,188), sem incluir a síndrome do X frágil, responsável por 2,5% a 3% da deficiência mental no sexo masculino. Essa nossa estimativa para a proporção de deficiência mental moderada grave ligada ao X entre indivíduos do sexo masculino com DM é da mesma ordem de grandeza daquelas relatadas na literatura, baseadas (a) na frequência da síndrome do X frágil em coortes de homens com deficiência mental e entre famílias com deficiência mental de herança ligada ao X ou (b) nas inferências da prevalência de deficiência mental e de deficiência mental causada por mutações no cromossomo X na população geral masculina. Entretanto, a frequência por nós determinada deve ser uma subestimativa, considerando que os desvios extremos do padrão de inativação ocorrem em apenas um terço das portadoras obrigatórias de mutações que causam deficiência mental com herança ligada ao X. Com base nos resultados deste estudo, consideramos indicada a avaliação do padrão de inativação do cromossomo X em mães de indivíduos do sexo masculino, casos isolados de deficiência mental. A detecção de desvio extremo da inativação deve ser considerada indicativa de deficiência mental de herança ligada ao X, constituindo subsídio para o aconselhamento genético da família e podendo levar á identificação da mutação causadora da deficiência mental. / Nearly a third of obligate carriers of mutations causative of X-linked mental retardation (XLMR) have been reported to have extreme X-inactivation skewing in peripheral blood cells, compared to their non-carrier relatives. Selective advantage of cells with the non-mutated allele on the active X chromosome would explain this skewing. Based on these findings, we used the pattern of X-inactivation in mothers of mentally retarded boys, as a parameter to evaluate the frequency of XLMR among non-familial cases. To determine the X-inactivation pattern in these women, we investigated the methylation status of the AR (Androgen Receptor) alleles in blood cells. We selected 115 boys with moderate to severe mental retardation of unknown cause, who had normal karyotypes and tested negative for fragile X syndrome; the mothers of 100 of these boys were found to be heterozygous for the polymorphic CAG repeat of the AR gene, a requisite of the X-inactivation assay. Eleven women (11%) had extremely skewed X-inactivation (≥ 98:2), a frequency significantly higher (P = 0.0001; Fisher exact test) than the frequency reported for adult women from the general population (1.7%; 95% CI = 0.007 0,034). Assuming that every mother with extremely skewed X-inactivation is a carrier of an X-chromosome mutation that causes mental retardation in her son, the frequency of XLMR in our sample of 100 boys is 11% (95% CI = 0,056 0,188), the fragile X syndrome being excluded. Although these figures are quite in agreement with previous estimations of the frequency of XLMR among mentally retarded men, they might be an underestimation, when it is taken into account that only about a third of obligate carriers of XLMR mutations have highly skewed X inactivation.

A inativação do cromossomo X (ICX) em fêmeas é um exemplo de regulação epigenética. O silenciamento de um dos cromossomos X leva à formação estável da heterocromatina facultativa através da aquisição de múltiplas modificações na cromatina que são mantidas nas subsequentes divisões celulares. Atualmente, algumas características epigenéticas associadas à manutenção da ICX têm sido descritas, contudo os mecanismos de ação e a identidade dos diferentes fatores envolvidos na manutenção da ICX ainda são desconhecidos ou pouco compreendidos. Nosso laboratório realizou uma triagem funcional genômica por bibliotecas de shRNAs (short harpin RNAs) para encontrar genes envolvidos na manutenção da ICX em humanos. A partir deste estudo foram identificados 20 novos genes candidatos a estarem envolvidos na manutenção da ICX. Assim, o objetivo deste trabalho foi validar o grau de envolvimento de dois destes genes candidatos (H3F3B e ASF1A) no processo de controle epigenético do cromossomo X. Para isto, foi realizado o silenciamento dos genes candidatos através da utilização de partículas lentivirais portando shRNAs específicos em fibroblastos primários femininos heterozigotos para uma mutação no gene HPRT e com desvio total de ICX, onde o único alelo normal do gene HPRT está no Xi. A reativação do Xi nestas células foi avaliada por cultivo das mesmas em meio HAT, que seleciona células HPRT+. Só sobreviveram os fibroblastos que foram silenciados para o gene H3F3B. Nestes, as células transduzidas com o shH3F3B.2 expressam o alelo selvagem do gene, presente no Xi, além do gene mutante. Ensaios de RNA-FISH e trimetilação de histonas foram feitos nessas células para avaliar a perda das marcas de cromatina inativa. Foi observada uma perda da nuvem de XIST nas células transduzidas com o shH3F3B.2 e selecionadas em HAT em passagens altas. Por último, análises de expressão alelo-específica de genes ligados ao X comprovaram que dois genes que são submetidos à ICX apresentaram expressão do alelo inativado (FLNA e FHL1). Porém, também foi observada uma mudança no padrão de expressão alelo-específica em genes autossômicos. Finalmente, as análises de expressão geral do cromossomo X mostraram que as células transduzidas com o shH3F3B.2 e selecionada em HAT tinham uma expressão gênica aumentada em relação ao controle. Em conclusão, nossos resultados sugerem uma descondensação da cromatina no cromossomo Xi e portanto um provável envolvimento do gene H3F3B na manutenção da ICX. / The X chromosome Inactivation (XCI) in females is an example of epigenetic regulation. Silencing of one of the X chromosomes leads to the stable formation of the facultative heterochromatin through the acquisition of multiple modifications in the chromatin that are maintained in the subsequent cell divisions. Currently, some epigenetic features associated with the maintenance of XCI have been described. Nonetheless, the mechanisms of action and the identity of the different factors involved in the maintenance of XCI are still unknown or poorly understood. Our laboratory performed a genomic functional screening by shRNA (short harpin RNAs) libraries to find genes involved in the maintenance of XCI in humans. From this study, we identified 20 new candidate genes to be involved in the maintenance of XCI. Thus, the objective of this work was to validate the degree of involvement of two of these candidate genes (H3F3B and ASF1A) in the epigenetic process control of the X chromosome. For this, the silencing of the candidate genes was performed in female heterozygous primary fibroblasts for a mutation of the HPRT gene and with a total XCI shift through the use of lentiviral particles carrying specific shRNAs, where the only normal allele of the HPRT gene is in the Xi (inactivated X). Xi reactivation was evaluated in these cells by culturing them in HAT medium, which selects HPRT + cells. Only the fibroblasts that were silenced for the H3F3B gene survived. Furthermore, the cells transduced with shH3F3B.2 express the HPRT wild gene allele, present in Xi, in addition to the mutant gene. RNA-FISH and histone trimethylation assays were performed on these cells to evaluate the loss of inactive chromatin marks. A loss of the XIST cloud was observed in cells transduced with shH3F3B.2 and selected in HAT at high passages. Finally, allele-specific expression analyzes of X-linked genes showed that two genes that undergo XCI showed expression of the inactivated allele (FLNA and FHL1). However, a change in allele-specific expression pattern was also observed in autosomal genes. Finally, the X chromosome general expression analyses showed that cells transduced with shH3F3B.2 and selected on HAT had increased gene expression relative to the control. In conclusion, our results suggest a decondensation of the chromatin in the Xi chromosome and therefore a probable involvement of the H3F3B gene in the maintenance of ICX.

Introdução: A maioria das doenças lisossômicas são herdadas como traços recessivos, mas a mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é de herança ligada ao cromossomo X. As doenças ligadas ao cromossomo X possuem um importante impacto para as famílias devido ao risco que as heterozigotas apresentam em ter um filho afetado. A maioria das heterozigotas para as doenças ligadas ao cromossomo X são clinicamente assintomáticas. Em relação à MPS II somente dez mulheres afetadas foram relatadas na literatura. Entretanto, nenhum estudo foi realizado para a avaliação da presença de sinais sutis da doença nessas heterozigotas. Objetivo: o objetivo principal desse estudo foi a identificação de sinais clínicos sutis e bioquímicos relacionados à MPS II nas heterozigotas para essa doença e adicionalmente estabelecer a associação desses achados com o padrão de inativação do cromossomo X. Métodos: esse foi um estudo observacional e transversal. Essas mulheres foram classificadas como heterozigotas e não heterozigotas baseadas na análise molecular do gene da iduronato sulfatase (IDS). Ambos grupos foram comparados com relação às seguintes variáveis: dados clínicos, achados do exame físico, cariótipo, padrão de inativação do cromossomo X (ensaio HUMARA), atividades da IDS em leucócitos e plasma, níveis de glicosaminoglicanos na urina, tomografia computadorizada de abdomen e coluna e ressonância magnetica de crânio. Resultados: Quarenta mulheres pertencentes a 24 famílias foram avaliadas. De acordo com a análise do DNA 22 foram classificadas em heterozigotas e 18 em não heterozigotas. Não foi encontrada nenhuma anormalidade no exame físico (n=40), cariótipo (n=31/40) ou na TC de coluna (n=31/40). A incidência de abortamento também não apresentou diferenças entre essas mulheres. Entretanto, a atividade da IDS em plasma (p<0,001) e em leucócitos (p<0,001) apresentaram níveis inferiores nas heterozigotas. A correção de Bonferroni foi aplicada e não foi encontrada nenhuma diferença entre os grupos dentre as variáveis analisadas. Também em relação ao padrão de inativação do cromossomo X não foi observada diferença esntre as heterozigotas e não heterozigotas. Conclusões: Esse é o primeiro estudo sistemático realizado em heterozigotas para MPS II. Não foi encontrada nenhuma evidência de manifestações clínicas sutis ou sinais radiológicos da doença MPS II nessas mulheres. Nossos achados sugerem que não existe relação entre a ausência dos sinais clínicos nessas mulheres e a ocorrência de um padrão favorável de desvio da inativação do cromossomo X. Esses dados sugerem que a MPS II apresenta uma baixa penetrância nas heterozigotas. / Introduction: Most lysosomal diseases are inherited as recessive traits, but muchopolysaccharidosis type II (MPS II) presents X-linked inheritance. The X-linked disorders have an important impact for families because the risk heterozygous present of having an affected child. Most heterozygotes for X-linked disorders are clinically asymptomatic. Regarding MPS II only ten affected females have been reported in the literature. However, none study has been taken in order to evaluate subtle signs of the disease in heterozygotes. Objective: The main objective of this study was to identify subtle clinical and biochemical signs of MPS II in heterozygotes for this disease, and to correlate the findings with the pattern of X chromosome inactivation presented by these women. Methods: This was an observational, transversal and controlled study. The women were classified as heterozygote or non-heterozygote based on molecular analysis of the iduronate sulfatase (IDS) gene. Both groups were compared between regarding clinical data, physical exam findings, karyotype, pattern of X inactivation (HUMARA assay), IDS activity in leukocytes and plasma, glycosaminoglicans levels in urine, computadorized tomography scans of abdomen and spine, and brain magnetic resonance imaging. Results: Forty women from 24 families were evaluated. According to DNA analysis, 22 women were classified as heterozygote and 18 as non-heterozygotes. We did not found any abnormality in physical examination (n=40), karyotype (n=31/40) or spine CT scans (n=31/40). The incidence of miscarriage also did not differ between these females. However, IDS activities in plasma (p<0.001) and in leukocyte (p<0.001) were lower in heterozygotes. Applying the Bonferroni’s correction, we did not find any difference between the groups regarding the variables analyzed. Also the pattern of X chromosome inactivation was not different between heterozygotes and non-heterozygotes. Conclusion: This is the first systematic study performed in heterozygotes for MPS II. We did not find any evidence of subtle clinical manifestations or radiological signs of MPS II disease in these females. Our findings suggest that there is no relation between the absence of clinical signs in these women and the occurrence of a favorable skewing pattern of X chromosome inactivation. This data suggests that MPS II is a disease which shows low penetrance in heterozygotes.

Several approaches using molecular biology techniques and the social sciences has been employed in order to clarify the involvement of Africans and their descendants in the history of Brazil. The African presence in America dates back to the sixteenth century when men and women were sold as slaves to serve as manpower in the colonies of Europe. It is estimated that since that time more than 15 million people have been brought forcibly to the Americas, 40% had Brazil as a destination. These Africans and their descendants started swapping genes with Europeans and Indians who inhabited the region. However, is not yet known in detail the participation of Africans in shaping history and genetics of population. Difficult access to detailed history of Africans and their descendants in Brazil is due largely to lack of documents and other historical data and geography, and only recently modern techniques of molecular biology have allowed a detailed analysis of the origin and migration of peoples. Quilombo communities are remnants of Quilombo, which were groups of runaway slaves and freedmen, located in remote and inaccessible. Quilombo is a Bantu word which means warrior camp in the forest. This study aimed to determine the polymorphism of 11 microsatellite markers on the Y chromosome in the maroon communities of the State of Alagoas. We analyzed 11 microsatellite loci of 211 men in nine maroon communities of the State of Alagoas, identified 108 haplotypes. The haplotype diversity varied from 0.7464 ± 0.0907 (Muquém) to 0.9794 ± 0.0594 (Carrasco), suggesting that there is significant founder effect in these communities. Analysis of molecular variance (AMOVA) revealed that populations have maroon marked heterogeneity, with 25.4% of the variation due to differences among the 74.6% and intrapopulation differences. The ancient African lineages, Amerindian and European is quite varied, noting that some populations are genetically closer to European and other populations of African populations. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / Diversas abordagens utilizando técnicas de biologia molecular e de ciências sociais tem sido empregadas com a finalidade de esclarecer a participação dos africanos e seus descendentes na historia do Brasil. A presença do africano na América remonta ao século XVI, quando homens e mulheres foram comercializados como escravos para servirem de mão-de-obra nas colônias européias. Estima se que desde essa época mais de 15 milhões de pessoas tenham sido trazidas forçadamente para o continente americano, sendo que 40% delas tiveram o Brasil como destino. Esses africanos e seus descendentes iniciaram troca de genes com europeus e índios que já habitavam a região. No entanto, ainda não se conhece em detalhes a participação dos africanos na formação histórica e genética da população brasileira. A dificuldade de acesso à historia detalhada dos africanos e seus descendentes no Brasil se deve em grande parte a escassez de documentos e outros dados histórico-geográficos, e só recentemente técnicas modernas de biologia molecular permitiram uma análise detalhada da origem e migração dos povos. Quilombolas são comunidades remanescentes dos quilombos, que eram agrupamentos de escravos fugitivos e libertos, localizados em regiões isoladas e de difícil acesso. Quilombo é um termo Banto, que quer dizer acampamento guerreiro na floresta. O presente trabalho teve como propósito a determinação do polimorfismo de 11 marcadores microssátelites do cromossomo Y nas comunidades quilombolas do Estado de Alagoas. Foram analisados 11 locos de microssatélites de 211 homens em nove comunidades quilombolas do Estado de Alagoas, sendo identificado 108 haplótipos. A diversidade haplotípica variou de 0,7464±0,0907 (Muquém) a 0.9794±0,0594 (Carrasco), sugerindo que não existe efeito fundador significativo nessas comunidades. A análise da variância molecular (AMOVA) revelou que as populações quilombolas apresentam acentuada heterogeneidade, com 25,4% da variação devido a diferenças interpopulacionais e 74,6% a diferenças intrapopulacionais. As linhagens ancestrais africanas, ameríndias e européias é bastante variado, observando-se que algumas populações se aproximam geneticamente de populações européias e outras de populações africanas.

Introdução: A maioria das doenças lisossômicas são herdadas como traços recessivos, mas a mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é de herança ligada ao cromossomo X. As doenças ligadas ao cromossomo X possuem um importante impacto para as famílias devido ao risco que as heterozigotas apresentam em ter um filho afetado. A maioria das heterozigotas para as doenças ligadas ao cromossomo X são clinicamente assintomáticas. Em relação à MPS II somente dez mulheres afetadas foram relatadas na literatura. Entretanto, nenhum estudo foi realizado para a avaliação da presença de sinais sutis da doença nessas heterozigotas. Objetivo: o objetivo principal desse estudo foi a identificação de sinais clínicos sutis e bioquímicos relacionados à MPS II nas heterozigotas para essa doença e adicionalmente estabelecer a associação desses achados com o padrão de inativação do cromossomo X. Métodos: esse foi um estudo observacional e transversal. Essas mulheres foram classificadas como heterozigotas e não heterozigotas baseadas na análise molecular do gene da iduronato sulfatase (IDS). Ambos grupos foram comparados com relação às seguintes variáveis: dados clínicos, achados do exame físico, cariótipo, padrão de inativação do cromossomo X (ensaio HUMARA), atividades da IDS em leucócitos e plasma, níveis de glicosaminoglicanos na urina, tomografia computadorizada de abdomen e coluna e ressonância magnetica de crânio. Resultados: Quarenta mulheres pertencentes a 24 famílias foram avaliadas. De acordo com a análise do DNA 22 foram classificadas em heterozigotas e 18 em não heterozigotas. Não foi encontrada nenhuma anormalidade no exame físico (n=40), cariótipo (n=31/40) ou na TC de coluna (n=31/40). A incidência de abortamento também não apresentou diferenças entre essas mulheres. Entretanto, a atividade da IDS em plasma (p<0,001) e em leucócitos (p<0,001) apresentaram níveis inferiores nas heterozigotas. A correção de Bonferroni foi aplicada e não foi encontrada nenhuma diferença entre os grupos dentre as variáveis analisadas. Também em relação ao padrão de inativação do cromossomo X não foi observada diferença esntre as heterozigotas e não heterozigotas. Conclusões: Esse é o primeiro estudo sistemático realizado em heterozigotas para MPS II. Não foi encontrada nenhuma evidência de manifestações clínicas sutis ou sinais radiológicos da doença MPS II nessas mulheres. Nossos achados sugerem que não existe relação entre a ausência dos sinais clínicos nessas mulheres e a ocorrência de um padrão favorável de desvio da inativação do cromossomo X. Esses dados sugerem que a MPS II apresenta uma baixa penetrância nas heterozigotas. / Introduction: Most lysosomal diseases are inherited as recessive traits, but muchopolysaccharidosis type II (MPS II) presents X-linked inheritance. The X-linked disorders have an important impact for families because the risk heterozygous present of having an affected child. Most heterozygotes for X-linked disorders are clinically asymptomatic. Regarding MPS II only ten affected females have been reported in the literature. However, none study has been taken in order to evaluate subtle signs of the disease in heterozygotes. Objective: The main objective of this study was to identify subtle clinical and biochemical signs of MPS II in heterozygotes for this disease, and to correlate the findings with the pattern of X chromosome inactivation presented by these women. Methods: This was an observational, transversal and controlled study. The women were classified as heterozygote or non-heterozygote based on molecular analysis of the iduronate sulfatase (IDS) gene. Both groups were compared between regarding clinical data, physical exam findings, karyotype, pattern of X inactivation (HUMARA assay), IDS activity in leukocytes and plasma, glycosaminoglicans levels in urine, computadorized tomography scans of abdomen and spine, and brain magnetic resonance imaging. Results: Forty women from 24 families were evaluated. According to DNA analysis, 22 women were classified as heterozygote and 18 as non-heterozygotes. We did not found any abnormality in physical examination (n=40), karyotype (n=31/40) or spine CT scans (n=31/40). The incidence of miscarriage also did not differ between these females. However, IDS activities in plasma (p<0.001) and in leukocyte (p<0.001) were lower in heterozygotes. Applying the Bonferroni’s correction, we did not find any difference between the groups regarding the variables analyzed. Also the pattern of X chromosome inactivation was not different between heterozygotes and non-heterozygotes. Conclusion: This is the first systematic study performed in heterozygotes for MPS II. We did not find any evidence of subtle clinical manifestations or radiological signs of MPS II disease in these females. Our findings suggest that there is no relation between the absence of clinical signs in these women and the occurrence of a favorable skewing pattern of X chromosome inactivation. This data suggests that MPS II is a disease which shows low penetrance in heterozygotes.