La voie de l’AMPc est une voie impliquée dans la physiopathologie de nombreuses tumeurs endocrines. Les phosphodiestérases sont des enzymes clés de la voie de l’AMPc dans la mesure où elles permettent de réguler finement les niveaux intra-cellulaires d’AMPc en hydrolysant l’AMPc en son catabolite inactif, le 5’AMP. L’hyperplasie macronodulaire bilatérale des surrénales est une étiologie rare de syndrome de Cushing ACTH-indépendant responsable d’un syndrome de Cushing souvent modéré contrastant avec la taille des nodules surrénaliens. Sa physiopathologie est mal connue.Nous avons tout d’abord pu montrer dans ce travail que les variants faux sens de la phosphodiestérase 11A pouvaient participer au développement des tumeurs corticosurrénales bilatérales sécrétrices de cortisol. Ces variants sont, en effet, non seulement retrouvés de façon plus fréquente chez les patients porteurs d’une hyperplasie nodulaire comparés à des sujets contrôles, mais ils ont également des conséquences fonctionnelles in vitro.Nous avons, dans une seconde partie, montré grâce à une étude de transcriptome ayant porté sur un groupe d’adénomes cortisoliques comparés à un groupe d’adénomes non-sécrétant que plusieurs gènes codant pour la voie de l’AMPc étaient impliqués dans la sécrétion cortisolique et que la phosphodiestérase 8 B semblait avoir un rôle prépondérant. Ces résultats ont ensuite été confirmés au niveau protéique. / Pas de résumé en anglais

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El hiperadrenocorticismo dependiente de hipófisis o Enfermedad de Cushing en caninos, es una enfermedad endocrina que afecta a perros de mediana a avanzada edad y que es consecuencia de la cronicidad de niveles excesivos de cortisol producidos por la corteza adrenal. Se produce por una hiperestimulación de la glándula, comandada por una hipersecreción de ACTH a nivel hipofisiario. Estos pacientes habitualmente padecen comorbilidades debido a patologías de mayor frecuencia en canes seniles y/o a las complicaciones del hipercortisolismo. El tratamiento más ampliamente aceptado es el farmacológico, que tradicionalmente buscó disminuir los niveles de cortisol producidos en la glándula adrenal sin controlar el tamaño del tumor, con los riesgos de daño cerebral que ello implica. En esta línea, la farmacoterapia aún vigente es el mitotano, trilostano y ketoconazol, siendo el trilostano el que presenta un mayor uso debido a que proporciona una esperanza de vida, al menos igual al mitotano, y una menor prevalencia de efectos adversos. Adicional a esta opción terapéutica, en los últimos 10 años la investigación científica ha buscado fármacos que actúen a nivel central y que controlen tanto el tamaño del tumor como los niveles de cortisol. De este modo se intenta mejorar el pronóstico aumentando la sobrevida, disminuyendo la presentación de efectos adversos y la probabilidad de presentar signos neurológicos. Es así como actualmente existen estudios que proponen el uso de ácido retinoico, cabergolina y pasireotida, la cual además ha sido estudiada conjuntamente al uso de fármacos de acción adrenal. Estas drogas si bien requerirán de mayores estudios en el área, debido a la baja presentación de efectos adversos en perros y los prometedores resultados obtenidos, se vuelven una opción terapéutica a considerar. Finalmente, de acuerdo con la información recopilada en este trabajo sobre cada droga, respecto a sus pros y contras, se propone un algoritmo de tratamiento para la Enfermedad de Cushing, que involucre la presencia de comorbilidades y que sirva de orientación a la hora de decidir un tratamiento médico. Éste debe incluir la instrucción del propietario respecto a riesgos de la terapia y debe considerar que, ante la inexperiencia y conocimiento limitado de cada droga, el tratamiento debe ser prudente en términos de dosis y monitoreo de un paciente crónico. / Canine pituitary dependent hyperadrenocorticism or Cushing's disease is an endocrine disorder of the middle-aged or older dogs. It is consequence of the excessive levels of cortisol produced chronically by adrenal cortex. It is produced because of the gland hyperstimulation, commanded by an hypersecretion of ACTH by pituitary gland. These patients frequently suffer comorbidities due to other pathologies, presented mostly in older dogs or by complications of hypercortisolism. The most widely accepted treatment for Cushing's disease is the pharmacological, which traditionally sought to reduce the levels of cortisol produced in the adrenal gland without controlling the size of the tumor, with the risks of brain damage involved. In this line, pharmacotherapy still in use is mitotane, trilostane and ketoconazole, being trilostane the one that presents a greater use because it provides a life expectancy, at least equal to mitotane, and a lower prevalence of adverse effects. In addition to this therapeutic option, in the last 10 years, scientific researching sought to medications which acts at pituitary level and that are able to control both, tumor size and cortisol levels. In this way, researchers are trying to improve the prognosis, increase the survival, reduce the presentation of adverse effects and the probability of presenting neurological signs. This is how there are currently studies that propose the use of retinoic acid, cabergoline and pasireotide. In the case of pasireotide it has also been studied concomitantly with the use of adrenal action drugs. This line of treatment although it will require more studies in the area, due to the low occurrence of adverse effects in dogs and the promising results obtained, they become a therapeutic option to consider. Finally, according to the information collected in this work about each drug, a treatment algorithm for Cushing's disease is proposed, which involves the presence of comorbidities and serves as a guide when deciding on a medical treatment. This should include the instruction of the owner regarding risks of the therapy and should consider the inexperience and limited knowledge of each drug, for which treatment should be prudent in terms of dose and monitoring of a chronic patient.

Morbus Cushing ist die häufigste Ursache für endogenes Cushing-Syndrom und führt auf Grund eines kortikotropen Hypophysenadenoms zu einem Glucocorticoid Überschuss und wiederum zu einer hohen Morbidität und Mortalität. Die Ursache hierfür sind unter anderem somatische Mutationen in den Deubiquitinasen USP8 und USP48. Das Ziel dieser Arbeit war es mittels der CRISPR/Cas9-Methode, die Mutationen USP8 und USP48 in Zelllinien zu etablieren und diese für Cushing-Syndrom Analysen zu verwenden. Hierfür wurden in dieser Arbeit gRNAs für USP8 und USP48 designt, welche anschließend in die humane embryonale Zelllinie HEK293AD Zellen transfiziert wurden. Diese Zellen wurden zu monoklonalen Zellen vereinzelt. Ziel war einen Knock-out von USP8 bzw. USP48 zu generieren. Es konnte ein erfolgreicher Zellklon generiert werden mit einem Knock-out von USP48. Ebenfalls konnte ein Genomediting von USP8 in Exon 20 durchgeführt werden. Zusammenfassend konnte die CRISPR/Cas9 Methode für ein M. Cushing-Zellmodells etabliert und eine gute Ausgangsbasis für weitere Experimente (z.B. ein gezielter Knock-in von USP8- und USP48- Mutationen) generiert werden. / Cushing disease (CD) is the most common reason for endogenous Cushing syndrome (CS). It is caused by corticotrope adenoma of the pituitary resulting in hypercortisolism that is associated with high morbidity and mortality. One of the underlying reasons are the activating mutations of the deubiquitinase USP8 and USP48. The objective of this work was to establish the USP8 and USP48 mutations in cell lines by the CRISPR/Cas9 method in order to use them for further CS analyses. Therefore, we designed gRNAs against USP8 and USP48 which were transfected into the human embryonal cell line of HEK293AD cells. Those cells were separated to generate monoclonal cell lines entailing the knock-out of either USP8 or USP48. We successfully provided a cell clone with a knock-out of USP48. Furthermore, we were able to edit the genome of USP8 in exon 20. In summary we were able to establish the CRISPR/Cas9 method for a CD cell model and provided a good baseline for further experiments (i.e., creating a knock-in of USP8 and USP48 mutations).

Thesis (M.S.)--Boston University

Der niedrig dosierte Dexamethason-Suppressionstest (LDDST) wird als Screeningverfahren in der Diagnostik des Cushing-Syndroms angewendet. Allerdings können Faktoren wie die variable Resorption, sowie ein gesteigerter Metabolismus von Dexamethason die Testergebnisse beeinflussen und zu falsch positiven Resultaten führen. Ein falsch positives Testresultat wird hierbei insbesondere bei adipösen Patienten häufiger beobachtet. In der vorliegenden Arbeit wurde daher der Einfluss des Körpergewichts auf das Ergebnis des Dexamethason-Suppressionstestes (DST) untersucht. Hierzu wurden hospitalisierte Patienten und ein aus gesunden Probanden bestehendes Kontrollkollektiv rekrutiert und diese einem regulären LDDST unterzogen. Es konnte gezeigt werden, dass übergewichtige Menschen im Rahmen des DST signifikant niedrigere Dexamethasonwerte erreichen als normalgewichtige Personen. Es ist daher davon auszugehen, dass Unterschiede im Body-Mass-Index (BMI) Einfluss auf die Resorptionsrate und den Metabolismus von Dexamethason nehmen und daraus resultierend die Serum-Dexamethasonspiegel wesentlich verringern können. Diese Prozesse scheinen allerdings keinen nachhaltigen Einfluss auf die Cortisolsuppression im DST zu haben, da die Cortisolwerte nach Dexamethasongabe zwischen adipösen und nicht adipösen Testpersonen nicht signifikant differierten. Diese Ergebnisse belegen, dass ein Zusammenhang zwischen BMI-Unterschieden und der Dexamethasonkinetik im LDDST besteht. Die erniedrigten Dexamethasonspiegel bei übergewichtigen Patienten scheinen hierbei insbesondere durch das wesentlich höhere Verteilungsvolumen und durch Unterschiede im hepatogenen Metabolismus bedingt zu sein. Trotz der erniedrigten Dexamethasonwerte bleibt die Feed-Back-Sensitivität der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HHNA) auch bei Adipositas erhalten, weshalb der LDDST als zuverlässiges Screeningverfahren bei adipösen Patienten mit Verdacht auf Cushing-Syndrom einzustufen ist.

Cette étude avait comme objectif d’évaluer la coagulation par l’utilisation de la thrombélastographie (TEG®) et de la génération de thrombine (GT) chez des beagles en santé recevant de la prednisone ainsi que chez des chiens atteints d’hyperadrénocorticisme (HAC). Dans un premier temps, six beagles adultes en santé ont été évalués dans une étude prospective longitudinale au courant de laquelle chaque individu recevait 1 mg/kg/jour de prednisone par la voie orale pendant 2 semaines. Après un arrêt de traitement d’une durée de 6 semaines, ils ont finalement reçu 4 mg/kg/jour de prednisone pour encore 2 semaines. Les tracés TEG® et les mesures de la GT ont été obtenus au temps 0, à la fin des 6 semaines d’interruption de traitement, ainsi qu’à la suite des 2 dosages de prednisone. Suite aux 2 traitements avec la prednisone, des résultats significatifs,lorsque comparés aux valeurs de base, ont été obtenus pour la cinétique du caillot (« clot kinetics » ou K), l’angle alpha (α) et l’amplitude maximale (« maximal amplitude » ou MA). La GT avait augmenté de manière significative mais seulement après la dose de 1 mg/kg/jour de prednisone. Dans un deuxième temps, 16 chiens atteints d’HAC ont été évalués avant l’initiation d’un traitement pour leur condition. Quinze chiens ont été évalués par TEG® et 15 par GT. Les données obtenues ont ensuite été comparées aux valeurs normales. L’analyse par TEG® a démontré que 12/15 chiens avaient au moins un paramètre suggérant un état d’hypercoagulabilité. L’analyse par GT a démontré que 4/15 chiens avaient des changements compatibles avec un état d’hypercoagulabilité. Un test t-pairé pour des valeurs de variance inégales a démontré que le groupe de chiens atteints d’HAC avait des tracés hypercoagulables et un potentiel endogène de thrombine (« endogenous thrombin potential » ou ETP) plus élevé, lorsque comparé à la population de référence. / The purpose of this study was to use thrombelastography (TEG®) and thrombin generation (TG) to evaluate coagulation in healthy beagles receiving oral prednisone as well as client-owned dogs diagnosed with hyperadrenocorticism (HAC).Six healthy adult beagles were used in a prospective ongitudinal study whereby all dogs received 1 mg/kg of prednisone orally once daily for two weeks, followed by a 6-week washout period and then 4 mg/kg of prednisone orally once daily for two weeks. TEG® tracings and TG measurements were obtained at baseline, at the end of the washout period and at the end of both corticosteroid trials. Significant results as compared to baseline were obtained for clot kinetics (K), alpha angle (α)and maximum amplitude (MA), with tracings compatible with a hypercoagulable profile following both corticosteroid trials. Thrombin generation resulted in a significant increase in endogenous thrombin potential (ETP) after the 1 mg/kg/day trial only. Secondly, sixteen dogs affected by HAC were evaluated. Fifteen dogs were evaluated by TEG® and 15 dogs were evaluated by TG before treatment and compared to the normal reference values. For the TEG® analysis, 12/15 dogs had at least one parameter that suggested hypercoagulability. A paired t test for values with unequal variance was used to compare the HAC dogs to the healthy dogs and found that HAC dogs have hypercoagulable TEG® tracings. The same results were found when TG was used with the ETP elevated in the HAC dogs. However, when dogs were evaluated individually, only 4/15 had hypercoagulable TG results.

Cette étude avait comme objectif d’évaluer la coagulation par l’utilisation de la thrombélastographie (TEG®) et de la génération de thrombine (GT) chez des beagles en santé recevant de la prednisone ainsi que chez des chiens atteints d’hyperadrénocorticisme (HAC). Dans un premier temps, six beagles adultes en santé ont été évalués dans une étude prospective longitudinale au courant de laquelle chaque individu recevait 1 mg/kg/jour de prednisone par la voie orale pendant 2 semaines. Après un arrêt de traitement d’une durée de 6 semaines, ils ont finalement reçu 4 mg/kg/jour de prednisone pour encore 2 semaines. Les tracés TEG® et les mesures de la GT ont été obtenus au temps 0, à la fin des 6 semaines d’interruption de traitement, ainsi qu’à la suite des 2 dosages de prednisone. Suite aux 2 traitements avec la prednisone, des résultats significatifs,lorsque comparés aux valeurs de base, ont été obtenus pour la cinétique du caillot (« clot kinetics » ou K), l’angle alpha (α) et l’amplitude maximale (« maximal amplitude » ou MA). La GT avait augmenté de manière significative mais seulement après la dose de 1 mg/kg/jour de prednisone. Dans un deuxième temps, 16 chiens atteints d’HAC ont été évalués avant l’initiation d’un traitement pour leur condition. Quinze chiens ont été évalués par TEG® et 15 par GT. Les données obtenues ont ensuite été comparées aux valeurs normales. L’analyse par TEG® a démontré que 12/15 chiens avaient au moins un paramètre suggérant un état d’hypercoagulabilité. L’analyse par GT a démontré que 4/15 chiens avaient des changements compatibles avec un état d’hypercoagulabilité. Un test t-pairé pour des valeurs de variance inégales a démontré que le groupe de chiens atteints d’HAC avait des tracés hypercoagulables et un potentiel endogène de thrombine (« endogenous thrombin potential » ou ETP) plus élevé, lorsque comparé à la population de référence. / The purpose of this study was to use thrombelastography (TEG®) and thrombin generation (TG) to evaluate coagulation in healthy beagles receiving oral prednisone as well as client-owned dogs diagnosed with hyperadrenocorticism (HAC).Six healthy adult beagles were used in a prospective ongitudinal study whereby all dogs received 1 mg/kg of prednisone orally once daily for two weeks, followed by a 6-week washout period and then 4 mg/kg of prednisone orally once daily for two weeks. TEG® tracings and TG measurements were obtained at baseline, at the end of the washout period and at the end of both corticosteroid trials. Significant results as compared to baseline were obtained for clot kinetics (K), alpha angle (α)and maximum amplitude (MA), with tracings compatible with a hypercoagulable profile following both corticosteroid trials. Thrombin generation resulted in a significant increase in endogenous thrombin potential (ETP) after the 1 mg/kg/day trial only. Secondly, sixteen dogs affected by HAC were evaluated. Fifteen dogs were evaluated by TEG® and 15 dogs were evaluated by TG before treatment and compared to the normal reference values. For the TEG® analysis, 12/15 dogs had at least one parameter that suggested hypercoagulability. A paired t test for values with unequal variance was used to compare the HAC dogs to the healthy dogs and found that HAC dogs have hypercoagulable TEG® tracings. The same results were found when TG was used with the ETP elevated in the HAC dogs. However, when dogs were evaluated individually, only 4/15 had hypercoagulable TG results.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:48Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10871.pdf: 288428 bytes, checksum: 1c97fa2e91133c59ce89adf43ddcefed (MD5) / A sindrome de Cushing (SC) endogena e rara. Pacientes com SC subclinica (SCS) apresentam hipercortisolismo sem manifestacoes clinicas. SC ocorre em 2-3% de diabeticos mal controlados. Estudamos 103 pacientes adultos obesos ambulatoriais com diabetes mellitus tipo 2 para avaliar alteracoes do cortisol e SCS. Todos coletaram cortisol salivar as 23:00h e cortisol salivar e serico apos teste de supressao com 1mg de dexametasona (DST). Pacientes cujos resultados de qualquer teste estavam no quintil superior (253ng/dL, 47ng/dL e 1,8ƒÊg/dL, respectivamente para cortisol salivar 23:00h e salivar e serico pos-DST) foram reavaliados. Os valores medios desse grupo encontravam-se 2,5 vezes acima dos valores dos demais pacientes. Apos um teste confirmatorio com 2mgx2dias DST a investigacao da SC foi encerrada para 61 pacientes com todos os testes normais e 33 com apenas um teste (falso) positivo. Todos os 8 pacientes com dois testes alterados apresentaram cortisol urinario normal, mas 3 deles mostraram maior probabilidade diagnostica de SCS (hipercortisolismo e alteracoes em exames de imagem). Contudo, o diagnostico final nao pode ser confirmado por cirurgia ou patologia em nenhum deles. Embora nao confirmatorios, os resultados deste estudo sugerem que a prevalencia de SCS seja maior em populacoes de risco do que na populacao geral. / Endogenous Cushing’s syndrome (CS) is unusual. Patients with subclinical CS (SCS) present altered cortisol dynamics without obvious manifestations. CS occurs in 2-3% of obese poorly controlled diabetics. We studied 103 overweight adult outpatients with type 2 diabetes to examine for cortisol abnormalities and SCS. All collected salivary cortisol at 23:00h and salivary and serum cortisol after a 1mg dexamethasone suppression test (DST). Patients whose results were in the upper quintile for each test (253ng/dL, 47ng/dL and 1.8ìg/dL, respectively for the 23:00h and post-DST saliva and serum cortisol) were re-investigated. Average values from the upper quintile group were 2.5- fold higher than in the remaining patients. After a confirmatory 2mgx2day DST the investigation for CS was ended for 61 patients with all normal tests and 33 with only one (false) positive test. All 8 patients who had two abnormal tests had subsequent normal 24h-urinary cortisol, and 3 of them were likely to have SCS (abnormal cortisol tests and positive imaging). However, a final diagnosis could not to be confirmed by surgery or pathology. Although not confirmatory, the results of this study suggest that the prevalence of SCS is considerably higher in populations at risk than in the general population. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Der niedrig dosierte Dexamethason-Suppressionstest (LDDST) wird als Screeningverfahren in der Diagnostik des Cushing-Syndroms angewendet. Allerdings können Faktoren wie die variable Resorption, sowie ein gesteigerter Metabolismus von Dexamethason die Testergebnisse beeinflussen und zu falsch positiven Resultaten führen. Ein falsch positives Testresultat wird hierbei insbesondere bei adipösen Patienten häufiger beobachtet. In der vorliegenden Arbeit wurde daher der Einfluss des Körpergewichts auf das Ergebnis des Dexamethason-Suppressionstestes (DST) untersucht. Hierzu wurden hospitalisierte Patienten und ein aus gesunden Probanden bestehendes Kontrollkollektiv rekrutiert und diese einem regulären LDDST unterzogen. Es konnte gezeigt werden, dass übergewichtige Menschen im Rahmen des DST signifikant niedrigere Dexamethasonwerte erreichen als normalgewichtige Personen. Es ist daher davon auszugehen, dass Unterschiede im Body-Mass-Index (BMI) Einfluss auf die Resorptionsrate und den Metabolismus von Dexamethason nehmen und daraus resultierend die Serum-Dexamethasonspiegel wesentlich verringern können. Diese Prozesse scheinen allerdings keinen nachhaltigen Einfluss auf die Cortisolsuppression im DST zu haben, da die Cortisolwerte nach Dexamethasongabe zwischen adipösen und nicht adipösen Testpersonen nicht signifikant differierten. Diese Ergebnisse belegen, dass ein Zusammenhang zwischen BMI-Unterschieden und der Dexamethasonkinetik im LDDST besteht. Die erniedrigten Dexamethasonspiegel bei übergewichtigen Patienten scheinen hierbei insbesondere durch das wesentlich höhere Verteilungsvolumen und durch Unterschiede im hepatogenen Metabolismus bedingt zu sein. Trotz der erniedrigten Dexamethasonwerte bleibt die Feed-Back-Sensitivität der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HHNA) auch bei Adipositas erhalten, weshalb der LDDST als zuverlässiges Screeningverfahren bei adipösen Patienten mit Verdacht auf Cushing-Syndrom einzustufen ist.

Glucocorticoids are well known for altering bone structure and elevating fracture risk. Nevertheless, there are very few reports on pelvic ring fractures, compared to other bones, especially with a predominantly ligamentous insufficiency, resulting in a rotationally unstable pelvic girdle.We report a 39-year-old premenopausal woman suffering from an atraumatic symphysiolysis and disruption of the left sacroiliac joint. She presented with external rotational pelvic instability and immobilization. Prior to the injury, she received high-dose glucocorticoids for a tentative diagnosis of rheumatoid arthritis over two months. This diagnosis was not confirmed. Other causes leading to the unstable pelvic girdle were excluded by several laboratory and radiological examinations. Elevated basal cortisol and adrenocorticotropic hormone levels were measured and subsequent corticotropin-releasing hormone stimulation, dexamethasone suppression test, and petrosal sinus sampling verified the diagnosis of adrenocorticotropic hormonedependent Cushing’s disease. The combination of adrenocorticotropic hormone-dependent Cushing’s disease and the additional application of exogenous glucocorticoids is the most probable cause of a rare atraumatic rotational pelvic instability in a premenopausal patient. To the authors’ knowledge, this case presents the first description of a rotationally unstable pelvic ring fracture involving a predominantly ligamentous insufficiency in the context of combined exogenous and endogenous glucocorticoid elevation.