Le canal calcique de type-L CaV1.2 participe au couplage excitation-contraction des cardiomyocytes. Cav1.2 est composé d’une sous-unité principale CaVα1, associée aux sous-unités auxiliaires CaVβ et CaVα2δ1. Lorsque présente à la membrane, c’est CaVα2δ1 qui est responsable de moduler la densité du courant calcique. Elle ne possède qu’un seul segment transmembranaire présent du côté C-terminal, au niveau de la protéine δ, ce qui en fait une protéine transmembranaire de type I. Certaines protéines qui appartiennent à cette famille doivent être clivées au niveau du site dit « omega », une modification post-traductionnelle nécessaire à leur fonction. Une fois clivées, ces protéines sont retenues à la membrane plasmique par une ancre glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI). Nos études en microscopie confocale montrent que la protéine sauvage est sensible à l’action de la phospholipase C qui clive de manière spécifique les groupements phosphoinositol, ce qui est compatible avec la présence d’une ancre GPI fonctionnelle. De plus, la mutation des résidus formant le site « omega » en isoleucine au niveau des sites G1060 et G1061 prévient l’adressage membranaire de CaVα2δ1 estimé par cytométrie en flux et imagerie confocale, et réduit la modulation des courants calciques mesurés par la méthode du « patch-clamp ». Les mutants G1060I et G1061I sont aussi associés à un changement dans le patron de migration de la partie C-terminale, suggérant un processus protéolytique défecteueux. Les mutations simples des glycines en alanines préservent les propriétés de la protéine mais le double mutant G1060A/G1061A réduit significativement l’expression de CaVα2δ1 à la surface de la cellule et sa modulation sur le canal CaV1.2. Ces données suggèrent fortement que le clivage requiert spécifiquement un résidu Glycine en position 1060 ou 1061 pour produire le clivage protéolytique dominant chez CaVα2δ1, et que cet ancrage GPI est essentiel à la fonction du canal. / Voltage-gated calcium channels CaV1.2 play an essential role in the regulation of cardiac excitability. Functional channels are formed by the CaVα1 subunit and the intracellular CaVβ and the extracellular CaVα2δ1 subunits. CaVα2δ1 are type I transmembrane proteins that undergo a posttranslational modification producing their association at the plasma membrane through a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. The molecular determinants required for the proteolytic cleavage of the recombinant CaVα2δ1 protein were studied using biochemical, immunocytochemical, fluorescence, and electrophysiological methods. Enzymatic treatment with a phospholipase C specific for the cleavage of phosphatidyl inositol lipids abolished the colocalisation of CaVα2δ1 with a plasma membrane marker as shown using live-cell confocal imaging. Single point mutations G1060I or G1061I in the predicted transmembrane CaVδ domain was shown to significantly reduce the cell surface fluorescence of CaVα2δ1 as characterized by two-color flow cytometry assays and confocal imaging, and to prevent the CaVα2δ1-mediated increase in the peak current density and voltage-dependent gating of CaV1.2 currents. The isoleucine mutations were also associated with a change in the migration pattern of the C-terminal fragments suggesting that proteolytic processing was altered. Single glycine to alanine mutations preserved the protein properties but the double mutant G1060A/G1061A significantly impaired cell surface expression of CaVα2δ1 and its functional regulation of CaV1.2. Altogether our data support a model where one Glycine residue at position 1060 or 1061 is required to produce the dominant proteolytic cleavage of CaVα2δ1 and further suggest that the GPI-anchored form of CaVα2δ1 is essential for channel function.

Les levures Candida sont des pathogènes opportunistes responsables d’infections graves chez les patients immunodéprimés. Au cours de ce travail, nous avons développé un modèle cellulaire in vitro pour la caractérisation multiparamétrique des phénotypes d’interaction entre les levures Candida et les macrophages et les neutrophiles, principaux effecteurs de la défense anti-Candida. Il repose sur l’utilisation de marqueurs fluorescents pour le suivi quantitatif de l’interaction en cytométrie en flux et en fluorimétrie. Ce modèle a été validé par la comparaison de l’interaction de trois espèces de levures, C. albicans, C. glabrata et C. lusitaniae, avec des macrophages murins et des neutrophiles humains. Deux stratégies principales de survie des levures à la phagocytose ont été mises en évidence : par la résistance à la phagolyse et la multiplication des levures à l’intérieur des phagocytes jusqu’à leur éclatement, ou par l’évitement de la phagocytose et la multiplication des levures à l’extérieur des phagocytes. L’interprétation des données quantitatives a été confirmée par microscopie à fluorescence et vidéo-microscopie. Afin de mieux comprendre les interactions Candida-phagocytes, nous avons mis au point des outils pour l’analyse fonctionnelle de gènes chez C. lusitaniae. Une stratégie de PCR chevauchante a été développée pour l’obtention de mutants nuls de C. lusitaniae, sans étape de clonage. C’est ainsi que le gène OLE2, codant une Δ9 désaturase d’acides gras potentiellement impliquée dans la biosynthèse de la prostaglandine PGE2, a été invalidé. Le mutant ole2Δ présentait de très nets défauts de filamentation et de reproduction sexuée. Par rapport à une souche sauvage, le mutant ole2∆ était massivement phagocyté par les macrophages, et la survie des phagocytes était plus importante, ce qui suggère un rôle important des lipides insaturés et des oxylipides dans la signalisation cellulaire au cours de l’interaction Candida-phagocytes. Dans la dernière partie de notre travail, nous avons construit une banque de 10 000 mutants de C. lusitaniae par l’intégration aléatoire d’un marqueur dans le génome. Le criblage de cette banque à travers notre modèle cellulaire d’interaction permettra d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans l’interaction avec les phagocytes afin de mieux comprendre la physiopathologie des candidoses et de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques. / Candida species are opportunistic pathogens causing severe infectious diseases in immunocompromised patients. In this work, we developed a tool for a multi-parameter characterization of the cell interactions between the yeasts Candida and both macrophages and neutrophils, which constitute the main defense against candidiasis. It relies on the labelling of each population with specific fluorescent markers, and on the use of fluorimetry and flow cytometry to assess interactions. The tool has been validated by comparing the interactions of three yeast species C. albicans, C. glabrata and C. lusitaniae, with murine macrophages and human neutrophils. We found that yeasts use two main ways for escaping phagocytosis, which has been confirmed using video-microscopy: either (1) by surviving to phagolysis and dividing into the phagosome until phagocytes burst, or (2) by avoiding phagocytosis and dividing outside phagocytes. In order to better understand the cellular and molecular mechanisms involved in Candida-phagocytes interactions, we developed new molecular tools for the functional analysis of genes in C. lusitaniae, notably a two-step cloning-free PCR-based method for the deletion of genes. This method was successfully used for the deletion of OLE2, a gene encoding a Δ9-desaturase of fatty acids, possibly implicated in prostaglandin PGE2 biosynthesis. The ole2Δ mutant exhibited strong defects in both pseudofilamention and sexual mating. During macrophages infection, ole2Δ yeast cells were massively internalized and triggered less phagocytes cell death than the wild type strain, suggesting that unsaturated fatty acids and/or oxylipids could play a role during interaction with phagocytes. Lastly, a bank of 10,000 mutants was constructed in C. lusitaniae by the random integration of a genetic marker in the genome. The screening of this bank through our tool to analyse cellular interactions will be undertaken to gain insights into understanding of the early stages of the infectious process.

Les plaquettes sanguines sont les principaux acteurs de l’hémostase primaire et de la thrombose, deux éléments majeurs de la physiopathologie vasculaire. Plusieurs médicaments régulent les fonctions plaquettaires mais peu de tests sont validés pour suivre leur efficacité en fonction de l’évolution clinique des patients. Mon doctorat a eu pour but de développer de nouvelles approches d’évaluation de la fonction plaquettaire. Deux essais cliniques réalisés sur des patients atteints de syndrome coronarien stable ont constitué la première partie de mon doctorat. La première étude met en évidence la nécessité d'une standardisation des tests biologiques pour la détection de patients répondant moins au clopidogrel, un inhibiteur du récepteur plaquettaire de l'ADP P2Y12. L’étude suivante montre le potentiel thérapeutique, chez ces patients, de l’inhibition conjointe de P2Y12 et du second récepteur plaquettaire de l'ADP P2Y1, sur la fonction plaquettaire. De plus, le suivi en temps réel par vidéomiscroscopie a permis de distinguer des effets précoces et tardifs des antiplaquettaires sur la formation du thrombus en chambre de perfusion. La seconde partie de mon doctorat concerne les microdomaines membranaires de type « lipid rafts » qui tiennent une place fondamentale dans les fonctions cellulaires et plaquettaires. Ainsi plusieurs récepteurs dépendent de ces microdomaines, régulant la fonction plaquettaire et les effets des médicaments antiplaquettaires. Cependant, les techniques d’étude de ces microdomaines sont complexes et peu adaptées aux études cliniques. Profitant de nouvelles sondes fluorescentes sensibles au niveau d’ordre liquide membranaire (OLM), nous avons développé une méthode de mesure de l’OLM par cytométrie de flux spectrale. Grâce à cette approche, nous avons montré que l’activation plaquettaire diminue l’OLM alors qu’il est augmenté chez des patients traités par un inhibiteur de la synthèse du cholestérol ou par le clopidogrel. Nous avons également mis en évidence, en condition de forces de cisaillement élevées correspondant à celles retrouvées au niveau de sténoses artérielles, une sous-population plaquettaire présentant un OLM plus bas. Le passage dans le domaine clinique de ces approches fondamentales qui privilégient l’étude dynamique des plaquettes pourrait permettre d’améliorer le diagnostique et le suivi de traitement de pathologies cardiovasculaires. / Blood platelets play a central role in primary hemostasis and thrombosis, two major elements of vascular physiopathology. Although a number of drugs regulate platelet functions, there are no validated tests that monitor their efficacy on the basis of the patients' clinical course. This doctorate, therefore, aims to develop novel approaches to evaluate platelet function. The first part of my work consisted of two clinical trials involving patients with stable coronary syndrome. The first study demonstrated the need for standardized biological tests to screen for patients who respond less well to clopidogrel, an ADP P2Y12 receptor antagonist. The second study showed the therapeutic potential of the joint inhibition of P2Y12 and P2Y1 receptors on platelet adhesion, activation, and aggregation for these patients. Furthermore, a video microscopy model using perfusion chambers made it possible to monitor the course of thrombosis in real time, and enabled us to dissociate the early and late effects of the antiplatelet drugs. Lipid raft membrane microdomains play a pivotal role in many cell functions. At the platelet level, many receptors depend on these microdomains and thus modulate the function as well as the drug sensitivity of platelets. However, current techniques for the study of these microdomains are complex and limit their clinical applications. By taking advantage of new fluorescent probes that are sensitive to the level of the membrane order, we developed a method of measuring the membrane order using spectral flow cytometry. Through this approach we showed that platelet activation reduced the lipid order of the membranes, whereas it was increased in patients treated with a cholesterol synthesis inhibitor or clopidogrel. It was also possible for us to demonstrate the appearance, under shear stress similar to that of stenotic arteries, of a platelet sub-population with a very low membrane order. These approaches which privilege the dynamic study of thrombi and platelets could be applied to the clinical practice and thus widen the fields of clinical studies.

Le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1), agent étiologique des feux sauvages, possède une structure multicouche comprenant une capside icosaédrale qui protège le génome viral d’ADN, une couche protéique très structurée appelée tégument et une enveloppe lipidique dérivant de la cellule hôte et parsemée de glycoprotéines virales. Tous ces constituants sont acquis séquentiellement à partir du noyau, du cytoplasme et du réseau trans-golgien. Cette structure multicouche confère à HSV-1 un potentiel considérable pour incorporer des protéines virales et cellulaires. Toutefois, l’ensemble des protéines qui composent ce virus n’a pas encore été élucidé. De plus, malgré son rôle critique à différentes étapes de l’infection, le tégument demeure encore mal défini et ce, tant dans sa composition que dans la séquence d’addition des protéines qui le composent. Toutes ces incertitudes quant aux mécanismes impliqués dans la morphogenèse du virus nous amènent à l’objectif de ce projet, soit la caractérisation du processus de maturation d’HSV-1. Le premier article présenté dans cette thèse et publié dans Journal of Virology s’attarde à la caractérisation protéique des virus extracellulaires matures. Grâce à l’élaboration d’un protocole d’isolation et de purification de ces virions, une étude protéomique a pu être effectuée. Celle-ci nous a permis de réaliser une cartographie de la composition globale en protéines virales des virus matures (8 protéines de la capside, 23 protéines du tégument et 13 glycoprotéines) qui a fait la page couverture de Journal of Virology. De plus, l’incorporation potentielle de 49 protéines cellulaires différentes a été révélée. Lors de cette étude protéomique, nous avons aussi relevé la présence de nouveaux composants du virion dont UL7, UL23, ICP0 et ICP4. Le deuxième article publié dans Journal of General Virology focalise sur ces protéines via une analyse biochimique afin de mieux comprendre les interactions et la dynamique du tégument. Ces résultats nous révèlent que, contrairement aux protéines ICP0 et ICP4, UL7 et UL23 peuvent être relâchées de la capside en présence de sels et que les cystéines libres jouent un rôle dans cette relâche. De plus, cet article met en évidence la présence d’ICP0 et d’ICP4 sur les capsides nucléaires suggérant une acquisition possible du tégument au noyau. La complexité du processus de morphogenèse du virus ainsi que la mise en évidence d’acquisition de protéines du tégument au noyau nous ont incités à poursuivre nos recherches sur la composition du virus à un stade précoce de son cycle viral. Les capsides C matures, prémisses des virus extracellulaires, ont donc été isolées et purifiées grâce à un protocole innovateur basé sur le tri par cytométrie en flux. L’analyse préliminaire de ces capsides par protéomique a permis d’identifier 28 protéines virales et 39 protéines cellulaires. Les données recueilles, comparées à celles obtenues avec les virus extracellulaires, suggèrent clairement un processus séquentiel d’acquisition des protéines du tégument débutant dans le noyau, site d’assemblage des capsides. Finalement, tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation d’HSV-1 via l’utilisation de techniques variées et innovatrices, telles que la protéomique et la cytométrie en flux, pouvant être appliquées à d’autres virus mais aussi permettre le développement de meilleurs traitements pour vaincre l’HSV-1. / Herpes simplex virus type 1 (HSV-1), the etiological agent of cold sores, has a multilayered structure that includes an icosahedral capsid that protects the viral DNA genome, a highly structured proteinaceous layer called tegument and a host-derived lipid envelope studded with viral glycoproteins. All these constituents are sequentially acquired from the nucleus, the cytoplasm and the trans-Golgi network. This multilayered structure confers to HSV-1 a considerable potential to incorporate viral and cellular proteins; however, all the proteins that compose this virus have not yet been elucidated. Moreover, despite its critical role at different stages of infection, the tegument is still poorly defined both in its composition and its sequence of addition of proteins. All these uncertainties about the mechanisms involved in the morphogenesis of the virus lead us to the goal of this project, which is the characterization of the maturation process of HSV-1. The first article presented in this thesis and published in Journal of Virology focuses on the protein characterization of extracellular mature virus. After developing a protocol for the isolation and purification of these virions, a proteomics study was performed. It allowed us to map the global viral protein composition of mature virions (8 capsid proteins, 23 tegument proteins and 13 glycoproteins), which made the cover page of Journal of Virology. Moreover, the potential incorporation of 49 cellular proteins was revealed. During this proteomics study, we confirmed the incorporation of novel virion components including UL7, UL23, ICP0 and ICP4. The second article published in Journal of General Virology focuses on these viral proteins by using a biochemical analysis to better understand the interactions and dynamic of the tegument. Our results revealed that, unlike ICP0 and ICP4 proteins, UL7 and UL23 can be released from the capsid in the presence of salts and that free cysteines play a role in this release. Moreover, this article highlights the presence of ICP0 and ICP4 on the nuclear capsids suggesting a potential acquisition of tegument proteins in the nucleus. The complexity of the viral morphogenesis process and the discovery of the tegument acquisition in the nucleus led us to pursue our research on the virus composition at an early stage of its viral cycle. The nuclear C capsids, precursors to the extracellular virus, were isolated and purified with an innovative protocol based on fluorescence activated cell sorting (FACS). The preliminary analysis of these capsids by proteomics allows us to identify 28 viral proteins and 39 cellular proteins. The collected data, compared to those obtained with extracellular viruses, clearly suggest a sequential process of tegument proteins acquisition starting in the nucleus, the assembly site of HSV-1 capsids. Finally, all these results contribute to a better understanding of the complex process of HSV-1 maturation by using varied and innovative techniques such as proteomic and FACS, which can be applied to other viruses and allow the development of better treatments to fight HSV-1.

Les canaux calciques de type L CaV1.2 sont principalement responsables de l’entrée des ions calcium pendant la phase plateau du potentiel d’action des cardiomyocytes ventriculaires. Cet influx calcique est requis pour initier la contraction du muscle cardiaque. Le canal CaV1.2 est un complexe oligomérique qui est composé de la sous-unité principale CaVα1 et des sous-unités auxiliaires CaVβ et CaVα2δ1. CaVβ joue un rôle déterminant dans l’adressage membranaire de la sous-unité CaVα1. CaVα2δ1 stabilise l’état ouvert du canal mais le mécanisme moléculaire responsable de cette modulation n’a pas été encore identifié. Nous avons récemment montré que cette modulation requiert une expression membranaire significative de CaVα2δ1 (Bourdin et al. 2015). CaVα2δ1 est une glycoprotéine qui possède 16 sites potentiels de glycosylation de type N. Nous avons donc évalué le rôle de la glycosylation de type-N dans l’adressage membranaire et la stabilité de CaVα2δ1. Nous avons d’abord confirmé que la protéine CaVα2δ1 recombinante, telle la protéine endogène, est significativement glycosylée puisque le traitement à la PNGase F se traduit par une diminution de 50 kDa de sa masse moléculaire, ce qui est compatible avec la présence de 16 sites Asn. Il s’est avéré par ailleurs que la mutation simultanée de 6/16 sites (6xNQ) est suffisante pour 1) réduire significativement la densité de surface de! CaVα2δ1 telle que mesurée par cytométrie en flux et par imagerie confocale 2) accélérer les cinétiques de dégradation telle qu’estimée après arrêt de la synthèse protéique et 3) diminuer la modulation fonctionnelle des courants générés par CaV1.2 telle qu’évaluée par la méthode du « patch-clamp ». Les effets les plus importants ont toutefois été obtenus avec les mutants N663Q, et les doubles mutants N348Q/N468Q, N348Q/N812Q, N468Q/N812Q. Ensemble, ces résultats montrent que Asn663 et à un moindre degré Asn348, Asn468 et Asn812 contribuent à la biogenèse et la stabilité de CaVα2δ1 et confirment que la glycosylation de type N de CaVα2δ1 est nécessaire à la fonction du canal calcique cardiaque de type L. / L-type CaV1.2 channels play a key role in the excitation-contraction coupling in the heart. They are formed of a pore-forming CaVα1 subunit in complex with the intracellular CaVβ and the disulfur-linked CaVα2δ accessory subunits. CaVα2δ significantly increases peak current densities of CaV1.2. The mechanism underlying this effect is still under study but requires that CaVα2δ be trafficked at the cell surface. CaVα2δ contains 16 putative N-glycosylation sites. A study was carried out to identify the role of N-glycosylation in the trafficking and protein stability of the subunit CaVα2δ. Herein we show that enzymatic removal of N-glycans produced a 50 kDa shift in the mobility of cardiac and recombinant CaVα2δ1 proteins. Simultaneous mutation of the 16 Asn sites was required to fully account for this change in protein mobility. Nonetheless, the mutation of only 6/16 sites was sufficient to 1) significantly reduce the steady-state cell surface fluorescence of CaVα2δ1 as characterized by two-color flow cytometry assays and confocal imaging; 2) accelerate the degradation kinetics estimated from cycloheximide chase assays; and 3) prevent the CaVα2δ1-mediated increase in peak current density and voltage-dependent gating of CaV1.2. Reversing the N348Q and N812Q mutations in the non-operational 6 Asn mutant functionally rescued CaVα2δ1. Single mutation N663Q and double mutations N348Q/ N468Q, N348Q/ N812Q, N468Q/N812Q decreased protein stability/synthesis and abolished steady-state cell surface density as well as upregulation of L-type currents. These results demonstrate that Asn663, and to a lesser extent Asn348, Asn468, and Asn812 contribute to the stability of CaVα2δ1 function and furthermore that N- glycosylation of CaVα2δ1 is essential to produce functional L-type Ca2+ channels.

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Les plaquettes sont les cellules principales de l’hémostase. Leur anomalie qualitative et/ou quantitative est à l’origine d’une diathèse hémorragique. Le diagnostic des anomalies plaquettaires nécessite des tests biologiques. L’objectif de notre travail a été d’améliorer leur diagnostic, en particulier, de développer de nouveaux outils d’exploration des granules denses plaquettaires. Les pathologies plaquettaires héréditaires sont mal connues en Chine. Donc la cadre de notre collaboration Nancy /Wuhan nous avons publié un article en Chinois sur les thrombopénies héréditaires. Ensuite, nous avons évalué les performances du test à la mépacrine combiné à l’expression de CD63 par cytométrie en flux (CMF) pour le diagnostic de la pathologie des grains denses plaquettaires. De plus, notre étude montre que la carence de vitamine C pourrait être associée à une thrombopathie des grains denses. Enfin, nous avons développé une approche par CMF, puis par HPLC, pour la détection de sérotonine plaquettaire / Platelets play an essential role in the hemostasis. Abnormalities in platelet number or platelet function may result in excessive bleeding. Diagnosis of platelet disorders requires platelet count and platelet function testing. Our work is aimed to improve the diagnosis of platelet disorders, especially to develop new approaches for testing the function of platelet dense granules. Inherited platelet disorders are hardly recognized in China. Therefore we published an article in Chinese on the topic of hereditary thrombocytopenia in a Chinese clinical journal, within the framework of collaboration between Nancy and Wuhan. In addition, we evaluated the usefulness of flow cytometric mepacrine assay combined with CD63 expression in the diagnosis of dense granule disorder. Moreover, our work demonstrates that vitamin C deficiency might be associated with platelet dense granule disorder. Finally, we developed a method by flow cytometry and then by HPLC for detection of platelet serotonin

L’objectif principal de ce travail est d’étudier les mécanismes d’oxydation lors de la photocatalyse (TiO2 irradié sous UV-A) appliquée à la dégradation des microorganismes et leurs effets sur les composants cellulaires. L'étude de l'efficacité antimicrobienne de TiO2 sur un panel de microorganismes (bactéries, spores, champignons) réalisée dans différents milieux (TiO2 en milieu riche, 'sec', en phase liquide) montre l’influence des méthodes d’évaluation, de test et de comptage sur les efficacités d’inactivation. Des études menées en présence de molécules scavengers d’anions superoxydes (O2°-) mettent en évidence l’implication des O2°- dans l’effet antibactérien et dans la peroxydation lipidique. Au niveau protéomique, diverses cibles d’action potentielles du TiO2 sont aussi proposées. Enfin, une partie applicative détermine l’efficacité antimicrobienne de dispositifs photocatalytiques équipés de mousses alvéolaires de β-SiC et de diodes électroluminescentes, et met en avant les propriétés auto-désinfectantes sous lumière solaire de textiles photocatalytiques fonctionnalisés par la technique layer-by-layer. / The main objective of this work is to study the oxidation mechanisms of UV-A photocatalysis on TiO2 applied to the degradation of microorganisms and their effects on cellular components. The study of the antimicrobial efficiency of TiO2 towards a panel of microorganisms (bacteria, spores, fungi) in different media (TiO2 in rich or 'dry' environment, in liquid phase) shows the influence of the evaluation methods, test and counting on the inactivation efficiency. Studies carried out in the presence of scavenger molecule of superoxide anions (O2°-) highlight the involvement of O2°- in the antibacterial effect and lipid peroxidation. Proteomics analysis leads to propose various potential targets of the TiO2 action. Finally, an application part deals with the design of photocatalytic devices based on LEDs and β-SiC alveolar foams for air disinfection, and of sunlight active self-disinfecting layer-by-layer functionalized photocatalytic textiles.

L'intérêt croissant susciter par les applications biomédicales des plasmas non thermiques, inspire le développement de nouvelles sources plasmas. Les décharges à barrière diélectrique (DBD) ou les décharges couronne générées dans l'air ambiant ou dans le flux de gaz rare sont généralement utilisées. Production des plasmas directement dans un liquide a un grand potentiel pour les processus de stérilisation des substances liquides et pour le traitement extracorporel du sang. Les mécanismes physiques de formation d’une décharge électrique dans un milieu liquide ne sont toujours pas entièrement compris .La première partie de cette thèse examine le sujet de l'initiation et le développement de décharge nanoseconde dans les diélectriques liquides (eau déminéralisée, éthanol et n-pentane). La visualisation ombroscopique résolue en temps, la spectroscopie optique d'émission et les mesures électrique sont appliqués à l’étude d’une décharge électrique initiée sur une électrode à pointe positive.Nous avons montré que, selon l'amplitude de tension trois scénarios différents peuvent se produire dans des diélectriques polaires, notamment, la cavitation d'une bulle, le développement de décharge dans une cavité gazeuse (le mode ‘buisson’) et l'initiation de la décharge filamentaire (le mode ‘arborescent’) se propageant directement dans le liquide. La différence dans la formation et la propagation de deux modes de la décharge (‘buisson’ et ‘arbre’) révèle les mécanismes physiques étant très distincts.Dans la deuxième partie de ce travail, nous abordons la question d’interaction entre les plasmas froids atmosphériques avec les cellules vivantes in vitro et in vivo. L’étude porte sur le mécanisme de la mort cellulaire induite par le plasma. Cytométrie de flux avec deux marqueurs AnnexinV (AV) et de l'iodure de propidium (PI) a été appliquée pour l’analyse de la viabilité cellulaire. On montre l’induction de l' apoptose dans les cellules de T lymphocyte humain (Jurkat) et dans les cellules épithéliales (HMEC) traités par le plasma de DBD nanoseconde. Dans les souris nudes l'induction de l'apoptose et de la nécrose en fonction de la dose est observé par la microscopie électronique dans les coupes de l'épiderme. L'analyse histologique montre l’apparition des lésions importantes dans l'épiderme , derme, hypoderme et les muscles en fonction de la durée du traitement. Production de peroxyde d'hydrogène dans le milieu de culture (PBS) exposé au plasma de DBD est mesurée à l’aide d’une sonde fluorescente sélective (Amplex® Red). La viabilité des cellules de la thyroïde humaines ( HTori -3) et des cellules de mélanome (1205Lu) cellules démontre la dépendance nonmonotone de la concentration de H2O2. Le rôle majeur du peroxyde d'hydrogène produit par plasma et du champ électrique de la DBD est suggéré. / Growing interest in biomedical applications of nonthermal plasmas inspires the development of new plasmas sources. Dielectric barrier (DBD) and corona discharges produced in ambient air or in noble gas flow are typically applied. Direct production of plasma in liquids has a great potential for sterilization of liquid substances and extracorporeal blood treatment. The physical mechanisms of discharge formation in liquid medium are not fully understood.The first part of this thesis deals with the initiation and development of the nanosecond discharge in liquid dielectrics (deionized water, ethanol and n-pentane). Time-resolved shadowgraph visualization, optical emission spectroscopy and electrical diagnostics are applied to investigate the discharge formation on point anode.We have shown that depending on the applied voltage amplitude three different scenario can occur in the polar dielectric, namely, cavitation of a bubble, discharge development in the gaseous cavity (bush-like mode) and initiation of the filamentary discharge (tree-like mode) propagating in bulk liquid. Formation of the bush-like and the tree-like discharges is governed by distinct physical mechanisms, resulting in strongly different plasma parameters.In the second part of this work we address the question of how cold atmospheric plasma interacts with living cells in-vitro and in-vivo, and what is the mechanism of plasma induced cell death. Flowcytometry based cell viability assay with two markers AnnexinV (AV) and Propidium iodide (PI), demonstrates a dose dependent induction of the apoptosis for human T lymphocyte (Jurkat) and epithelial (HMEC) cells treated with DBD plasma. In nude mice model, induction of apoptosis and necrosis in dose dependant manner is observed by electron microscopy in thin epidermis sections. Histological analysis shows significant lesions appeared in epidermis, dermis, hypodermis and muscle as a function of treatment duration. Production of hydrogen peroxide in culture medium (PBS) exposed to DBD plasma is measured using selective fluorescent probe (Amplex® Red). Cell viability of human thyroid epithelial (HTori-3) and melanoma (1205Lu) cells demonstrates nonmonotonous dependence on H2O2 concentration. The major role of plasma produced hydrogen peroxide and DBD electric field is suggested.

Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène d’importance dans l’industrie porcine et est responsable d’importantes pertes économiques. Il n’existe pas d’antiviral efficace contre celui-ci. Il a récemment été mis en évidence que le surnageant de culture d’Actinobacillus pleuropneumoniae, l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine, possédait une activité antivirale in vitro contre le VSRRP dans la lignée cellulaire SJPL. Les objectifs de mon projet sont (i) d’étudier les mécanismes cellulaires menant à l’activité antivirale causée par le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae, et (ii) de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae. Dans un premier temps, des analyses de protéome ont été effectuées et ont permis d’observer que le surnageant de culture modulait la régulation du cycle cellulaire. Dans le but d’analyser le cycle cellulaire des cellules SJPL, la cytométrie en flux a été utilisée et a permis de démontrer que le surnageant de culture induisait un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M. Deux inhibiteurs de la phase G2/M ont alors été utilisé. Il s'est avéré que ces inhibiteurs avaient la capacité d’inhiber le VSRRP dans les cellules SJPL. Enfin, la spectrométrie de masse a été utilisée dans le but de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae et d’identifier deux molécules. Ce projet a permis de démontrer pour la première fois qu’A. pleuropneumoniae est capable de perturber le cycle cellulaire et que ce dernier était un élément important dans l’effet antiviral contre le VSRRP. / Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is the most important pathogen in the swine industry and causes important economic losses. No effective antiviral drugs against it exist. It was recently reported that the culture supernatant of Actinobacillus pleuropneumoniae, the causative agent of porcine pleuropneumonia, possesses an antiviral activity in vitro against PRRSV in SJPL cells. The objectives of this project were (i) to identify the mechanism behind the antiviral activity displayed by A. pleuropneumoniae, and (ii) to characterize the active molecules present in the culture supernatant. Proteomic analyses were first conducted and demonstrated the culture supernatant ability to induce modulations of the cell cycle regulation. In order to determine the SJPL cell cycle, flow cytometry analyses were performed and demonstrated that the culture supernatant induced a G2/M-phase cell cycle arrest. Two G2/M-phase cell cycle inhibitors were then used and their ability to inhibit PRRSV infection in SJPL cells was demonstrated. Finally, in order to characterize the active molecules present in the A. pleuropneumoniae culture supernatant, mass spectrometry was used and two molecules were identified. This is the first study demonstrating the A. pleuropneumoniae ability to disrupt cell cycle and the cell cycle importance to the inhibitory activity against PRRSV.