Annona hypoglauca Mart. foi coletada em área inundada da Floresta Amazônica, próximo à Manaus (Brasil). Os alcalóides foram obtidos do extrato bruto do caule por partição ácido-base, e a partir do resíduo dessa extração foi realizada a partição com solventes de diferentes polaridades, originando as frações livres de alcalóides. A partir da análise de CG-EM dos alcalóides totais foi possível caracterizar sete alcalóides aporfínicos (actinodafinina, anonaina, glaucina, isoboldina, isodomesticina, nornuciferina e roemerina) e possivelmente duas protoberberinas (esculerina e caseadina). Os alcalóides totais foram fracionados em coluna cromatográfica e posteriormente purificados em placa cromatográfica preparativa permitindo o isolamento de dois alcalóides aporfínicos: actinodafinina e isoboldina. As estruturas desses produtos naturais foram definidos com base em espectros de dados, incluindo 1H RMN, 13C RMN, 13C DEPT e CG-EM. Pela primeira vez a ocorrência da actinodafinina esta sendo reportada em uma espécies de Annona. O extrato bruto, as frações livres de alcalóides, os alcalóides totais e suas frações foram submetidos a avaliação da atividade antibacteriana por microdiluição e atividade citotóxica in vitro frente a células de tumores humanos. Para todos os extratos testados, somente os alcalóides totais e suas frações apresentaram atividade frente a bactérias Gram +. No ensaio de citotoxicidade com linhagens de células de tumores, o extrato bruto foi capaz de inibir o crescimento de todas as linhagens celulares testadas, apresentando efeito letal para a linhagem de Câncer de Cólon (KM-12), enquanto as frações livres de alcalóides demonstraram baixa atividade. Por outro lado, as frações livres de alcalóides apresentaram atividade mais pronunciada para a linhagem de Câncer de Pulmão (NCIH-460) do que os alcalóides. Assim, a atividade citotóxica encontrada no extrato bruto é decorrente do sinergismo ou complementação entre os componentes das frações alcaloídicas e não alcaloídicas, isto é, nenhuma das frações isoladamente é responsável pela atividade observada no extrato bruto. / Annona hypoglauca Mart. was collected in the flooded areas of the Amazonian Forest near Manaus (Brazil). The alkaloids were obtained from the stems crude extract by acid-base partitioning and the remaining alkaloid-free extract was partitioned with organic solvents of different polarity. The GC/MS analysis of the total alkaloids allowed the identification of seven aporphine alkaloids (actinophanine, anonaine, glaucine, isoboldine, isodomesticine, nornuciferine and roemerine) and possibly two proberberine alkaloids (scoulerine and caseadine). The total alkaloids were fractionated by column chromatography and further purified by preparative thin-layer chromatography allowing the isolation of two aporphine alkaloids: actinodaphnine and isoboldine. The structures of these natural products were defined based on their spectral data, including 1H NMR, 13C NMR, 13C DEPT and CG/MS. This is the first report for the occurrence of actinodaphnine in Annona species. The crude extract, alkaloid-free organic extracts, total alkaloids and its fractions were tested for their antibacterial activity by the microdilution broth assay and cytotoxic activity against in vitro tissue culture cells of human. From all the extracts assayed, only the total alkaloids and their fractions showed a relevant antibacterial activity against Gram positive organisms. In the cytotoxicity assay with human tumor cell lines, the crude extract was able to inhibit the growth of all cell lines tested, with a lethal effect for the colon cancer (KM-12) cell line. The evaluation of this activity with the total alkaloid and alkaloid-free fractions indicated selectivity for the different cellular lines. The alkaloid fraction presented high growth inhibition for the colon cancer cell line (KM-12), while the alkaloid-free fractions displayed lower activity. On the other hand, the alkaloid free fractions showed a higher activity for the lung cancer cell line (NCIH-460) than the total alkaloids. Thus, the cytotoxic activity found in the crude extract is the result of the synergism or complementary activity among the components of the alkaloid and alkaloid-free fractions, e.g, none of the fractions separately is responsible for the activity observed in the crude extract.

Oleorresinas de espécies de Copaifera sp são amplamente utilizadas na medicina popular brasileira e estudos químicos e biológicos demonstram que diterpenos e sesquiterpenos estão entre os principais compostos bioativos das oleorresinas. Um importante fator para a avaliação da segurança e eficácia de fármacos é o conhecimento sobre o seu metabolismo, o qual pode ser adquirido por meio de estudos de biotransformação utilizando fungos filamentosos e bactérias do trato gastrointestinal. Os fungos filamentosos são organismos eucariotos e o aparato enzimático se assemelha com o dos mamíferos podendo contribuir para a elucidação de rotas metabólicas fornecendo informações sobre a formação de produtos farmacologicamente ativos, inativos ou tóxicos para o organismo. Esses estudos podem ainda contribuir para a obtenção de substâncias inéditas com potencial atividade biológica. O uso de bactérias da microbiota intestinal em estudos de metabolismo também é importante, pois os medicamentos e alimentos, quando ingeridos, podem ser metabolizados por essas bactérias que colonizam o trato gastrointestinal. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de fungos filamentosos e de bactérias do trato gastrointestinal para biotransformar o ácido 3?-acetoxi-copálico e ?-cariofileno, presentes em oleorresinas de Copaifera, bem como isolar os produtos de biotransformação para avaliação da citotoxidade. Os experimentos de biotransformação foram realizados com 10 linhagens de fungos filamentosos e com 8 linhagens de bactérias do trato gastrointestinal. Os extratos obtidos em acetato de etila das culturas das biotransformações do diterpeno foram analisados por CLAE/DAD/CAD e CLAE-EM e os extratos obtidos em n-hexano e em acetato de etila das culturas das biotransformações do sesquiterpeno, bem como a fração volátil captada das culturas por microextração em fase sólida (SPME) no modo headspace, foram analisados por CG-EM. Todos os micro-organismos testados foram capazes de biotransformar o ácido 3?-acetoxi-copálico e 9 produtos de biotransformação foram isolados, suas estruturas químicas foram identificadas, sendo seis inéditos e todos os produtos foram avaliados quanto a atividade citotóxica frente às linhagens celulares de glândulas mamárias normais (MCF-10A) e de adenocarcinoma mamário (MCF-7). Todos os metabólitos do ácido 3?-acetoxi-copálico apresentaram menor citotoxidade frente as linhagens avaliadas do que o próprio ácido 3?-acetóxi-copálico. Os fungos A. niger, A. brasiliensis e as três linhagens de Cunninghamella foram capazes de biotransformar o ?-cariofileno. Entretanto, como não foram obtidos bons rendimentos nesses processos, não foi possível isolar os produtos de biotransformação. Com os dados obtidos foi possível apenas elaborar uma proposta para a estrutura química de um dos produtos oriundos da biotransformação do ?-cariofileno realizada com C. echinulata ATCC 9245. / Oleoresins from Copaifera sp species are widely used in Brazilian folk medicine and chemical and biological studies showed that diterpenes and sesquiterpenes are among the main bioactive compounds of oleoresins. An important factor for assessing the safety and efficacy of drugs is the knowledge about their metabolism, which can be acquired through biotransformation studies using filamentous fungi and human gut bacteria. Filamentous fungi are eukaryotic organisms and the enzymatic apparatus is similar to those of mammals and may contribute to the elucidation of metabolic pathways providing information on the production of pharmacologically active, inactive or toxic compounds to the organism. These studies may also contribute to provide new compounds with potential biological activity. The use of human gut bacteria in metabolism studies is also important because drugs and foods, when ingested, can be metabolized by bacteria that colonize the gastrointestinal tract. The aim of this study was to evaluate the potential of filamentous fungi and human gut bacteria to biotransform 3?-acetoxy-copalic acid and ?-caryophyllene found in oleoresins from Copaifera as well as to isolate the biotransformation products for evaluation of their cytotoxicity. Biotransformation experiments were carried out with 10 filamentous fungi strains and 8 human gut bacteria strains. The ethyl acetate extracts obtained from the biotransformation processes of diterpene were analyzed by HPLC/DAD/CAD and HPLC-MS and n-hexane and ethyl acetate extracts obtained from the biotransformation processes of sesquiterpene, as well as the volatile fraction collected by solid phase microextraction headspace, were analyzed by GC-MS. All tested microorganisms were able to biotransform the 3?-acetoxy-copalic acid and 9 biotransformation products were isolated, their chemical structures were identified, from which six are new and all the products were evaluated for cytotoxic activity against normal mammary gland (MCF-10A) and breast adenocarcinoma (MCF-7) cell lines. All metabolites of 3?-acetoxy-copalic acid showed lower cytotoxicity against the evaluated cell lines than the 3?-acetoxy-copalic acid. The fungi A. niger, A. brasiliensis and the three Cunninghamella strains were able to biotransform ?-caryophyllene. However, as good yields were not achieved in these processes, it was not possible to isolate the biotransformation products. The obtained data became possible to just make a proposal for the chemical structure of a product from the ?-caryophyllene biotransformation process performed by C. echinulata ATCC 9245.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2017-03-17T12:18:44Z No. of bitstreams: 1 2016 - Emanoel Hottes.pdf: 4033048 bytes, checksum: fe0f804a0e5a67c894370834c0964ff8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-17T12:18:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Emanoel Hottes.pdf: 4033048 bytes, checksum: fe0f804a0e5a67c894370834c0964ff8 (MD5) Previous issue date: 2016-04-07 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / CuII complexes containing thiazole and thioimidazole derivatives have been synthesized and characterized. The ligands (E)-2-(2-benzylidenehydrazinyl)-4-phenylthiazole (L1), (E)-2-(2-(4-chlorobenzylidene)hydrazinyl)-4-phenylthiazole (L2), (E)-2-(2-(4-methoxybenzylidene)hydrazinyl)-4-phenylthiazole (L3), (E)-4-phenyl-2-(2-(pyridin-2-ylmethylene)hydrazinyl)thiazole (L4), (E)-5-phenyl-1-(pyridin-2-ylmethyleneamino)-1H-imidazole-2(3H)-thione (L5) and (E)-1-(2-hydroxybenzylideneamino)-5-phenyl-1H-imidazole-2(3H)-thione (L6), reported in the literature, have been obtained in collaboration with Laboratory LaDMol-QM from UFRRJ. For these ligands, it is been performed qualitative calculations and molecular modeling by the semi empiric method PM6 for geometry optimization and estimate the relative energies of the frontier orbitals and conformers. The crystalline structure of the ligand L2 was determined by X-ray diffraction analysis. The CuII complexes have been obtained from the reactions of the ligands with CuCl2 in different stoichiometries. The proposed structures of the complexes have been formulated based on elemental analysis of CHN, electronic paramagnetic resonance (EPR) and electronic (UV-Vis) and vibrational (FTIR) spectroscopy. The results of EPR point to the occurrence of more than one CuII nucleus in all reaction products. For complexes CuL1-CuL3 with potentially bidentate ligands it has been proposed coordination from sulfur or nitrogen from thiazole ring and nitrogen from azomethine, with possible octahedral and/or square planar geometries. For CuL4-CuL6 with potentially tridentate ligands it is been proposed coordination from sulfur as well as nitrogen atoms. For CuL6, there is also a possibility of coordination through the oxygen atom, with a CuII possibly pentacoordinate.. Studies with yeast have shown that amongst the compounds, L1 has had the best activity in the inhibition of the cell growth. It was possible to observe that all compounds decrease the cell survival during the period of incubation. The studies of lipid peroxidation have shown that the complexes were more toxic than the ligands and the complex CuL3 has shown better toxicity when compared to the other compounds and the control. / Complexos de CuII com ligantes derivados de tiazol e tioimidazol, foram sintetizados e caracterizados. Os ligantes (E)-2-(2-benzilidenohidrazinil)-4-feniltiazol (L1), (E)-2-(2-(4-clorobenzilideno)hidrazinil)-4-feniltiazol (L2), (E)-2-(2-(4-metoxibenzilideno)hidrazinil)-4-feniltiazol (L3), (E)-4-fenil-2-(2-(piridin-2-il-metileno)hidrazinil)tiazol (L4), (E)-5-fenil-1-((piridin-2-il-metileno)amino)-1H-imidazol-2(3H)-tiona (L5) e (E)-1-((2-hidroxibenzilideno)amino)-5-fenil-1H-imidazol-2(3H)-tione (L6), j? reportados na literatura, foram obtidos e caracterizados em parceria com o Laborat?rio LaDMol-QM da UFRRJ. Para estes ligantes foram realizados c?lculos qualitativos de modelagem molecular pelo m?todo semi-emp?rico PM6 para otimiza??o de geometria e estimativas de energias relativas de orbitais de fronteira e de conf?rmeros. A estrutura cristalina do ligante L2 foi determinada por difra??o de raios-X de monocristal. Os complexos de CuII foram obtidos a partir de rea??o dos ligantes com CuCl2 em diferentes estequiometrias. As propostas para os complexos foram formuladas com base nos dados de an?lise elementar de CHN, resson?ncia paramagn?tica eletr?nica (EPR) e espectroscopias eletr?nica (UV-vis) e vibracional (FTIR). Os resultados de EPR apontam para a ocorr?ncia de mais de um n?cleo de CuII em todos os produtos. Para os complexos CuL1-CuL3 com ligantes potencialmente bidentados (L1-L3) foi proposta complexa??o tanto pelo ?tomo de enxofre (anel tiazol) como tamb?m pelos ?tomos de nitrog?nio (azometino), com possibilidades de geometrias octa?dricas e tamb?m quadradas. J? os complexos CuL4-CuL6, com ligantes potencialmente tridentados (L4-L6), foi proposta complexa??o tanto pelo ?tomo de enxofre do anel tiazol como tamb?m pelos ?tomos de nitrog?nio do azometino e do anel pirid?nico. No caso de CuL6 ainda h? possibilidade de coordena??o atrav?s do ?tomo de oxig?nio, com CuII possivelmente pentacoordenado.. Testes realizados em leveduras mostraram que dentre os compostos, o L1 foi o que apresentou melhor desempenho na inibi??o do crescimento das c?lulas. No caso do teste de viabilidade foi poss?vel observar que todos os compostos diminuem a sobrevida celular no per?odo de incuba??o. Por meio da an?lise de peroxida??o lip?dica foi poss?vel verificar que os complexos foram mais t?xicos do que os ligantes e que o CuL3 foi o que apresentou maior toxidez quando comparado com os demais complexos e com o controle

A natureza e diversidade das estruturas químicas com atividade farmacológica que se tem encontrado nos organismos marinhos justificam a busca por novos compostos que são de interesse nas mais diversas áreas de aplicação. As espécies de macroalgas vermelhas, em especial Laurencia spp., merecem destaque pela enorme variedade de terpenos e acetogeninas que produzem, sendo consideradas de grande potencial na produção de novos fármacos. O estudo de seus constituintes pode fornecer importantes subsídios para a quimiotaxonomia, ecologia química, caracterização das espécies e avaliação do potencial biotecnológico. Baseado nisso, Laurencia aldingensis, L. dendroidea e Laurenciella sp. foram selecionadas para o presente estudo para isolamento, caracterização e teste de atividades biológicas dos seus compostos. A técnica do DNA barcoding foi utilizada como ferramenta de diagnóstico para garantir a similaridade entre as amostras de cada espécie, que foram coletadas em época e locais diferentes. Do extrato orgânico de Laurencia aldingensis, nove substâncias foram isoladas, sendo quatro esfingosinas (1-4), três terpenos (5-7) e duas novas substâncias halogenadas (8 e 9). Do extrato orgânico de Laurencia dendroidea formam isolados dois terpenos halogenados conhecidos (10, 11) e, do extrato de Laurenciella sp. três novas substâncias halogenadas alifáticas insaturadas (12-14), assim como um ácido graxo (15) e um esterol (16) conhecidos. Dentre elas, a 8 apresentou atividade citotóxica, mas não se mostrou seletivo, e as substâncias 4 e 11 apresentaram atividade esquistossomicida, bastante promissora. No entanto, nenhum deles apresentou atividade antioxidante. Diante desta investigação, podemos dizer que as informações geradas com os estudos de Laurencia aldingensis, L. dendroidea e Laurenciella sp. expandiram significantemente o conhecimento no que tange a diversidade química no gênero e o potencial biológico-farmacêutico dos mesmos. / The nature and diversity of chemical structures with pharmacological activity that have been found in marine organisms justifies the search for new compounds that may have applications in various areas of interest. Species of red seaweeds, especially Laurencia spp., are special because of the unprecedented variety of terpenes and acetogenins they produce that are considered potentially useful for the production of new drugs. Study of their constituents can also provide important insights relating to their chemotaxonomy, chemical ecology, characterization of species and biotechnological potential. On this basis Laurencia aldingensis, L. dendroidea and Laurenciella sp., were selected for study and isolation, characterization, and biological activity assessment of isolatable quantities of their compounds. The technique of DNA barcoding was used as a diagnostic tool to ensure similarity between samples of each species collected at different times and places. From the organic extract of Laurencia aldingensis nine compounds were isolated; four sphingosines (1-4), three terpenes (5-7) and other two new halogenated compound (8, 9). From the organic extract of Laurencia dendroidea two known halogenated terpenes (10, 11) were isolated while from a similar extract of Laurenciella sp., three new halogenated aliphatic compounds (12-14) were isolated together with known fatty acid (15) and sterol (16). Among all isolates, 8 demonstrated unspecific cytotoxic activity and compounds 4 and 11 showed promising schistosomicidal activity. In applied antioxidant assays none of the isolates we noted to have activity. From the overall investigation it is also clear that the information gleaned from the studies of Laurencia aldingensis, L. dendroidea and Laurenciella sp., significantly expanded our knowledge base concerning chemical diversity in the genus Laurencia and their biological-pharmaceutical potential.

A natureza e diversidade das estruturas químicas com atividade farmacológica que se tem encontrado nos organismos marinhos justificam a busca por novos compostos que são de interesse nas mais diversas áreas de aplicação. As espécies de macroalgas vermelhas, em especial Laurencia spp., merecem destaque pela enorme variedade de terpenos e acetogeninas que produzem, sendo consideradas de grande potencial na produção de novos fármacos. O estudo de seus constituintes pode fornecer importantes subsídios para a quimiotaxonomia, ecologia química, caracterização das espécies e avaliação do potencial biotecnológico. Baseado nisso, Laurencia aldingensis, L. dendroidea e Laurenciella sp. foram selecionadas para o presente estudo para isolamento, caracterização e teste de atividades biológicas dos seus compostos. A técnica do DNA barcoding foi utilizada como ferramenta de diagnóstico para garantir a similaridade entre as amostras de cada espécie, que foram coletadas em época e locais diferentes. Do extrato orgânico de Laurencia aldingensis, nove substâncias foram isoladas, sendo quatro esfingosinas (1-4), três terpenos (5-7) e duas novas substâncias halogenadas (8 e 9). Do extrato orgânico de Laurencia dendroidea formam isolados dois terpenos halogenados conhecidos (10, 11) e, do extrato de Laurenciella sp. três novas substâncias halogenadas alifáticas insaturadas (12-14), assim como um ácido graxo (15) e um esterol (16) conhecidos. Dentre elas, a 8 apresentou atividade citotóxica, mas não se mostrou seletivo, e as substâncias 4 e 11 apresentaram atividade esquistossomicida, bastante promissora. No entanto, nenhum deles apresentou atividade antioxidante. Diante desta investigação, podemos dizer que as informações geradas com os estudos de Laurencia aldingensis, L. dendroidea e Laurenciella sp. expandiram significantemente o conhecimento no que tange a diversidade química no gênero e o potencial biológico-farmacêutico dos mesmos. / The nature and diversity of chemical structures with pharmacological activity that have been found in marine organisms justifies the search for new compounds that may have applications in various areas of interest. Species of red seaweeds, especially Laurencia spp., are special because of the unprecedented variety of terpenes and acetogenins they produce that are considered potentially useful for the production of new drugs. Study of their constituents can also provide important insights relating to their chemotaxonomy, chemical ecology, characterization of species and biotechnological potential. On this basis Laurencia aldingensis, L. dendroidea and Laurenciella sp., were selected for study and isolation, characterization, and biological activity assessment of isolatable quantities of their compounds. The technique of DNA barcoding was used as a diagnostic tool to ensure similarity between samples of each species collected at different times and places. From the organic extract of Laurencia aldingensis nine compounds were isolated; four sphingosines (1-4), three terpenes (5-7) and other two new halogenated compound (8, 9). From the organic extract of Laurencia dendroidea two known halogenated terpenes (10, 11) were isolated while from a similar extract of Laurenciella sp., three new halogenated aliphatic compounds (12-14) were isolated together with known fatty acid (15) and sterol (16). Among all isolates, 8 demonstrated unspecific cytotoxic activity and compounds 4 and 11 showed promising schistosomicidal activity. In applied antioxidant assays none of the isolates we noted to have activity. From the overall investigation it is also clear that the information gleaned from the studies of Laurencia aldingensis, L. dendroidea and Laurenciella sp., significantly expanded our knowledge base concerning chemical diversity in the genus Laurencia and their biological-pharmaceutical potential.

Annona hypoglauca Mart. foi coletada em área inundada da Floresta Amazônica, próximo à Manaus (Brasil). Os alcalóides foram obtidos do extrato bruto do caule por partição ácido-base, e a partir do resíduo dessa extração foi realizada a partição com solventes de diferentes polaridades, originando as frações livres de alcalóides. A partir da análise de CG-EM dos alcalóides totais foi possível caracterizar sete alcalóides aporfínicos (actinodafinina, anonaina, glaucina, isoboldina, isodomesticina, nornuciferina e roemerina) e possivelmente duas protoberberinas (esculerina e caseadina). Os alcalóides totais foram fracionados em coluna cromatográfica e posteriormente purificados em placa cromatográfica preparativa permitindo o isolamento de dois alcalóides aporfínicos: actinodafinina e isoboldina. As estruturas desses produtos naturais foram definidos com base em espectros de dados, incluindo 1H RMN, 13C RMN, 13C DEPT e CG-EM. Pela primeira vez a ocorrência da actinodafinina esta sendo reportada em uma espécies de Annona. O extrato bruto, as frações livres de alcalóides, os alcalóides totais e suas frações foram submetidos a avaliação da atividade antibacteriana por microdiluição e atividade citotóxica in vitro frente a células de tumores humanos. Para todos os extratos testados, somente os alcalóides totais e suas frações apresentaram atividade frente a bactérias Gram +. No ensaio de citotoxicidade com linhagens de células de tumores, o extrato bruto foi capaz de inibir o crescimento de todas as linhagens celulares testadas, apresentando efeito letal para a linhagem de Câncer de Cólon (KM-12), enquanto as frações livres de alcalóides demonstraram baixa atividade. Por outro lado, as frações livres de alcalóides apresentaram atividade mais pronunciada para a linhagem de Câncer de Pulmão (NCIH-460) do que os alcalóides. Assim, a atividade citotóxica encontrada no extrato bruto é decorrente do sinergismo ou complementação entre os componentes das frações alcaloídicas e não alcaloídicas, isto é, nenhuma das frações isoladamente é responsável pela atividade observada no extrato bruto. / Annona hypoglauca Mart. was collected in the flooded areas of the Amazonian Forest near Manaus (Brazil). The alkaloids were obtained from the stems crude extract by acid-base partitioning and the remaining alkaloid-free extract was partitioned with organic solvents of different polarity. The GC/MS analysis of the total alkaloids allowed the identification of seven aporphine alkaloids (actinophanine, anonaine, glaucine, isoboldine, isodomesticine, nornuciferine and roemerine) and possibly two proberberine alkaloids (scoulerine and caseadine). The total alkaloids were fractionated by column chromatography and further purified by preparative thin-layer chromatography allowing the isolation of two aporphine alkaloids: actinodaphnine and isoboldine. The structures of these natural products were defined based on their spectral data, including 1H NMR, 13C NMR, 13C DEPT and CG/MS. This is the first report for the occurrence of actinodaphnine in Annona species. The crude extract, alkaloid-free organic extracts, total alkaloids and its fractions were tested for their antibacterial activity by the microdilution broth assay and cytotoxic activity against in vitro tissue culture cells of human. From all the extracts assayed, only the total alkaloids and their fractions showed a relevant antibacterial activity against Gram positive organisms. In the cytotoxicity assay with human tumor cell lines, the crude extract was able to inhibit the growth of all cell lines tested, with a lethal effect for the colon cancer (KM-12) cell line. The evaluation of this activity with the total alkaloid and alkaloid-free fractions indicated selectivity for the different cellular lines. The alkaloid fraction presented high growth inhibition for the colon cancer cell line (KM-12), while the alkaloid-free fractions displayed lower activity. On the other hand, the alkaloid free fractions showed a higher activity for the lung cancer cell line (NCIH-460) than the total alkaloids. Thus, the cytotoxic activity found in the crude extract is the result of the synergism or complementary activity among the components of the alkaloid and alkaloid-free fractions, e.g, none of the fractions separately is responsible for the activity observed in the crude extract.

Os venenos de serpentes são ricos em proteínas, enzimas e peptídeos biologicamente ativos. Diversas enzimas tais como fosfolipases A2 (PLA2s), metaloproteases (MP), L-aminoácido oxidases (LAAOs) são responsáveis pelo quadro clínico do envenenamento ofídico. Atualmente, o isolamento e a caracterização funcional e estrutural destas enzimas têm auxiliado na compreensão do mecanismo de ação destas toxinas e nas formas alternativas de tratamento. Além disso, estas enzimas se tornaram valiosas ferramentas de aplicação biotecnológica, na busca de novos fármacos de interesse na clínica médica. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar bioquímica e funcionalmente a L-aminoácido oxidase do veneno de Bothrops atrox. O isolamento da LAAO de B. atrox (LAAOBatrox) envolveu três etapas cromatográficas: a exclusão molecular em Sephadex G-75, troca iônica em ES-502N utilizando CLAE e, por último, a cromatografia de afinidade com uso da Lentil-Lectina, conferindo um alto grau de pureza à proteína confirmado por SDS-PAGE. Após a caracterização bioquímica, a LAAOBatrox demonstrou ser uma glicoproteína com 12% de açúcar, massa molecular relativa de 67.000 e pI de 4,4 confirmando seu caráter ácido pela composição em aminoácidos, predominando Asx (Ácido aspártico ou asparagina) e Glx (Ácido glutâmico ou glutamina). LAAOBatrox apresentou especificidade de substrato para L-Met e L-Leu. Com o seqüenciamento dos peptídeos trípticos internos e em comparação com as LAAOs de outros venenos, a LAAOBatrox apresentou homologia de 100% com LAAOs isoladas de B. moojeni e B. jararacussu e apresentou sequenciamento N-terminal de ADDN-NPLEE-NIRRDD que é homólogo ao das LAAOs já descritas. A LAAOBatrox apresentou atividade edematogênica moderada quando comparada ao veneno bruto, atividade coagulante baixa sobre o plasma humano citratado, atividade de agregação plaquetária sendo que 25µg/mL foi capaz de agregar aproximadamente 100% de plaquetas, onde o efeito obtido pela proteína pode ser devido à liberação de H2O2, sendo que a catalase foi adicionada ao meio tratado com LAAOBatrox e o efeito de agregação plaquetária obtido foi próximo à 0%. LAAOBatrox apresentou efeito citotóxico sobre diferentes linhagens tumorais: B16F10 onde as células apresentaram 70% de morte por apoptose e PC12 que apresentaram uma viabilidade celular de 20% após o tratamento com a enzima. LAAOBatrox não apresentou efeito citotóxico significativo sobre células normais. Portanto, a LAAOBatrox consiste de uma enzima multifuncional que poderá servir como ferramenta para investigação dos processos celulares que estão envolvidos no envenenamento. / Snake venoms are rich in proteins, enzymes and biological active peptides. Many enzymes, like phospholipases A2, metalloproteinases, L-amino acid oxidases are responsible by clinical aspects of ophidian poisoning. Nowadays, isolation and the functional and structural characterizations of these enzymes have been useful to elucidate their mechanisms of action. Besides, these enzymes have great value for biotechnology on searching of new molecules for medicine development. The aim of this work was isolate Lamino acid oxidase from B. atrox venom (LAAOBatrox) and characterize biochemical and functionally LAAOBatrox. The isolation consisted of 3 chromatographic steps: molecular exclusion using a G-75 Sephadex column, ion exchange using ES-502N column in HPLC and affinity chromatography with Lentil-Lectin column. Afterward, LAAOBatrox was analyzed by SDS-PAGE to confirm an expected high purity level. Biochemical characterization showed LAAOBatrox is a glycoprotein of 12% sugar-containing with relative molecular weight of 67000, pI estimated in 4,4 pointing to acid character due to its amino acids composition, rich for Asx and Glx residues. LAAOBatrox displays high specificity to hydrophobic L-amino acids (best substrates: L-Met and L-Leu). The Nterminal amino acid sequence (ADDN-NPLEE-NIRRDD) and the internal peptide sequences showed close structural homology to other snake venom L-amino acid oxidades, presenting 100% homology to LAAO from B. moojeni and B. jararacussu. This enzyme induces moderate edema compared to crude venom, low coagulating activity in human plasma and 100% of in vitro platelet aggregation induction with 25 g/mL, but this can be due to H2O2 production by LAAOs once added catalase has inhibited aggregation induced by LAAOBatrox and the effect was close to 0%. LAAOBatrox presents citotoxicity effect for tumor cell lines: 70% of death by apoptosis in B16F10 and 20% cellular viability for PC12, after LAAOBatrox treatment. LAAOBatrox did not display citotoxicity effect in normal cells (peripheral blood mononuclear cells). Thus, LAAOBatrox is a multifunctional enzyme of huge potential for investigation of cellular processes involved on poisoning and also for developing new medicines.

Cumarinas são estruturas promissoras e diversas atividades biológicas têm sido atribuídas a esses metabólitos secundários vegetais. Estudos sugerem que o mecanismo antifúngico desses compostos esteja correlacionado com a atividade antioxidante. A reação da tirosinase, que produz radicais livres, está envolvida no processo de melanização do fungo Sporothrix schenckii, o causador de micose subcutânea de maior incidência no sul do Brasil. A inibição dessa enzima foi recentemente reportada para extrato de Pterocaulon (Asteraceae), planta rica em cumarinas e usada na medicina tradicional do Brasil para tratamento tópico de micoses e na medicina popular da Argentina como anticâncer. O objetivo desse trabalho foi investigar in vitro a atividade antifúngica, correlacionando-a com atividade antioxidante, de extratos de espécies de Pterocaulon e de 6,7-metilenodioxicumarinas isoladas e também de 4-metilcumarinas obtidas por síntese, bem como a investigação da atividade citotóxica de algumas destas moléculas. As 6,7-metilenodioxicumarinas foram isoladas de P. balansae e P. lorentzii, enquanto que as 4-metilcumarinas foram sintetizadas via Pechmann por micro-ondas. A atividade antifúngica contra Sporotrix schenckii foi realizada conforme manual do Clinical and Laboratory Standards Institute. O estudo das propriedades eletroquímicas foi obtido por voltametria cíclica e a capacidade antioxidante pelo método espectofotométrico DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) e pelo método fluorimétrico ACAP contra radicais peroxil. A análise dessa atividade mostrou que os extratos metanólicos de espécies de Pterocaulon (P. polystachyum, P. balansae, P. lorentzii, P. lanatum e P. cordobense) foram ativos frente às cepas do fungo S. schenckii, sendo o extrato de P. polystachyum o mais ativo, apresentando Concentração Inibitória Mínima (CIM) compreendida entre 156 e 312 μg/mL. O fracionamento dos extratos lipofílicos de P. balansae e P. lorentzii levou ao isolamento de três metilenodioxicumarinas. Dados cristalográficos da 5-metóxi-6,7-metilenodioxicumarina, inéditos, foram depositados no Cambridge Crystallographic Data Centre 779123. As cumarinas sintéticas foram obtidas em rendimentos satisfatórios (98-30%) e em reduzido tempo de reação (5-20 min). O screening destas cumarinas frente às cepas do fungo S. schenckii revelou que 5-carboxi-6,7-diidroxi-4-metilcumarina, com CIM de 66 μM e Concentração Fungicida Mínima de 246 μM, foi o composto mais ativo. Essa cumarina apresentou sinergismo com a Anfotericina B, sendo sua CIM reduzida para 15 μM. A atividade antifúngica desses compostos pode estar correlacionada com a atividade antioxidante. O composto 5-carboxi-6,7-diidroxi-4-metilcumarina foi o mais ativo mostrando elevada capacidade antioxidante frente aos radicais DPPH com valores de IC50 de 17,49 μM e elevada atividade frente ao radical peroxil. Além disso, apresentou um potencial de oxidação de 0,4 V sugerindo atividade antioxidante. Baseado nos ensaios antioxidante e antifúngico foi possível observar que a presença de grupamentos hidroxilas no C-7 e C-8 do anel cumarínico, assim como a adição de grupamento polar no C-5 favoreceu ambas as atividades antifúngica e antioxidante. Na segunda etapa desse trabalho foi avaliada a citotoxicidade das cumarinas isoladas e algumas cumarinas simples, disponíveis comercialmente, pelo método Metil Tiazol Tetrazólio (MTT) usando linhagens de glioma humano (U138-MG) e de ratos (C6). Foi observado que as 6,7-metilenodioxicumarinas causaram uma significativa redução na viabilidade celular, sugerindo uma influência positiva do grupamento metilenodioxi sobre essa atividade. O composto 5-metóxi-6,7-metilenodioxicumarina foi o mais promissor (IC50= 34,6 μM e IC50= 31,6 μM para C6 e U-138 MG, respectivamente). Como desfecho desse trabalho, pode-se concluir que as cumarinas apresentaram uma atividade inibitória frente ao crescimento celular de linhagens de glioma e um efeito fungicida sobre S. schenckii, resultados estes que corroboram com o uso popular dessas plantas. / Coumarins are promising structures and diverse biological activities have been attributed to these secondary plant metabolites. Studies suggest that the mechanism of antifungal compounds is correlated with antioxidant activity. The reaction of tyrosinase, which produces free radicals, is involved in the process of melanization of the fungus Sporothrix schenckii, the agent of subcutaneous mycosis with the highest incidence in southern Brazil. The inhibition of this enzyme has recently been reported to extract Pterocaulon (Asteraceae) This plant is rich in coumarins and used in traditional medicine in Brazil for topical treatment of fungal infections and in folk medicine of Argentina as anticancer. The aim of this study was to investigate the in vitro antifungal activity and correlation with its antioxidant properties and cytotoxic activities of extracts of some species of Pterocaulon, as well as the isolated coumarins, and 4-methylcoumarin analogs obtained by synthesis. The 6.7-methylenedioxycoumarins were isolated from P. balansae and P. lorentzii, while the 4-methylcoumarins were synthesized via Pechmann reaction using microwave. The antifungal activity against Sporothrix schenckii was performed as indicated in the Manual of Clinical and Laboratory Standards Institute. A study of the electrochemical properties of coumarins was performed by cyclic voltammetry, by the method of 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) and against peroxyl radicals (ACAP) by fluorometric method. The analysis showed that the antifungal activity of the methanol extracts of Pterocaulon species (P. polystachyum, P. balansae, P. lorentzii, P. lanatum and P. cordobense) were active against the strains of the fungus S. schenckii, being the extract of P. polystachyum the most active, presenting Minimum Inhibitory Concentration (MIC) compressed between 156 and 312 μg/mL. The fractionation of lipophilic extracts of P. balansae and P. lorentzii led to the isolation of three methylenedioxycoumarins. The crystallographic data of 5-methoxy-6,7-methylenedioxycoumarin were deposited at the Cambridge Crystallographic Data Center 779123. The synthetic coumarins were obtained in satisfactory yields (98-30%) and reduced reaction time (5-20 min). The screening of these coumarins against strains of the fungus S. schenckii revealed that the 5-carboxy-6,7-dihydroxy-4-methylcoumarin was the most active compound, presenting MIC of 66 μM and Minimum Fungicidal Concentration of 246 μM. This coumarin showed synergism with Amphotericin B, and its MIC was reduced to 15 μM. The antifungal activity of phenolic compounds could be related to its antioxidant activities. The compound 5-carboxy-6,7-dihydroxy-4-methylcoumarin was again the most active with IC50 value of 17.49 μM, showing the highest capacity to deplete the radicals DPPH and ACAP, moreover present a oxidation potential of 0.4 V suggesting antioxidant activity. Based on the antioxidant and antifungal tests it was observed that the presence of hydroxyl groups at C-7 and C-8 of the coumarin ring and the addition of polar grouping at C-5 favored both antifungal and antioxidant activities.In the second part of this work, it was evaluated the cytotoxicity of the Pterocaulon compounds and some commercially available coumarins, with simple structure. The cytotoxic potential was determined by Methyl Thiazole Tetrazolium (MTT) test using strains of human glioma (U138-MG) and rat (C6). It was observed that the 6,7-methylenedioxycoumarins caused a significant reduction in cell viability, suggesting a positive influence of the methylenedioxy group in this activity. The compound 5-methoxy-6,7-methylenedioxycoumarin was the most promising (IC50 = 34.6 μM and IC50 = 31.6 μM for C6 and U-138 MG, respectively). In conclusion, this work it was demonstrated that some coumarins showed an inhibitory activity against the growth of glioma cell lines and a fungicidal effect on the S. schenckii. These results corroborate the popular use of these plants.

Submitted by Ana Hilda Fonseca (anahilda@ufba.br) on 2016-09-08T14:57:09Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Síntese_4_aril_3,4_diidrocumarinas_corrigida_final.pdf: 2298956 bytes, checksum: c56efe2a43dfa29764b57a22d7ac1966 (MD5) / Approved for entry into archive by Vanessa Reis (vanessa.jamile@ufba.br) on 2016-09-08T15:04:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_Síntese_4_aril_3,4_diidrocumarinas_corrigida_final.pdf: 2298956 bytes, checksum: c56efe2a43dfa29764b57a22d7ac1966 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T15:04:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_Síntese_4_aril_3,4_diidrocumarinas_corrigida_final.pdf: 2298956 bytes, checksum: c56efe2a43dfa29764b57a22d7ac1966 (MD5) / CNPq / As 4-aril-3,4-di-hidrocumarinas são produtos naturais estruturalmente e biogeneticamente relacionados aos flavonóides que exibem diferentes atividades biológicas. Neste trabalho foram sintetizados inicialmente oito derivados de 4-aril- 3,4-di-hidrocumarina, com rendimentos baixo a moderados (4-69%). Estes derivados foram obtidos através de reações de condensação entre derivados de fenóis e de ácidos cinâmicos, utilizando o ácido polifosfórico como catalisador. A partir da 4-aril- 3,4-diidrocumarinas (10a) foram obtidos derivados acetilados, metilado e base de Mannich, empregando métodos clássicos. Dentre as 4-aril-3,4-di-hidrocumarinas obtidas seis são inéditas na literatura (10f-g, 55b-c e 60). Utilizando-se a mesma metodologia empregada no preparo das 4-aril-3,4-di-hidrocumarinas foi também sintetizada as cumarinas herniarina (44a), 5-hidroxi-cumarina (44b) e a umbeliferona (44c) com rendimentos de moderados a bons (42-82%). Todas as substâncias preparadas foram caracterizadas por métodos espectroscópicos. As 4-aril-3,4-di- hidrocumarina obtidas tiveram sua citotoxicidade e capacidade antioxidante avaliadas. Apenas 10a e 10c apresentaram atividade oxidante considerável, com destaque para este último que demonstrou atividade comparável aos padrões, ácido gálico e quercetina. Nos testes de citotoxicidade contra Artemia salina, os compostos apresentaram atividade moderada, destacando-se como ativo o novo composto 3f (CL50 = 96,86µg/mL). / The 4-aryl-3,4-di-hydrocoumarins are natural products biogenetical and structurally related to flavonoids that exhibit different biological activities. In this work were synthesized initially eight derivatives of 4-aryl-3,4-di-hydrocoumarins with low to moderate yields (4-69%). These derivatives were obtained by condensation reactions between phenols and cinnamic acid derivatives, using polyphosphoric acid as catalyst. From the 4-aryl-3,4-di-hydrocoumarins (10a) were obtained acetylated derivatives, methylated and Mannich base, using classical methods. 4-aryl-3,4-di- hydrocoumarins obtained, six of them were new compounds (10f-g, 55b-c and 60). Using the same methodology used in the preparation of 4-aryl-3,4-di-hydrocoumarins was also synthesized coumarins herniarin (44a), 5-hydroxy-coumarin (44b) and umbelliferone (44c) with modest to good yields (42 -82%). All substances prepared were characterized by spectroscopic methods. The 4-aryl-3,4-di-hydrocoumarins had obtained their cytotoxicity and antioxidant capacity evaluated. Only 10a and 10c showed considerable oxidant activity, especially the last one who showed activity comparable to standards, gallic acid and quercetin. In tests of cytotoxicity against Artemia salina, the compounds showed moderate activity, particularly the new activity compound 10f (LC50 = 96.86 mg / mL).

Orientador: Christiane Pienna Soares / Banca: Christiane Pienna Soares / Banca: Haroldo Wilson Moreira / Banca: Ana Marisa Fusco Almedia / Banca: Raquel Alves dos Santos / Banca: Maria Regina Torqueti Toloi / Resumo: O câncer de mama é a maior causa de morbidade e mortalidade entre as mulheres no mundo. Pesquisas revelam vários fatores prognósticos e preditivos para a identificação de pacientes com alto risco de agressividade, metastases e doença recorrente na condição de combater estas estatísticas. Por esta razão, é evidente a necessidade do desenvolvimento de estratégias de tratamento mais eficazes. Estudos prévios com Pterogyne nitens Tul. (Fabaceae-Caesalpinioideae), uma planta nativa do Brasil resultou o isolamento de dois alcalóides guanidínicos. Exibiram atividade seletiva direcionada a DNA deficiente de reparo, sugerindo potencial atividade anticâncer. Objetivo: O objetivo do presente estudo foi avaliar a citotoxicidade e apoptose induzidas pelos alcalóides pteroginina (PGN) and pteroginidina (PGD) em linhagem de adenocarcinoma (MCF-7) e carcinoma ductal invasivo (ZR-7531). Materiais e Métodos: As duas linhagens celulares foram tratadas pelos alcalóides em várias concentrações (0.25 - 10 mM) em dois tempos, t0 (24h) e t24 (24h seguido por 24h pós-tratamento). O ensaio de citotoxicidade foi determinado pelo teste de MTT; a morte celular (apoptose e necrose) foi analisada usando os métodos Hoechst 33342/iodeto propídio, Kit de Anexina V-FITC e atividade de Caspases 3/7. Resultados: Os tratamentos com os alcalóides demonstraram citotoxicidade concentração-resposta nas linhagens de câncer de mama. Para avaliação da apoptose foi observado um intense efeito concentraçãoresposta em apoptose tardia/necrose e discreto sinal para apoptose precoce em todas concentrações (p<0,01). No ensaio Hoechst/iodeto, observou diferença significante entre os estágios de apoptose precoce e tardia de ambas linhagens. A pteroginina no período t0 e t24, e pteroginidina no período t0 demonstraram possuir intenso efeito concentração... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Breast cancer is a major cause of morbidity and mortality among women worldwide. Research has elucidated several specific prognostic and predictive factors to identify patients at high risk of the aggressive disease, metastasis and recurrence of the disease in order to combat these statistics. For this reason, there is an obvious need to develop more efficacious treatment strategies. Previous studies on Pterogyne nitens Tul. (Fabaceae-Caesalpinioideae), a native plant of Brazil, resulted in the isolation of two guanidine alkaloids, exhibited selective activity towards a DNA repair-deficient, suggesting potential anti-cancer activity. Objective: The aim of the present study was to evaluate the citotoxicity and apoptosis induced by alkaloids pterogynine (PGN) and pterogynidine (PGD) in human adenocarcinoma cell line (MCF-7) and human invasive ductal carcinoma cell line(ZR-7531). Material and Methods: The two cell lines were treated by both alkaloids at several concentrations (0.25 - 10 mM) and two time points, 24h (t0) and 24h followed by 24h pos-treatment (t24). The cytotoxicity assay was determined by MTT assay; the cell death (apoptosis and necrosis) were analyzed using the dye Hoechst 33342/propidium iodide, Annexin V-FITC and Caspase 3/7 activity. Results: The treatments with the alkaloids demonstrated citotoxicity effect concentrationresponse in breast cell lines. Apoptosis evaluation, pterogynine and pterogynidine has an intense effect concentration-response of late apoptosis/necrosis and a discrete signal of early apoptosis in all of the concentrations (p<0.01). Hoechst/iodide assay, it was observe significant difference among the stages of early and late apoptosis in the both cells lines. Pterogynine for the period of t0 and t24, and pterogynidine for the period of t0 demonstrated to possess an intense concentrationresponse... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor