O Ensaio Cometa (Eletroforese em Gel de Célula Única) foi aplicado ao estudo do potencial genotóxico da β-naftoflavona (BNF) em exposição in vivo a eritrócitos de robalos, Centropomus parallelus. Condições específicas para o ensaio cometa de células de sangue de robalos foram estabelecidas com base em informações obtidas em literatura; e através de experimentos com exposição in vitro a diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio, e com desenrolamento e eletroforese em diferentes alcalinidades e voltagens. Para avaliar o potencial genotóxico da BNF, os peixes foram expostos a 1ppm e 5ppm de BNF por 24, 48 e 72 horas. Controles foram mantidos em água do mar e em água do mar com DMSO, utilizado com solvente. Células de sangue foram coletadas, submetidas a ensaio cometa em versão alcalina de pH>13 e coradas por prata. Os cometas foram analisados por métodos visuais, incluindo Índice de Danos, Porcentagem de Danos e Freqüência de Danos, e através do sistema de análise de imagem ScionImage. Exposições in vitro de eritrócitos a H2O2 resultaram em relação dose-resposta em pH 12,6 e pH>13, indicando aplicabilidade do ensaio a células de sangue de robalos. Exposições in vivo a BNF indicaram tendência a maior Índice de Danos em grupos expostos comparados a controles, porém não ocorreu diferença significativa estatisticamente. A grande amplitude de variação dos dados, em controles e nos demais grupos experimentais, dificultou sua análise e interpretação. / Single Cell Gel Electrophoresis or Comet Assay was applied to study the genotoxic potential of exposure in vivo to β-naphthoflavone (BNF) on erythrocytes of fat snook, Centropomus parallelus. Specific conditions for the comet assay on fat snook blood cells were established based on information obtained from literature together with results of experiments in which slides were exposed in vitro to different concentrations of hydrogen peroxide, submitted to unwinding and electrophoresis at different alkalinity and different voltages. To assess the genotoxic potential of BNF, fish were exposed in vivo to 1ppm and 5ppm of BNF for 24, 48 and 72 hours. Controls were exposed to sea water only and sea water plus DMSO, used as carrier. Blood cells were collected, submitted to alkaline version of comet assay at pH>13 and silver stained. Comets were analyzed by visual methods including Damage Index, Percentage of Damage and Frequency of Damage, and by ScionImage image analysis system. In vitro expositions of erythrocytes to H2O2 resulted in dose-response relationship, at pH 12,6 and pH>13, indicating applicability of the assay to blood cells of fat snook. In vivo exposure to BNF showed a slight tendency towards a higher Damage Index, though not statistically significant, in exposed groups as compared to controls. Wide amplitude of variations of data, in the controls as well as in other experimental groups, made their analysis and interpretation difficult.

Scientific research using nanotechnology is a relatively recent development with a variety of potential applications in many fields of science. Within this field of research, many new products, with improved performances, have been developed. Despite increased research on its toxicity to ecosystem, the knowledge about this area is still limited. To evaluate the toxicity and genotoxicity of different sizes silica nanoparticles (SiNP)to the environment, different species, on different trophic levels (Vibrio fisheri, Raphidocelissubcapitata, Daniorerio and Allium cepa) were exposed to TM40 (22 nm), HS30 (12 nm), SM30 (7 nm) with concentrations ranging from0.19 to 163.8 g/L (TM40) and 0.29 to 122.85 g/L (HS30 and SM30), and the following parameters were monitored during exposure: production of bioluminescence (V. fischeri), growth rate (R. subcapitata), embryonic development and DNA damage (D. rerio) and germination rate, growth and DNA damage (A. cepa). Within each test SiNPpresent a size dependent chronic toxicity. The bioluminescence test present a EC50 of 29.11, 32.34 and 4.58 g/L for TM40, HS30 and SM30, respectively. For the growth rate assay the EC50 was 9.32, 9.07 and 7.93 g/L for TM40, HS30 and SM30, respectively. And for the zebra fish embryonic development test for TM40, HS30 and SM30, the EC50 was 5.85, 1.13 and 2.68 g/L respectively. All particles also induce phytotoxicity in A.cepa, growth and germination reduce significatively when expose to SiNP. Futhermoregenotoxic effects were also induced by the particles for both A.cepaand D. rerio. Therefore, SiNP can cause toxicity to the environment and size can strongly influence this toxicity / Com uma variedade de aplicações potenciais, em diversos campos da ciência, as pesquisas científicas utilizando nanotecnologia são de desenvolvimento relativamente recente. Dentro deste campo de pesquisa, vários novos produtos, com desempenhos melhorados têm sido desenvolvidos. Apesar do aumento de pesquisas sobre a toxicidade dessas tecnologias à biota, o conhecimento sobre esta área ainda é limitado. Visando avaliar a toxicidade e genotoxicidade denanopartículasde sílica (SiNP) no meio ambiente diferentes espécies pertencentes a diversos níveis tróficos (Vibriofisheri, Raphidocelissubcapitata, DaniorerioandAllium cepa) foram expostos a Ludox TM40 (22 nm), Ludox HS30 (12 nm) e Ludox SM30 (7 nm). As espécies de teste foram expostas a concentrações de nanopartículas (NP) variando de 0.29 a 163.8 g/L (TM40) e 0.19 a 122.85 g/L (HS30 e SM30) e os seguintes parâmetros monitorizados durante a exposição: a produção de bioluminescência (V. fischeri), o crescimento taxa (R. subcapitata), inibição de alimentação (D. magna), desenvolvimento embrionário e dano ao DNA (D. rerio) e taxa de germinação, crescimento e danos ao DNA (A. cepa). Nos testes feitos com as SiNPfoi observado que a toxicidade é dependente do tamanho da partícula. O ensaio de bioluminescência apresentou um EC50 de 29.11, 32.34 e 4.58 g/L para TM40, HS30 e SM30, respectivamente. Para o ensaio de taxa de crescimento o EC50 foi 9.32, 9.07 e 7.93 g/Lpara TM40, HS30 e SM30, respectivamente. E para o teste de desenvolvimento embrionário com peixe zebra, para o TM40, HS30 e SM30 o EC50 foi de 5.85, 1.13 e 2.68g/L, respectivamente. Todas as partículas também induziram fitotoxicidade em A. cepa, crescimento e germinação reduziram significativamente quando o organismo foi exposto a SiNP. Efeitos genotóxicos também foram induzir pelas partículas, tanto para A. cepa quanto paraD. rerio. Portanto, as SiNP podem causar toxicidade ao ambiente e o tamanho pode influenciar fortemente a essa toxicidade

A constante exposição dos diferentes organismos a agentes que danificam a estrutura da molécula do DNA fez com que a célula desenvolvesse mecanismos de reparo que se mostraram conservados durante a evolução. Em células de mamíferos, as vias de reparo ao dano ao DNA e a regulação dos pontos de checagem do ciclo celular atuam de forma coordenada no reparo do dano a fim de evitar uma progressão do ciclo celular antes do reparo e uma possível perpetuação do dano. Além disso, alguns dos componentes dessas vias metabólicas também atuam em outros processos, como replicação, transcrição, recombinação meiótica e silenciamento gênico. NER é um importante mecanismo no processo que reconhece e remove dímeros de ciclobutano e 6-4 pirimidina-pirimidona da estrutura do DNA. Em mamíferos foram identificados sete grupos de complementação para células deficientes de XP (XPA-G). Um desses grupos é XPE, conhecido por possuir forte afinidade ao dano ao DNA causado por luz UV, sendo formado por duas subunidades, DDB1 e DDB2. Uma busca no banco de dados de Aspergillus nidulans utilizando uma seqüência DDB1 de Homo sapiens, revelou uma única seqüência com similaridade relevante denominada como DdbA que não possui nenhuma similaridade com a proteína DDB2. Em Aspergillus nidulans, a proteína DdbA também está envolvida no reparo do dano ao DNA causado por luz UV e 4-NQO, no entanto, vimos aqui, que DdbA está interagindo com as proteínas UvsBATR, H2AX e CshBCSB no reparo ao dano ao DNA causado por MMS, Bleomicina, 4-NQO e luz UV. Além disso, uma análise na expressão do gene ddbA mostrou que ele é induzido por estas drogas, no estresse oxidativo e nos processos de desenvolvimento assexual e sexual de A. nidulans. Nós também vimos que a localização celular de DdbA não foi afetada durante a resposta ao dano ao DNA causado por luz UV e 4-NQO indicando que a proteína DdbA está presente no núcleo independentemente do dano. Em S. pombe, as proteínas serina-treonina quinases CHK1 e CHK2 foram identificadas como essenciais para o bloqueio do ciclo celular na fase S em resposta ao dano ao DNA ou em resposta ao estresse replicacional. Essas quinases são fosforiladas pelas quinases ATM e ATR e tem sido extensivamente caracterizadas em A. nidulans. Neste fungo, as proteínas ChkACHK1 e ChkBCHK2 estão envolvidas na reposta ao dano ao DNA e estão interagindo de forma epistática e sinergística com as proteínas quinases AtmAATM e UvsBATR. Nossos resultados também sugerem que as proteínas ChkA e ChkB podem estar envolvidas em meiose, e atuam em vias complementares durante o bloqueio da fase S do ciclo celular. Além disso, as proteínas AtmA, ChkA, ChkB e UvsB são redundantemente complementares na manutenção do crescimento polar das hifas em Aspergillus nidulans. / The constant exposure of different organisms to agents that damage the DNA structure, has provided the cells with repair mechanisms that are conserved during evolution. In mammal cells, the DNA damage repair pathways and the cell cycle checkpoint regulation act together to prevent cell cycle progression before the repair is performed avoiding mutation fixaxion. However these responses are complex and demand overlapping functions and the intersection of many metabolic pathways. NER is an important mechanism in the process that recognize and remove cyclobutane pyrimidine dimers and 6-4 pyrimidine-pyrimidone photoproduct from the DNA structure. In mammals seven complementation groups for XP deficient cells were identified. One of these groups is XPE, known for having strong affinity to the DNA damage caused by UV light and is formed by two subunits DDB1 and DDB2. A search on the Aspergilus nidulans database using a Homo sapiens DDB1 sequence, revealed a single ORF with relevant similarity. The A. nidulans homologue was deleted and named DdbA. ddbA does not have significant similarity to DDB2 protein. In A. nidulans the protein DdbA is involved on the DNA damage repair caused by UV light and 4NQO. Additionaly ddbA is genetically interacting with uvsBATR, histone H2AX and cshBCSB the damage repair caused by MMS , BLEO, 4NQO and UV light. Also, an analysis of the gene ddbA expression indicated that it is induced by MMS, BLEO, 4-NQO, oxidative stressing agents and by the assexual and sexual development processes of A. nidulans. We also verified that the sub-cellular localization of DdbA was not affected by the presence of UV light or 4-NQO indicating that the protein DdbA is constitutively present in the nucleus. In S. pombe, the serine treonine kinases CHK1 and CHK2 proteins were identified as essential to the Sphase blockage in response to the DNA damage or replicational stress. These kinases are phosphorilated by ATR and ATM kinases, respectively and have been extensively characterized in A. nidulans. In this fungus, the proteins ChkACHK1 and ChkBCHK2 are involved on the DNA damage response and are genetically interacting in an epistatic and/or synergistic manner with the AtmAATM and UvsBATR kinases. Our results also sugest that the proteins ChkA and ChkB may also be involved in meiosis and act in a complementary way during the S-phase block. Furthermore the AtmA, ChkA, ChkB e UvsB proteins are complementary redundant for the maintenance of the polar growth in A. nidulans.

As acidemias D-2-hidroxiglutárica e L-2-hidroxiglutárica são duas distintas desordens neurometabólicas bioquimicamente caracterizadas por níveis aumentados dos ácidos D-2-hidroxiglutárico e L-2-hidroxiglutárico em tecidos e fluidos biológicos, respectivamente. Pacientes acometidos pela acidemia D-2-hidroxiglutárica são classificados em duas variantes, a D-2-hidroxiglutárica do tipo I ou a D-2-hidroxiglutárica do tipo II. A acidemia D-2-hidroxiglutárica do tipo I é causada por uma mutação no gene da D-2-hidroxiglutarato desidrogenase enquanto que a acidemia D-2-hidroxiglutárica do tipo II é causada por uma mutação de ganho de função no gene da isocitrato desidrogenase II. A acidemia L-2-hidroxiglutárica é causada por uma mutação no gene da L-2-hidroxiglutarato desidrogenase. Considerando que a fisiopatologia destas doenças não está totalmente elucidada e que muitos estudos têm demonstrado o envolvimento do estresse oxidativo em erros inatos do metabolismo, este trabalho tem por objetivo principal investigar parâmetros de estresse oxidativo e nitrativo na urina de pacientes com acidemia L-2-hidroxiglutárica e o dano ao DNA in vitro causado pelos ácidos acumulados em ambas as patologias, as acidemias D-2-hidroxiglutárica e L-2-hidroxiglutárica, bem como o efeito protetor da L-carnitina sobre o dano. Dessa forma, verificou-se que as concentrações de 50 μM do ácido D-2-hidroxiglutárico e 30 μM do ácido L-2-hidroxiglutárico induzem dano ao DNA e que concentrações de 30 μM e 150 μM de L-carnitina reduzem significativamente in vitro o dano ao DNA, comparado aos controles. Além disso, foram analisadas amostras de urina dos pacientes com acidemia L-2-hidroxiglutárica. Observou-se aumento significativo de espécies de guanina oxidadas, um marcador bioquímico de dano oxidativo ao DNA, bem como um aumento significativo da excreção de di-tirosina, indicando que os pacientes tem dano a proteínas. Entretanto, não houve diferença significativa nos níveis de isoprostanos urinários e nos níveis de espécies reativas do nitrogênio. Esses resultados sugerem, pelo menos em parte, dano oxidativo a proteínas e ao DNA e ressaltam o potencial antioxidante da L-carnitina como um promissor adjuvante no tratamento de pacientes afetados pelas acidemias L-2-hidroxiglutárica ou D-2-hidroxiglutárica. / D-2-hydroxyglutaric and L-2-hydroxyglutaric acidurias are two distinct neurometabolic disorders biochemically characterized by increased levels of D-2-hydroxyglutaric and L-2-hydroxyglutaric acids in biological fluids and tissues, respectively. Patients affected by D-2-hydroxyglutaric aciduria are classified into two variants, D-2-hydroxyglutaric aciduria type I or D-2-hydroxyglutaric aciduria type II. D-2-hydroxyglutaric aciduria type I is caused by mutation of D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase gene while D-2-hydroxyglutaric aciduria type II is caused by a gain of function mutation in isocitrate dehydrogenase 2 gene. L-2-hydroxyglutaric aciduria is caused by mutation in the L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase gene. Considering that the pathophysiology of these diseases is not fully understood and that many studies have been shown the involvement of oxidative stress in inborn errors of metabolism, the main objective of this work was investigate oxidative and nitrative stress parameters in the urine of L-2-hydroxyglutaric aciduria patients and to investigate the in vitro DNA damage caused by the accumulated acids of D-2-hydroxyglutaric and L-2-hydroxyglutaric acidurias as well as the protective effect of L-carnitine on this damage. It has been found that concentrations of 50 μM of D-2-hydroxyglutaric acid and 30 μM of L-2-hydroxyglutaric acid induce DNA damage and concentrations of 30 μM and 150 μM of L-carnitine significantly reduced the in vitro DNA damage compared to controls. In addition, urine samples from L-2-hydroxyglutaric aciduria patients were analyzed. It was observed a significant increase of oxidized guanine species, an oxidative DNA damage biomarker as well as a significant increase of urinary di-tyrosine level, indicating protein oxidative damage in the patients. However, there was no significant difference in the levels of urinary isoprostanes and reactive nitrogen species. These results suggest, at least in part, proteins and DNA oxidative damage and highlight the L-carnitine antioxidant potential as a promising adjuvant in the treatment of patients affected by L-2-hydroxyglutaric or D-2-hydroxyglutaric aciduria.

O Ensaio Cometa (Eletroforese em Gel de Célula Única) foi aplicado ao estudo do potencial genotóxico da β-naftoflavona (BNF) em exposição in vivo a eritrócitos de robalos, Centropomus parallelus. Condições específicas para o ensaio cometa de células de sangue de robalos foram estabelecidas com base em informações obtidas em literatura; e através de experimentos com exposição in vitro a diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio, e com desenrolamento e eletroforese em diferentes alcalinidades e voltagens. Para avaliar o potencial genotóxico da BNF, os peixes foram expostos a 1ppm e 5ppm de BNF por 24, 48 e 72 horas. Controles foram mantidos em água do mar e em água do mar com DMSO, utilizado com solvente. Células de sangue foram coletadas, submetidas a ensaio cometa em versão alcalina de pH>13 e coradas por prata. Os cometas foram analisados por métodos visuais, incluindo Índice de Danos, Porcentagem de Danos e Freqüência de Danos, e através do sistema de análise de imagem ScionImage. Exposições in vitro de eritrócitos a H2O2 resultaram em relação dose-resposta em pH 12,6 e pH>13, indicando aplicabilidade do ensaio a células de sangue de robalos. Exposições in vivo a BNF indicaram tendência a maior Índice de Danos em grupos expostos comparados a controles, porém não ocorreu diferença significativa estatisticamente. A grande amplitude de variação dos dados, em controles e nos demais grupos experimentais, dificultou sua análise e interpretação. / Single Cell Gel Electrophoresis or Comet Assay was applied to study the genotoxic potential of exposure in vivo to β-naphthoflavone (BNF) on erythrocytes of fat snook, Centropomus parallelus. Specific conditions for the comet assay on fat snook blood cells were established based on information obtained from literature together with results of experiments in which slides were exposed in vitro to different concentrations of hydrogen peroxide, submitted to unwinding and electrophoresis at different alkalinity and different voltages. To assess the genotoxic potential of BNF, fish were exposed in vivo to 1ppm and 5ppm of BNF for 24, 48 and 72 hours. Controls were exposed to sea water only and sea water plus DMSO, used as carrier. Blood cells were collected, submitted to alkaline version of comet assay at pH>13 and silver stained. Comets were analyzed by visual methods including Damage Index, Percentage of Damage and Frequency of Damage, and by ScionImage image analysis system. In vitro expositions of erythrocytes to H2O2 resulted in dose-response relationship, at pH 12,6 and pH>13, indicating applicability of the assay to blood cells of fat snook. In vivo exposure to BNF showed a slight tendency towards a higher Damage Index, though not statistically significant, in exposed groups as compared to controls. Wide amplitude of variations of data, in the controls as well as in other experimental groups, made their analysis and interpretation difficult.

A constante exposição dos diferentes organismos a agentes que danificam a estrutura da molécula do DNA fez com que a célula desenvolvesse mecanismos de reparo que se mostraram conservados durante a evolução. Em células de mamíferos, as vias de reparo ao dano ao DNA e a regulação dos pontos de checagem do ciclo celular atuam de forma coordenada no reparo do dano a fim de evitar uma progressão do ciclo celular antes do reparo e uma possível perpetuação do dano. Além disso, alguns dos componentes dessas vias metabólicas também atuam em outros processos, como replicação, transcrição, recombinação meiótica e silenciamento gênico. NER é um importante mecanismo no processo que reconhece e remove dímeros de ciclobutano e 6-4 pirimidina-pirimidona da estrutura do DNA. Em mamíferos foram identificados sete grupos de complementação para células deficientes de XP (XPA-G). Um desses grupos é XPE, conhecido por possuir forte afinidade ao dano ao DNA causado por luz UV, sendo formado por duas subunidades, DDB1 e DDB2. Uma busca no banco de dados de Aspergillus nidulans utilizando uma seqüência DDB1 de Homo sapiens, revelou uma única seqüência com similaridade relevante denominada como DdbA que não possui nenhuma similaridade com a proteína DDB2. Em Aspergillus nidulans, a proteína DdbA também está envolvida no reparo do dano ao DNA causado por luz UV e 4-NQO, no entanto, vimos aqui, que DdbA está interagindo com as proteínas UvsBATR, H2AX e CshBCSB no reparo ao dano ao DNA causado por MMS, Bleomicina, 4-NQO e luz UV. Além disso, uma análise na expressão do gene ddbA mostrou que ele é induzido por estas drogas, no estresse oxidativo e nos processos de desenvolvimento assexual e sexual de A. nidulans. Nós também vimos que a localização celular de DdbA não foi afetada durante a resposta ao dano ao DNA causado por luz UV e 4-NQO indicando que a proteína DdbA está presente no núcleo independentemente do dano. Em S. pombe, as proteínas serina-treonina quinases CHK1 e CHK2 foram identificadas como essenciais para o bloqueio do ciclo celular na fase S em resposta ao dano ao DNA ou em resposta ao estresse replicacional. Essas quinases são fosforiladas pelas quinases ATM e ATR e tem sido extensivamente caracterizadas em A. nidulans. Neste fungo, as proteínas ChkACHK1 e ChkBCHK2 estão envolvidas na reposta ao dano ao DNA e estão interagindo de forma epistática e sinergística com as proteínas quinases AtmAATM e UvsBATR. Nossos resultados também sugerem que as proteínas ChkA e ChkB podem estar envolvidas em meiose, e atuam em vias complementares durante o bloqueio da fase S do ciclo celular. Além disso, as proteínas AtmA, ChkA, ChkB e UvsB são redundantemente complementares na manutenção do crescimento polar das hifas em Aspergillus nidulans. / The constant exposure of different organisms to agents that damage the DNA structure, has provided the cells with repair mechanisms that are conserved during evolution. In mammal cells, the DNA damage repair pathways and the cell cycle checkpoint regulation act together to prevent cell cycle progression before the repair is performed avoiding mutation fixaxion. However these responses are complex and demand overlapping functions and the intersection of many metabolic pathways. NER is an important mechanism in the process that recognize and remove cyclobutane pyrimidine dimers and 6-4 pyrimidine-pyrimidone photoproduct from the DNA structure. In mammals seven complementation groups for XP deficient cells were identified. One of these groups is XPE, known for having strong affinity to the DNA damage caused by UV light and is formed by two subunits DDB1 and DDB2. A search on the Aspergilus nidulans database using a Homo sapiens DDB1 sequence, revealed a single ORF with relevant similarity. The A. nidulans homologue was deleted and named DdbA. ddbA does not have significant similarity to DDB2 protein. In A. nidulans the protein DdbA is involved on the DNA damage repair caused by UV light and 4NQO. Additionaly ddbA is genetically interacting with uvsBATR, histone H2AX and cshBCSB the damage repair caused by MMS , BLEO, 4NQO and UV light. Also, an analysis of the gene ddbA expression indicated that it is induced by MMS, BLEO, 4-NQO, oxidative stressing agents and by the assexual and sexual development processes of A. nidulans. We also verified that the sub-cellular localization of DdbA was not affected by the presence of UV light or 4-NQO indicating that the protein DdbA is constitutively present in the nucleus. In S. pombe, the serine treonine kinases CHK1 and CHK2 proteins were identified as essential to the Sphase blockage in response to the DNA damage or replicational stress. These kinases are phosphorilated by ATR and ATM kinases, respectively and have been extensively characterized in A. nidulans. In this fungus, the proteins ChkACHK1 and ChkBCHK2 are involved on the DNA damage response and are genetically interacting in an epistatic and/or synergistic manner with the AtmAATM and UvsBATR kinases. Our results also sugest that the proteins ChkA and ChkB may also be involved in meiosis and act in a complementary way during the S-phase block. Furthermore the AtmA, ChkA, ChkB e UvsB proteins are complementary redundant for the maintenance of the polar growth in A. nidulans.

Orientador: Claudia Regina Bonini Domingos / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Nicola Amanda Conran Zorzetto / Resumo: A anemia falciforme (AF) é uma anemia hemolítica hereditária que acarreta ao portador manifestações clínicas complexas e diversificadas. Na AF o estresse oxidativo é um dos fatores que interferem no fenótipo do portador, uma vez que influencia nos processos de vaso-oclusão aumentando as propriedades adesivas dos eritrócitos, leucócitos e plaquetas ao endotélio. Durante a transformação do eritrócito discóide com hemoglobina (Hb) S em eritrócito afoiçado, dentre os eventos bioquímicos e polimerizantes da célula, ocorre a degradação oxidativa dessa Hb, com a liberação agentes pró-oxidantes. Estes promovem a oxidação de lipídeos e também de proteínas e DNA, modificando mecanismos celulares que levam a célula a apoptose e, consequentemente, causam danos aos tecidos. Neste contexto, os principais meios de defesa no organismo são divididos em dois grupos, enzimáticos e não enzimáticos. Entre as enzimas detoxificantes de fase II mais estudadas estão as GSTs, que pertencem a uma família multifuncional de enzimas que catalisam a conjugação da molécula de GSH e possuem papel fundamental em mecanismos de defesa contra compostos endo e xenobióticos. Considerando a grande incidência da AF em nosso país e as manifestações clínicas diferenciadas nos portadores, o presente trabalho pretendeu investigar os polimorfismos das GSTs (GSTM1, GSTT1 e GSTP1) e verificar sua influência sob parâmetros oxidativos - peroxidação lipídica por TBARS, e lesão de DNA pela avaliação de Corpos de Howell-Jolly e Ensaio Cometa em portadores da AF. Foram avaliadas amostras de 91 indivíduos com AF com e sem o uso de HU e 99 amostas de um grupo controle. Para o desenvolvimento do trabalho, as amostras foram separadas em três grupos: indivíduos portadores de anemia falciforme em uso de hidroxiureia (AF + HU: 46 indivíduos), indivíduos portadores de anemia falciforme sem uso de hidroxiureia (AF - HU: 45 indivíduos) e o grupo ... / Abstract: Sickle cell anemia (SCA) is an inherited hemolytic disease that leads complex and diverse clinical manifestations. In SCA, oxidative stress is one of the factors that affect the phenotype of the carrier, in response of its influences on vaso-occlusion processes that increases the adhesive properties of erythrocytes, leukocytes and platelets to the endothelium. During the transformation of discoid erythrocytes with hemoglobin (Hb) S into sickle cells, among the biochemical and polymerizing events, the oxidative degradation of this Hb occurs, releasing pro-oxidants agents. They promote oxidation of lipids and proteins and modify cellular mechanisms that lead to cell apoptosis and cause tissue damage. In this context, the main means of body defense are divided in two groups: enzymatic and non-enzymatic. Among the phase II detoxifying enzymes, the most studied are Glutathione S-transferases (GSTs), which belong to a family of multifunctional enzymes that catalyze the combination of the glutathione (GSH) molecule and have a central role in mechanisms of defense against xenobiotic compounds. Considering the high incidence of SCA in our country and the different clinical manifestations in patients, this study aimed to investigate polymorphisms of GSTs (GSTM1 , GSTT1 and GSTP1 ) and determine its influence on oxidative parameters - lipid peroxidation by TBARS and DNA damage by evaluation of Howell -Jolly bodies (HJB) and comet assay in patients with SCA. Samples of 91 patients with SCA with and without hydroxyurea (HU) use and 99 samples of a control group were evaluated. For the work development, the samples were separated into three groups: individuals with sickle cell anemia using hydroxyurea (SCA + HU: 46 individuals), individuals with sickle cell disease without use of hydroxyurea (SCA - HU: 45 individuals) and control group (CG: 99 individuals) to verify the influence of medication on the evaluated parameters. Only the genotypic profile ... / Mestre

O crack é um subproduto da cocaína obtido a partir da pasta de coca acrescida do bicarbonato de sódio, sendo comercializado na forma de pequenas pedras porosas. No Brasil, o consumo de crack tem sido alvo de grande preocupação devido sua expressiva expansão em várias regiões, sendo que o aumento da prevalência do seu consumo vem sendo amplamente documentado nos últimos anos. A dependência de crack é a causa mais prevalente de internação por uso de cocaína. Há uma necessidade imediata de estudos que se direcionem para esta população. A presente pesquisa pretende demonstrar evidências capazes de contribuir para o entendimento dos mecanismos envolvidos na ação do psicotrópico crack sobre o DNA, bem como oferecer dados que auxiliem no desenvolvimento de tratamentos para pacientes usuários abusivos desta droga. Este estudo teve como objetivo avaliar o dano ao DNA e a capacidade de reparo, em 31 indivíduos usuários ativos de crack, relacionando-os com um grupo controle com 40 participantes. O trabalho foi desenvolvido através de voluntários recém internados na Clínica Marcelo Campos em São Leopoldo. Foram coletadas amostras em três momentos (internação, 48h após e ao término do tratamento) e submetidas às técnicas de micronúcleo e cometa. Dentre os resultados desta avaliação, foram evidenciados índices de dano significativamente diferentes entre os grupos nas técnicas de micronúcleos e cometa, e entre os períodos de coleta na técnica de cometa. Os valores obtidos para o índice de dano de DNA da técnica do cometa nos três momentos de avaliação revelaram uma diminuição estatisticamente significativa apenas após o término do tratamento. Em relação à utilização concomitante de outras substâncias, o consumo de tabaco ocorreu em 68% dos indivíduos, maconha em 71% e cocaína em 32%, sendo que 19% faziam uso concomitante de todas as drogas mencionadas. Houve correlação com o tempo de uso do tabaco e o índice de dano (P=0,043), MN (P=0,017) e NBP (P=0,023) em determinados momentos. O consumo de álcool ocorreu em 61,29% dos participantes, não havendo correlação estatisticamente significativa com os marcadores de dano. A idade e o tempo de utilização do crack não apresentaram associação ao índice de dano. Houve associação significativa entre o consumo de chimarrão (Ilex paraguaiensis) e MN (P= 0,045). Estudos associando o crack com dano ao DNA são, ainda, escassos. Este trabalho buscou acrescentar informações quanto ao potencial danoso desta substância. / Crack is a by-product of cocaine resulting from the addition of sodium bicarbonate to cocaine base paste, being sold in the form of small, porous rocks. In Brazil, the consumption of crack has been the subject of great concern due to its significant expansion in various regions, thus the increasing prevalence of drug use has been documented in recent years. The dependence of crack is the most prevalent cause of hospitalization due to cocaine use, supporting an immediate need for studies to target this population. This research aims to demonstrate evidence that can contribute to the understanding of the mechanisms involved in the action of psychotropic Crack on DNA, as well as provide data to assist in development of treatments for patients who are drug abusers. This study aimed to assess the damage and DNA repair capacity in 31 individuals who are active users of crack, comparing them to a control group of 40 participants. The study was conducted by volunteers newly admitted to the Clinic Marcelo Campos in São Leopoldo. Samples were collected at three time points (at admission, 48 hours latter and at the end of treatment) and subjected to the comet and micronucleus techniques. Among the results of this assessment damage indices were evident and significantly different between groups in the comet and micronucleus techniques, and between sampling periods for the comet technique. The values obtained for the rate of DNA damage in the comet technique in all three time points revealed a statistically significant decrease only after the end of treatment. Regarding the concomitant use of other substances, no significant association was found with the results. Tobacco consumption occurred in 68% of subjects, marijuana in 71% and cocaine in 32%, being 19% users of all drugs mentioned. There was a correlation over time of tobacco use and the damage index (P = 0.043), MN (P = 0.017) and NBP (P = 0.023) at certain time points.. Alcohol consumption occurred in 61.29% of the participants, there was no statistically significant correlation with markers of damage.The age and duration of use were not associated to the crack damage index. There was a significant association between the consumption of yerba mate (Ilex paraguaiensis) and MN. (P = 0.045). Studies associating the crack with DNA damage are still scarce. This study brings additional information about the potential harmful of substance.

A doença de Gaucher (DG) é uma doença de armazenamento lisossômico causada por uma mutação no gene que codifica a enzima β-glicosidase, a deficiência dessa enzima provoca o acúmulo de glicosilceramidas nos lisossomos do sistema retículo endotelial. A DG é divididas em três tipos, o tipo I é a forma mais branda e mais prevalente da doença. As consequências desta doença incluem hepatoesplenomegalia, deficiências ósseas, manifestações hematológicas e neurodegeneração, porém os mecanismos fisiopatológicos ainda não estão totalmente esclarecidos. Portanto, a fim de esclarecer a fisiopatologia envolvida na DG, o presente estudo avaliou a produção de espécies reativas de oxigênio, as atividades da superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase, os níveis de nitritos, os imunoconteúdos de iNOS e de pNF-kB, os danos ao DNA e o conteúdo sulfidrilas em diferentes componentes da sangue de indivíduos afetados. Os pacientes foram divididos em dois grupos: controles com diagnóstico negativo para DG e pacientes diagnosticados com DG tipo I, tratados com terapia de reposição enzimática. O sangue foi coletado 5 minutos antes do tratamento. Os resultados mostraram que a atividade de superóxido dismutase foi reduzida em eritrócitos, enquanto atividade da glutationa peroxidase foi aumentada no plasma de pacientes com DG. Os níveis de nitritos e o imunoconteúdo pNF-kB estavam significativamente aumentados no plasma e leucócitos, respectivamente. Ensaio do cometa foi realizada no sangue total e indicou danos no DNA. Observou-se também um dano oxidativo a proteínas, devido a redução do conteúdo sulfidrilas em plasma e eritrócitos. Nossos resultados sugerem que pacientes com DG, mesmo em tratamento, apresentam alteração no status oxidativo/nitrativo e parâmetros inflamatórios, bem como evidências de danos ao DNA no sangue, o que poderia ser, pelo menos em parte, associado à fisiopatologia da DG. / Gaucher disease (GD) is a lysosomal storage disorder caused by a mutation in the gene encoding β-glucosidase enzyme, this enzyme deficiency leads to glucosylceramides accumulation in the lysosomes of the reticulum endothelial system. GD divided into three types, where in type I is the mildest and most prevalent form of disease. The consequences of this disease include hepatosplenomegaly, bone impairments, hematologic manifestations and neurodegeneration, but pathophysiology mechanisms are still not well elucidated. Therefore, in order to clarify the pathophysiology involved in GD, the present study evaluated reactive oxygen species production, superoxide dismutase, catalase and gluthatione peroxidase activities, nitrite levels, immunocontent of iNOS and pNF-κB, DNA damage and sulfhydryl content in differents components of blood from affected individuals.Patients were divided into two groups: controls with negative diagnosis to GD and patients diagnosed to GD type I treated with enzyme replacement therapy. Blood were collected 5 minutes before the treatment. Results showed that superoxide dismutase activity was reduced in erythrocytes while gluthatione peroxidase activity was increased in plasma of GD patients. Nitrite levels and pNF-κB immunocontent were significantly increased in plasma and leukocytes, respectively. Comet assay was performed in whole blood and indicated DNA damage. We also observed an oxidative damage to proteins elicited by decreased sulfhydryl content in plasma and erythrocytes. Our findings suggest that patients with GD, even in treatment, have altered oxidative/nitrative status and inflammatory parameters, as well as evidence of DNA damage in blood, what could be at least in part, associated with pathophysiology of GD.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-27 / Objetivos:Avaliar o efeito da varicocele na integridade do DNA nuclear,na atividade mitocondrial,na peroxidação lipídica e na integridade acrossômica dos espermatozóides.Métodos:as amostras foram obtidas e analisadas de acordo com os parâmetros da OMS(1999) e morfologia segundo critério estrito de Kruger.O grupo de estudo incluiu 30 homens com varicocele grauII ou III e o grupo controle incluiu 32 homens sem varicocele.A integridade do DNA nuclear dos espermatozóides foi avaliada pelo ensaio Cometa alcalino, e as células foram classificadas de acordo com a intensidade de dano no DNA:grau I(alta integridade do DNA),grau II(DNA ainda íntegro ou em início de fragmentação),grau III(DNA moderadamente fragmentado)e grau IV(DNA altamente fragmentado).A atividade mitocondrial foi avaliada pelo método colorimétrico proposto por Hrudka(1987),e as células foram classificadas em:classe I(mitocôndrias todas ativas),classe II (mais de 50 por cento de mitocôndrias ativas),classe III(menos de 50 por cento de mitocôndrias ativas)e classe IV(mitocôndrias todas inativas).A peroxidação lipídica foi determinada usando-se o método descrito por Ohkawa(1979),que se baseia na determinação de MDA devido à sua reação com o TBA, e o nível de peroxidação lipídica foi descrito em nanogramas de TBARS/mL de sêmen.A integridade do acrossoma foi avaliada através da sonda fluorescente PNA(Peannut Agglutinin)-FITC (Fluorescein isothiocyanite)conjugada, e o resultado foi expresso em porcentagem de espermatozóides com acrossoma íntegro.Resultados: quanto à integridade do DNA,o grupo de homens com varicocele apresentou uma menor porcentagem de espermatozóides com DNA nuclear íntegro(grau II, p=0,040).Não houve diferença na porcentagem de células grau I,III e IV.Quanto à atividade mitocondrial, o grupo de homens com varicocele apresentou uma porcentagem maior de espermatozóides com mitocôndrias inativas(classe III, p=0,020)e uma porcentagem menor de espermatozóides com mitocôndrias ativas(classe I, p=0,005).Não houve diferença na porcentagem de células classe II e IV.Quanto à integridade acrossômica, o grupo de homens com varicocele apresentou uma menor porcentagem de espermatozóides com acrossoma íntegro(p=0,0002).Por fim, com relação ao nível de peroxidação lipídica,não foi encontrada nenhuma diferença estatisticamente significante entre os grupos com e sem varicocele.Conclusões: Neste estudo, homens com varicocele apresentaram um aumento nas taxas de fragmentação de DNA e uma redução na atividade mitocondrial e na integridade acrossômica dos espermatozóides.Todavia, nenhuma diferença entre os níveis seminais de MDA foi encontrada, o que sugere que talvez as alterações funcionais encontradas não estejam associadas diretamente com o estresse oxidativo, ou que o estresse oxidativo leve a alterações no DNA, mitocôndrias e acrossoma durante a espermatogênese, e não após a ejaculação / Objectives: to assess the effect of varicocele on sperm nuclear DNA integrity, mitochondrial activity, lipid peroxidation and acrosome integrity. Methods: semen samples were obtained and analyzed according to the World Health Organization guidelines (1999) and sperm morphology was evaluated by Kruger’s strict criteria (1986). The study group included 30 men with varicocele grades II or III and the control group included 32 men without varicocele. Sperm nuclear DNA integrity was assessed by the alkaline Comet assay, and cells were graded according to the intensity of DNA damage: class I (high DNA integrity), class II (DNA still intact or initiating fragmentation), class III (DNA fairly fragmented) and class IV (DNA extremely fragmented). Mitochondrial activity was evaluated by the colorimetric method proposed by Hrudka (1987). Cells were classified according to the proportion of active mitochondria: class I (100% of active mitochondria), class II (more than 50% of active mitochondria), class III (less than 50% of active mitochondria) and class IV (100% of inactive mitochondria). Lipid peroxidation was determinated by Ohkawa’s method, which is based on the measurement of malondialdehyde (MDA) due to its reaction with thiobarbituric acid (TBA), and the levels of lipid peroxidation were described as nanograms of TBARS/mL. Acrosome integrity was assessed by use of the conjugated fluorescent probe PNA-FITC and the results were expressed in percentages of intact acrosomes (fluorescence was observed over the entire acrosomal region of the sperm head). Results: Concerning DNA integrity, the varicocele group showed less spermatozoa with intact nuclear DNA (grade II, p=0,040). There was no significant difference in classes I, III and IV between the two groups. Regarding mitochondrial activity the varicocele group showed more cells with inactive mitochondria (class III, p=0,001) and less cells with active mitochondria (class I, p=0,005). There was no difference in classes II and IV. Also, the varicocele group showed less spermatozoa with intact acrosomes (p=0,0002), when compared to the controls. Finally, no significant differences were observed in lipid peroxidation levels. Conclusions: This study was able to demonstrate that varicocele in adults is associated with increased DNA fragmentation, reduced mitochondrial activity and decreased acrosome integrity even when semen quality does not differ from men without varicocele. However, levels of seminal products of lipid degradation (MDA) are not increased in these patients, suggesting that perhaps the functional changes found are not directly associated with oxidative stress, or that oxidative stress leads to changes in DNA, acrosomes and mitochondria during spermatogenesis, and not after ejaculation. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações