Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-02-07T18:54:08Z No. of bitstreams: 1 Micely D`el-Rei Hermida... Transporte de Leishmania do sitio.pdf: 12642864 bytes, checksum: 1f1b3fd2c8676340857d3b59f352212d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-07T18:54:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Micely D`el-Rei Hermida... Transporte de Leishmania do sitio.pdf: 12642864 bytes, checksum: 1f1b3fd2c8676340857d3b59f352212d (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina. Salvador, BA, Brasil / A infecção por Leishmania modula a função de integrinas em fagócitos inflamatórios, afetando a migração celular e disseminação do parasito. O conhecimento sobre as populações de fagócitos capazes de transportar Leishmania ou fragmentos de parasitos mortos, e os mecanismos de disseminação da Leishmania do sítio de infecção para os diferentes tecidos ainda está incompleto. Nesse trabalho, nós adaptamos um modelo de migração de células in vivo para estudar o efeito da infecção parasitária na capacidade das diferentes populações de fagócitos mononucleares de migrar do sítio inflamatório para o linfonodo drenante e para estudar a cinética de disseminação da Leishmania através do sistema linfático. Inicialmente, nós usamos um modelo de peritonite crônica induzida por tioglicolato para identificar populações de fagócitos inflamatórios susceptíveis a infecção por Leishmania e suas possíveis alterações na migração após a infecção. Células peritoneais estimuladas por tioglicolato coletadas de animais Ly5.1+, não infectadas ou infectadas por Leishmania, foram injetadas na cavidade peritoneal de animais Ly5.1- e as diferentes populações de fagócitos foram rastreadas no linfonodo drenante. Células migrantes corresponderam no linfonodo 1% dos leucócitos injetados. Em animais injetados com células peritoneais cultivadas somente com meio, 28-90% das células migrantes eram células dendríticas mielóides e 30-74% eram macrófagos. No grupo de animais injetados com células do exsudato peritoneal co-cultivadas com Leishmania, 9-65% das células migrantes eram células dendríticas mielóides e 20-69% eram macrófagos. Somente a migração da célula dendríticas foi consistentemente diminuída após a co-incubação Leishmania. Em seguida, nós determinamos a cinética de disseminação do parasito do sítio inflamatório para o linfonodo drenante e sistemicamente. Promastigotas de L. amazonensis foram injetadas na cavidade peritoneal de camundongos e depois de 15min e 30min; 1h, 2h, 4h, 6h, 12h e 24h amostras de fagócitos peritoneais, linfonodo, baço e pulmão foram cultivados para isolamento de Leishmania. Culturas de fagócitos peritoneais e células do linfonodo ficaram positivas após 15min a 6h da infecção. Parasitos foram detectados em culturas de células esplênicas de 15min a 1h após a infecção. Cultura de células do pulmão foram positivas 1h após a infecção ou, menos consistentemente, 15min e 30min após a inoculação. Parasitos na forma promastigota foram identificados no linfonodo drenante. Nossos dados mostraram que: (1) Uma variedade de fagócitos são capazes de migrar do sítio inflamatório para o linfonodo drenante. (2) Populações de células dendríticas infectadas por Leishmania parecem estar retidas no sítio inflamatório. (3) Os mecanismos de disseminação da Leishmania da cavidade peritoneal para o linfonodo ocorre em menos de 15 minutos após a injeção. (4) O trânsito para a corrente sanguínea ocorre nas primeiras horas após a infecção. Nossos dados também sugerem que mesmo antes do tempo requerido para alterações nas populações de células inflamatórias ocorra no sítio inflamatório, parasitos de Leishmania e seus antígenos podem chegar ao linfonodo drenante. / Leishmania infection modulates integrin function in inflammatory phagocytes, affecting cell migration and parasite dissemination. The knowledge on the phagocyte populations capable of transporting Leishmania or fragments of dead parasites, and the mechanisms of Leishmania dissemination from the infection site to the different tissues is still incomplete. In this work, we adapted a model of cell migration in vivo to study the effect of parasite infection upon the ability of different mononuclear phagocyte populations to migrate from the inflammatory site to the draining lymph node and to study the kinetics of Leishmania dissemination through the lymphatic system. First, we used a model of chronic peritonitis induced by thioglycollate to identify inflammatory phagocytes populations susceptible to Leishmania infection and the potential changes in their migratory patterns after infection. Uninfected and Leishmania-infected, thioglycollate-elicited peritoneal exudate cells from Ly5.1+ mice were injected into the peritoneal cavity of Ly5.1- mice, and the different phagocyte populations were tracked to the draining lymph node. Migrating cells corresponded 1% of the injected leukocytes. In the animals injected with peritoneal cells cultivated with medium alone, 28-90% of the migrating cells were myeloid dendritic cells and 30-74% were macrophages. In the group of animals injected with peritoneal exudate cells co-cultivated with Leishmania, 9-65% of the migrating cells were myeloid dendritic cells and 20-69% were macrophages. Only dendritic cell migration was consistently decreased after co-incubation with Leishmania. Afterwards, we determined the kinetic of parasite dissemination from the inflammatory site to the draining lymph node and systemically. L. amazonensis promastigotes were injected into BALB/c mice peritoneal cavity and after 15min and 30min; 1h, 2h, 4h, 6h, 12h and 24h samples of peritoneal phagocytes, lymph nodes, spleen and lungs were cultivated for Leishmania isolation. Peritoneal phagocytes and lymph nodes were positive after 15min to 6h of infection. Parasites were detected in splenic cells cultures 15min to 1h after infection. Lungs cultures were positive after 1h of infection or, less consistently, 15min and 30min after inoculation. Labeled parasites were identified in the draining lymph nodes. Our data show that: (1) A variety of phagocytes are able to migrate from the inflammatory site to the draining lymph node. (2) Populations of Leishmania-infected dendritic cells appear to be retained in the inflammatory site. (3) The mechanisms of Leishmania dissemination from peritoneal cavity to the lymph node occur in less than 15 minutes after injection. (4) The transit to bloodstream occurs in the first hour of infection. Our data also suggest that even before the time required for deep changes in inflammatory cell population takes place in the inflammatory site, Leishmania parasites and their antigens can reach the draining lymph node.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-07-23Bitstream added on 2014-06-13T18:30:24Z : No. of bitstreams: 1 tansini_a_me_arafcf.pdf: 1446439 bytes, checksum: 2d298f3950fa8afa956b4ee972cd76f4 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A infecção por Y. pseudotuberculosis é a causa de doenças intestinais e extraintestinais. A resolução da infecção está relacionada com a ativação de células Th1. Macrófagos e células dendríticas são capazes de orientar a resposta imune adaptativa através da produção de citocinas e apresentação de antígenos às células T. Estas células metabolizam L-arginina por duas vias, utilizando as enzimas iNOS ou arginase. O metabolismo de L-arginina é um importante parâmetro para discriminar o estado de ativação destas células. O objetivo deste estudo foi verificar a influência da infecção por Y. pseudotuberculosis sobre o comportamento de macrófagos e células dendríticas de camundongos resistentes (C57BL/6) e suscetíveis (BALB/c). Macrófagos peritoneais e células dendríticas esplênicas foram obtidos em 12 horas, 1º, 3º e 5º dias pós-infecção, cultivados, e foi determinada a produção de NO, atividade da arginase, produção de citocinas e capacidade imunoestimulatória destas células. Durante a infecção, macrófagos e células dendríticas de camundongos C57BL/6 infectados produziram quantidade maiores de NO, IL-12 e TNF- , enquanto as células de camundongos BALB/c infectados apresentaram maior atividade da arginase e produção de IL-10. A infecção provocou uma diminuição na capacidade de estimulação de macrófagos e células dendríticas, com menor proliferação de células T nos camundongos BALB/c. Estes resultados sugerem que os mecanismos responsáveis pela resistência e suscetibilidade à infecção podem estar relacionados com diferenças no estado de ativação de macrófagos e células dendríticas. / Y. pseudotuberculosis infection is the cause of intestinal or extraintestinal diseases. The resolution of infection is connected with activation of Th1 cells. Macrophages and dendritic cells are able to orient the adaptive immune response through the production of cytokines and antigen presentation to T-cells. These cells metabolize L-arginine by two pathways, using the iNOS or arginase enzymes. L-arginine metabolism is an important parameter to discriminate the activate state of these cells. The objective of this study was to verify the influence of Y. pseudotuberculosis infection on the behavior of macrophages and dendritic cells from susceptible (BALB/c) and resistant (C57BL/6) mice. Peritoneal macrophages and splenic dendritic cells were obtained on the 12 h, 1st, 3rd, 5th day post-infection, cultured, and the NO production, arginase activity, cytokines production and immunostimulatory capacity of these cells was determined. During the infection, macrophages and dendritic cells from infected C57BL/6 mice produced higher amounts of NO, IL-12 and TNF- , while the cells from infected BALB/c mice presented higher arginase activity and IL-10 production. The infection leads to a decrease in the immunostimulatory capacity of macrophages and dendritic cells, with T-cell proliferation smaller in the BALB/c mice. These results suggest that mechanisms responsible for the resistance and susceptibility to infection may be connect with differences in the activation state of macrophages and dendritic cells.

abstract: Combination therapy has shown to improve success for cancer treatment. Oncolytic virotherapy is cancer treatment that uses engineered viruses to specifically infect and kill cancer cells, without harming healthy cells. Immunotherapy boosts the body's natural defenses towards cancer. The combination of oncolytic virotherapy and immunotherapy is explored through deterministic systems of nonlinear differential equations, constructed to match experimental data for murine melanoma. Mathematical analysis was done in order to gain insight on the relationship between cancer, viruses and immune response. One extension of the model focuses on clinical needs, with the underlying goal to seek optimal treatment regimens; for both frequency and dose quantity. The models in this work were first used to estimate parameters from preclinical experimental data, to identify biologically realistic parameter values. Insight gained from the mathematical analysis in the first model, allowed for numerical analysis to explore optimal treatment regimens of combination oncolytic virotherapy and dendritic vaccinations. Permutations accounting for treatment scheduled were done to find regimens that reduce tumor size. Observations from the produced data lead to in silico exploration of immune-viral interactions. Results suggest under optimal settings, combination treatment works better than monotherapy of either type. The most optimal result suggests treatment over a longer period of time, with fractioned doses, while reducing the total dendritic vaccination quantity, and maintaining the maximum virotherapy used in the experimental work. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Applied Mathematics for the Life and Social Sciences 2016

Orientador: Beatriz Maria Machado de Medeiros / Banca: Angela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Iracilda Zeppone Carlos / Resumo: A infecção por Y. pseudotuberculosis é a causa de doenças intestinais e extraintestinais. A resolução da infecção está relacionada com a ativação de células Th1. Macrófagos e células dendríticas são capazes de orientar a resposta imune adaptativa através da produção de citocinas e apresentação de antígenos às células T. Estas células metabolizam L-arginina por duas vias, utilizando as enzimas iNOS ou arginase. O metabolismo de L-arginina é um importante parâmetro para discriminar o estado de ativação destas células. O objetivo deste estudo foi verificar a influência da infecção por Y. pseudotuberculosis sobre o comportamento de macrófagos e células dendríticas de camundongos resistentes (C57BL/6) e suscetíveis (BALB/c). Macrófagos peritoneais e células dendríticas esplênicas foram obtidos em 12 horas, 1º, 3º e 5º dias pós-infecção, cultivados, e foi determinada a produção de NO, atividade da arginase, produção de citocinas e capacidade imunoestimulatória destas células. Durante a infecção, macrófagos e células dendríticas de camundongos C57BL/6 infectados produziram quantidade maiores de NO, IL-12 e TNF- , enquanto as células de camundongos BALB/c infectados apresentaram maior atividade da arginase e produção de IL-10. A infecção provocou uma diminuição na capacidade de estimulação de macrófagos e células dendríticas, com menor proliferação de células T nos camundongos BALB/c. Estes resultados sugerem que os mecanismos responsáveis pela resistência e suscetibilidade à infecção podem estar relacionados com diferenças no estado de ativação de macrófagos e células dendríticas. / Abstract: Y. pseudotuberculosis infection is the cause of intestinal or extraintestinal diseases. The resolution of infection is connected with activation of Th1 cells. Macrophages and dendritic cells are able to orient the adaptive immune response through the production of cytokines and antigen presentation to T-cells. These cells metabolize L-arginine by two pathways, using the iNOS or arginase enzymes. L-arginine metabolism is an important parameter to discriminate the activate state of these cells. The objective of this study was to verify the influence of Y. pseudotuberculosis infection on the behavior of macrophages and dendritic cells from susceptible (BALB/c) and resistant (C57BL/6) mice. Peritoneal macrophages and splenic dendritic cells were obtained on the 12 h, 1st, 3rd, 5th day post-infection, cultured, and the NO production, arginase activity, cytokines production and immunostimulatory capacity of these cells was determined. During the infection, macrophages and dendritic cells from infected C57BL/6 mice produced higher amounts of NO, IL-12 and TNF- , while the cells from infected BALB/c mice presented higher arginase activity and IL-10 production. The infection leads to a decrease in the immunostimulatory capacity of macrophages and dendritic cells, with T-cell proliferation smaller in the BALB/c mice. These results suggest that mechanisms responsible for the resistance and susceptibility to infection may be connect with differences in the activation state of macrophages and dendritic cells. / Mestre

Interaction between mouse dendritic cells (DCs) and Borrelia afzelii spichochetes was studied on three different levels: phagocytosis of borrelia by DCs, production of cytokines by borrelia-activated DCs and the ablilty of DCs to activate CD4+ T cells. The effect of Ixodes ricinus saliva on each of these levels was examined. Tick saliva was shown to decrease the number of phagocosing DCs. The ability of borrelia-activated DCs to induce both proliferation and IL-2 production in specific CD4+ T cells was significantly reduced by tick saliva. And surprisingly, we have shown an inhibitory effect of I. ricinus saliva on the production of both Th1 (IL-6 and TNF-{$\alpha$}) and Th2 (IL-10) cytokines. Our data reveal a complex inhibitory effect of tick saliva on DC function.

Células dendríticas (DCs) são as responsáveis por orquestrar a resposta imunológica adaptativa através da estimulação de células T. Na imunoterapia do câncer, as DCs são um dos principais alvos de estimulação. Entretanto a maturação anormal destas pode interferir no resultado final da resposta imune. Neste estudo, analisaram-se os efeitos causados pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) na maturação de DCs. Nas DCs maturadas em presença de VEGF, utilizando-se citoquímica, constatou-se alterações morfológicas, como número reduzido de dendritos e citoplasma basofílico; a análise de expressão gênica global por microarranjos de DNA mostrou grande variação da expressão de genes relacionados com adesão celular e citoesqueleto. Na avaliação funcional verificou-se redução da capacidade das DCs de ativar linfócitos. Juntos esses resultados sugerem que células expostas ao VEGF seriam menos especializadas. A compreensão do impacto do VEGF em mecanismos de maturação celular contribui para o entendimento da supressão imunológica nos tumores que secretam VEGF. / Dendritic cells (DCs) are in charge of orchestrating the adaptive immune response through T cells activation. DCs are the main target in cancer cell immunotherapy. However, DCs inadequate maturation interferes in the outcome of the immune response. In this study, were analyzed the effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) on DCs maturation. DCs matured in the presence of VEGF, showed morphologic alterations such as reduced number of dendrites and basophilic cytoplasm by cytochemistry. Global gene expression assessed by DNA microarrays demonstrated broad variation in the expression of cell adhesion and cytoskeleton regulation-related genes. Functional studies detected the reduced capacity of VEGF-exposed DCs in the activation of lymphocytes. All together these results suggest that cells exposed to VEGF are less differentiated, a possible mechanism involved in the immune suppression caused by VEGF secreting tumors.

A descoberta de novos alvos terapêuticos capazes de reverter o efeito tumoral imunossupressor sobre as células dendríticas (DCs) é de grande relevância clínica. Identificamos que monócitos de pacientes com leucemia linfóide crônica (LLC) têm alterações na sinalização de STAT6 induzida por IL-4 que previne a maturação fenotípico-funcional das DCs. Embora os monócitos dos pacientes apresentem alta expressão de IL-4R, a atividade de STAT6 está inibida devido aos elevados níveis de SOCS5. IL-10 reproduz esta desregulação de STAT6/SOCS5 nos monócitos de doadores saudáveis, causando diferenciação defeituosa das DCs. Isso indica que SOCS5 está envolvida nas alterações das DCs de pacientes. Ainda, encontramos que a inibição de STAT3 com pirimetamina, um composto em ensaio clínico para LLC, não afeta a maturação das DCs, diferentemente da inibição de STAT5 por JQ1. Isso mostra que STAT5 é importante para a maturação das DCs, e sugere que a JQ1, mas não a pirimetamina, pode causar imunossupressão. Já SOCS5 pode ser um novo potencial alvo para terapia do câncer. / Discovery of new targets to reverse tumor immunosuppression on dendritic cells (DCs) hold great therapeutic promise. Here, we identify that monocytes from chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients have alteration in IL-4-induced STAT6 signaling that prevents DCs phenotypic and functional maturation. Although patients monocytes display high IL-4R expression, STAT6 activity is inhibited because of elevated SOCS5 levels. IL-10-treatment of healthy donors monocytes reproduces this altered mechanism (STAT6/SOCS5) and leads to a defective DC differentiation. These findings indicate that a high SOCS5 level is involved on CLL-DCs impaired function. Moreover, we find that pharmacologic inhibition of STAT3 by pyrimethamine, a clinical trial compound for CLL, does not affect LPS-induced DCs maturation while STAT5 inhibition by JQ1 prevents it. Our findings show that STAT5 is important for DCs maturation, and suggest that JQ1, but not pyrimetamine, can cause immunosuppression. Additionally, SOCS5 emerges as a new potential target for cancer treatment.

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença crônica e potencialmente fatal causada, no Brasil, pelo protozoário Leishmania infantum. A resistência à LV é relacionada ao desenvolvimento de uma resposta imune celular eficiente. Para isso, células dendríticas (DCs) reconhecem produtos antigênicos do parasito, através dos Toll-like Receptors (TLRs), e, após ativação, produzem fatores, que irão orquestrar o recrutamento celular e desenvolvimento da resposta imune protetora. Dentre os vários TLRs, tem sido demonstrado que o TLR9 está relacionado com a resistência à infecção em modelo de leishmaniose cutânea. No presente estudo, nosso objetivo foi determinar o papel do TLR9 durante a infecção por L. infantum. Nossos resultados demonstram que a expressão de TLR9 é modulada positivamente durante a infecção in vivo e in vitro pela L. infantum. O TLR9 é essencial para o controle da infecção contra L. infantum, uma vez que camundongos TLR9-/- são mais susceptíveis à infecção, apresentando maior número de parasitos no baço e fígado na 4ª e 6ª semana pós-infecção. A fenotipagem de leucócitos presente no baço demonstrou que camundongos TLR9-/- possuem menor número de neutrófilos. De maneira semelhante, a análise imuno-histoquímica mostrou uma reduzida marcação de células 7/4+ (específica para neutrófilos) no fígado de animais TLR9-/-. A falha na migração de neutrófilos observada em animais TLR9-/- não está associada a uma incapacidade de ativação dos polimorfonucleares, mas sim a deficiências na produção de fatores quimiotáticos, como CXCL1 (KC) e CXCL2 (MIP-2) nos órgãos-alvo. Investigando o mecanismo de ação, as células dendríticas oriundas de animais TLR9-/- falham em seu processo de ativação frente à infecção in vitro e in vivo com L. infantum, apresentando um fenótipo semi-maduro, com redução de expressão de MHC-II e moléculas coestimuladoras. Interessante que essas células apresentaram deficiência na produção de mediadores quimiotáticos de neutrófilos como KC e MIP-2, e consequentemente, induzindo o menor recrutamento de neutrófilos in vitro. Em conjunto, nossos resultados demonstram que o TLR9 é essencial para o controle da infecção por L. infantum, através de um mecanismo dependente do recrutamento de neutrófilos para o sítio inflamatório mediado pela ativação apropriada de fatores quimiotáticos de neutrófilos pelas DCs. / Visceral leishmaniasis (VL) is a chronic and potentially fatal disease caused by protozoan Leishmania infantum, in Brazil. The resistance against VL is related to the development of cellular immune response. During infection, the dendritic cells (DCs) recognize antigenic products through Toll-like Receptors (TLRs) and then orchestrate the cellular recruitment and immune response development. Among several TLRs, it has been showed that TLR9 is related to resistance to cutaneous leishmaniasis. In the present study, our aim was to determinate the role of TLR9 during L. infantum infection. Our results demonstrated that TLR9 is up regulated during in vitro and in vivo L. infantum infection. TLR9 is critical for protective immunity against L. infantum, since TLR9-/- mice infected were more susceptible to infection, displaying high amounts of parasites in spleen and liver, at 4th and 6th weeks post-infection. Phenotyping the leukocytes into the spleen, TLR9-/- mice presented reduced neutrophils when compared to WT. Likewise, imunohistochemistry analyses showed the reduced of 7/4+ cells (specific to neutrophils) staining into the TLR-9-/- liver. The failure of neutrophil migration is not associated to their stage of activation impaired, but due the reduced levels of CXCL1 (KC) and CXCL2 (MIP-2) (neutrophil chemoatracttant) produced into into the spleen cells culture from infected TLR9-/-. Furthermore, DCs from TLR9-/- presented a semi-mature stage during in vitro and in vivo L. infantum infection, showing reduced expression of MHC-II and co-stimulatory molecule. Interestingly, the ability of DC to produce the neutrophil chemotact mediators (KC and MIP-2) was completely reduced by that derived from TLR9-/- mice, affecting neutrophil migration into Boyden chamber. Altogether, we demonstrated that TLR9 presents a critical role in the protective response against L.infantu through the mechanism dependent of crosstalk between neutrophil recruitment and DC activation.

Orientador: Leonilda Maria Barbosa dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T01:42:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Longhini_AnaLedaFigueiredo_D.pdf: 9031331 bytes, checksum: 8341cfb783e3d43620c305cd18937b1e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: No presente estudo demonstramos a ativação de mecanismos imunosupressores em células dendríticas plasmocitóides (pDCs) e linfócitos B pela ação do agonista de TLR-9, ODN-CpG no modelo de estudo da esclerose múltipla (EM) e na encefalomielite experimental autoimune (EAE). A EAE é o modelo experimental da esclerose múltipla. Nossos resultados demonstram que a administração in vivo de ODN-CpG reduz significativamente a gravidade de EAE. A redução da doença foi acompanhada pela diminuição da resposta proliferativa dos linfócitos encefalitogênicos e consequentemente a infiltração dessas células no sistema nervoso central. A diminuição da resposta proliferativa parece ser devido ao efeito imunoregulador das pDCs, uma vez que a depleção dessas células faz com que a resposta proliferativa retorne aos níveis normais. O tratamento com ODN-CpG induziu a expressão da enzima indoleamine 2,3 dioxigenase pelas pDCs. Essa enzima está relacionada à geração de células T reguladoras. De fato nossos resultados mostraram um aumento da porcentagem de células T CD4+CD25+ e da expressão das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e TGF-b no grupo tratado. Adicionalmente, a transferência de pDCs ativadas isoladas é capaz de reduzir a gravidade da doença. Além das pDCs, os linfócitos B também expressam TLR-9 e podem ser ativados pelo tratamento com CpG, de fato, embora o número de células não difira do controle não tratado, a transferência de linfócitos B de animais tratados com CpG é capaz de diminuir a gravidade da doença. O efeito supressor dos linfócitos B pode ser atribuído à expressão de IL-10 nos animais tratados. Em paralelo, nós demonstramos um aumento na porcentagem de pDCs em líquido cefalorraquidiano de pacientes com EM durante a fase de surto da doença quando comparados com pacientes em remissão ou com outras doenças neurológicas não inflamatórias. Nossos resultados indicam que elas podem estar envolvidas tanto com a piora da doença, o que poderia ser explicado por uma infecção viral, ou pelo contrário, estando em maior número poderia com sua ação imunomoduladora preparar o organismo para a fase de remissão da doença. Entretanto, pacientes com EM apresentam deficiência na indução de células T naive a produzirem IL-10, mas não IFN-g, o que poderia ser explicado em parte pela deficiência da expressão de IDO obervada após ativação in vitro com CpG, quando comparadas com pDCs de indivíduos saudáveis. A deficiência da expressão de IDO pode comprometer o efeito imunomodulador das pDCs na esclerose múltipla / Abstract: In the present study we verified the activation of immunomodulatory mechanisms of plasmacytoid dendritic cells (pDCs) and B lymphocytes by the action of TLR9 agonist, CpG-ODN during multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). EAE is the experimental model of human MS. Our results provide evidence that in vivo administration of CpG-ODN significantly reduces the severity of EAE. The reduction in disease was followed by decreasing in the proliferative response of encephalitogenic lymphocytes and consequently infiltration of these cells in the central nervous system. The decrease in the proliferative response seem to be due to the immunomodulatory effect of pDCs, since depletion of these cells restored the proliferative response, returns to normal levels. Treatment with ODN-CpG induced expression of indoleamine 2,3 dioxygenase enzyme by pDCs. This enzyme is related to the enhancement of regulatory T. Indeed, our results have shown an increased of percentage of CD25+CD4+Foxp3+ cells and expression of anti-inflammatory cytokines IL-10 and TGF-b in the treated group. Moreover, the adoptive transfer of activated pDCs alone reduced the clinical course of EAE. In addition to the pDCs, B lymphocytes also express TLR9 and can be activated by treatment with CpG, in fact, although the number of cells does not differ from untreated controls, the transfer of B lymphocytes from animals treated with CpG was able to reduce the severity of the disease as well. The immunomodulatory effect of B lymphocytes may be due to expression of IL-10 in treated animals. In parallel, we were able to report an increase of pDCs percentage in cerebrospinal fluid of MS patients during relapse compared with patients in remission or other non-inflammatory neurologic diseases. This data indicate that it may be involved with the worsening of the disease, which could be explained by viral infection, or be involved in the initial immunomodulatory mechanisms responsible for the remission. However, MS patients presented deficiency to induce naive T cells to produce IL-10, but not IFN-g, which could partly be explained by the deficiency of IDO expression observed after CpG in vitro activation, when compared with pDCs from healthy individuals. The deficiency of IDO expression may compromise the immunomodulatory effect of pDCs in MS disease / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Durant ce travail de thèse j’ai étudié des mécanismes de contrôle de la réponse inflammatoire qui, lorsqu’ils sont dérégulés, peuvent mener à une pathologie autoimmune/autoinflammatoire sévère, la Polyarthrite Rhumatoïde (PR). J’ai essentiellement analysé deux aspects de ces mécanismes : en premier lieu, j’ai pu participer à la démonstration de l’importance de l’endonucléase DICER (impliquée dans la biogénèse des microARNs - miRs), dans le contexte de la PR, particulièrement au niveau des synoviocytes type fibroblastique (FLS), des cellules résidentes de la cavité synoviale. J’ai aussi initié une étude visant à identifier, in vivo, l’intégralité des transcrits dont l’expression est régulée par des miRs dans les FLS de patients atteints de PR. En plus de fournir une vision globale de la régulation miR-dépendante dans ces cellules, ce travail permettra aussi d’identifier des cibles de miRs d’intérêt dans la PR en s’affranchissant des prédictions bio-informatiques qui peuvent s’avérer incorrectes. Un second axe de mon projet de thèse avait pour objectif de fournir une meilleure description du dialogue intercellulaire dans la cavité articulaire. Pour cela, je me suis plus particulièrement intéressé au rôle des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs) dans la physiopathologie de la PR. Ainsi j’ai pu démontrer un rôle protecteur de ces cellules (initialement décrites pour leurs fonctions dans la défense antivirale), dans le contexte de l’arthrite inflammatoire dans plusieurs modèles murins. Ces travaux m’ont permis de proposer une stratégie thérapeutique innovante, basée sur le recrutement articulaire des pDCs. Cette approche, non invasive (par application topique de crème contenant 5% d’imiquimod), s’est montrée efficace aussi bien pour la réduction des symptômes cliniques de l’inflammation que pour l’amélioration des marqueurs biologiques comme l’érosion osseuse. / During my PhD, I studied the mechanisms that control inflammation which, when disturbed, can lead to a severe autoimmune/ auto inflammatory disease, rheumatoid arthritis (RA). My work was focused on the analysis of two aspects in these mechanisms: first, I participated to an analysis of the roles of the endonuclease DICER (involved in the biogenesis of microRNAs – miRs) in the pathogenesis of RA, specifically in fibroblast-like synoviocytes (FLS), which are resident cells of the synovial cavity. I also initiated a study aiming at the identification of the FLS transcriptome which is regulated by miRs in RA patients. This approach will provide an overview of the miR-dependent regulation in these cells and enable the identification of in vivo validated miR-targeted mRNAs in RA. A second axis of my thesis project aimed at providing a better description of the intercellular dialogue in the joint cavity. For this, I was particularly interested in the role of plasmacytoid dendritic cells (pDCs) in the pathophysiology of RA. I demonstrated a protective role of these cells (initially described for their functions in antiviral defense) in the context of inflammatory arthritis in several mouse models. During this work, I had the opportunity to try an innovative therapeutic strategy based on the recruitment and activation of pDCs in the joints. This noninvasive and painless approach (topical application of cream containing 5% imiquimod) was effective in reducing inflammatory clinical symptoms and also improved biological markers such as bone erosion.