Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-11-08T10:14:33Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Nara Cristina Teixeira - 2016.pdf: 2553556 bytes, checksum: 4d26487aa9084ba304be81c862eb3ec0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-11-08T10:14:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Nara Cristina Teixeira - 2016.pdf: 2553556 bytes, checksum: 4d26487aa9084ba304be81c862eb3ec0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-08T10:14:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Nara Cristina Teixeira - 2016.pdf: 2553556 bytes, checksum: 4d26487aa9084ba304be81c862eb3ec0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Considered the most destructive disease of rice (Oryza sativa), the blast caused by the fungus M. oryzae is of concern worldwide. Because the pathogen staying power in the soil and crop residues for long and indeterminate periods is essential monitoring before the pathogen's entry into new areas, due to the commitment of nearby plantations. The seeds are considered the main ways of spread of disease due to storage, transportation and introduction into harmless areas. The methodology currently recommended by the Ministry of Agriculture for fungi monitoring seed is the "Blotter test", however, the morphological characterization can often be uncertain due to the rapid growth of fungal invasion and the similarity between structures of some pathogens. Morphologically M. oryzae can be indistinguishable from some species, such as the causal agent of rice blast wheat and other grasses therefore the most adequate way for safe diagnosis is the molecular detection. In seeds percentage infestation is often low, which is nevertheless important because the seed of transmission capacity for the seedling, however small conidia concentrations may be insufficient for the molecular detection by techniques potentially used as PCR (Polymerase Chain Reaction). Technically a methodology for molecular amplification isothermal LAMP (Loop- Mediated Isothermal Amplification) simpler recently been developed, which allows to safely identify the target, due to the projection of specific primers based on exclusive regions of the genome of the organism. The technique has advantages as high sensitivity due to the recognition by the initiators of six regions of the target, in addition to specificity, speed and security in the diagnosis. It is important to consider the cost reduction compared with PCR, due to use of constant temperature and straightforward interpretation of results using turbidity generated in positive samples or color change if the addition of dyes, eliminating the use of devices, specialized professionals in handling high standard laboratories. The interpretation the results with the naked eye makes the seed control in environments such as laboratories, warehouses, cooperatives with minimal structure, reflecting positively on the proper targeting of lots, either for planting, consumption or disposal. Therefore, the aim of this study was to survey the main potentially destructive pathogenic fungi found in seeds, and develop a rapid detection kit by LAMP methodology for M. oryzae. / Considerada a doença mais destrutiva do arroz (Oryza sativa), a Brusone, causada pelo fungo Magnaporthe. oryzae é motivo de preocupação no mundo todo. Devido a capacidade de permanência do patógeno no solo e em restos culturais por longos e indeterminados períodos é essencial o monitoramento perante a entrada do patógeno em novas áreas, em razão do comprometimento dos próximos plantios. As sementes são consideradas as principais formas de disseminação da doença devido à capacidade de armazenamento, transporte e introdução em áreas indenes. A metodologia atualmente recomendada pelo Ministério da Agricultura para monitoramento de fungos em sementes é o “Blotter test”, entretanto, a caracterização morfológicapode muitas vezes ser incerta devido à invasão de fungos de crescimento rápido e a semelhança entre estruturas de alguns patógenos. Morfologicamente M. oryzae pode ser indistinguível de algumas espécies, como é o caso do agente causal da brusone de diversas gramíneas, portanto, a maneira mais adequada para diagnose segura é a detecção molecular. Em sementes, a porcentagem de infestação muitas vezes é baixa, o que não deixa de ser importante devido a capacidade de transmissibilidade da semente para a plântula, no entanto as pequenas concentrações de conídios podem ser insuficientes para a detecção molecular, por meio de técnicas potencialmente utilizadas como a PCR (Reação Polimerase em Cadeia). Tecnicamente mais simples, recentemente foi desenvolvida uma metodologia de amplificação molecular isotérmica LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), que permite identificar de forma segura o alvo, em decorrência da projeção de iniciadores específicos, baseados em regiões exclusivas do genoma do organismo. A técnica apresenta vantagens como, alta sensibilidade devido ao reconhecimento pelos iniciadores de seis regiões do alvo, além da especificidade, agilidade e segurança no diagnostico. È importante considerar a redução de custos em comparação com a PCR, devido ao uso de temperaturas constantes, e interpretação direta dos resultados por meio da turbidez gerada em amostras positivas, ou mudança de coloração no caso da adição de corantes, dispensando o uso de aparelhos, profissionais especializados e manuseio em laboratórios de alto padrão. A intepretação dos resultados a olhos nus facilita o controle de sementes em ambientes como laboratórios, armazéns, cooperativas com estrutura mínima, refletindo positivamente sobre o direcionamento adequado de lotes, seja para o plantio, consumo ou descarte. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar o levantamento dos principais fungos patogênicos potencialmente destrutivos encontrados em sementes, e desenvolver um kit de detecção rápida por meio da metodologia LAMP para M. oryzae.

No Brasil, casos de doença exantemática em bovinos e humanos têm sido relatados em diversas regiões, cujo agente causal é o virus vaccinia pertencente ao gênero Orthopoxirus da família Poxviridae. Classicamente, a varíola bovina é causada pelo Cowpoxvirus, entretanto, outros Poxvirus, como o vírus vaccinia podem desenvolver sintomatologia clínica semelhante. Além de comprometer a cadeia produtiva de leite, uma vez que dificulta a ordenha, predispõe a mastite e descarte do produto, é uma zoonose e atualmente está incluída no diagnóstico de doença vesicular. A origem desses casos bem como a epidemiologia da doença ainda é pouco conhecida. Assim, objetivou-se no presente estudo 1) Avaliar a soroprevalência de Orthopoxirus em rebanhos bovinos do circuito sete do Estado de São Paulo que compreendem as regiões do Vale do Paraíba e Mogi das Cruzes e associar os possíveis fatores de risco envolvidos na transmissão da doença; 2) Detectar e caracterizar a presença de Orthopoxirus em amostras suspeitas de doença vesicular, no período de 2007 a 2009, provenientes de diversas regiões do Brasil utilizando técnicas convencionais e moleculares: microscopia eletrônica, isolamento viral, PCR e RFLP; 3) Sequenciamento e análise filogenética das amostras positivas para o vírus vaccinia. Para o inquérito soroepidemiológico foram analisadas 76 propriedades pertencentes ao circuito 7 que compreendem as regiões do Vale do Paraíba e Mogi das Cruzes, estado de São Paulo, selecionadas aleatoriamente, totalizando 619 animais, estratificados em fêmeas acima de dois anos. A soroprevalência de Orthopoxirus no Vale do Paraíba foi de 32,3% (200/619) pela virusneutralização. Associação positiva foi encontrada para presença de animais silvestres. No diagnóstico virológico foram analisadas 227 amostras de epitélio, negativas para outras doenças vesiculares. Encontrou-se frequencia de 63,4% (144/227) positivas para o Orthopoxirus em praticamente todas as regiões do país. A análise por RFLP revelou perfil de padrão para o vírus vaccinia. O sequenciamento dos isolados confirmou que o vírus vaccinia é a estirpe circulante e está agrupado no grupo I de isolados de vaccinia brasileiros. / In Brazil, cases of rash illness in cattle and humans have been reported in several regions whose causal agent is the vaccinia virus belonging to the genus Orthopoxirus (OPV) family Poxviridae. Classically, cowpox is caused by Cowpoxvirus, however, other poxviruses such as vaccinia virus may develop same clinical signs. In addition to compromising the production chain of milk, as it hampers milking, predisposes to mastitis and discard the product, also it is a zoonosis and is currently included in the differential diagnosis of vesicular disease. The origin of these cases as well as the epidemiology of the disease is still unknown. Thus, the aim of the present study 1) assess the serum prevalence of OPV in cattle herds circuit seven Vale do Paraíba and associate the possible risk factors involved in disease transmission, 2) identify and characterize the presence of OPV in samples suspected vesicular disease in the period 2007-2009, from various regions of Brazil using conventional techniques and molecular electron microscopy, virus isolation, PCR and RFLP; 3) Sequencing and phylogenetic analysis of the samples positive for OPV. For epidemiological survey were analyzed 76 properties in the region of Vale do Paraíba, São Paulo, randomly selected, totaling 619 animals, stratified in females more than two years. The serum prevalence of OPV in the Paraíba Valley was 32.3% (200/619) by virus neutralization. Positive association was found for presence of wild animals. The virological diagnosis were analyzed 227 samples of epithelium, negative for other vesicular diseases. Met frequency of 63.4% (144/227) positive for OPV in practically all regions of the country. RFLP analysis revealed default profile for the vaccinia virus. The sequencing of the isolates confirmed that vaccinia virus strain is circulating and is clustered in group I isolates of Brazilians vaccinia.

Padronizou-se a PCR-Multiplex para a detecção do DNA de Neisseria meningitidis. Para tanto os primers escolhidos foram: RW01, DG74 e COR28 baseados na subunidade menor do ribossomo (16S rRNA) que apresenta regiões de seqüências conservadas encontradas em todas as bactérias conhecidas. Os primers RW01 e DG74 amplificaram o fragmento universal bacteriano de 370 bp e, os primers RW01 e COR28, o fragmento específico de N. meningitidis de 279 bp em uma única etapa. Os resultados obtidos nas amostras de LCR de 168 pacientes pelos métodos de cultura e PCR-Multiplex quando comparados à bacterioscopia mostraram que tal técnica apresentou alta sensibilidade (91,3%) no estudo de amostras de LCR de bacterioscopia positiva, enquanto que a cultura apresentou resultados menores (19,7%). Nas amostras de LCR com bacterioscopia negativa a sensibilidade da PCR-Multiplex (57,8%) também foi mais elevada do que da cultura (10%). Estes dados sugerem que a técnica aqui padronizada é altamente promissora para ser utilizada como método diagnóstico da meningite meningocócica, especialmente nos casos de pacientes submetidos à terapia antibiótica prévia. / The PCR-multiplex technique was standardized to detect N.meningitidis DNA. It was used universal primer for all bacteria showing sequence of minor subunit of 16S ribossome regions (RW01, DG74) by amplification of 370bp fragment and another (COR28) for specific sequence of N. meningitidis, amplifying 279bp fragment in one step. The results obtained in CSF samples of 168 patients by culture and PCR-Multiplex technique when compared with microscopy showed high sensitivity (91,3%) in samples with positive microscopy (81) to Gram negative diplococcus, however the culture presented only 19, 7% of positivity in the same samples. In other hand the CSF samples with negative bacterioscopy (67) the PCR-Multiplex sensitivity (57,8%) was higher to culture (10,0%) too. These data indicate a high sensitivity and specificity of PCR as a tool for a rapid diagnosis of meningococcal meningitis, mainly in that patient submitted to previous antibiotic therapy as in case of this work (90% of patients) besides the possibility of a rational practice of specific treatment.

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T11:08:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Angelini_Michelle_D.pdf: 4094056 bytes, checksum: b80e9ba086ee8f30b823ce5b5718f3c7 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As bactérias do gênero Shigella spp. são responsáveis por infecções intestinais endêmicas e epidêmicas denominadas shigueloses. As shigueloses, transmitidas por via fecal-oral, principalmente através das mãos e água contaminadas, são responsáveis por 10% dos casos de diarréia entre crianças até cinco anos de idade em países em desenvolvimento. Estima-se que, anualmente, 1,1 milhões de pessoas morram de infecções causadas por Shigella. No Brasil, estudos revelam que as shigueloses estão entre as principais causas de diarréia. O presente trabalho teve por objetivo analisar a análise clonal comparativa de 119 linhagens de Shigella spp., entre elas 57 S. flexneri e 62 S. sonnei, isoladas de diferentes casos de shiguelose ocorridos nas regiões metropolitanas de Campinas e Ribeirão Preto, Estado de São Paulo, pelos métodos de PCR da seqüência consenso intergênica repetitiva enterobacteriana (ERIC-PCR), de PCR de elementos extragênicos palindrômicos repetitivos (REP-PCR), análise do padrão de macro-restrição em gel de eltroforese com campo pulsado e análise da presença de integrons. A maior parte dos casos de shiguelose estudados aconteceram no verão, estação de maior precipitação de chuvas. Do total de casos, 57,9% das infecções causadas por S. sonnei e 64,4% das causadas por S. flexneri afetaram crianças com menos de 5 anos de idade. Pela análise de ERIC e REP-PCR foram caracterizados grupos de identidade entre as linhagens isoladas em ambas regiões. Pela análise de PFGE caracterizaram-se os genótipos circulantes nas regiões. Não foi possível determinar uma correlação entre a presença dos integrons, o perfil de resistência a antimicrobianos e os resultados obtidos pelos métodos utilizados neste trabalho nas linhagens de S. sonnei pesquisadas. / Abstract: The bacteria of the genus Shigella spp. are responsible for endemic and epidemic intestinal infections called shigellosis. The shigellosis, transmitted by fecal-oral route, mainly through the hands and contaminated water, are responsible for 10% of cases of diarrhea among children under five years of age in developing countries. It is estimated that annually 1.1 million people die from infections caused by Shigella. In Brazil, studies show that shigellosis are among the main causes of diarrhea. The present study was carried out to examine the clonal variation of 119 strains of Shigella spp., including 57 S. flexneri and 62 S. sonnei, isolated from different cases of shigellosis occurred in the metropolitan regions of Campinas and Ribeirão Preto, São Paulo state, by ERIC-PCR, REP-PCR, and PFGE methods and by integrons profile analysis. Most of shigellosis cases happened in summer, season of highest precipitation of rain. Of the total cases, 57.9% of infections caused by S. sonnei and 64.4% of infections caused by S. flexneri affected children under 5 years of age. By analysis of ERIC and REP-PCR groups were characterized for identity between the strains isolated in both regions. By the analysis of PFGE circulating genotypes were characterized in the regions. It was not possible to determine a correlation among the presence of integrons, the profile of resistance to antibiotics and the results obtained by the methods used in this work in strains of S. sonnei investigated. / Doutorado / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Edi Lúcia Sartorato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:38:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Svidnicki_MariaCarolinaCostaMelo_D.pdf: 3787463 bytes, checksum: 29bd7c40aa78f66813f8c5ccbd4806be (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A perda da audição é uma doença sensorial comum, que pode ser causada por fatores genéticos ou ambientais. Os recentes avanços na biologia molecular têm permitido a determinação das causas genéticas da perda auditiva, e mais de 100 genes já foram relacionados com este fenótipo. Devido à elevada heterogeneidade genética envolvida, um grande número de pacientes permanece sem diagnóstico molecular, pois apenas um pequeno conjunto de genes é geralmente analisado. Isso indica a necessidade de novas estratégias metodológicas para o rastreamento simultâneo de mutações em múltiplos genes. Neste trabalho, um painel para genotipagem utilizando o sistema de espectrometria de massa iPLEX MassARRAY® (Sequenom Inc.), contendo 86 alterações em 17 genes, foi otimizado e testado, visando sua aplicação no diagnóstico molecular de indivíduos com perda auditiva. Inicialmente, um teste com indivíduos controles mostrou falha em 20% das alterações. Na tentativa de se obter uma maior taxa de genotipagem, os primers das alterações que falharam foram redesenhados e ressintetizados. Novos testes com 25 indivíduos controles mostraram um significativo aumento na taxa de genotipagem, e a especificidade e sensibilidade da técnica foram estimadas em mais de 95%. Após a otimização dos ensaios, um grupo de 180 indivíduos, com perda auditiva não-sindrômica com causa presumidamente genética, foi rastreado utilizando o painel desenvolvido, e a validação das mutações identificadas foi realizada por sequenciamento de DNA ou PCR seguido de análise de restrição enzimática. Alterações genéticas foram confirmadas em 31% dos indivíduos, sendo que em 20,6% dos casos analisados foi possível esclarecer a etiologia da perda auditiva. Alterações no gene GJB2 foram as mais prevalentes, porém outras mutações também foram identificadas nos genes SLC26A4, CDH23, MT-RNR1, MT-TS1, MYO15A e OTOF. A genotipagem de mutações usando o sistema iPLEX MassARRAY® mostrou melhor custo-benefício em comparação com as técnicas convencionais, e permitiu rastrear um conjunto mais abrangente de genes do que aqueles atualmente analisados. Portanto, o painel desenvolvido é viável para o rastreamento inicial de mutações envolvidas com a perda auditiva não-sindrômica e poderá auxiliar no diagnóstico dos pacientes afetados / Abstract: Hearing loss (HL) is a common sensorial disorder, which can be caused by genetic or environmental factors. Recent advances in molecular biology have allowed the determination of the genetic causes of HL, and more than 100 genes have been linked to the phenotype. Due to the extraordinary genetic heterogeneity involved in HL a large percentage of patients remain without any molecular diagnosis. This indicates the need for new methodological strategies for simultaneously screening for mutations in multiple genes. In this work, we optimized and tested a panel of 86 mutations in 17 different genes, screened using the mass spectrometry system, iPLEX MassARRAY® (Sequenom Inc.), in order to determine the molecular etiology of hearing loss. An initial genotyping of control subjects, showed failures in 20% of the selected alterations. In an attempt to achieve greater genotyping rates, the tests that failed were redesigned and new primers were synthesized. Further tests with 25 control subjects were then performed and showed significant increase in genotyping rate. The sensitivity and specificity of the technique showed average values above 95%. Additionally, a group of 180 individuals, with nonsyndromic hearing loss with presumably genetic causes, was tested using the developed panel, and the validation of the identified mutations was performed by DNA sequencing or PCR followed by restriction enzyme analysis. Genetic alterations were confirmed in 31% of patients, and in 20.6% of the individuals was possible to elucidate the etiology of HL. Mutations in the GJB2 gene were the most prevalent, but other mutations in the SLC26A4, CDH23, MT-RNR1, MYO15A, and OTOF genes were also identified. Genotyping of mutations using iPLEX MassARRAY® Spectrometry System proved to be faster and more cost-effective, compared to conventional techniques, and enabled the screening of a broader set of genes and mutations than those currently analyzed to establish the molecular etiology of hearing loss. Hence, the developed panel is feasible for the initial screening mutations involved in non-syndromic hearing loss and may aid in the diagnosis of affected patients / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Virgínia Bodelão Richini Pereira / Resumo: As infecções intestinais parasitárias são um problema mundial. Parasitas veiculados em água e alimentos como podem ser provenientes da falta de higiene durante o manuseio dos alimentos, contaminação ambiental por material fecal, irrigação de cultivos agrícolas com águas poluídas ou fossas sépticas precárias, situações comuns em países como o Brasil. Tais questões, colaboram para ocorrência de surtos por água e alimentos na população. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a presença de parasitas importantes em saúde pública em hortaliças e água de irrigação de propriedades do município de Bauru, São Paulo; bem como, nas fezes e nas mãos de manipuladores dos cultivos. As amostras foram coletadas de cinco propriedades do município de Bauru, sendo uma localizada em área urbana e quatro em área rural. Foram obtidas 33 amostras de água de irrigação, 62 de hortaliças, 31 das mãos e dez fecais dos manipuladores. Todas as amostras foram submetidas a análise molecular e as águas de irrigação submetidas ainda a análise microbiológica. Na análise microbiológica foi detectado coliformes totais e E. coli em três propriedades. Na análise molecular, o parasita mais prevalente em água de irrigação e hortaliça foi Cyclospora cayetanensis. Taenia spp. foi detectada em uma hortaliça e Giardia spp. foi mais prevalente nas amostras humanas. Não foi detectado Toxoplasma gondii. As amostras de água de irrigação apresentaram maior quantidade de amostras positivas. Atividades de educação em ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Parasitic intestinal infections are a worldwide problem. Parasites carried in water and food as they may come from the lack of hygiene during food handling, environmental contamination by fecal material, irrigation of agricultural crops with polluted water or precarious septic tanks, common situations in countries like Brazil. Such issues contribute to the occurrence of outbreaks by water and food in the population. Thus, the objective of this work was to investigate the presence of important parasites in public health in vegetables and irrigation water on rural properties in the municipality of Bauru, São Paulo; as well as in the feces and in the hands of crop handlers. The samples were collected from five rural properties in the municipality of Bauru, one of them located in an urban area and another four in a rural area. Were collected 33 samples of irrigation water, 62 of vegetables, 31 of hands and 10 fecal samples from handlers. All samples were subjected to molecular analysis and irrigation water was also subjected to microbiological analysis. In this microbiological analysis, total coliforms were detected at high rates and E. coli in three of the properties. In molecular analysis, the parasite most prevalent in the analysis and most common in irrigation water and vegetables was Cyclospora cayetanensis. Taenia spp. was detected in one greenery. Giardia spp. was most detected in human samples. Toxoplasma gondii was not detected. The samples of irrigation water had a grea... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Doenças tireoideanas são bastante comuns, sendo sua maioria benigna. A relação entre os diversos tipos de doenças tireoideanas, bem como seus aspectos moleculares, são pouco conhecidos. O bócio (hiperplasia), por exemplo, é descrito por alguns como relacionado com carcinoma (tumor maligno) papilífero, enquanto que outros afirmam não haver relação causal entre as duas doenças. A questão mais desafiante, porém, refere-se à distinção entre adenoma (tumor benigno) e carcinoma folicular, que atualmente é feita apenas após à cirurgia, não permitindo tratamento diferenciado para os dois tipos de tumor. Este trabalho buscou identificar genes diferencialmente expressos entre tecido tireoideano normal, bócio, adenoma e carcinoma papilífero utilizando microarrays. Carcinomas foliculares não foram incluídos devido ao número e tamanho reduzidos das amostras. Dois tipos de array foram utilizados: arrays em membranas de nylon, contendo 213 clones obtidos por DDRT-PCR de amostras de tireóide, e arrays em vidro, contendo 3800 clones ORESTES. Experimentos utilizando o primeiro tipo de array identificaram três genes diferencialmente expressos, cuja expressão foi analisada por RT-PCR em 10 amostras de cada tipo de tecido. Dois deles foram capazes de diferenciar carcinomas papilíferos de tecido normal e bócio com 89% de precisão para o tumor maligno e 80% para os tecidos não malignos. Os arrays em vidro foram utilizados para avaliar o perfil de expressão de aproximadamente 10 amostras de cada tipo de tecido tireoideano. Foram identificados 160 clones diferencialmente expressos entre quaisquer dois tipos de tecido, cujas seqüências foram determinadas e comparadas com as dos bancos de dados. Dentre os genes mais interessantes destacam-se o correspondente à ATPase Na/K, cuja expressão está reduzida nos carcinomas em relação a tecidos normais e adenomas, o da proteína PDCD4, envolvida em morte celular programada, mais expresso em adenomas e tecidos normais em comparação com carcinomas e bócios, e os da calgizzarin (S100A11) e da α1-anti-tripsina, ambos mais ativos nos carcinomas do que nos demais tecidos. Todos esses genes já foram descritos como diferencialmente expressos em algum tipo de tumor. Este trabalho levou à padronização da metodologia de microarray em lâminas de vidro em nosso laboratório, bem como à identificação de genes que podem elucidar as alterações envolvidas na formação do bócio, adenoma e carcinoma papilífero. A implantação da técnica de amplificação de mRNA em nosso laboratório viabilizou a utilização de 10 amostras de carcinoma folicular, cuja massa de RNA total era insuficiente para as hibridizações. Essas amostras serão hibridizadas, juntamente com 10 amostras de adenoma, com microarrays contendo 4800 genes humanos conhecidos para a busca de genes diferencialmente expressos, de grande interesse diagnóstico. / Thyroid diseases are very common and are usually benign. The causal relationships among the different types of disease, as well as their molecular aspects, are not well understood. The goiter (hyperplasia), for instance, is described by some as related to papillary carcinoma (a malignant tumor), while others say there is no causal relationship between the two diseases. The most defying question, however, concerns the distinction between adenoma (benign tumor) and follicular carcinoma, which is currently made only after surgery, not allowing distinct treatments for the two kinds of tumor. This work aimed to identify differentially expressed genes among normal thyroid tissue, goiter, adenoma and papillary carcinoma using microarrays. Follicular carcinomas were not included due to the reduced number and size of the samples. Two kinds of array were used: arrays in nylon membranes, with 213 clones isolated from thyroid samples by differential display (DDRT-PCR); and glass slide arrays containing 3800 ORESTES clones.Experiments using the first type of array identified three differentially expressed genes, whose expression was analyzed by RT-PCR in 10 samples of each kind of tissue. Two of these genes were able to differentiate papillary carcinomas from goiters and normal tissues with precisions of 89% for the malignant tumor and 80% for the non-malignant tissues. Glass slide arrays were used to evaluate gene expression profile of approximately 10 samples of each type of thyroid tissue. 160 clones differentially expressed between any two tissues were identified, and their sequences were determined and compared with databases. Among the most interesting genes are Na/K ATPase gene, whose expression is reduced in carcinomas compared to normal tissues and adenomas, the gene corresponding to PDCD4 protein, involved in program cell death, with elevated expression in adenomas and normal tissues than carcinomas and goiters, and the genes of calgizzarin (S100A11) and α1-antitrypsin, both more active in carcinomas than the other tissues. All these genes have already been described as differentially expressed in at least one type of human cancer. This work led to the standardization of glass slide microarray technology in our laboratory, and to the identification of genes that may clarify the alterations involved in the formation of goiter, adenoma and follicular carcinoma. The implementation of mRNA amplification technique in our laboratory allowed the utilization of 10 samples of follicular carcinoma, whose mass was insufficient for microarray hybridizations. These samples will be hybridized along with 10 samples of adenomas, with microarrays containing 4800 known human genes to search for differentially expressed genes, of great diagnostic interest.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ANDREIA PIRES AMANCIO.pdf: 1468482 bytes, checksum: cfd035e6b0a287fb6f6c412088f7aa20 (MD5) Previous issue date: 2013-01-31 / The Intellectual Disability (DM) is defined as an incomplete level of intellectual development, and its manifestation usually occurs before 18 years of age. It is one of the most common neuropsychiatric disorders, with a prevalence of 5% in our population. The Fragile X syndrome (FXS) is the most common cause of inherited mental retardation worldwide, and the second most common genetic cause of mental retardation. The phenotype of FXS is associated with mutations in FMR1 (Fragile X Mental Retardation-linked type 1), which is caused by the expansion of repetition of a trinucleotide sequence (CGG) in the regulatory region of the FMR1 gene, located on chromosome X (Xq27 .3). The importance of clinical recognition and specific diagnosis of FXS comes from the fact that theoretically all cases are hereditary and familial. In this context, this study aimed to validate the molecular genetic diagnosis simplified and cost, for patients suspected of FXS in the Laboratory of Cytogenetics and Molecular Genetics (LaGene) of the Department of Health of the State of Goiás in Goiânia using the PCR technique. We selected 35 patients referred by medical service of public health to LaGene with clinical indication for diagnosis of FXS. The patients' DNA was extracted and subjected to two PCR methods, here called PCR Screening (PCR-T) and PCR for Pre-mutation (PCR-P). The new methodology, PCRT, 88% produced conclusive results against 100% conclusiveness of the standard technique (PCR-P) and getting a p> 0.11. The alleles amplified by PCR-P allowed the diagnosis of pre-mutation in a sample. From these observations we propose a strategy for the diagnosis of the syndrome using PCR-P research in pre-mutation individuals in parents with inconclusive results. Given the successful results and improved the PCR, including the new and easy diagnosis of pre-mutation samples not completed by the technique of drawing, we suggest the implementation of both PCR genetics laboratory in the State of Goiás (LaGene ) for the diagnosis of FXS. / A Deficiência Mental (DM) é definida como sendo um nível incompleto do desenvolvimento intelectual, e sua manifestação ocorre normalmente antes dos 18 anos de idade. É um dos transtornos neuropsiquiátricos mais comuns, com uma prevalência de 5% na população brasileira. A síndrome do X-Frágil (SXF) é a causa mais comum de retardo mental hereditário em todo o mundo, e a segunda causa genética mais frequente de deficiência mental. O fenótipo da SXF está associado a mutações no gene FMR1 (Fragile X-linked Mental Retardation type 1), que é causada pela expansão da repetição de uma sequência de trinucleotídeos (CGG) na região reguladora do gene FMR1, localizado no cromossomo X (Xq27.3). A importância do reconhecimento clínico e diagnóstico específico da SXF vem do fato de que teoricamente todos os casos são hereditários e familiais. Nesse contexto, este estudo teve como objetivo validar o diagnóstico genético-molecular simplificado e de baixo custo, para pacientes com suspeita da SXF no Laboratório de Citogenética e Genética Molecular (LaGene) da Secretaria Estadual de Saúde do Estado de Goiás, na cidade de Goiânia, utilizando a técnica de PCR. Foram selecionados 35 pacientes encaminhados pelo serviço médico da rede pública de saúde ao LaGene com indicação clínica de diagnóstico da SXF. O DNA desses pacientes foi extraído e submetido a dois métodos de PCR, aqui denominados PCR de Triagem (PCR-T) e PCR para Pré-mutação (PCR-P). A nova metodologia, PCRT, produziu 88% de resultados conclusivos contra 100% de conclusividade pela técnica padrão (PCR-P) e obtendo um p>0,11. Os alelos amplificados pela PCR-P possibilitou o diagnóstico de pré-mutação em uma amostra. A partir destas observações propõe-se uma estratégia para o diagnóstico da síndrome utilizando a PCR-P na pesquisa de pré-mutação em pais de indivíduos com resultados inconclusivos. Considerando os resultados bem sucedidos e aprimorados da técnica de PCR, incluindo o novo e fácill diagnóstico da pré-mutação de amostras não concluídas pela técnica de triagem, sugere-se a implementação de ambas as PCR no laboratório de genética do Estado de Goiás (LaGene) para o diagnóstico da SXF.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2016-08-05T10:36:05Z No. of bitstreams: 2 Tese - Herika Xavier da Costa - 2015.pdf: 2103590 bytes, checksum: f8dd254901af7084719caef9647c0af2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-05T15:01:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Herika Xavier da Costa - 2015.pdf: 2103590 bytes, checksum: f8dd254901af7084719caef9647c0af2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-05T15:01:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Herika Xavier da Costa - 2015.pdf: 2103590 bytes, checksum: f8dd254901af7084719caef9647c0af2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-04-23 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Anaplasma platys and Ehrlichia canis are obligate intracellular rickettsial organisms of dogs. A. platys appear to parasitize only platelets causing canine infectious cyclic thrombocytopenia (CICT), whereas E. canis has tropism for circulating mononuclear cells causing canine monocytic ehrlichiosis (CME). Clinical signs of CME and CICT are nonspecific and common to many other diseases transmitted by ticks. Definitive diagnosis of A. platys and E. canis is made by specific diagnostic tests; however, two new real time PCR protocols (qPCR) for the detection of A. platys and E. canis were developed from reference sequences for the 16S rRNA gene of A. platys and E. canis. New primers and probes were able to detect A. platys and E. canis. Identification of natural infections in dogs by A. platys and E. canis, previously confirmed by conventional PCR, showed high correlation sensitivity (100% for A. platys and E. canis) and epidemiological specificity (100% for A. platys and 98,41% for E. canis) with new qPCR using hydrolyses probe (TaqMan) protocols Analytical specificity tests produced species-specific results, not occurring DNA amplification of the following blood parasites Babesia vogeli, Hepatozoon canis and Mycoplasma haemofelis. R. sanguineus DNA. Two new qPCR protocols described were able to detect 0,14 fg of E. canis DNA and 0,9 fg of A. platys DNA and represent alternative as a diagnostic tool for the specific detection of A. platys and E. canis being useful for diagnosis of these canine hemoparasitosis. Ocular abnormalities are among the clinical signs found in dogs infected with E. canis and cases of uveitis have been attributed to infection with A. platys, but the frequency of eye injuries in cases of infection with A. platys is still unknown. After searching the frequency of infections by A. platys and E. canis in 100 dogs with ocular (OA) and 100 dogs without ocular alterations (WOA), using the PCR as a diagnostic method, we found that among the hemoparasites, A. platys and E. canis detected and identified by PCR, E. canis was the most frequent, both in the group of OA dogs (33%; 33/100) and in the group of WOA dogs (24%; 24 / 100). The frequency of A. platys was 5% (5/100) for the group of OA dogs and 4% (4/100) for the group of WOA dogs. Ocular changes associated with infection by E. canis were bilateral uveitis and retinal detachment. It was not possible to verify the relationship of ocular manifestations with infection by A. platys due to the low number of dogs with ocular abnormalities infected with this rickettsia. / Anaplasma platys e Ehrlichia canis são riquétsias intracelulares obrigatórias de cães. A. platys parasita plaquetas causando a trombocitopenia cíclica infecciosa canina (TCIC), enquanto que E. canis possui tropismo por células mononucleares circulantes, causando a erliquiose monocítica canina (EMC). Os sinais clínicos da EMC e TCIC são inespecíficos e comuns a inúmeras outras enfermidades transmitidas por carrapatos. O diagnóstico definitivo de E. canis e A. platys é firmado através do emprego de testes de diagnóstico específicos. Dessa forma, dois novos protocolos de ensaios de PCR em tempo real (qPCR) para o detecção de A. platys e E. canis foram desenvolvidos a partir de sequências de referência para o gene 16S rRNA de A. platys e E. canis. Os novos iniciadores e sondas desenhados foram capazes de detectar A. platys e E. canis. Identificação de infecções naturais em cães por A. platys e E. canis, previamente confirmada por PCR convencional demonstrou alta correlação na sensibilidade (100% para A. platys e E. canis) e especificidade epidemiológicas (100% para A. platys e 98,41% para E. canis) com os novos protocolos de qPCR utilizando sondas de hidrólise TaqMan. Os testes de especificidade analítica produziram resultado espécie específicos, não ocorrendo amplificação de DNA dos seguintes hemoparasitos: Babesia vogeli, Hepatozoon canis e Mycoplasma haemofelis. DNA de Rhipicephalus sanguineus também não foi amplificado. Os dois novos protocolos de qPCR descritos aqui foram capazes de detectar até 0,14 fg de DNA de E. canis e 0,9 fg de DNA de A. platys e representam alternativas como ferramenta de diagnóstico para a detecção específica de A. platys e E. canis, sendo útil para o diagnóstico dessas hemoparasitoses em cães. As alterações oculares estão entre os sinais clínicos encontrados em cães infectados com Ehrlichia canis e casos de uveítes já foram atribuídos a infecção por A. platys, porém a frequência de lesões oculares em casos de infecção por A. platys ainda é desconhecida. Após pesquisar a frequência de infecções por E. canis e A. platys em 100 cães com alterações oculares (CAO) e 100 cães sem alterações oculares (SAO), utilizando-se a PCR como método de diagnóstico, verificou-se que dentre os hemoparasitos, E. canis e A. platys, detectados e identificados por PCR, E. canis foi o de maior frequência, tanto no grupo de cães CAO (33%; 33/100) quanto no grupo de cães SAO (24%; 24/100). A frequência de A. platys foi de 5% (5/100) para o grupo de cães CAO e 4% (4/100) para o grupo de cães SAO. As alterações oculares que apresentaram relação com a infecção por E. canis foram uveíte bilateral e descolamento de retina. Não foi possível verificar a relação das alterações oculares com a infecção por A. platys devido ao baixo número de cães com alterações oculares infectados com esta riquétsia.

Introdução: A AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida) é caracterizada por uma disfunção grave no sistema imunológico causada por uma infecção por HIV (Human Immunodeficiency Virus). A quantificação da viremia (carga viral) é uma ferramenta muito útil no monitoramento dos pacientes infectados pelo HIV, sendo um marcador de progressão da doença e eficácia do tratamento. A estimativa incorreta da carga viral pode levar à decisão terapêutica equivocada, portanto métodos acurados de quantificação se fazem necessários. Diversas técnicas comerciais estão disponíveis para a quantificação da carga viral do HIV-1: a maioria destas se baseiam na detecção de ácidos nucléicos e outras na detecção de enzimas e antígenos. O grau de automação varia nas diferentes técnicas assim como os procedimentos de isolamento, amplificação e detecção. A correlação e a concordância entre estas técnicas têm sido estudadas e há relatos de discordância entre os valores de carga viral produzidos por diferentes métodos. O conhecimento sobre o efeito das variações entre as técnicas se faz necessário para assegurar a interpretação adequada dos resultados. A interpretação dos resultados correta é particularmente importante quando estes estão próximos a pontos de corte utilizados para definições de rebote viral e falha virológica. Objetivos: O objetivo deste estudo é comparar as técnicas de PCR (Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0) e b-DNA (Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0) para quantificação do HIV-1. Métodos: 1000 amostras recebidas no HIV/GUM Research Laboratory do Chelsea and Westminster Hospital para quantificação da carga viral do HIV-1 durante os meses de Dezembro de 2009 e Janeiro de 2010 foram testadas pelos métodos de PCR (Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0) e b-DNA (Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0). Resultados: Uma superquantificação sistemática foi observada nos resultados testados por PCR. Esta superquantificação ficou evidente nos resultados entre 50 e 250 cópias. Uma concordância elevada foi observada na análise dos pontos de corte de 500 e 1000 copias/mL. Uma correlação linear forte foi observada entre estas técnicas na análise das amostras que obtiveram resultados dentro do limite comum de detecção de ambas as técnicas, porém o nível de concordância foi insatisfatório. Conclusão: A superquantificação observada nos resultados obtidos pelo Cobas AmpliPrep TaqMan HIV- 1 v2.0 em relação ao bDNA Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0 é provavelmente o resultado de uma sensibilidade aumentada desta técnica. Nós recomendamos cautela quando resultados de duas metodologias diferentes são comparados, especialmente quando se comparam metodologias convencionais com aquelas baseadas em PCR em tempo real. / Introduction: AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) is characterised by a severe immune dysfunction caused by the HIV (Human Immunodeficiency Virus). The HIV viral load quantification is an essential tool to monitor HIV-infected patients. The HIV quantification is a disease progression marker and it is a key indicator in treatment efficacy. Inaccurate viral RNA values may subsequently lead to inappropriate treatment decisions hence accurate quantification methods are necessary. Several different methodologies are available to quantify the HIV viral load: a number of them are based on nucleic acid detection and others in detection of enzymes and antigens. Automation is also variable among these methods in addition to differences in isolation, amplification and detection. Several studies have been carried out to evaluate their correlation and agreement and some have evidenced discordant viral load values assessed by different assays. The knowledge about these differences should be taken in to account when analysing viral load results, particularly when low-level viraemia is concerned or those close to endpoints employed for definition of virological failure. Objectives: In this study, two methods to quantify viral load are evaluated: one is based on real-time PCR (AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0) and the other is based on branched-DNA technology (Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0). Methods: 1000 plasma samples received at the HIV/GUM Research Laboratory within Chelsea and Westminster Hospital for HIV-1 viral load quantification between December 2009 and January 2010 were tested by both Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0 and Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0 methods. Results: Results obtained show that Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0 PCR systematically overquantifies the viral loads results when compared to bDNA Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0. Conclusion: The overquantification by Cobas AmpliPrep TaqMan HIV-1 v2.0 over bDNA Siemens Versant HIV-1 RNA 3.0 is likely to be a result of its increased sensitivity. We recommend caution when comparing results from different methodologies, especially when a conventional assay and a real-time PCR assay are concerned.