O inseticida spinosad tem sido um dos mais utilizados para o controle de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) no Brasil, devido à sua eficácia e ao seu mecanismo de ação único (modulador alostérico de receptores nicotínicos da acetilcolina). Para fornecer subsídios a um programa de manejo da resistência, foram realizados estudos para compreender as bases genéticas e moleculares da resistência de S. frugiperda a este inseticida. Inicialmente, foi selecionada uma linhagem de S. frugiperda resistente a spinosad (Spin-res) em laboratório por meio da técnica \"F2 screen\". A razão de resistência, baseada na CL50, foi de aproximadamente 890 vezes. A partir de cruzamentos recíprocos entre a linhagem suscetível (Sus) e Spin-res, constatou-se que o padrão de herança da resistência de S. frugiperda a spinosad é autossômica e incompletamente recessiva. Retrocruzamentos da progênie F1 de cruzamentos recíprocos com a linhagem Spin-res confirmaram a hipótese de herança poligênica da resistência, com número mínimo de segregações independentes variando de 1,86 a 2,45. Além disso, observou-se um elevado custo adaptativo associado à resistência de S. frugiperda a spinosad, baseado nos parâmetros da tabela de vida e fertilidade. A partir dos dados de seqüenciamento de quatro bibliotecas de cDNA de lagartas de quarto ínstar das linhagens Sus e Spin-res (expostas ou não a spinosad), utilizando a plataforma HiScan1000&reg; (Illumina&copy;), foi realizada a comparação do perfil de transcrição e expressão diferencial de genes entre as linhagens Sus e Spin-R. O transcritoma foi montado utilizando a estratégia de novo contendo cerca de 19 milhões de leituras single-end com qualidades de score acima de 30, gerando 42406 transcritos com o N50 de 598 pb. A busca por similaridade no banco de dados não-redundante (nr) do NCBI, possibilitou a anotação funcional de 24980 (59%) transcritos, alinhando-se a Bombyx mori L., Helicoverpa armigera (Hübner) e Spodoptera spp. com 22,5; 3,81 e 3,6% das sequências respectivamente. Foram identificados 2903 transcritos apresentando expressão diferencial (P <= 0,05, t-test; fold-change > 2) entre as linhagens Spin-res e Sus. Dentre os transcritos relacionados a enzimas do complexo metabólico, 23 P450 monooxigenases, 13 glutathiona S-transferases, uma carboxilesterase e uma esterase foram superexpressas na linhagem Spin-res. Além disso, foi observada a superexpressão de 15 genes relacionados à produção energética na linhagem Spin-res, o que pode estar relacionada ao elevado custo adaptativo associado à resistência. Análises de PCR quantitativo em tempo real confirmaram que os padrões de expressão foram consistentes com os resultados de RNA-seq. Bioensaios com os sinergistas PBO e DEM mostraram pouco envolvimento de enzimas P450 e nenhum envolvimento de glutationa S-transferases na resistência de S. frugiperda a spinosad. O sequenciamento da subunidade &alpha;6 do receptor nicotínico de acetilcolina de ambas linhagens demonstrou a existência de uma mutação sinônima entre as duas linhagens (G567A), indicando que a subunidade &alpha;6 não é a única relacionada à resistência de S. frugiperda a spinosad. / Spinosad has been one of the most used insecticides to manage Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) in Brazil, due to its efficacy and unique mode of action (nicotinic acetylcholine receptor allosteric modulator). To support an insect resistance management program (IRM), we selected and characterized in laboratory a spinosad-resistant strain (Spin-res) of S. frugiperda using the F2 screen method. The resistance ratio, based on LC50, was &asymp; 890-fold. Based on reciprocal crosses between susceptible (Sus) and Spin-res, the inheritance of spinosad resistance in S. frugiperda was autosomal incompletely recessive. Backcrosses between the F1 from reciprocal crosses and the parental Spin-res revealed a polygenic resistance, with an estimation of at least 1.86 to 2.45 genes related to spinosad resistance. Furthermore, it was observed a strong fitness cost associated to spinosad-resistance in Spin-res strain, based on the life table and fertility parameters. The characterization of the transcriptional profile and the differential gene expression comparison between susceptible and spinosad-resistant strains of Spodoptera frugiperda were obtained from the sequencing of cDNA libraries from fourth instar larvae of Sus and Spin-res strains (exposed or not to spinosad) using a HiScan1000&reg; platform (Illumina&copy;). The transcriptome was de novo assembled using nearly 19 million single-end reads with quality score over 30, yielding 42,406 transcripts with a N50 of 598 bp. Based on similarity search in the non-redundant (nr) nucleotide database, 24,980 (59%) transcripts were annotated. Most of the transcripts aligned to Bombyx mori L., Helicoverpa armigera (Hübner) and Spodoptera spp., with 22.5%, 3.81, and 3.6, respectively. We identified 2,032 differentially expressed transcripts (P <= 0.05, t-test; fold-change > 2) between the susceptible and spinosad-resistant strains. Among metabolic enzyme transcripts, 23 P450 monooxigenases, 13 glutathione S-transferases, one carboxylesterase and one esterase were up-regulated in the spinosad-resistant strain. In addition, it was observed 15 genes superexpressed in spinosad-resistant strain related to energy production, which can be related to the high fitness cost associated with resistance. Quantitative real-time PCR analysis showed that patterns of gene expression were consistent with RNA-seq results. Synergistic bioassays using PBO and DEM showed little involvement of P450s in spinosad-resistance and lack of involvement regarding the glutathione Stransferases. Furthermore, we sequenced and compared the subunit &alpha;6 from the nicotinic acetylcholine receptor of S. frugiperda Spin-res and Sus strains. Only one synonymous mutation within the two strains (G567A) was found, showing that the &alpha;6 is not the only subunit involved in S. frugiperda resistance to spinosad.

A endometriose é uma doença ginecológica benigna, de etiologia complexa e multifatorial, caracterizada pela presença de estroma e tecido glandular tipo endométrio fora da cavidade uterina. Afeta de 10 a 15% da população feminina, que apresentam sintomatologia variada, incluindo dor pélvica e infertilidade. Para elucidar mecanismos potenciais que estejam envolvidos com a fisiopatologia complexa desta doença, analisamos o perfil de expressão gênico diferencial pela metodologia de hibridação subtrativa em tecido eutópico e ectópico (lesões peritoniais e endometrioma ovariano) de 17 mulheres com endometriose, no início da fase proliferativa do ciclo menstrual. Foram identificados 291 genes desregulados nas lesões endometrióticas, considerados como genes candidatos. Para a validação dos dados, utilizamos a metodologia de PCR em tempo real para os genes CTGF e SPARC, indicados como superexpressos; e MYC, MMP3, IGFBP1 e PAEP como menos expressos nas lesões. Diferenças significativas de expressão nas lesões peritoniais foram obtidas para os genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP e nos endometriomas ovarianos para os genes MMP3 e PAEP. Sugerimos que a desregulação dos genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI e PAEP seja responsável pela perda da homeostase celular nas lesões endometrióticas, contribuindo para a implantação e sobrevivência do tecido ectópico no ambiente extra-uterino. Este trabalho disponibilizou ao banco de dados da literatura, 291 genes com expressão gênica diferencial em lesões endometriótricas peritoniais e ovarianas como candidatos a investigações futuras. / Endometriosis is a benign gynecological disease, which presents a multifactorial and complex etiology, characterized by the presence of stromal and glandular endometrium tissue outside the uterine cavity. Ten to 15% of the female population is affected by the disease with a wideranging symptomatology including pelvic pain and infertility. To clarify the potential mechanisms involved in the complex physiopathology of this disease, we analyzed the differential gene expression profile by subtractive hybridization in eutopic and ectopic tissue (peritoneal lesions and ovarian endometriomas) from 17 women with endometriosis, in the early proliferative phase of the menstrual cycle. We identified 291 genes deregulated in the endometriotic lesions, considered as candidate genes. For data validation, Real Time PCR was applied for genes CTGF and SPARC, indicated as overexpressed; and for genes MYC, MMP3, IGFBP1 and PAEP, indicated as downregulated in the lesions. Significant differences in the peritoneal lesions expression were obtained for genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP and in the ovarian endometriomas for genes MMP3 and PAEP. We suggest that the deregulation of genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI and PAEP is responsible for loss of cellular homeostasis in the endometriotic lesions, contributing for the implantation and maintenance of the ectopic tissue in the extra-uterine environment. This study provided 291 genes with differential gene expression, in peritoneal and ovarian lesions, to the literature database as candidates for future investigations.

As síndromes hipertensivas gestacionais estão entre as maiores causas de morte materna e fetal. Entre elas destaca-se a pré-eclâmpsia (PE), que caracteriza-se pelo aumento da pressão arterial e proteinúria, a partir da 20ª semana de gestação. Embora sua etiologia seja ainda discutida, o papel dos fatores genéticos é amplamente aceito. Alterações do padrão da inativação do cromossomo X, processo epigenético encontrado em mamíferos com placenta, têm sido encontradas em algumas doenças que ocorrem exclusivamente em mulheres. O XIST é um gene chave nesse processo. Por outro lado, muitos microRNAs (pequenos RNAs não codificantes) são expressos abundantemente na placenta humana e alguns estão mapeados no cromossomo X. O objetivo do presente trabalho foi a verificação do padrão de inativação do cromossomo X e da expressão dos genes XIST e dos microRNAs X-específicos miR-221, miR-222 e mir-223 em mulheres com PE. O ensaio de HUMARA (receptor de andrógeno humano) utilizando PCR convencional e digestão com a enzima sensível à metilação HpaII foi analisado de forma qualitativa (visualização em gel de poliacrilamida) e semi-quantitativa (sequenciamento), sendo realizado a partir de sangue periférico (todas as amostras) e de tecido placentário [apenas das placentas de fetos femininos (17 amostras)]. Para o estudo do padrão de expressão foi obtido cDNA por transcrição reversa, a partir de RNA total extraído do tecido placentário (30 amostras).. A análise foi realizada por meio de PCR em tempo real. Foram utilizados os testes de Qui-quadrado e de t-Student, além do modelo linear generalizado para a análise estatística. Não houve diferença estatisticamente significativa para o parâmetro de inativação do cromossomo X entre os grupos controle e de PE, independente do tipo de tecido estudado (sangue ou placenta) quando foram aplicados os ensaios de HUMARA qualitativo e semi-quantitativo. Para o gene XIST e o microRNA miR-221 não foi evidenciada diferença estatisticamente significativa entre os grupos controle e de PE. O microRNA miR-223 não apresentou transcritos detectáveis em nenhum dos grupos de estudo. Para o microRNA miR-222, houve diferença estatisticamente significativa, sendo que no grupo de PE a expressão foi mais elevada. Não foi encontrada associação entre o padrão de inativação do cromossomo X e a expressão do gene XIST e dos microRNAs estudados. Embora a inativação preferencial do cromossomo X tenha sido encontrada nos dois grupos, padrões de inativação preferencial extrema foram verificados em um número maior de casos com PE. Os resultados mostram que o miR-222 apresenta potencial para ser utilizado como marcador molecular da PE, sugerindo também que exista uma diminuição na expressão de seus genes-alvo que devem ser estudados como candidatos na patogênese da doença. / The gestational hypertensive syndromes are among the major causes of maternal and fetal death. The Preeclampsia (PE) is the most prevalent of those syndromes and it is characterized by the increase of blood pressure and proteinury, which start from to 20th week of gestation. Although its ethiology is argued actually the genetics factors have been accepted. Alterations in pattern of chromosome X inactivation, epigenetic process of mammals with placenta have been found in some diseases that occur exclusively in women. XIST is a key gene in this process. On the other hand very microRNAs (small RNAs no coding) are overexpressed in human placenta and someones are located at X choromosome. The subject of this research was verify the patterns of chromosome X inactivation and the expression of the XIST gene and X-specific microRNAs in women affected by PE. In the HUMARA (human androgen receptor) assay was carried out with peripheral blood (all samples) and placental tissue [only female fetuses placentas (17 samples)]. The conventional PCR and digestion methodology with HpaII enzyme were employed and the result was analysed to qualitative (polyacrilamide gel) and semi quantitative (sequencing) form. The cDNA was obtained to gene expression study by reverse transcription reaction from placenta total RNA (30 samples). Gene expression assay was carried out with real time PCR. To statistical analyze was used the Qui-square and t-Student tests besides the widespread lineal model. There was not statistical significant differences to chormosome X inactivation parameter among the groups control and PE independently of the tissue studied (blood or placenta) when the qualitative and semi quantitative HUMARA assay were applied. To XIST and miR-221 were not evidenced significant statistical differences among the groups control and of PE. The miR-223 did not show detectable transcripts to any group studied. The miR-222 expression was more elevated in the PE group than control group and this difference was significant statistically. In the present study was not found association among the chromosome X inactivation pattern and the gene expression of XIST and the microRNAs studied. Although the chromosome X inactivation have been found in the two groups the preferential chromosome X inactivation patterns were verified in a great number of cases in PE group. The results showed that miR-222 has a potential to be employed as molecular marker of PE also suggesting the existence of a decrease in expression of its target genes which have to be investigated like candidates to disease pathogenesis.

O feijão-comum (Phaseolus vulgaris) é atacado por uma gama de patógenos que afetam a produtividade das lavouras e a qualidade dos grãos. Dentre os patógenos de importância econômica para a cultura no Brasil, destaca-se o nematoide das galhas (Meloidogyne incognita). Embora haja relatos sobre a avaliação de cultivares na presença de M. incognita, as fontes de resistência tem se mostrado pouco efetivas. Por isso, pesquisas que possibilitem um melhor entendimento sobre a interação planta-nematoide são de extrema valia e devem nortear novas estratégias para o melhoramento do feijoeiro. Assim, no presente estudo, 18 cultivares de P. vulgaris foram avaliadas quanto à resistência a M. incognita raça 3, sendo que quatro comportaram-se como pouco suscetíveis, 11 como moderadamente suscetíveis e três altamente suscetíveis. A cultivar IPR Saracura mostrou menor grau de suscetibilidade e foi, então, usada na construção de 12 bibliotecas de RNAseq, visando à identificação dos genes envolvidos na reposta à infecção pelo nematoide. Foram adotados dois tratamentos, 4 e 10 DAI (dias após inoculação), compostos de plantas inoculadas e controles. Primeiramente, realizou-se o mapeamento dos transcritos de cada biblioteca, tomando como referência o genoma de P. vulgaris (G19833), o que resultou na identificação de 27.195 unigenes. Em seguida, foi realizada a quantificação da expressão dos transcritos mapeados e genes diferencialmente expressos foram identificados. No total, 191 genes do hospedeiro apresentaram expressão diferencial, considerando-se: i) o tratamento inoculado em relação ao controle; ii) a razão de expressão (Fold Change - FC) mínima absoluta igual a 4; iii) o nível de significância ? = 0,05. Do total, 120 genes foram identificados aos 4 DAI e 71 aos 10 DAI. As sequências mapeadas foram contrastadas àquelas dos bancos de dados NCBI e TAIR, usando a ferramenta BLASTx e, posteriormente, anotadas usando os softwares Blast2GO e MapMan. Detectou-se similaridade com genes codificadores de proteínas conhecidas para 90% (24.604/27.195) dos unigenes, sendo que 69% (16.991/24.604) deles foram anotados. Quanto à expressão diferencial, 98% (188/191) dos transcritos mostraram similaridade com proteínas conhecidas e 67% (127/188) puderam ser anotados. Os transcritos foram atribuídos a diferentes categorias funcionais putativas, predominando o termo ontológico \'processos metabólicos\', em ambas as plataformas. A anotação dos genes na plataforma MapMan mostrou abundância das categorias da via de resposta a estresse, com predominância de genes de defesa superexpressos aos 4 DAI e reprimidos aos 10 DAI. Por fim, 10 genes mostraram expressão diferencial tanto aos 4 como aos 10 DAI: sete deles foram estáveis, sendo superexpressos nas plantas inoculadas, e três apresentaram comportamentos opostos nos momentos avaliados. Ênfase foi dada a um gene que codifica uma \'probable inactive ADP-ribosyltransferase\' e a quatro genes de resposta a ferimento. / The common bean (Phaseolus vulgaris) is attacked by a range of pathogens, which affect crop yield and the quality of grains. Among the pathogens of economic significance to the crop in Brazil, the root-knot nematodes (Meloidogyne incognita) deserve attention. Though there are some reports on cultivar evaluation in presence of M. incognita, the resistance sources have not being effective. Therefore, it is of valuable importance research projects that could lead to a better understanding of plant-nematode interaction and to indicate new strategies for common bean breeding. In the present study, 18 cultivars of P. vulgaris were evaluated in regard to their resistance to M. incognita race 3; four were less susceptible, 11 moderately susceptible, and three were highly susceptible. \'IPR Saracura\' behaved as the less susceptible cultivar and then was selected for the construction of 12 RNAseq libraries, aiming at the identification of genes differentially expressed in response to nematode infection. Two treatments were adopted, 4 and 10 days after inoculation (DAI), each comprised of inoculated and control plants. Firstly, the transcripts were mapped to the reference genome of P. vulgaris (G19833), resulting in the identification of 27,195 unigenes. Then, the mapped transcript\'s expression was quantified and differentially expressed genes were identified. In total, 191 genes of the host plant showed differential expression taking into consideration: i) the inoculated treatments in relation to their control; ii) an absolute fold change (FC) >= 4; iii) a level of significance ? = 0,05. Of the total, 120 genes were detected at 4 DAI and 71 at 10 DAI. The mapped sequences were compared against those deposited in NCBI and TAIR databanks using BLASTx and subsequently annotated using Blast2GO and MapMan softwares. Similarity to known proteins was detected for 90% of the unigenes (24,604/27,195) and 69% (16,991/24,604) of them were annotated. Regarding assessing differential expression, 98% (188/191) of the transcripts showed similarity to known proteins and 67% (127/188) were annotated. Transcripts were attributed to different putative functional categories and the ontological term \'metabolic process\' was predominant within both platforms. Gene annotation within MapMan platform showed predominance of stress-related pathway categories, with prevalence of defense genes overexpressed at 4 DAI and repressed at 10 DAI. Finally, 10 genes showed differential expression at both 4 and 10 DAI: seven were stably overexpressed in the inoculated plants, and three showed an opposite behavior regarding the evaluation periods. Attention was given to a gene encoding a probable inactive ADP-ribosyltransferase and four genes related to wound response.

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma importante cultura agrícola, sendo hospedeira de vários patógenos, incluindo o fungo biotrófico Sporisorium scitamineum, agente causal do carvão. A doença reduz a produtividade das lavouras de cana e a qualidade de seus produtos, sendo reconhecida pelo desenvolvimento de uma estrutura em forma de chicote, onde os teliósporos são produzidos. O objetivo deste estudo foi analisar o transcritoma da interação cana-de-açúcar - S. scitamineum, visando a identificação de genes do hospedeiro diferencialmente expressos em resposta à infecção fúngica. Gemas da variedade tolerante \'RB92-5345\' foram inoculadas com S. scitamineum e mantidas em casa de vegetação para a coleta das amostras, em dois momentos: 120 h após a inoculação, e no momento da emissão do chicote, aos 200 dias após a inoculação. Foram construídas 12 bibliotecas com base na abordagem RNAseq. Três estratégias computacionais foram utilizadas nas etapas de mapeamento e análise da expressão diferencial de genes da cana: (i) STAR e DESeq, tomando como referência o genoma do sorgo; (ii) Bowtie 2 e DESeq, e (iii) CLC Genomics Workbench, tomando como referência as sequências codificadoras (CDS) do sorgo. Diagramas de Venn foram construídos para identificar genes diferencialmente expressos comuns às três estratégias computacionais, aumentando a acurácia das análises. Para a anotação, foi usada a ferramenta BLAST2GO. Foram obtidos 225 milhões de reads; dentre os 185 milhões usados no mapeamento, 66% foram mapeados em genes e 51% nas CDS. Aproximadamente 77% dos genes e 87% das CDS mapeados apresentaram atividade transcricional (pelo menos um read mapeado), sob as condições do experimento, em ambos os momentos da interação. Um total de 596 e 2.148 genes diferencialmente expressos foram identificados nas respostas iniciais e tardias à infecção, respectivamente; para 79% deles foi possível atribuir uma função. Pelas intersecções, 41 (resposta inicial) e 206 (resposta tardia) genes foram comuns às três estratégias. Sugere-se que a planta percebe o patógeno no início da interação, porém o fungo é capaz de suprimir a resposta de defesa vegetal. Propõe-se que há uma reprogramação da expressão gênica defesa-orientada, favorecendo o desenvolvimento da planta, mesmo com a doença instalada. A expressão de genes relacionados à resistência, às vias de hormônios e com a formação da parede celular (além de inibidores de proteínas fúngicas) sugerem que a planta se empenha drasticamente para sobreviver após 200 dias de interação. Decifrando os perfis do transcritoma da cana na interação com S. scitamineum, este trabalho deve contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos de resistência ao carvão. / Sugarcane (Saccharum spp.) is an important crop, and hosts several pathogens, including the biotrophic fungus Sporisorium scitamineum, the causal agent of smut. The disease reduces the sugarcane crop yield and the quality of its products, and is recognized by the development of a whip-like structure, where teliospores are produced. The objective of this study was to analyze the transcriptome of sugarcane - S. scitamineum interaction and to identify differentially expressed genes from the host in response to fungal infection. Buds of the tolerant variety \'RB92-5345\' were inoculated with S. scitamineum and maintained in a greenhouse for two sampling interaction moments: 120 h after inoculation, and at the moment of the whip emission, 200 days after inoculation. Twelve libraries were constructed based on RNAseq approach. Three computational strategies were used in the mapping step and differential expression analysis of sugarcane genes: (i) STAR and DESeq, using as reference the sorghum genome; (ii) Bowtie 2 and DESeq, and (iii) CLC Genomics Workbench, using as reference the coding sequences (CDS) from sorghum. Venn diagrams were created to identify differential expressed genes that were common to the three computational strategies, thus increasing the analysis accuracy. For annotation, the BLAST2GO tool was used. We have obtained 225 million reads; out of the 185 million reads used for mapping, 66% were mapped to genes and 51% to CDS. Approximately 77% and 87% of the mapped genes and CDS respectively showed transcriptional activity (at least one read was mapped) under the experimental conditions at both interaction moments. A total of 596 and 2,148 differentially expressed genes were identified at early and late responses to the infection, respectively; it was possible to attribute function to 79% of them. Through intersectioning, 41 (early response) and 206 (late response) genes were found to be common to the three strategies. It is suggested that the plant recognizes the pathogen at the beginning of interaction period, though the fungal is able to suppress the host defense response. It is also proposed that a defense-oriented transcriptional reprogramming takes place, supporting plant development even with the disease setting. The expression of genes related to resistance, hormone pathways, and cell wall formation (as well as inhibitors of fungal proteins) suggests that the plant makes exceptional efforts to survive after 200 days of interaction. Deciphering the sugarcane transcriptome profile during the interaction with S. scitamineum, this study should contribute to a better understanding of the resistance mechanisms to the smut.

Orientadores: Ana Maria Lima de Azeredo Espin, Tatiana Teixeira Torres / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T02:29:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_GiseleAntoniazzi_M.pdf: 5837869 bytes, checksum: 23826467e3b82c7f5176f5bfdcecb022 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Os estudos da base molecular do comportamento são difíceis de serem realizados uma vez que um comportamento pode ser moldado por diversos fatores (incluindo fatores genéticos). Vários trabalhos ligaram genes a comportamentos específicos. Com bases nesses estudos, nós usamos espécies da família Calliphoridae como modelo para o estudo da evolução do hábito de parasitismo. Espécies muito próximas de califorídeos exibem comportamentos alimentares diferentes como o hábito necrófago ou parasita. Ainda não se sabe como o hábito de parasitismo surgiu em Calliphoridae, no entanto, existem diversas estratégias para tentarmos entender a evolução do hábito de parasitismo. Uma delas envolve a análise da expressão de genes candidatos relacionando as diferenças de expressão observadas com os diferentes hábitos alimentares. Assim, nós utilizamos a técnica de PCR em tempo real, que mede a expressão do gene de interesse em relação a um gene de referência. O uso do gene de referência tem como objetivo retirar uma parte da variação experimental. Portanto, esse gene deve não deve variar sua expressão nas diferentes espécies que foram estudadas. Então, primeiramente selecionamos e validamos genes de referência para obtermos uma quantificação mais precisa dos níveis de expressão dos genes candidatos. Após essa etapa, selecionamos genes candidatos e os separamos em quatro categorias: a) genes diretamente relacionados ao comportamento alimentar, b) genes relacionados ao metabolismo de substâncias tóxicas, c) genes relacionados a respostas imunológicas e; d) genes diretamente ligados ao hábito de parasitismo. A expressão de oito genes candidatos foi analisada em espécies dos gêneros Chrysomya e Cochliomyia. Além disso, foi possível inferir como a expressão desses genes evolui dentro da família Calliphoridae. Nós observamos uma grande conservação nos níveis de expressão gênica em larvas e em adultos evidenciamos diferenças de expressão correlacionadas com a divergência entre as espécies. O gene que se destacou em nossas análises por sua possível relação com o hábito alimentar deve ser estudado detalhadamente para dar continuidade ao projeto / Abstract: Studies involving the molecular basis of behavior are difficult to perform because behavior is shaped by several factors (including genetic factors). Several studies have linked genes to specific behaviors. Based in these studies, we used species of the family Calliphoridae to study the evolution of parasitism. Closely related species of this family exhibit different feeding behaviors (obligate parasites and saprophagous species). It is unclear how parasitism arose in Calliphoridae, however, it is possible to observe in their evolutionary history that this habit appears in three separate occasions. One approach to initiate this study is to examine the expression of candidate genes. For this purpose, we used real time PCR, but gene expression is measured relative to a reference gene. The use of a reference gene is to remove a part of the experimental variation. Therefore, this gene is expected not to vary its expression in the different species studied. Thus, we first selected and validated reference genes to obtain a more accurate quantification of gene expression levels. After this step, we selected candidate genes and separated them into four categories: a) genes directly related to feeding behavior, b) genes related to metabolism of toxic substances, c) genes related to immune responses and d) genes directly linked to parasitism. We analyzed the expression of eight candidate genes in species of Chrysomya and Cochliomyia genera. Moreover, it was possible to infer how the expression of these genes is evolving within family Calliphoridae. We observed a wide conservation in gene expression levels in larvae and in adults there was evidence of neutral evolution (genes differentially expressed among species). The gene Mvl may be involved in the different feeding habits and paved the way to continue the study of the evolution of parasitism / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Leishmania é um gênero de protozoários tripanossomatídeos, dimórficos, causadores das leishmanioses. As espécies do subgênero Viannia, como Leishmania (Viannia) braziliensis, são causadoras da leishmaniose cutânea e cutâneo-mucosa nas Américas Central e do Sul. A regulação da expressão gênica em Leishmania ocorre preferencialmente no nível póstranscricional com a participação de elementos regulatórios de ação cis e trans e proteínas ligantes de RNA. Neste contexto, RNAs não codificadores (ncRNAs) conhecidos por seus papéis regulatórios em diversos organismos, ainda são pouco explorados em Leishmania. Sendo assim, o presente estudo analisou o transcriptoma de L. braziliensis explorando o conteúdo codificador e não codificador do parasita. A investigação de expressão diferencial (DE), incluindo análises de enriquecimento de ontologias gênicas, confirmou padrões de expressão, por categoria funcional, como os já reportados para outras espécies de Leishmania durante o desenvolvimento. No entanto, a avaliação do conjunto desses genes DE, empregando a ortologia como parâmetro, sugeriu uma possível contribuição de genes parálogos para a diversidade entre espécies de Leishmania. Para a análise de ncRNAs, um pipeline desenvolvido por Patrícia C. Ruy possibilitou a identificação e caracterização de 11372 ncRNAs putativos em L. braziliensis. Análises acerca dos padrões de expressão diferencial foi conduzido e trinta e cinco ncRNAs putativos foram categorizados, selecionados e submetidos a Northern blotting para avaliação do tamanho e confirmação do padrão de expressão; seis genes foram selecionados para análises funcionais subsequentes. Para avaliação de uma possível função para os ncRNAs a serem investigados, foram gerados parasitos nocaute de cinco desses ncRNAs. O crescimento dos parasitos nocaute em cultura axênica não foi afetado pela ausência dos genes mas o perfil de infecção de macrófagos in vitro foi afetado em 4 dos 6 transfectantes; sugerindo que os ncRNAs sejam funcionais. Cinco ncRNAs foram submetidos a ensaios de pull-down e o conjunto de proteínas ligantes desses transcritos foi identificada. Esse estudo do transcriptoma de L. braziliensis contribui para o entendimento da modulação da expressão dos genes codificadores de proteínas, revela o conteúdo de ncRNA putativos, sua expressão diferencial durante o seu desenvolvimento e ensaia os primeiros estudos funcionais sobre os últimos / Leishmania is a genus of trypanosomatid protozoan parasites, causative agents of leishmaniases. Viannia sub-genera species as Leishmania (Viannia) braziliensis are the causative agents of cutaneous and muco-cutaneous leishmaniasis in Central and South America. The gene expression in this parasites is regulated via post-transcriptional mecanisms comprising the action of cis and trans regulatory elements and RNA binding proteins. In this context, non coding RNAs poorly explored as putative factors involved in regulation of gene expression in Leishmania must be investigated. In this study the transcriptome of coding and ncRNAs of L. braziliensis were analysed. Differential expression analysis, including gene ontology enrichment analysis, during the parasite development revealed the expected paterns for gene expression in Leishamnia spp. A comparative analysis, considering up-regulated genes suggested a contribution of paralogues genes to diversity between Leishmania. spp. To uncover putative ncRNAs, a computational pipeline was previous designed identifying and characterizing 11,372 putative ncRNAs in L. braziliensis, allowing a classification into different ncRNAs classes. The differential expression analysis revealed similar patterns to those observed for protein coding genes. Thirty-five putative ncRNAs were categorized, selected and subjected to Northern blotting being 6 of them selected to functional analysis. These selected group was investigated conducting and stablishing knockout lines, that revealed phenotypic differences concerning diminishing in promastigote growth and in vitro macrophage infection, suggesting possible functional roles of ncRNAs in L. braziliensis. Finnaly, the protein interactions of these ncRNAs were revealed and must be explored in the future to uncover possible regulatory roles of this ncRNAs until now, putative in L. braziliensis. This work represents an outline of L. braziliensis transcriptome contributing to improve the understanding of coding and noncoding RNA content in the parasite

<p>For many years, researchers have developed ways to diagnose degenerative disease in the retina by utilizing multiple gene analysis techniques. Retinitis pigmentosa (RP) disease can cause either partially or totally blindness in adults. For that reason, it is crucial to find a way to pinpoint the causes in order to develop a proper medication or treatment. One of the common methods is genome-wide analysis (GWA). However, it cannot fully identify the genes that are indirectly related to the changes in eye size. In this research, RNA sequencing (RNA-seq) analysis is used to link the phenotype to genotype, creating a pool of candidate genes that might associate with the RP. This will support future research in finding a therapy or treatment to cure such disease in human adults.</p> <p><br></p> <p>Using the Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP) – a gene reference panel of fruit fly – two types of datasets are involved in this analysis: eye-size data and gene expression data with two replicates for each strain. This allows us to create a phenotype-genotype map. In other words, we are trying to trace the genes (genotype) that exhibit the RP disease guided by comparing their eye size (phenotype). The basic idea of the algorithm is to discover the best replicate combination that maximizes the correlation between gene expression and eye-size. Since there are 2N possible replicate combinations, where N is the number of selected strains, the original implementation of sequential algorithm was computationally intensive.</p> <p><br></p> <p>The original idea of finding the best replicate combination was proposed by Nguyen et al. (2022). In this research, however, we restructured the algorithms to distribute the tasks of finding the best replicate combination and run them in parallel. The implementation was done using the R programming language, utilizing doParallel and foreach packages, and able to execute on a multicore machine. The program was tested on both a laptop and a server, and the experimental results showed an outstanding improvement in terms of the execution time. For instance, while using 32 processes, the results reported up to 95% reduction in execution time when compared with the sequential version of the code. Furthermore, with the increment of computational capabilities, we were able to explore and analyze more extreme eye-size lines using three eye-size datasets representing different phenotype models. This further improved the accuracy of the results where the top candidate genes from all cases showed connection to RP.</p>

O câncer é a segunda maior causa de morte no mundo, sendo responsável por aproximadamente 7,6 milhões de óbitos. Entretanto, pesquisadores alertam para uma associação inversa entre o consumo de frutas e hortaliças e o desenvolvimento de neoplasias, desta forma a organização mundial da saúde sugere, dentre outras medidas para controle do câncer, o aumento do consumo de frutas e hortaliças. Nesse contexto o objetivo deste trabalho foi avaliar os eventuais efeitos quimiopreventivos das hortaliças Brassicas, couve (C) e repolho (R). Realizaram-se dois experimentos sendo o primeiro, o modelo de hepatocacinogênese de Ito, onde as hortaliças foram fornecidas durante 8 semanas na água de beber (10% p/v), animais que receberam apenas água foram utilizados como controle. Nesse experimento não houve inibição (P>0,05) de lesões pré-neoplásicas hepáticas positivas para glutationa S-transferase forma placental e não houve indução (P>0,05) da apoptose nos grupos tratados com C ou R. Contudo, observou-se redução (P<0,05) de danos em DNA hepático e aumento (P<0,05) da concentração hepática de luteína de ratos tratados com C e R, quando comparados a ratos controle. No segundo experimento as hortaliças foram fornecidas durante 8 semanas na água de beber (20% p/v), e os animais foram submetidos a aplicação do carcinogênico hepático 24h antes da eutanásia. Não houve redução (P>0,05) de danos em DNA, contudo a concentração do aduto de DNA 8-hidroxi-2-deoxiguanosina (8-OHdG) e foi elevada (P<0,05) em animais tratados com R quando comparados a tratados com C e controles. Com relação à expressão diferencial de genes, 29 genes foram diferencialmente expressos em fígado, dentre eles o gene da 8-oxoguanina-DNA-glicosilase (enzima de reparo do DNA), foi hipoexpressa no grupo tratado com R, o que pode explicar o aumentado valor de adutos no mesmo grupo. O cólon apresentou 31 genes com diferença de expressão, onde 5 genes estão relacionados ao metabolismo de xenobióticos. / Cancer is the major cause of death in the world, being responsible for approximately 7.6 million deaths. However, there is a hypothesis of an inverse association between fruit and vegetable consumption and the development of cancer. Therefore, the World Health Organization suggests, among other actions for controlling cancer, the increase in vegetable and fruit consumption. The aim of this work was to evaluate eventual chemopreventive effects of Brassicas vegetables, kale (K) and cabbage (C). Two experiments were done: the first one was Ito´s hepatocarcinogenesis model, where vegetables were provided during 8 weeks in the rats´ drinking water (10% w/v). Animals that received only water were considered control. In this experiment, there was no inhibition (P<0,05) of glutathione S-transferase placental form positive preneoplastic lesions and, also, there was no induction (P<0,05) of apoptosis in the groups treated with K or C However, it was observed a reduction (P<0,05) in hepatic DNA damages and an increase (P<0,05) in lutein hepatic concentration of rats treated with K or C, when compared to the control. In the second experiment, the vegetables were provided during 8 weeks in the rats´ drinking water (20% w/v), and animals were submitted to carcinogenic application 24h before euthanasia. There was no reduction (P<0,05) in DNA damages, however there was an increase (P<0,05) in the concentration of 8-hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHdG) DNA in animals treated with C when compared to the ones treated with K and control. In relation to the differential gene expression, 29 genes were differently expressed in the liver, such as the 8-oxoguanine-DNA-glycosylase gene, which was downregulated in the group treated with C. This might explain the increased value of adducts in the same group. Colon presented 31 genes with difference in expression, whereas 5 genes are related to xenobiotic metabolism.

A citricultura destaca-se dentro do agronegócio brasileiro gerando dividendos diretos com exportações e empregos, e indiretos com arrecadação de impostos. No entanto, ainda padece com problemas fitossanitários, com destaque para o HLB (Huanglongbing, HLB, ex-greening), que nos últimos dez anos tem dizimado pomares e provocado o abandono da cultura por muitos produtores. Causada no Brasil pelas bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus e Ca. Liberibacter americanus, é uma doença sistêmica, restrita aos vasos do floema, e induz ao aparecimento de sintomas semelhantes àqueles causados por deficiência de nutrientes em folhas e ramos, frutos com tamanhos reduzidos e assimétricos e coloração amarelada das plantas, tornando-as economicamente inviáveis. A transmissão da doença acontece naturalmente pelo inseto Diaphorina citri, e artificialmente por meio de borbulhas contaminadas. Todas as variedades de citros e rutáceas próximas são comprovadamente suscetíveis ao HLB; entretanto, há diferenças marcantes entre níveis de suscetibilidade entre os genótipos, como Poncirus trifoliata, que apresenta certa resistência ou tolerância à doença. Os mecanismos de patogenicidade de Ca. Liberibacter spp. e a resposta molecular da planta à infecção ainda não estão bem definidos e o estudo da ativação dos mecanismos de defesa da planta induzidos por hormônios vegetais é um importante foco na elucidação deste complexo patossistema. Diante deste panorama, este estudo propôs avaliar o perfil de expressão de genes associados às vias do jasmonato e do etileno em plantas de Citrus sinensis L. Osb. (suscetível) e Poncirus trifoliata (L.) Raf. (resistente ou tolerante) em resposta à infecção pelas duas espécies de bactérias causadoras do HLB no Brasil, separadamente. Os perfis transcricionais dos genes avaliados não foram estatisticamente distintos, mas mereceram destaque os genes de biossíntese e metabolismo de jasmonato LOX2, AOC3 e JMT, os genes sinalizadores da via de jasmonato JAZ2 e MYC2, o gene de biossíntese de etileno SAM1, os receptores de etileno ETR1, ERS1 e EIN4, o regulador negativo de etileno CTR1, o regulador positivo da sinalização de etileno EIN2, os fatores de transcrição EIN3, EIL1, ERF1, ERF2, ERF/AP2, uma MAPkinase MAPK6 e uma proteína PR PR-4. Estes resultados mostram que as vias sinalizadas por jasmonato e etileno são modificadas pelas bactérias Ca. Liberibacter spp. No entanto, não foi possível comprovar a importância destas vias na resposta diferencial de genótipos suscetível e resistente/ tolerante de citros ao HLB. / The citrus industry stands out in the Brazilian agribusiness generating direct and indirect jobs and significant revenues. However, the citrus crop faces several diseases, especially the HLB (Huanglongbing, ex-greening), which, in the last ten years, have caused severe losses to growers. In Brazil, HLB is caused by the bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus and Ca. Liberibacter americanus, which are restricted to the phloem and induce symptoms similar to those caused by nutrient deficiency in citrus leaves and branches. Fruits are of reduced size and asymmetrical, and the plants tend to show overall yellowing. These symptoms altogether lead to the economical death of the plant. Transmission of the pathogens occurs naturally by the Asian citrus psyllid Diaphorina citri, or by contaminated buds. All citrus varieties and relatives are considered susceptible to HLB; however, there are clear differences in levels of susceptibility among genotypes. Poncirus trifoliata, for instance, exhibits some resistance or tolerance to the disease. The mechanisms involved in the pathogenesis of Ca. Liberibacter spp. and the molecular responses of the hosts to the infection are still unknown, but emphasis has been given to the defense mechanisms induced by plant hormones in order to try to elucidate the interactions of such complex pathosystem. Based on this scenario, this study aimed to evaluate the expression profile of Citrus sinensis (L.) Osb. (susceptible) and Poncirus trifoliata (L.) Raf. (resistant or tolerant) genes associated with the jasmonate and ethylene pathways in response to infection by both species of Ca. Liberibacter spp. causing HLB in Brazil, separately. The transcriptional profiles did not differ statistically, for the evaluated genes, including those in the jasmonate biosynthesis and metabolism (LOX2, AOC3 and JMT), signaling pathway (JAZ2 and MYC2), biosynthesis of ethylene (SAM1), ethylene receptors (ETR1, ERS1 and EIN4), negative regulator of ethylene (CTR1), positive regulator of ethylene signaling (EIN2), transcription factors (EIN3, EIL1, ERF1, ERF2, ERF/AP2), a MAPkinase (MAPK6) and a PR protein (PR-4). These results suggest that the jasmonate and ethylene pathways exhibit some modulation caused by the bacteria Ca Liberibacter spp. However, it does not seem that these pathways are relevant for the differential response of susceptibility or resistance/ tolerance of the citrus genotypes to HLB.