Congenital hypothyroidism (CH) is the most frequent of the rare endocrine diseases (e.g. Addison's disease, Cushing's syndrome, Congenital adrenal hyperplasia.), which affects 1:2000 – 4000 newborns. If not immediately diagnosed after birth, thyroid hormones deficiency causes severe defects in brain and skeletal development leading to a complex clinical scenario called cretinism. CH can be due to a defective synthesis of thyroid hormones (dyshormonogenesis) or an abnormal embryonic development of the gland. Data obtained using knockout mouse models have shown the pivotal role of four specific transcription factors (NKX2.1, PAX8, FOXE1 and HHEX) for the correct organogenesis or function of the gland. Although mutations in those genes have been identified in few cases of CH patients, the pathogenetic mechanisms remain still elusive in the vast majority of CH cases (95%).<p>For the identification of new genes and molecular events controlling thyroid organogenesis it would be useful to develop an in vitro cellular model to recapitulate thyroid embryogenesis in a dish. Embryonic Stem Cells (ESCs) have recently emerged as system model to recapitulate the embryogenesis of several tissues in vitro.<p>Induced overexpression of defined transcription factors has been shown to have a directing effect on the differentiation of pluripotent stem cells into specific cell types. In this thesis I show that a transient overexpression of the transcription factors NKX2.1 and PAX8 is sufficient to direct the differentiation of murine ESCs into thyroid follicular cells (TFC) and promotes in vitro self- assembly of TFC into three-dimensional follicular structures, when associated to a subsequent thyrotropin (TSH) treatment. Cells differentiated by this protocol showed significant iodide organification activity, a hallmark of thyroid tissue function. Importantly, athyroid mice grafted with mESC-derived thyroid follicles show normalization of plasma T4 levels with concomitant decrease of plasma TSH. In addition, a full normalization of body temperature at 4 weeks after transplantation was observed. Together, these data clearly demonstrate that grafting of our mESC-derived thyroid cells rescues the hypothyroid state and triggers symptomatic recovery along with the normalization of plasma hormone concentrations. The high efficiency of TFC differentiation and follicle morphogenesis in our system will provide an unprecedented opportunity for future studies to decipher regulatory mechanisms involved in embryonic thyroid development, a major research need towards an improved understanding of the molecular mechanisms underlying congenital hypothyroidism, the most common congenital endocrine disorder in humans. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Mécanismes d’activation et conséquences fonctionnelles de la dimérisation des récepteurs aux chimiokines<p><p>Les chimiokines sont de petites protéines qui régulent la migration des cellules immunitaires. Elles exercent leur action en se liant à des récepteurs appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) dont la fonction est intimement liée à la régulation des cellules immunitaires. Notre laboratoire étudie depuis plusieurs années les relations reliant la structure et la fonction des récepteurs aux chimiokines. Ces dernières années, un nouveau concept est venu révolutionner le mode de fonctionnement des RCPGs. En effet, des travaux ont montré que la plupart des RCPGs sont capables de former des dimères. Le but de cette thèse de doctorat est d’étudier de manière systématique la dimérisation des récepteurs aux chimiokines et d’analyser les conséquences fonctionnelles de la dimérisation. <p><p>Dimérisation des récepteurs humains aux chimiokines et conséquences fonctionnelles<p><p>En utilisant une technique biophysique basée sur un transfert d’énergie de luminescence (BRET) nous avons montré au cours de ce travail de thèse que les récepteurs CCR1, CCR2, CCR5, CCR7 et CXCR4 sont capables de former des homodimères et des hétérodimères. De plus, une dimérisation entre ChemR23, dont le ligand naturel, la chémérine, est structurellement différent des chimiokines, et les récepteurs CCR7 et CXCR4, a également été identifiée. <p><p>D’un point de vue fonctionnel, des expériences réalisées au laboratoire dans le cadre d’un autre travail de thèse ont identifié une forme de compétition croisée entre CCR2, CCR5 et CXCR4 où la liaison de ligands (agonistes ou antagonistes) spécifiques de l'un des deux récepteurs inhibe la liaison des ligands spécifiques de l’autre. Ces effets ont été démontrés sur des cellules recombinantes mais aussi sur des cellules immunes et dans un modèle in vivo. (El-Asmar, 2005; Springael, 2006; Sohy, 2007; Sohy, 2009). Au cours de ce travail, nous nous sommes dans un premier temps focalisés sur les <p>hétéromères de ChemR23 avec CXCR4 et CCR7 et nous avons ensuite étudié plus en profondeur les hétéromères de CCR7. Concernant la dimérisation de ChemR23 avec les récepteurs aux chimiokines CCR7 et CXCR4, nous avons pu mettre en évidence une coopérativité négative de liaison entre les agonistes des récepteurs comme cela avait pu être démontré pour CCR2/CCR5/CXCR4. Par contre, nous n’avons observé aucun effet de compétition hétérologue ou d’inhibition fonctionnelle croisée de l’AMD3100 sur ChemR23 quand il est coexprimé avec CXCR4. De manière additionnelle, nous avons pu observer cette compétition croisée sur des cellules dendritiques murines immatures, démontrant l’existence des effets de l’hétérodimérisation lorsque les récepteurs sont exprimés à un niveau physiologique. Lors de l’étude approfondie des hétéromères de CCR7, nous avons montré que les conséquences fonctionnelles de l’hétérodimérisation de CCR7 sont différentes suivant le récepteur avec lequel il interagit. Pour l’hétérodimère CCR7/CCR2, nous avons identifié une forme de compétition croisée, où la liaison de ligands spécifiques de l'un des deux récepteurs inhibe la liaison des ligands spécifiques de l’autre, rejoignant les effets mis en évidence pour les hétéromères CCR2/CCR5/CXCR4. Ensuite, nous avons montré pour l’hétérodimère CCR7/CCR5 que les ligands de CCR7 sont capables d’inhiber la liaison des ligands spécifiques sur CCR5 mais que l’inverse n’est pas vrai. Enfin, pour l’hétérodimère CCR7/CXCR4, nous n’avons pas pu mettre en évidence d’inhibition croisée, que ce soit dans un sens ou dans l’autre. D’autre part, un effet inhibiteur de CCR7 a également été identifié pour les hétéromères CCR7/CCR5 et CCR7/CXCR4. Nous avons pu montrer que l’expression de CCR7 exerce un effet négatif sur la réponse fonctionnelle de certains récepteurs hétérologues comme CCR5 et CXCR4 mais pas CCR2 ou ChemR23.<p><p>L’ensemble de ces données permet de mieux comprendre les interactions entre récepteurs et pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles pour les programmes de recherche de molécules thérapeutiques, qui, jusqu’à présent, ciblaient presque exclusivement un seul et unique récepteur.<p><p>Etude du mécanisme d’activation du récepteur CCR5 et étude de la relation entre activité constitutive et dimérisation.<p><p>De nombreux travaux ont été menés ces dernières années afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à la base de l’activation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Il apparaît que les RCPGs peuvent se trouver dans plusieurs états conformationnels, dont certains sont favorisés par la présence d’agonistes ou d’antagonistes, ou encore d’anticorps reconnaissant des épitopes conformationnels. Certaines mutations peuvent également induire la stabilisation de certaines conformations, actives ou inactives. Pour les RCPGs appartenant à la famille de la rhodopsine, il en a résulté un modèle selon lequel les récepteurs sont maintenus dans une conformation inactive par un ensemble d’interactions ioniques impliquant l’arginine (R3.50) d’un motif DRY conservé, présent à l’extrémité cytosolique du troisième segment transmembranaire. Les interactions responsables de ce qu’on appelle le « DRY-lock » feraient intervenir notamment l’aspartate (D3.49) adjacent de l’arginine et un aspartate ou glutamate (D/E6.30) localisé au sein de l’hélice 6. Selon ce modèle, la liaison d’un agoniste, ainsi que certaines mutations, favoriseraient la rupture de ces interactions ioniques, et une conformation permettant aux récepteurs de se coupler plus efficacement aux protéines G. Des résultats du laboratoire indiquent cependant que ce modèle ne serait pas transposable complètement au récepteur CCR5. <p><p>CCR5 possède intrinsèquement une activité constitutive en absence d'agoniste. Cette activité peut être mise en évidence par l'action d'un des antagonistes de CCR5, le TAK-779, qui s'est révélé posséder une activité de type agoniste inverse. D'autre part, CCR5 possède au sein de l'hélice 6 une arginine en position 6.30 et non pas un glutamate ou un aspartate. Une arginine à cette position ne peut donc contribuer au maintien d’une conformation inactive par interaction avec R3.50 .Dans le but de tester le modèle de « DRY-lock » sur CCR5 et de mieux comprendre les interactions moléculaires impliquées dans l’activation du récepteur, plusieurs récepteurs mutants ont été construits au laboratoire. Tout d’abord, l’arginine 3.50 du motif DRY a été mutée en Asn (R3.50N) afin de rompre les interactions ioniques de ce résidu. L’aspartate 3.49 a été muté en Asn (D3.49N) ou en Val (D3.49V), afin de neutraliser une des interactions du « DRY-lock » (Lagane, 2005). L’arginine 6.30 a été mutée d’une part en Asp (R6.30D) ou en Glu (R6.30E), afin de rétablir une possibilité d’interaction avec R3.50, d’autre part en Ala (R6.30A) et en Gln (R6.30Q) afin de mieux cerner le rôle de la charge de l’arginine. Afin de tester l’hypothèse d’interaction entre le résidu 6.30 et le résidu 2.40, l’aspartate 2 .40 a été mutée en Ala (D2.40A) ou en Arg (D2.40R) et des récepteurs présentant les deux mutations ont également construits (D2.40A/R6.30A et D2.40R/R6.30D). L’ensemble des résultats obtenus par l’analyse de ces mutants a permis de montrer que la nature des interactions entre l’extrémité cytosolique des hélices 3 et 6 influence l’activité du récepteur CCR5 (Springael, 2007). Une interaction forte conduit à une forme de récepteur inactif alors qu’une interaction faible s’accompagne d’une augmentation d’activité constitutive. Cette propriété de CCR5 serait donc partagée avec d’autres récepteurs appartenant à la famille de la rhodopsine. Cependant les interactions inter-hélice stabilisant ces conformations seraient différentes pour CCR5. D’autre part, l’étude de la position 2.40 laisse supposer l'importance du résidu aspartate 2.40 dans le maintien d'une conformation permettant l'activité constitutive du récepteur. Nous avons également testé s’il existait une corrélation entre activité constitutive et capacité du récepteur CCR5 à former des dimères, mais les résultats ne nous ont pas permis de mettre en évidence une quelconque relation entre activité et dimérisation.<p><p> <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Shigella flexneri est une bactérie à Gram négatif responsable du décès d’environ un million d’individus par an dont la majorité est des enfants âgés de moins de 5 ans. A ce jour, aucun vaccin satisfaisant n’est disponible et la résistance aux antibiotiques ne cesse dangereusement d’augmenter. Pour éradiquer la shigellose il est impératif de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires associés à la pathogénie de Shigella.<p>Dans le cadre de notre projet de thèse, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de plusieurs gènes situés sur le plasmide de virulence de S. flexneri dont SfpgdA, Sfgtr4, virK et les gènes spa9, spa24 et spa29 localisés dans la région d’entrée spécifiant l’appareil de sécrétion de type 3 (AST3). Pour ce faire, nous avons dans un premier temps généré des souches de Shigella mutées (KO) de ces gènes et étudié ensuite leurs propriétés de virulence aussi bien in vitro, dans des modèles cellulaires, qu’in vivo, dans un modèle animal. Nos résultats montrent que le gène SfpgdA code pour une peptidoglycane (PG) déacétylase nécessaire à la survie de Shigella dans les polymorphonucleaire neutrophiles (PMNs). Nous avons également montré que le gène Sfgtr4 spécifie une lipopolysacharide (LPS) glycosyle transférase impliquée dans la résistance au lysozyme et dans la survie dans les PMNs. Des études antérieures avaient montré qu’une mutation à l’aide d’un transposon du gène virK abolissait la dissémination de Shigella entre les cellules épithéliales par un mécanisme restant inconnu. Afin d’investiguer ce mécanisme, nous avons construit un mutant non-polaire du gène virK et étudié son phénotype. A notre grand étonnement, nous avons démontré que ce mutant présente les mêmes propriétés de virulence que la souche sauvage de Shigella. Par contre, comme pour les gènes SfpgdA et Sfgtr4, nous avons montré que le mutant virK est également affecté dans sa résistance au lysozyme et dans sa persistance dans les PMNs. De plus, nous avons montré que l’ensemble des gènes SfpgdA, Sfgtr4 et virK, est impliqué dans la résistance au système immunitaire grâce à la régulation de la sécrétion des cytokines proinflammatoires TNF-α et IL-6. L’existence d’homologie frappante entre les 3 gènes étudiés et des gènes impliqués dans la formation de biofilm chez plusieurs bactéries nous a incités à investiguer cette propriété pour Shigella. Nous avons ainsi montré, pour la première fois, que la souche sauvage de Shigella forme des biofilms in vitro. De plus, nous avons montré que cette formation est accélérée dans les mutants SfpgdA, Sfgtr4 et virK. Finalement, nous avons identifié un réseau d’interactions entre SfPgdA, SfGtr4, VirK et MsbB2, suggérant l’existence d’un complexe localisé à la surface bactérienne qui serait responsable des modifications engendrées au niveau du PG et ou LPS. <p>Dans une autre partie de notre travail nous nous sommes intéressés aux gènes spa9, spa24 et spa29. Nous avons montré que ces 3 gènes sont nécessaires à la sécrétion des protéines de virulence et à l’invasion cellulaire. De plus, nous avons montré qu’un domaine central de la protéine Spa24 (Spa24SD) est nécessaire à l’assemblage de l’AST3 grâce à ces interactions avec différents composants de ce système.<p>La dernière partie de notre travail a porté sur l’étude du gène orf182 et du gène ushA qui existe en 2 copies dans le génome bactérien (un plasmidique et un chromosomique). Les souches de Shigella KO de ces gènes, dans les tests effectués in vitro, présentent approximativement le phénotype sauvage et devraient faire l’objet d’étude plus avancées. <p>En conclusion, nos travaux feront l’objet de 4 publications et représentent une contribution importante à la compréhension des mécanismes moléculaires associés à la pathogénie de Shigella. De plus, nos travaux dépasseront le cadre de Shigella puisque les gènes étudiés ici sont conservés chez plusieurs bactéries pathogènes.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Malgré l’avancée considérable des connaissances sur le génome humain, de nombreuses maladies génétiques restent mal comprises car nous ignorons encore quel gène porte la mutation responsable d’une pathologie spécifique. Notre travail s’intègre dans le cadre de l’étude des maladies génétiques héréditaires monogéniques récessives, maladies rares mais qui ensemble touchent près d’1% de la population globale.<p>Les maladies récessives sont des maladies génétiques dont le phénotype malade ne se déclare que lorsque les deux allèles d’un gène sont mutés, hérités chacun d’un parent porteur. L’approche que nous utilisons pour localiser le gène causal dans le génome est l’analyse de liaison génétique. Les familles consanguines sont le profil idéal pour ce type d’étude car l’hypothèse peut être faite que les enfants atteints ont hérité deux fois de la même mutation, chaque allèle malade provenant d’un parent porteur et hérité d’un ancêtre commun relativement proche Dans cette optique, nous établissons une cartographie d’homozygotie (homozygosity mapping) du génome des patients, c à d que nous recherchons à travers le génome complet des zones d’homozygotie indiquant une identité par descente à partir d’un ancêtre commun (1) en à testant systématiquement un grand nombre de marqueurs génomiques polymorphes (microsatellites d’ADN et SNPs) répartis sur tous les chromosomes dans l’ADN extrait de tous les membres de la famille, atteints et non atteints. Ensuite nous inspectons la région homozygote à la recherche des meilleures gènes candidats, que nous séquençons jusqu’à trouver une mutation dont le rôle causal de la pathologie soit convaincant.<p>Nous avons étudié une famille constituée de 2 boucles de consanguinité avec plusieurs enfants atteints d’épilepsie myoclonique progressive (PME). <p>Nous avons criblé le génome entier des patients au moyen d’un kit permettant l’analyse de 382 microsatellites et avons confronté ces résultats avec ceux d’une analyse sur puce de 10.000 SNPs. Cela nous a permis de mettre en évidence un nouveau locus de PME s’étalant sur une dizaine de cM sur la région centromérique du chromosome 7. La valeur maximale du LOD score que nous avons calculé atteint 4.0 rendant ce locus significatif. Dans cet intervalle, contenant environ 85 gènes annotés, nous avons séquencé le gène KCTD7 car il s’agit de l’acronyme pour K+ Channel Tetramerization Domain 7, spéculant sur une interaction potentielle avec un canal potassique. Ce séquençage a révélé une mutation non sens homozygote chez les atteints, hétérozygotes chez les parents, et totalement absente dans une série de 100 contrôles. Cette mutation, sur l’exon 2 de KCTD7, substitue une arginine par un codon stop, tronquant deux tiers de la protéine (289aa total). L’ensemble de ces résultats ont été repris dans une première publication au journal Annals of Neurology en 2007 (2). <p>Au début de ce travail, le gène KCTD7 était une simple annotation génomique. Son ADNc avait été cloné dans un effort systématique à haut débit et des ESTs (expressed sequence tag) en avaient été caractérisés. La famille des protéines KCTDs sont de petites protéines solubles caractérisées par un domaine d’interaction protéine-protéine appelé BTB/POZ. Ces protéines sont impliquées dans une grande variété de processus biologiques. Certaines sont des adaptateurs spécifiques du complexe multimèrique E3 Ubiquitine Ligase (2), d’autres sont impliquées dans l’assemblage des récepteurs GABAb (3), d’autres encore sont des protéines nucléaires, stimulant l’activité polymérase de l’ADN polδ2 (4).<p>Nous avons montré, en utilisant la technique du Northern Blot, que l’ARNm du gène KCTD7 était exprimé de manière ubiquitaire (cerveau, cœur, foie, poumon, intestin, colon, reins, rate, yeux, muscle). Ceci a été confirmé par PCR après transcription inverse à partir d’ARNs provenant des mêmes tissus chez la souris adulte. Nous avons également montré que ce gène était déjà exprimé durant la vie fœtale par PCR après transcription inverse à partir d’embryon de souris (E6.5 à E14.5).<p>Nos Western Blots ne nous ayant pas permis d’observer la protéine endogène dans les extraits tissulaires totaux, nous avons pensé que la protéine pouvait être rapidement dégradée. Nous avons donc mesuré la demi-vie de la protéine KCTD7 recombinante en cellules COS-7 traitées pour différents temps par la cyclohéximide comme inhibiteur de la synthèse protéique. Cette demi-vie a été évaluée à 6h, ce qui indique que KCTD7 n’est pas une protéine hyper-labile. <p>Puisque nous avions l’hypothèse que KCTD7 puisse interagir avec les canaux ioniques membranaire, nous avons cherché à comprendre sa distribution intracellulaire. Ainsi, nous avons déterminé par immuno-fluorescence que la protéine recombinant KCTD7, marquée par les tags GFP, HIS ou HA, avait une distribution essentiellement périnucléaire en cellules COS-7. Lors des immuno-détections, nous avons utilisé soit l’anticorps contre KCTD7, soit l’anticorps contre le tag, afin de renforcer la validité du marquage. Un signal à la membrane plasmique n’ayant pas été détecté, nous avons postulé que KCTD7 n’interagit sans doute pas directement à cette membrane, que ce soit avec des canaux ioniques membranaires ou des récepteurs de neurotransmetteurs (GABAb). Un modèle de régulateur direct de canaux potassiques associés au réticulum endoplasmique a déjà été proposé pour KCNRG, un membre des protéines KCTDs capable de réguler négativement l’activité des canaux Kv1.1 et Kv1.4 par un contrôle de leur expression à la membrane grâce à leur rétention dans le réticulum endoplasmique (6). <p>A l’instar d’autres protéines de la famille des KCTDs, nous avons montré, par des expériences de co-immunoprécipitation, que KCTD7 était capable de former des homodimères, très probablement grâce à son module d’interaction BTB/POZ comme cela à été montré pour d’autres protéines de la même famille (7). Nous avons également montré par co-immunoprécipitation que KCTD7 interagi avec la Cullin-3 alors qu’il ne lie pas la Cullin-1. Cette protéine fait partie d’un complexe protéique impliqué dans l’ubiquitination de certains substrats. Nous avons montré que KCTD7 n’est pas sujet à l’ubiquitination en cellules COS-7 co-transfectées par KCTD7 et l’ubiquitine-flag, ce qui n’exclu pas qu’il puisse l’être dans un autre système ou d’autres conditions expérimentales. L’ubiquitination, quand elle ne conduit pas son substrat à la dégradation par le protéasome, est un processus qui permet le contrôle de l’expression de nombreuses protéines, dont certains canaux ioniques membranaires (KCNQ2/3 et KNCQ3/5 (8), Kv1.3 (9), Kv1.5 (10) et KCNH2 (11)) et certaines enzymes métaboliques défectueuses dans certaines PME (dont Laforine et Maline (12), Cystatine B (13), β-hexosaminidase (14)). KCTD7 pourrait donc cibler la Cullin-3 vers son substrat et sans être ubiquitiné lui-même. <p>Nous avons étudié plus en détail l’expression de KCTD7 (ARN et protéine) dans le cerveau de souris adulte. Nous avons déterminé à la fois par des expériences d’hybridation in situ (ARN) et d’immunohistochimie (protéine) sur des coupes coronales de cerveau de souris adultes CD1 que KCTD7 semble être spécifiquement localisé dans trois régions distinctes :la couche de cellules mitrales des bulbes olfactifs, le gyrus denté et les régions CA1 et CA3 de l’hippocampe, et enfin la couche de cellules de Purkinje du cervelet. Il apparait que ces zones sont atteintes dans un modèle murin de la maladie d’Unverricht-Lundborg (15), la forme la plus fréquente d’épilepsie myoclonique progressive et très proche du phénotype de nos patients.<p>Enfin, nous avons montré en collaboration avec le laboratoire du professeur Schiffmann par des mesures électrophysiologiques (Patch Clamp en cellule entière) que KCTD7 diminue le potentiel de repos (accroît la polarisation) de la membrane cellulaire de neurones corticaux embryonnaires de souris en cultures primaires, diminuant l’excitabilité neuronale en augmentant la conductance de la membrane plasmique. Ces résultats sont compatibles avec l’idée qu’une perte de fonction de la protéine entraîne une augmentation de l’excitabilité neuronale qui est caractéristique de l’épilepsie. Ces données fonctionnelles sur KCTD7 ont fait l’objet d’un manuscrit actuellement en cours de soumission au journal Molecular and Cellular Neuroscience.<p>Les données que nous avons récoltées sur KCTD7 ont précisé un mécanisme probable d’action de la protéine. Malgré les limitations de nos modèles expérimentaux, nous postulons que le défaut de KCTD7 cause l’épilepsie en modifiant la conductance potassique et par là, le potentiel de repos et l’excitabilité de la membrane plasmique des neurones, peut-être par ubiquitination, via la Culline-3, d’un canal potassique. À notre connaissance, il s’agirait de la première PME dont le défaut primaire serait au niveau du potentiel membranaire. Cette hypothèse cadre bien avec l’observation clinique que les patients les plus atteints étaient ceux dont l’épilepsie était la moins bien contrôlée par le traitement, suggérant une dégénérescence secondaire excito-toxique. <p>La suite logique de notre travail serait la définition plus précise de l’expression sub-cellulaire de KCTD7 en microscopie confocale à fluorescence, de son expression spatiale et temporelle chez la souris et si possible chez l’homme, l’étude de l’ubiquitination de sous-unités de canaux potassiques, et le développement d’un modèle animal, poisson zèbre ou souris, afin, entre autres, d’y tester l’hypothèse que la sévérité de l’hyperexcitabilité neuronale elle-même aggrave le phénotype. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le métabolisme des phosphoinositides est constitué d’un réseau complexe d’enzymes et de seconds messagers phospholipidiques et solubles cruciaux pour de nombreux processus cellulaires. Le phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3), second messager très important dans la cellule est contrôlé par plusieurs phosphatases. La phosphatase PTEN, fréquemment mutée dans de nombreux cancers humains (glioblastome, cancer de la prostate, cancer du sein, …), le déphosphoryle en position 3 pour donner du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2). Les cellules de mammifères possèdent également une activité « inositol 5-phosphatase » pour de nombreux dérivés du myo-inositol. C’est la protéine SHIP2 (SH2-containing Inositol 5-phosphatase 2), une lipide phosphatase membre de la famille des phosphatidylinositol polyphosphate 5-phosphatases qui est, entre autres, responsable de cette activité. <p>Le but de ce travail de thèse a été de mettre en évidence un rôle potentiel de SHIP2 et/ou PTEN dans un modèle murin de tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) ;ce modèle exprime une forme constitutivement active du récepteur tyrosine kinase Kit muté sur l’acide aminé 641. Les souris qui ont été générées par le groupe du Dr Brian Rubin (Lerner Research Institute and Taussig Cancer Center, Cleveland) sont dénommées, les souris KitK641E.<p>La caractérisation des souris KitK641E nous a permis de montrer que SHIP2 et PTEN étaient exprimés dans les cellules Kit positives, les cellules de Cajal et qu’ils semblaient régulés de façons différentes.<p>En effet, nous avons pu mettre en évidence une augmentation de l’expression de PTEN dans l’antre gastrique des souris KitK641E homozygotes. Cette augmentation d’expression a également été observée dans l’antre gastrique de souris double transgéniques KitK641E x PTEN+/- alors que l’expression de PTEN dans le foie, un tissu n’exprimant pas de cellules Kit positives, était bien diminuée. Des expériences de PCR quantitative ont également permis de montrer que cette augmentation d’expression de PTEN ne provenait pas d’une augmentation du taux d’ARNm mais qu’elle se situait plutôt au niveau post-traductionnel. Ces données nous permettent de conclure que l’augmentation d’expression de PTEN dans les cellules Kit positives des souris KitK641E homozygotes est influencée par l’activation constitutive du récepteur Kit. <p>A l’inverse, l’expression de SHIP2 dans les cellules Kit positives n’a pu être mise en évidence qu’après activation constitutive du récepteur Kit. En parallèle, l’étude des voies de signalisation dépendantes du récepteur Kit nous ont permis de montrer que la phosphorylation de PKB ne semblait pas être affectée et que ce serait plutôt la voie des MAPK kinases qui interviendrait dans ce modèle. <p>Nous avons également observé la localisation subcellulaire de SHIP2 et de PTEN en utilisant un modèle cellulaire de cellules GIST882 (cellules dérivées d’un GIST humain portant la mutation correspondante à notre modèle murin). Dans ce modèle, PTEN est principalement localisé dans le noyau alors que SHIP2 est localisé à la fois au sein du noyau et du cytoplasme. Ce modèle nous a également permis de montrer que la forme phosphorylée sur tyrosine de SHIP2 (Y1135) était localisée dans le noyau et qu’elle était modulée en fonction du cycle cellulaire.<p>En conclusion, ces travaux ont permis de montrer que dans le modèle de souris KitK641E, SHIP2 et PTEN étaient localisés au sein des cellules Kit positives et qu’ils étaient modulés par des mécanismes différents. L’augmentation d’expression de PTEN observée dans les souris KitK641E homozygotes pourrait constituer un mécanisme de rétrocontrôle négatif afin de modifier l’impact de voies de signalisation en aval du récepteur Kit dans ce modèle oncogénique.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Malgré l’existence de différents vaccins protecteurs à l’égard des infections par B. pertussis, la coqueluche reste une maladie infectieuse fréquente et est encore actuellement responsable de 300.000 décès par an dans le monde. Une meilleure compréhension des réponses immunitaires induites par les principaux facteurs de virulence de B. pertussis est donc importante afin d’optimaliser la vaccination. Alors que le rôle des anticorps dans la protection contre la coqueluche est reconnu depuis de nombreuses années, celui des réponses d’immunité cellulaire a été identifié mais est moins bien caractérisé. <p>Dans ce travail, nous avons analysé différents aspects des réponses d’immunité cellulaire induites par deux antigènes majeurs de B. pertussis, l’hémagglutinine filamenteuse (FHA) et la toxine pertussique (PT) chez des nourrissons. Nous avons étudié la persistance des réponses spécifiques des antigènes de B. pertussis après la primo vaccination des nourrissons et caractérisé différents facteurs qui modulent ces réponses, nous permettant ainsi de comprendre l’hétérogénéité des réponses d’immunité cellulaire observées tant qualitativement que quantitativement. <p>Nous avons montré que les réponses immunitaires spécifiques de la FHA et de la PT pouvaient persister jusqu’à neuf mois après la dernière administration du vaccin contre la coqueluche. Ces réponses immunitaires sont caractérisées par une production d’interféron-gamma (IFN-&61543;) par les cellules sanguines circulantes (PBMC), par une prolifération lymphocytaire ainsi que par une production d’anticorps. Bien que les lymphocytes T CD8+ participent à la sécrétion spécifique d’IFN-&61543; leur participation semble quantitativement moins importante que celle des lymphocytes T CD4+ et dépendante de ces derniers. Cependant, les PBMC de certains enfants vaccinés ne produisent pas ou peu d’IFN-&61472;&61543; après stimulation in vitro par les antigènes de B. pertussis. Cette inhibition, voire absence, de réponse immunitaire de type Th1 spécifique est associée à une sécrétion constitutive d’IL-10 par les monocytes ou à la présence de lymphocytes T CD8+. Enfin, étant donné que la FHA est inductrice d’IL-10 dans un modèle in vitro murin, nous avons analysé son effet sur la production in vitro de cette cytokine par les cellules dendritiques humaines (DCs). Nous avons montré que la FHA induit bien une production d’IL-10 par les DCs mais également les productions d’IL-12p70, d’IL-6 et d’IL-23, cytokines impliquées dans la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes T effecteurs Th1 ou Th17. Parallèlement, nous avons testé une forme tronquée de FHA, la FHA 44 qui est également protectrice dans un modèle murin d’infection par B. pertussis. Nous avons montré que cette FHA tronquée n’induit pas de production d’IL-10 tout en induisant une production d’IL-12p70 et d’IL-23 par les DCs. La forme moléculaire de FHA présente dans les vaccins joue donc un rôle déterminant sur le type de réponses immunitaires induites et le remplacement de la FHA native dans les vaccins acellulaires par la FHA 44 devrait potentiellement permettre une meilleure réponse IFN-& / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ce travail de thèse porte sur l’étude de la cinématique 3D du rachis cervical supérieur ainsi que<p>sur l’analyse des bras de levier des muscles sous-occipitaux postérieurs, par le développement<p>de différentes méthodes contribuant à la modélisation anatomique du mouvement.<p>La première partie de ce travail s’oriente vers l’étude des mouvements de flexion extension, de<p>rotation axiale et de flexion latérale ainsi que des axes qui y sont rapportés. Pour ce faire, deux<p>protocoles ont été développés sur préparations anatomiques, l’un visant à analyser les<p>mouvements discrets à partir de différentes attitudes du rachis cervical supérieur et l’autre<p>s’intéressant aux mouvements instantanés. Ceux-ci ont permis de mettre en évidence une<p>orientation et une position de l’axe hélicoïdal dépendantes du mouvement, du segment étudié<p>et de sa position spatiale.<p>En deuxième intention, nous nous sommes intéressés aux propriétés biomécaniques musculaires<p>de cette région, et en particulier à l’étude des bras de levier. Deux méthodes de calcul<p>distinctes ont été utilisées, montrant chacune des résultats différents d’un point de vue<p>quantitatif mais relativement similaires au niveau qualitatif.<p>Pour terminer, nous avons exploité ces méthodes afin d’apprécier leur faisabilité dans le cadre<p>d’une évaluation fonctionnelle in vivo. Il en ressort une concordance de résultats cinématiques<p>par rapport aux études susmentionnées, permettant d’entrevoir des perspectives cliniques<p>encourageantes.<p>Par ailleurs, la modélisation musculo-squelettique 3D pourrait également contribuer à la<p>compréhension du dysfonctionnement cinématique du rachis cervical supérieur./ <p><p>This thesis concerns 3D kinematics analysis of the upper cervical spine (UCS) and computation of the posterior suboccipital muscle moment arms as well the development of different methods contributing to anatomical modeling and motion representation. The first part of this work is focused on the kinematics of flexion extension, axial rotation and lateral bending of the UCS. Two protocols were developed and applied in anatomical specimens, one to analyze discrete movements in different attitudes of upper cervical spine and the second concerned instantaneous motions. In addition to usual range of motion data, orientation and position of helical axes was computed for each motion type and UCS joint segment.<p>In the second part, we were interested in posterior suboccipital muscle biomechanical properties, particularly in the study of moment arms. Two different calculation methods were used, each showing different results from a quantitative point of view but quite similar in quality. Finally, we used these methods to assess their feasibility for in vivo functional assessment. The latter showed a concordance of kinematic results compared to the above studies, offering insight and clinical perspectives. In addition, musculoskeletal modelling 3D could also contribute to understanding of the kinematic features of upper cervical spine disorders.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Mesenchymal stromal cells (MSC) are adherent, clonogenic, fibroblast-like cells endowing with unique multipotent differentiation potential and immunosuppressive properties. They are considered as promising candidates for regenerative medicine and immunotherapy. <p>MSC can be isolated from different tissue sources including bone marrow (BM), adipose tissue (AT) and Wharton’s Jelly (WJ). Although fulfilling the ISCT criteria required to be recognized as MSC, MSC from these different sources could disclose some differences taking into account their different anatomical origin and ontogeny as well.<p>In the present work, we investigated the influence of MSC source on their immunosuppressive as well as differentiation properties. We further extended our study to the role of the microenvironment (infection and inflammation) on these features. <p>We show that BM-MSC express Toll-like receptors (TLR) from TLR1 to TLR6. In an inflammatory environment, TLR2, 3 and 4 are significantly upregulated. By upregulating TLR3 and TLR4 transcription, inflammation increases BM-MSC responsiveness to LPS (TLR4 ligand) and poly(I:C) (TLR3 ligand) leading to a pro-inflammatory shift of their cytokine profile. The effect of TLR ligation on BM-MSC osteogenic potential is donor dependent. Inflammation as well as stimulation with LPS and poly(I:C) result in a decrease of BM-MSC immunosuppressive capabilities. <p>We further observed that BM-, AT- and WJ-MSC do not have the same pattern of TLR expression and consequently do not respond the same way to bacterial or viral infection. WJ-MSC do not express TLR4 and although TLR3 is present at the protein level it is not functional as its ligation do not trigger cytokine expression. Inflammation modulates this TLR pattern expression by upregulating TLR3 in all three MSC types and TLR4 only in BM-MSC. TLR ligation increases the production of inflammatory cytokines in BM- and AT- but not in WJ-MSC and augments anti-inflammatory cytokines in AT-MSC. Although inflammation increases in all MSC types the secretion of inflammatory cytokines, additional TLR triggering does not further affect WJ-MSC. The immunosuppressive potential of WJ-MSC on mixed leucocytes reaction (MLR) is not affected either by inflammation or by TLR triggering.<p>On the differentiation side, WJ-MSC has the lower potential to differentiate into osteoblast as compared to BM- and AT-MSC, as revealed by alkaline-phosphatase (ALP) activity and by measuring extracellular Ca2+ deposits. However, inflammation is able to strongly increase the osteogenic differentiation of WJ-MSC as calcification and ALP activity appears as early as at day 7. However this latter enzymatic activity remains much lower than that disclosed by BM-MSC. TLR3 or TLR4 triggering does not affect the osteogenesis of WJ-MSC while it increases it in AT- and also, although to lesser extent, in BM-MSC.<p><p>Our work establishes that the source from which MSC is derived is of major importance for the design of MSC based immunointervention. WJ-MSC appear to be the most attractive cell type when an immunosuppressive action is required in an inflammatory or infectious context. Although WJ-MSC are poorly osteogenic, a complete osteogenic differentiation can be obtained under inflammatory conditions. Taking into account their easy accessibility as well as their huge proliferative potential, these data open an avenue for using these cells in regenerative medicine particularly in clinical settings where chronic inflammation or infection have to be considered. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le système immunitaire est capable de rejeter une tumeur, même si l'interaction entre système immun et tumeurs est et reste complexe. Contrôler à long terme la croissance de la tumeur est un challenge, probablement suite à divers mécanismes de tolérance centrale et périphérique. Différentes approches d'immunothérapie du cancer ont été et sont toujours développées. Nous avons, au laboratoire, investigué et démontré, dans le cadre de deux différents modèles tumoraux murins, les capacités thérapeutiques d’une nouvelle stratégie de vaccinations combinées associant des injections de cellules dendritiques (DC) et de cellules tumorales sécrétrices de GM-CSF.<p><p>Notre travail de thèse a consisté à poursuivre l'étude de cette stratégie de vaccins combinés en étudiant plus particulièrement le rôle des lymphocytes T régulateurs (Treg) dans l'efficacité thérapeutique des vaccinations. <p>Les Treg regroupent différentes populations cellulaires immunosuppressives dérivées du thymus qui jouent un rôle clé dans le maintien de la tolérance périphérique. Les Treg naturels dont le mécanisme de suppression principal nécessite un contact cellule-cellule, expriment de façon constitutive les molécules de surface CD4, CD25 et CTLA-4 mais le marqueur le plus spécifique est le facteur de transcription Foxp3 qui est indispensable à leur développement et à leur fonction suppressive. Dans un premier temps, nous avons donc caractérisé les Treg de rat pour l'expression de Foxp3 et la nature et spécificité antigénique de leur fonction suppressive. Nos résultats démontrent d’une part, une expression de Foxp3 restreinte aux LT CD25+ natifs et liée à une fonction suppressive s'exerçant par contact cellule-cellule et d’autre part, une spécificité antigénique non-restreinte de ces Treg. <p><p>Ensuite, nous avons utilisé ce modèle de vaccination associant des injections de DC et de cellules tumorales sécrétrices de GM-CSF pour analyser comparativement les réponses immunes induites chez les rats vaccinés guéris ou non-guéris et les rats contrôles non vaccinés et identifier les paramètres cruciaux conduisant à l'éradication de la tumeur. Nos résultats ont montré que la principale différence entre rats vaccinés guéris et non guéris ne réside pas dans l'induction de réponses cytotoxiques systémiques spécifiques de la tumeur. Par contre, la guérison est associée à la persistance d'une réponse systémique LT CD4+ TH1 ainsi qu'au recrutement important en intratumoral de LT CD8+ cytotoxiques lié à une faible proportion relative de Treg. <p><p>Comme dans la majorité des études publiées chez l'animal, les DC utilisées dans ces vaccins combinés ont été générées à partir de rats naïfs, par différenciation de précurseurs de la moëlle osseuse en présence de GM-CSF seul. Par analogie avec les vaccins DC administrés aux patients cancéreux, nous avons aussi dérivé des DC à partir de la moëlle osseuse de rats porteurs d’une tumeur (TUM+) et nous avons constaté que ces mêmes vaccins combinés montraient in vivo une efficacité thérapeutique nettement moins bonne que leurs équivalents naïfs. Nous avons établi que cette différence d’efficacité était liée à la présence de Treg fonctionnels dans les vaccins DC dérivés de rats TUM+. Puis, nous avons établi le lien entre la présence de Treg dans les vaccins DC TUM+ et leur moins bonne efficacité thérapeutique en montrant qu'un traitement in vivo des rats TUM+ au témozolomide (TMZ) avant de générer les vaccins DC résultait in vitro, en une moindre expression de Foxp3 et une fonction suppressive diminuée et in vivo, en une bien meilleure survie des rats vaccinés.<p><p>Enfin, dans le but d’une utilisation future en clinique, nous avons développé une approche simplifiée ‘tout in vivo’ de notre modèle de vaccinations combinées, en utilisant la tumeur localement irradiée in vivo comme source d’antigène pour des DC autologues injectées en péri-tumoral et un apport exogène de GM-CSF. Nous avons utilisé des adénovirus associés recombinants porteurs du gène du GM-CSF (AAV1-GM-CSF) pour transduire la tumeur in vivo. Ces injections intratumorales d’AAV1-GM-CSF ont montré de bons résultats en vaccinations combinées puisque 60% des rats ont pu être guéris d’une tumeur 9L pré-implantée. Nous avons ensuite expérimenté l’enrobage des AAV1-GM-CSF dans un polymère biocompatible et thermosensible, le poloxamère, avant de les injecter en intratumoral, sans observer de meilleur effet thérapeutique. Cependant, nous avons constaté que l'utilisation du poloxamère pour enrober du GM-CSF recombinant permettait d'améliorer nettement la survie des rats vaccinés par comparaison à l'utilisation de GM-CSF recombinant seul.<p><p>La stratégie de vaccinations combinées que nous avons largement explorée et validée chez le rat serait une alternative intéressante à développer en clinique, particulièrement en combinaison avec un traitement permettant d'éliminer les Treg à la fois dans les vaccins et chez les patients vaccinés.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Précédemment, nous avons montré que la surexpression de l'échangeur Na/Ca NCX1), une protéine responsable de la sortie de calcium (Ca2+) des cellules, augmentait la mort cellulaire programmée ou « apoptose » et réduisait la prolifération des cellules β. Afin d’étudier plus en profondeur le rôle de l’échangeur dans les cellules β in vivo, nous avons développé et caractérisé des souris présentant une inactivation de NCX1.<p>Des méthodes biologiques et morphologiques (imagerie du Ca2+, capture de Ca2+, métabolisme du glucose, sécrétion d'insuline et morphométrie par comptage de points) ont été utilisées pour évaluer la fonction de la cellule β in vitro. Les taux de glucose et d'insuline dans le sang ont été mesurés afin de déterminer le métabolisme du glucose et la sensibilité à l’insuline in vivo. Des îlots ont été transplantés sous la capsule rénale pour évaluer leur capacité à corriger le diabète chez les souris rendues diabétiques par l’alloxane.<p>L'inactivation hétérozygote de Ncx1 chez les souris provoque une augmentation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose avec un renforcement important à la fois de la première et de la deuxième phase. Ces résultats s’accompagnent d’une augmentation de la masse et de la prolifération des cellules β. La mutation augmente également le contenu en insuline, l’immunomarquage de la proinsuline, la capture de Ca2+ induite par le glucose et la résistance à l'hypoxie des cellules β. En outre, les îlots de souris Ncx1+/- montrent une capacité à compenser le diabète 2 à 4 fois plus élevé que les îlots de souris Ncx1+/+ lorsque transplantés chez des souris diabétiques.<p>En conclusion, l’inactivation de l'échangeur Na/Ca conduit à une augmentation de la fonction de la cellule β, de sa prolifération, de sa masse et de sa résistance au stress physiologique, à savoir à divers changements de fonction des cellules β opposés aux principales anomalies rencontrées dans le diabète de type 2 (Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM). Ceci nous procure un modèle unique pour la prévention et le traitement du dysfonctionnement des cellules β dans le T2DM et pour la transplantation d'îlots.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished