Les cellules souches assurent le développement des tissus, leur renouvellement ainsique leur réparation suite à des blessures. L’une des questions clés du domaine de labiologie des cellules souches est l’identification des différents types cellulaires qu’unecellule souche peut donner. Les cellules souches peuvent être multipotentes, c’est-à-direcapables de donner naissance à plusieurs types cellulaires différents, ou unipotentes,c’est-à-dire qu’elles ne peuvent alors se différencier qu’en un seul type cellulaire. Lesexpériences de traçage cellulaire sont réalisées quotidiennement en biologie dudéveloppement et en biologie des cellules souches afin d’évaluer le devenir des cellulessouches in vivo. Cependant, il n’existe à ce jour aucune méthode rigoureuse permettantd’interpréter les résultats d’expériences de traçage cellulaire de manière non ambigüe etde déterminer la multipotence ou l’unipotence des cellules souches avec grande précisionet de manière statistiquement fiable. Nous avons développé de nouvelles méthodes afind’évaluer avec une très grande précision le caractère unipotent ou multipotent descellules souches du sein et de la prostate. Ces nouvelles découvertes démontrent demanière non ambigüe que la prostate provient de cellules souches multipotentes, alorsque seules des cellules souches unipotentes contribuent au développement et auremodelage de la glande mammaire au stade adulte. D’autre part, nous montrons que cesont des cellules souches multipotentes qui sont responsables des phases précoces dudéveloppement embryonnaire de la glande mammaire, et que ces cellules deviennentunipotentes peu avant la naissance. Nous avons étudié les mécanismes régulant le passagede l’état multipotent à l’état unipotent et démontrons que le facteur de transcription p63joue un rôle crucial dans la restriction du potentiel de différenciation des cellules souchesmammaires embryonnaires. Enfin, nous montrons que les cellules souches mammairesadultes, normalement unipotentes, peuvent redevenir multipotentes en conditionsphysiopathologiques telles que l’ablation spécifique d’une lignée cellulaire mammaire ouau cours de l’initiation tumorale. Nous essayons donc de comprendre de manière généraleles mécanismes impliqués dans le passage de l’état unipotent à l’état multipotent descellules souches mammaires adultes, et d’élucider les similarités existant entre lesdifférentes conditions dans lesquelles des cellules souches mammaires multipotentessont observées. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’infarctus du myocarde est une cause majeure de morbidité et mortalité adulte dans les pays développés. Le manque de perfusion myocardique induit la mort des cardiomyocytes notamment par apoptose. Un remodelage moléculaire et cellulaire s’ensuit et comprend une hypertrophie des cardiomyocytes dans la zone péri-infarcie, de la fibrose, une réactivation des gènes fœtaux et des changements métaboliques. Ce remodelage entraîne à terme une diminution de fonction menant à la défaillance cardiaque. Les traitement médicamenteux améliorent la qualité de vie et la survie mais ne peuvent guérir. La thérapie hybride (cellulaire et génique) est une approche thérapeutique nouvelle et prometteuse pour l’infarctus du myocarde. C’est dans ce contexte que s’inscrivent les travaux de ma thèse. <p>Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont des cellules souches adultes de choix pour la thérapie cellulaire. Plusieurs études ont montré qu’elles participent à la cardioprotection et à la régénération du myocarde en sécrétant une myriade de facteurs de croissance et de cytokines aux effets pro-angiogéniques et anti-apoptotiques.<p>Le « stromal-derived factor-1 » (SDF-1) ou CXCL12 est une chimiokine produite par un grand nombre de cellules dont les CSM et les cardiomyocytes. Il est un ligand pour CXCR4 et CXCR7, 2 récepteurs de la famille des récepteurs liés aux protéines G. CXCL12a est un facteur critique pour la migration, la domiciliation et la survie des cellules souches de la moelle osseuse dans le myocarde infarci et pour la survie des cardiomyocytes. Dans l’infarctus aigu du myocarde, un délai entre la fenêtre temporelle d’activation du ligand et de son récepteur rend cet axe peu efficace. Dans les pathologies ischémiques chroniques, une altération de la signalisation CXCL12a/CXCR4 réduit ses effets bénéfiques.<p>Ces observations ont conduit au développement d’approches thérapeutiques ciblant l'axe CXCL12a/CXCR4. CXCL12a peut être administré seul, sa production peut être stimulée par la transplantation de cellules souches, enfin sa synthèse peut être augmentée dans le myocarde par thérapie génique ou par l’association d’une thérapie cellulaire et génique. La majorité des études montrent une amélioration du remodelage et de la fonction cardiaque associée essentiellement à une néovascularisation et un effet antiapoptotique. Cependant, les effets directs de CXCL12a sur les cardiomyocytes ne sont pas encore complètement élucidés.<p>L’objectif général de ce travail était de contribuer à la compréhension des mécanismes d’action de CXCL12a sur les cardiomyocytes néonataux de rat que celui-ci agisse seul ou dans le cadre d’une thérapie hybride.<p>Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié les effets non génomiques de CXCL12a en nous focalisant sur l’homéostasie calcique et ses conséquences fonctionnelles. Nous avons investigué la modulation des flux calciques par CXCL12a en chargeant le cytoplasme de cardiomyocytes néonataux de rat en culture avec le Fluo-4 acétoxyméthyl ester, indicateur fluorescent du niveau de calcium. CXCL12a augmente le calcium intracytoplasmique. La réponse calcique dépend de la liaison de CXCL12a à CXCR4 et majoritairement de l’ouverture des canaux calciques dépendants de l’inositol triphosphate (IP3Rs). Le flux calcique induit par la caféine (un agoniste des récepteurs à ryanodine) est diminué lorsque les IP3Rs sont bloqués. Ceci peut s’expliquer par une interaction entre ces 2 canaux. L’incubation avec le CXCL12a augmente in vitro la fréquence de battement des cardiomyocytes et cet effet est additif à celui de la forskoline (un activateur de l’adénylate cyclase). In vivo, l’administration intramyocardique de CXCL12a augmente le dP/dt max (indice de contractilité cardiaque) du ventricule gauche. <p>Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié les effets génomiques de CXCL12a; le but de cette étude était double :(1) identifier de nouvelles voies de signalisation contribuant aux effets de CXCL12a sur les cardiomyocytes et (2) comparer les effets de CXCL12a administré seul aux effets du surnageant de CSM surexprimant CXCL12a. Nous avons construit le lentivirus pWXLd-CXCL12a-IRES-GFP pour transduire des CSM en culture. L’expression protéique de CXCL12a dans le surnageant des CSM transduites a été confirmée par ELISA et l’activité du CXCL12a a été vérifiée par le test à l’aequorine. Pour identifier de nouvelles voies de signalisation modulées à l’étage transcriptionnel, nous avons privilégié le microarray, méthodologie qui permet une approche globale sans à priori. Nous avons ensuite confirmé les résultats par une approche ciblée sur certains gènes par la technique de RTQ-PCR. Pour le microarray, les cardiomyocytes ont été incubés pendant 1 heure avec (a) du CXCL12a commercial &61480;&61493;µ&61517;&61481; dilué dans le milieu des cardiomyocytes sans FBS, (b) le milieu des cardiomyocytes sans FBS (échantillon témoin de a), (c) le surnageant de CSM transduites par le virus pWXLd-CXCL12a-IRES-GFP et (d) le surnageant de CSM transduites par le virus pWXLd-GFP (échantillon témoin de c). Un ensemble discret de 218 gènes correspondant à 0,63% du génome du rat étaient régulés. Parmi les 60 gènes communs rapidement modulés dans les deux conditions (a et c), 34 étaient sur-exprimés alors que 26 étaient sous-exprimés. L’analyse avec le logiciel David suggère que le CXCL12a seul à la dose de 5 μM ou présent dans le surnageant de CSM le surexprimant à la concentration d’environ 2 nM module des voies déjà connues comme la voie des MAPkinases et plusieurs voies liées à l’apoptose comme JAK/STAT, p53 et NOD ainsi que 2 nouvelles voies: le voie des adipocytokines et de PPAR. Par RTQ-PCR, nous avons confirmé la modulation positive par CXCL12a de JAK2 et AKT. De plus, CXCL12a réprime l’expression protéique de la LPL, l’expression génique de la FABP et de l’Angptl-4 et l’expression génique et protéique de l’adiponectine, protéines toutes impliquées dans le transfert des acides gras et leur β oxydation. <p>Nous avons ensuite investigué les effets génomiques de CXCL12a dans le cadre d’une thérapie hybride. L’analyse du microarray et l’analyse ciblée de quelques gènes ont permis de conclure que la modulation de l’expression génique dépend non seulement de la concentration en CXCL12a mais également de la présence d’autres facteurs soit issus directement du milieu de culture commercial des CSM soit issus du milieu conditionné des CSM.<p>Ce travail ouvre de nouvelles perspectives pour mieux comprendre le rôle de CXCL12a dans l’homéostasie calcique et le métabolisme des lipides et son impact dans la physiopathologie du cœur. De plus, ce travail appuie le fait que le développement clinique des thérapies hybrides doit être précédé d’une investigation complète des effets génomique et non génomiques de cette thérapie sur les cardiomyocytes. Cependant, il faut rester prudent car, à cause de l’environnement du myocarde sain ou malade, aucune étude fondamentale ne permet de prédire l’ensemble des effets in vivo.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

In a near future, the computation power will be widely used in endoscopy rooms. It will enable the augmented reality already implemented in some surgery. Before reaching this, a preliminary step is the development of a 3D reconstruction endoscope. In addition to that, endoscopists suffer from a lack of quantitative data to evaluate dimensions and distances, notably for the polyp size measurement.<p>In this thesis, a contribution to more a robust 3D reconstruction endoscopic device is proposed. Structured light technique is used and implemented using a diffractive optical element. Two patterns are developed and compared: the first is based on the spatial-neighbourhood coding strategy, the second on the direct-coding strategy. The latter is implemented on a diffractive optical element and used in an endoscopic 3D reconstruction device. It is tested in several conditions and shows excellent quantitative results but the robustness against bad visual conditions (occlusions, liquids, specular reflection,) must be improved. <p>Based on this technology, an endoscopic ruler is developed. It is dedicated to answer endoscopists lack of measurement system. The pattern is simplified to a single line to be more robust. Quantitative data show a sub-pixel accuracy and the device is robust in all tested cases. The system has then been validated with a gastroenterologist to measure polyps. Compared to literature in this field, this device performs better and is more accurate. / Doctorat en Sciences de l'ingénieur / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le myélome multiple (MM) est une hémopathie maligne de la lignée B qui se manifeste par <p>une accumulation de plasmocytes monoclonaux dans la moelle osseuse. Le MM se caractérise par <p>la nature inéluctable de ses rechutes de plus en plus réfractaires au traitement. Au sein de la moelle <p>osseuse, les cellules malignes interagissent avec leur microenvironnement notamment composé de <p>cellules stromales mésenchymateuses (CSM). Les CSM apportent un soutien aux cellules <p>plasmocytaires (PC) malignes via des interactions cellulaires directes (VLA-4, VCAM-1, CD44,…) <p>ou par la production de cytokines (IL-6, SDF1, VEGF,…). De ces interactions résulte l’apparition <p>d’altérations constitutives au sein des MM-CSM telles qu’une production réduite de dépôts de <p>calcium et une augmentation de la sécrétion de nombreux facteurs (IL-6, GDF-15, etc.). <p>L’objectif de ce travail est de mieux caractériser les anomalies constitutives (génomiques, <p>prolifératives, immunomodulatrices, etc.) des MM-CSM et d'évaluer l’impact des traitements reçus <p>par les patients sur ces anomalies. Ces analyses permettront de mieux définir le rôle des CSM dans <p>la physiopathologie et la progression de la maladie afin de mettre en évidence d’éventuelles cibles <p>thérapeutiques.<p>Compte tenu de l’altération de nombreux acteurs du cycle cellulaire mise en évidence par <p>notre analyse du profil d’expression génique des MM-CSM après comparaison avec celui des CSM <p>de donneurs sains (DS-CSM), nous avons décidé d’étudier leurs capacités prolifératives. Nos <p>observations démontrent que a) les MM-CSM sont caractérisées par une réduction de leur <p>clonogénicité et par un temps de doublement plus important par rapport aux DS-CSM b) l’entrée <p>précoce des MM-CSM en sénescence est confirmée par l'augmentation drastique du nombre de <p>cellules exprimant la « senescence-associated β-galactosidase », par l’augmentation de la taille <p>cellulaire, par l’expression spécifique de membres du « senescence-associated secretory profile » <p>(SASP) et par la surexpression de TP53 et TP21, deux facteurs importants du cycle cellulaire et de <p>la sénescence c) l’ostéoblastogenèse des MM-CSM est altérée en raison de ce processus de <p>sénescence, à savoir, une réduction de la production de calcium et une hausse précoce de l’activité<p>de la phosphatase alcaline des MM-CSM par rapport aux DS-CSM d) l’activité de support à <p>l’hématopoïèse des MM-CSM est augmentée (« increased Blast-Colony Forming Cells and LongTerm Culture Initiating Cells »). <p>Dans la seconde partie de ce travail, on s’est intéressée plus particulièrement aux capacités <p>immunomodulatrices des MM-CSM. Nous avons observé, par réaction mixte lymphocytaire et <p>stimulation mitogénique (PHA/IL-2), a) une réduction de l’inhibition de la prolifération des <p>lymphocytes T activés en présence de MM-CSM par rapport aux DS-CSM b) une inversion du ratio <p>Th17/Treg lorsque des lymphocytes T activés sont cultivés en présence de MM-CSM par rapport <p>aux DS-CSM ;les mécanismes potentiellement impliqués dans ces altérations ont été investigués c)<p>les MM-CSM présentaient une expression anormale du CD40/40L, VCAM1, ICAM-1, LFA-3 <p>HLA-DR et HLA-ABC et des taux d’IL-6 et d’IL-10 altérés ont été mesuré dans le milieu de <p>culture lorsque les lymphocytes T activés étaient cultivés en présence de MM-CSM par rapport aux <p>DS-CSM. <p>Nos résultats suggèrent que les MM-CSM entrent précocement en sénescence avec de <p>profondes altérations de leurs propriétés biologiques et notamment leur capacités <p>d'immunomodulation et de différenciation ostéogénique. Nous concluons que l’entrée en <p>sénescence des MM-CSM pourrait être à l’origine d’une altération du microenvironnement tumoral <p>qui favoriserait rechutes et résistances aux traitements. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La prévalence de l’obésité et du diabète de type 1 (DT1) s’accroit dans le monde à une vitesse alarmante. L’augmentation du poids corporel, de la quantité d’acides gras libres (AGL) circulant et de la résistance à l’insuline peut induire un stress du réticulum endoplasmique (RE) dans les cellules beta du pancréas, ce qui pourrait favoriser l’inflammation. Afin de tester cette hypothèse, nous avons exposé des cellules beta à un léger stress chronique du RE induit par de l’acide ciclopiazonique (ACP) ou l’AGL palmitate et les avons ensuite traitées avec une faible dose d’interleukine 1β (IL-1β) ou de facteur de nécrose tumorale (TNF-α). L’addition d’IL- 1β, mais pas de TNF-α, a conduit à l’augmentation de la production de marqueurs pro-inflammatoires et de chimiokines. Cette différence de résultat en fonction de l’exposition à l’IL-1β ou au TNF-α peut-être au moins partiellement expliquée par un usage différentiel du complexe de la kinase IκB (IKK) et de la voie du facteur nucléaire κ-B (NF-κB), menant à terme à une activation plus élevée par l’IL-1β en comparaison à TNF-α. L’analyse des branches de la réponse de la protéine dépliée impliquées a révélé que la voie de l’Inositol-requiring enzyme 1 (IRE1) / X-box binding protein 1 spliced (XBP1s) est le médiateur clé dans le couplage avec la réponse inflammatoire déclenchée par l’IL-1β. En effet, le knockdown d’IRE1 ou de XBP1 a permis d’éviter l’exacerbation de l’activité du promoteur NF-κB et l’expression des gènes cibles de NF-κB. Les mécanismes impliqués dans la régulation XBP1-dépendante de la réponse pro-inflammatoire sont partiellement dépendant de la modulation de la Forkhead box O1 (FoxO1). Le stress du RE et l’IL-1β participent aussi à un autre évènement crucial dans le développement du DT1, à savoir la mort progressive des cellules beta, qui est également exacerbée par la combinaison ACP + IL-1β. Contrairement à l’inflammation, la voie IRE1/XBP1 n’est pas impliquée dans l’apoptose cellulaire induite par la combinaison d’ACP et d’IL-1β. Dans ce contexte, nous suggérons que le devenir de la cellule est décidé par la balance entre les protéines Bcl-2 anti-apoptotiques et pro-apoptotiques. Ainsi, nous avons montré que le gène A1 associé à Bcl-2 (A1) est négativement régulé par le stress du RE tandis que l’IL-1β active la protéine BH3-only Bim, aboutissant à une apoptose accrue des cellules beta. En conclusion, nos données suggèrent que le stress du RE est un facteur sensibilisation pour l’induction de l’inflammation des ilots pancréatiques et de l’apoptose des cellules beta. Ceci pourrait fournir une explication mécanistique à l’augmentation parallèle observée de l’obésité infantile et de la fréquence du DT1.\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La maladie de Chagas, due au protozoaire Trypanosoma cruzi, est un important problème de santé publique en Amérique latine. Le parasite peut se transmettre à l’homme via un vecteur de la famille des triatomes, par transfusion sanguine ou transplantation d’organe et congénitalement de la mère à son fœtus. Le Laboratoire de Parasitologie s’est particulièrement intéressé à la maladie de Chagas congénitale. Dans le cadre de cette thématique, le Laboratoire a montré que les nouveau-nés congénitalement infectés par T. cruzi développent une forte réponse lymphocytaire T CD8+ spécifique semblable à celle des adultes, accompagnée d’une production d’interféron-gamma (IFN-g), et ce en dépit de l’immaturité bien connue du système immun néonatal. En effet, le système immun néonatal est naturellement orienté vers le développement de réponses immunes Th2 tandis que la réponse Th1 est inhibée. De multiples mécanismes sont à l’origine de cette déviation en début de vie. Certaines déficiences au niveau des cellules du système immun inné y contribuent, dont la difficulté des cellules dendritiques (DCs) à produire de l’IL-12, cytokine clé dans l’induction d’une réponse Th1. Les multiples déficiences du système immun en début de vie rendent les nouveau-nés et jeunes enfants particulièrement sensibles aux pathogènes et limitent l’efficacité des vaccins administrés en début de vie. <p>Afin de mieux connaître les mécanismes par lesquels T. cruzi induit cette forte réponse immune de type 1 chez les nouveau-nés, nous nous sommes intéressés à l’activation de la réponse immune innée par le parasite. De nombreuses cellules peuvent être impliquées dans la mise en place d’une réponse de type 1, dont les cellules dendritiques (DCs), les monocytes et les cellules NK. Le Laboratoire de Parasitologie a montré que T. cruzi activait in vitro les DCs néonatales, les rendant capables d’induire une réponse lymphocytaire T plus orientée vers la production d’IFN-g. D’autres données obtenues chez les nouveau-nés congénitalement infectés par T. cruzi suggèrent que les cellules NK ont été activées in utero quand le parasite a été transmis par la mère infectée. Nous nous sommes ici intéressés à la capacité des cellules NK néonatales à produire rapidement de l’IFN-g en réponse à T. cruzi. Une telle production précoce est en effet un élément contribuant à orienter une réponse immune de type 1.<p>Nous avons effectué des co-cultures de cellules mononucléaires de sang de cordon de nouveau-nés sains (CBMC) ou de sang périphérique adulte (PBMC) avec des trypomastigotes vivants de T. cruzi. Nos résultats montrent qu’en présence d’IL-15, T. cruzi induit une forte production d’IFN-g par les CBMC. Cette réponse est précoce et est accompagnée d’une production de TNF-a mais pas d’IL-10. Les cellules NK CD56brightCD16-/low et CD56dimCD16- sont les meilleures productrices d’IFN-g dans les deux groupes d’âges. La réponse des cellules NK néonatales est substantielle mais reste légèrement inférieure à celle des cellules adultes. Nous avons par ailleurs observé un déficit de production précoce d’IFN-g par les cellules T CD3+CD56+ (NK-like) et CD3+CD56- (« classiques ») néonatales par rapport aux cellules adultes. <p>La réponse IFN-g par les cellules NK est proportionnelle aux concentrations de parasites et d’IL-15 et accompagnée d’une activation phénotypique des cellules NK. Il est bien connu que des cellules accessoires telles que les cellules dendritiques et les monocytes contribuent généralement à activer indirectement les cellules NK. Des expériences de déplétion cellulaire indiquent que la production d’IFN-g par les cellules NK néonatales sensibilisées par l’IL-15 fait intervenir les monocytes mais pas les DCs myéloïdes, et qu’un contact avec les monocytes est nécessaire. De plus, elle requiert un contact du parasite vivant avec les CBMC et implique l’engagement des TLR2 et TLR4, ainsi qu’une production endogène d’IL-12. <p>Enfin, nous avons observé que les monocytes, et non les DCs myéloïdes, sont la source précoce de l’IL-12p70. Les parasites sont capables d’induire la synthèse de cette cytokine importante pour l’initiation d’une réponse de type 1 en l’absence de cytokines additionnelles, aussi bien dans les monocytes néonataux qu’adultes. La synthèse d’IL-12 par les monocytes s’accompagne d’une augmentation de l’expression de molécules co-activatrices CD40, CD80 et CD83 à leur surface. Ces dernières pourraient dès lors jouer un rôle supplémentaire dans l’activation indirecte des cellules NK néonatales par le parasite.<p>Cet ensemble de résultats montre que T. cruzi active les cellules néonatales du système immunitaire et plus particulièrement la production d’IL-12 par les monocytes et d’IFN-g par les cellules NK. Cette voie d’activation monocytes – IL-12 – cellules NK – IFN-g pourrait contribuer à la levée de l’immaturité du système immun des nouveau-nés congénitalement infectés décrite plus haut. Ces observations ont d’importantes implications pour la compréhension des mécanismes de protection en début de vie et pourraient aboutir à la mise au point d’un nouvel adjuvant vaccinal permettant de réduire la polarisation Th2 physiologique des nouveau-nés. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

<p>Over the past decade, studies using murine models have led to the demonstration that CD4+ T helper (Th) cells play a critical role in the control of cancer progression. Additional support for their importance comes from the growing body of recent clinical/translational research data demonstrating the importance of tumor-infiltrating T and B lymphocytes in long-term patient survival for various types of cancer, including breast cancer (BC). As the key population coordinating adaptive immune responses, the role(s) played by individual Th subsets in cancer immunity remains largely controversial. The Th1 subset has uniquely been shown to have a clear anti-tumor effect, guiding CD8+ cytotoxic T cells-mediated direct tumor cell lysis through IFN-γ secretion. Although the negative regulatory role played by Treg cells has been extensively studied in cancer, its prognostic value along with that of Th2 and Th17 cells have not been clearly demonstrated in patients. T follicular helper (Tfh) cells, a recently characterized Th subset that plays a primary role in the generation of B cell memory in secondary lymphoid organs, have not been previously described infiltrating solid tumors. The principal objective of this thesis was to perform an in-depth characterization of tumor-infiltrating CD4+ T cells (TIL) and Th subsets in human BC, where very little is currently known.<p>Using whole genome microarrays, we analyzed the gene expression profiles of TIL relative to their counterparts from the axillary lymph nodes and peripheral blood. Applying a novel approach, we compared TIL profiles with public microarray data for Th subsets, demonstrating: 1) the presence of all major Th subsets (Th1, Th2, Th17, Treg as well as Tfh) in the TIL, 2) the TIL are effector memory rather than central memory cells, 3) the TIL are concomitantly activated and suppressed and 4) TIL from tumors with extensive lymphoid infiltrates are more activated/less suppressed in the TCR/CD3 signaling pathway, producing higher levels and a wider panel of Th cytokines than TIL from minimally-infiltrated tumors.<p>We also performed in vitro experiments to study tumor microenvironment effects on TIL by treating normal CD4+ T cells from healthy donor blood with primary tumor supernatants (SN). Tumor SN largely reproduces the TIL profile in normal Th cells, totally suppressing their activation and inhibiting their cytokine production. Intriguingly, the highly restricted number of cytokines induced by tumor SN included several tumor-promoting factors, such as IL-8 and TNF. SN from an extensively-infiltrated tumor was found to be less immune-suppressive than SN from minimally-infiltrated tumors. In line with this, TIL from minimally-infiltrated tumors are closer to SN-treated (suppressed) activated donor cells whereas TIL from extensively-infiltrated tumors are more similar to activated cells without SN treatment.<p>These results led us to further investigate the observed differences between TIL from extensive and minimally-infiltrated tumors. Genes characterizing Th1 and Tfh cells were enriched in the extensively-infiltrated tumors. PD-1hiCD200hi Tfh cells were specifically detected in extensively-infiltrated tumors by flow cytometry and these cells were determined to be the major source of the chemokine CXCL13. Immunohistochemical analysis demonstrated highly-organized tertiary lymphoid structures (TLS) within the tumor, containing a CD4+/CD8+ T cell zone and a B cell zone with reactive germinal centers where Tfh cells and follicular dendritic cells (FDC) are resident. Their presence suggests the origin of an effective memory anti-tumor immune response.<p>Finally, we generated Tfh- and Th1-specific gene signatures reflecting differences between extensive and minimal TIL and tested their prognostic value in large-patient-scale public data sets. Our Tfh signature predicts better 10-year disease-free survival for all BC subtypes, outperforming the Th1 signature, suggesting that Tfh cells play a more central role than Th1 cells in anti-tumor immunity. CXCL13 is the determinant gene of our Tfh signature, showing particularly strong prognostic power for the HER2+ subtype. Additionally, these signatures also predict a better response to neoadjuvant chemotherapy.<p>This thesis research has demonstrated that a previously undetected Th subset, Tfh cells, infiltrates solid tumors and shown that their presence signals enhanced anti-tumor immunity.<p><p> <p>Durant cette dernière décennie, des travaux menés dans des modèles murins ont permis de mettre en évidence le rôle crucial joué par les lymphocytes T auxiliaires CD4+ (Th) dans le contrôle de la progression des cancers. De plus, de nombreuses études cliniques et/ou translationnelles récentes corroborent ces observations en montrant une corrélation entre l’importance de l’infiltration intra-tumorale par les lymphocytes T et B et la survie à long terme des patients atteints de différents types de cancer, dont le cancer du sein. En tant que chefs d’orchestre de la réponse immune adaptative, les rôles spécifiques des sous-populations des cellules Th restent controversés. Les Th1 sont la seule population exerçant une claire réponse anti-tumorale, qui est liée à la sécrétion d’IFN-γ, une cytokine primordiale à l’action des lymphocytes T cytotoxiques CD8+. Bien que le rôle néfaste des T régulateurs (Treg) a été largement étudié dans le cancer, leur implication pronostique ainsi que celle des Th2 et Th17 n’ont pas encore été clairement démontrées. La présence d’une sous-population de CD4, les T auxiliaires folliculaires (Tfh), cellules clés dans la différenciation des lymphocytes B mémoires au sein des organes lymphoïdes secondaires, n’a jamais été décrite dans les cancers solides. Le but principal de ce travail est de caractériser les sous-populations des lymphocytes T CD4+ infiltrant la tumeur (TIL) en prenant comme modèle le cancer du sein humain. A l’heure actuelle, il existe très peu de données sur les TIL CD4 dans ce type de cancer.<p>Nous avons d’abord établi le profil génique des TIL en les comparant avec ceux provenant des ganglions axillaires ou du sang périphérique. En appliquant une nouvelle approche, nous avons comparé les profils des TIL avec les données publiques de sous-populations de Th et démontré que :1) toutes les sous-populations de cellules Th (Th1, Th2, Th17, Treg et Tfh) infiltrent la tumeur, 2) les TIL ont un phénotype plus proche de celui des cellules mémoires effectrices que des cellules mémoires centrales, 3) les TIL sont simultanément activés et supprimés et 4) les TIL provenant des tumeurs massivement infiltrées («extensives») par des lymphocytes sont mieux activés et moins supprimés que les TIL des tumeurs peu infiltrées («minimales») dans la voie de signalisation TCR et produisent des cytokines d’une quantité plus élevée et d’une répertoire plus large.<p>Nous avons également effectué des expériences in vitro pour étudier l’effet de l’environnement tumoral sur les TIL en traitant des CD4 normaux (provenant des donneuses saines) par le surnageant (SN) extrait des tumeurs fraiches. Le SN tumoral induit un profil génique proche de celui des TIL en inhibant l’activation et la production de cytokines de ces cellules stimulées. Curieusement, parmi le peu de cytokines induites par le SN tumoral, des facteurs pro-tumoraux comme IL-8 et TNF sont détectés. Le surnageant provenant d’une tumeur «extensive» est moins immunosuppresseur que ceux des tumeurs «minimales». Conformément, les TIL provenant des tumeurs «minimales» ont un profil génique proche des cellules normales activées et traitées (supprimées) par le SN tumoral tandis que les TIL des tumeurs «extensives» ressemblent aux cellules activées non traitées.<p>Ces résultats nous avaient guidés à investiguer plus profondément les différences observées entre les TIL des tumeurs «extensives» et «minimales». Les gènes caractéristiques des Th1 et Tfh sont enrichis dans les tumeurs «extensives». Les cellules Tfh PD1hiCD200hi sont spécifiquement détectées par cytométrie de flux dans les tumeurs «extensives» et sont identifiées comme les producteurs principaux de la chimiokine CXCL13. L’examen par immunohistochimie a permis de détecter des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans la tumeur, composées d’une zone T (CD4 et CD8) et d’une zone B au sein de laquelle se trouve parfois un centre germinatif actif contenant des Tfh et des cellules dendritiques folliculaires (FDC). La présence de ces structures suggère l’origine d’une réponse immune mémoire anti-tumorale.<p>Finalement, nous avons établi des signatures géniques spécifiques aux Tfh et Th1 et recherché leur impact pronostique dans deux bases de données publiques à grande échelle. Notre signature Tfh est positivement corrélée avec la survie à 10 ans des patientes de tous les sous-types de cancer du sein, et est plus performante que la signature Th1. Ceci suggère que les Tfh pourraient jouer un rôle plus crucial que les Th1 dans la réponse immune anti-tumorale. CXCL13 est le gène déterminant de notre signature Tfh et son expression est fortement associée à une meilleure survie chez les patientes du sous-type HER2+. De plus, ces signatures prévoient également une meilleure réponse à la chimiothérapie néoadjuvante (préopératoire).<p>Cette étude a démontré qu’une nouvelle sous-population de CD4, les Tfh, infiltre la tumeur solide et leur présence indique l’existence d’une immunité anti-tumorale renforcée.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The skin epidermis ensures critical vital functions: it represents the first line of defense against external aggressions.<p>The Epidermal Proliferative Unit (EPU) and the stochastic model are two opposite theories that have been proposed to explain the homeostasis of the interfollicular epidermis (IFE). During my thesis, we addressed this question. We used two inducible CREER transgenic mouse models (K14CREER and InvCREER) to labeled basal cells of the IFE using the RosaYFP reporter system, allowing us to follow their fate. Using confocal microscopy to analyze the basal YFP positive clones induced, we demonstrated the existence of two distinct basal progenitors. The mathematical modeling of our data set confirmed this observation and clearly demonstrated the existence of a quiescent stem cell (SC) population (targeted by the K14 promoter), which eventually gives rise to a more rapidly proliferating cells, the committed progenitors (CPs, targeted by the Inv promoter) that participate actively to replace the IFE cells lost during the normal turnover of the tissue. By using an independent genetic mouse model (K5tTA tetO-H2BGFP) and by studying the transcriptional profiling of the two basal populations, we confirmed our hypothesis, and thus reconciling the two seemingly opposite EPU and stochastic models. Finally, we challenged the function of the K14 SCs and Inv CPs during IFE wound healing. Conversely to what happens during homeostasis, we observed that SCs are massively proliferating and participating to the repair and maintenance of the damaged area, while CPs are poorly recruited to the wound.<p>The skin is also a highly sensitive organ, which contains many different receptors specialized in a precise sensation, and richly innervated by somatosensory neurons.<p>The Merkel Cells (MCs) are mechanoreceptors present in the basal layer of the IFE that have features of both neurons and keratinocytes, and might be implicated in the development of a rare but very aggressive skin tumor. Since their discovery in 1875, many studies claimed the neural crest cells (NCCs) or the epidermal progenitors are at the origin of MC, but no clear evidence has been proposed. <p>During my thesis, we were also interested in the embryonic origin of the MC. We used different transgenic mouse models to assess the NCC (Wnt1CRE and Pax3CRE RosaYFP) and the epidermal (K14CRE RosaYFP) hypotheses and we finally demonstrated that MC arise from embryonic epidermal progenitors. Using induction of adult epidermis transgenic mouse (K14CREER RosaYFP, K15CREPR RosaYFP), we showed that the epidermis also participates to the renewing of adult MC. Finally, we deleted the Math1 gene in all the MC progenitors (K14CRE Mathfl/fl) of mouse embryos, resulting in the absence of MCs in adult mice, demonstrating the importance of this transcription factor for MCs specification during embryogenesis.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Minimally invasive surgery (MIS) consists in operating through small incisions in which a camera and adapted instruments are inserted. It allows to perform many interventions with reduced trauma for the patient. One of these is the ablation of peripheral pulmonary nodules.<p><p>Nevertheless, the means for detecting nodules during MIS are limited. In fact, because of the lack of direct contact, the surgeon cannot palpate the lung to find invisible lesions, as he would do in classical open surgery. As a result, only clearly visible nodules can be treated by MIS presently.<p><p>This work aims at designing, building and controlling a teleoperated palpation instrument, in order to extend the possibilities of MIS in the thoracic field. Such an instrument is made of a master device, manipulated by an operator, and a slave device which is in contact with the patient and reproduces the task imposed by the master. Adequate control laws between these two parts allow to restore the operator's haptic sensation. The goal is not to build a marketable prototype, but to establish a proof of concept.<p><p>The palpation device has been designed in collaboration with thoracic surgeons on the basis of the study of the medical gesture. The specifications have been deduced through experiments with experiencied surgeons from the Erasmus Hospital and the Charleroi Civil Hospital.<p><p>A pantograph has been built to be used as the master of the palpation tool. The slave is made of a 2 degrees of freedom (dof) clamp, which can be actuated in compression and shear. The compression corresponds to vertical moves of the pantograph, and the shear to horizontal ones. Force sensors have been designed within this project to measure the efforts along these directions, both at the master and the slave side, in order to implement advanced force-feedback control laws and for validation purposes.<p><p>Teleoperation control laws providing a suitable kinesthetic force feedback for lung palpation have been designed and validated through simulations. These simulations have been realized using a realistic model of lung, validated by experienced surgeons. Among the implemented control schemes, the 3-Channel scheme, including a local force control loop at the master side, is the most efficient for lung palpation. Moreover, the increased efficiency of a 2 dof device with respect to a 1 dof tool has been confirmed. Indeed, a characteristic force profile due to the motion in 2 directions appeared in the compression force tracking, making the lesion easier to locate. / Doctorat en Sciences de l'ingénieur / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les phosphoinositides sont des phospholipides constituant des membranes cellulaires eucaryotes qui participent entre autres à la transmission de certains signaux extracellulaires dans le milieu intracellulaire. Désormais, un contrôle rigoureux et constant de leur métablisme par des enzymes est primordial pour assurer le bon fonctionnement de l'activité cellulaire. La 5-phosphatase SHIP2 est une enzyme capable d'hydrolyser certains de ces phosphoinositides dont le PtdIns(3,4,5)P3. Ce dernier, produit majoritaire d'une famille d'enzymes dénommées les PI(3)K, gouverne un large éventail de fonctions cellulaires dont la prolifération et le métabolisme énergétique. Deux souris knock-out pour SHIP2 ont été rapportées. La première présente une invalidation conjointe, accidentelle, des gènes INPPL1 et PHOX2A ;à l'état homozygote elle conduit à une létalité précoce. L'hétérozygote est viable et hypersensible à l'insuline. La seconde, caractérisée par l'invalidation unique d'INPPL1, est viable à l'état homozygote. D'un point vue phénotypique, cette souris ne montre pas d'altération majeure du métabolisme du glucose sous un régime conventionnel, mais un retard de croissance et une anomalie de la face. Elle est aussi protégée de l'obésité et de l'insulinorésistance induite par un régime riche en graisse.<p>Pour lever la controverse quant au rôle de SHIP2 in vivo chez la souris, le laboratoire hôte a généré un nouveau modèle, la souris SHIP2Δ/Δ, génétiquement modifiée pour exprimer une protéine SHIP2 tronquée dépourvue d'activité catalytique. L'analyse phénotypique de cette souris SHIP2Δ/Δ a permis de confirmer le retard de croissance et l'anomalie craniofaciale observés précédemment. Elle a aussi mis en évidence une réduction de la masse musculaire, de la masse adipeuse et une atrophie du tractus génital femelle. Le métabolisme du glucose et la sensibilité à l'insuline de la souris SHIP2Δ/Δ ne sont que peu affectés. Nous avons ensuite évalué la capacité du mutant SHIP2Δ à corriger l'insulinorésistance consécutive à une réduction de moitié de l'activité PI(3)K de classe IA in vivo chez la souris. L'expression du mutant SHIP2Δ sur ce fond génétique permet de rétablir un métabolisme glucidique normal mais cette récupération ne semble cependant pas s'opérer par la restauration de la phosphorylation de la PKB/Akt. D'autre part, les anomalies du développement de la souris SHIP2Δ/Δ sont maintenues sur ce fond génétique et accompagnées d'une hypertrophie cardiaque. Désormais, les effets de l'inactivation de SHIP2 in vivo chez la souris ne semblent pas être la seule conséquence d'une hyperactivation de la voie PI(3)K de classe IA suite à la perte d'une voie de dégradation du PtdIns(3,4,5)P3. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished