L'hémorragie intra-cérébrale (HIC) est responsable d’environ 15 % des accidents vasculaires cérébraux. Son incidence augmente avec l’âge et sa mortalité à 3 mois est de 30 % pour atteindre 60% à 1 an .1 La prise en charge de l’HIC représente un défi majeur pour la Santé Publique. <p>Plusieurs attitudes thérapeutiques ont été proposées récemment ;parmi elles l’administration, lors de la phase aigue, de substances neuroprotectrices 1,2 ou de facteurs de coagulation 1,2,3 .<p>En effet, c’est durant cette phase, que surviennent l’inondation ventriculaire, la constitution et la croissance de l’hématome et l’engagement cérébral avec le décès comme conséquence.<p>Le contrôle de l'hypertension intra-crânienne représente la première ligne de traitement ;malheureusement son efficacité s’avère très limitée à l’heure actuelle et aucune nouvelle modalité thérapeutique n’a porté ses fruits. 1<p>Dans ce travail nous avons tenté de définir les éléments cliniques intervenant au cours de la phase aigue de l’hémorragie intracérébrale sur lesquels pourraient agir une prise en charge mieux ciblée plus spécifique.<p>(1) Nous avons comparé la dizaine d’échelles pronostiques proposées depuis celle d’Hemphill en 2001, comprenant des éléments cliniques et radiologiques et utilisées pour la stratification du risque dans l’HIC afin de déterminer la ou les plus adaptée(s).3,4,5,6 <p>Nous avons conclu que ces échelles ne permettent pas une discrimination optimale et qu’elles restent équivalentes dans leur sensibilité et spécificité pronostiques.5<p>(2) Nous nous sommes ensuite concentrés sur les éléments cliniques et biologiques liés à la phase aigue de l’HIC pouvant influencer les décisions thérapeutiques (température, glycémie, dysfonction ionique, état critique,…). <p>Il ressort de l’étude de ces facteurs que seule l'hyperglycémie est associée à un mauvais pronostic.7,8<p> (3) Nous avons également essayé de voir si les caractèristiques de la lésion hémorragique jouent un rôle important ;nous avons noté (a) que la taille de l’hématome proprement dit reste l’élément prédicteur le plus important de mortalité, (b) 9 que la taille de l’ œdème cérébral y est lié (c) 9 qu’il existe une synergie d’effets délétères (surtout pour les petits hématomes) entre la taille de l’hématome et celle de l’œdème (d) 9, que la localisation de l’hématome influence également son extension ventriculaire (d) que la quantité de sang libéré dans les ventricules cérébraux a pour conséquence un pronostic péjoratif (associé à l’élévation de la glycémie à la phase aigue). 6,7<p>(4)Nous nous sommes intéressés à l’existence d’une éventuelle susceptibilité génétique pouvant intervenir dans la cinétique du saignement; nous avons relevé que la simple variation d’une paire de base du génome (SNP single nucleotide polymorphism) au niveau des gènes impliqués dans l’hémostase (gène du facteur de von Willebrand; rs216321) et l’agrégation plaquettaire (rs342286) pourrait influencer la taille de l’hématome lors de la phase aigue et sa croissance au cours des premières heures.10,11,12<p> (5) Enfin, nous avons voulu caractériser l’invalidité liée à l’HIC chez les survivants. Il existe une hétérogénéité des échelles d’évolution clinique mais en les comparant, l’Index de Bartel (qui intègre un large éventail d’activités de la vie de tous les jours) se montre supérieur aux scores de Rankin et de Glasgow. 13 Néanmoins, l’index de Barthel n’intègre pas la mortalité au sein des paramètres d’évolution clinique, risquant ainsi de biaiser l'interprétation en présence d’un nombre élevé de décès dans l’étude.<p> En conclusion, au cours de l’HIC, les caractéristiques s évolutifs de l’hématome au cours de la phase aigue, notamment sa taille, sa croissance et son extension dans les ventricules cérébraux sont responsables d’une série d’événements interactifs conduisant à un effet de masse mais également une cascade d’événements biologiques aggravant le pronostic, surtout chez des patients présentant une susceptibilité génétique La prise en compte de ces facteurs de risque devrait permettre une amélioration de la qualité de prise en charge et donc des résultats cliniques.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Lung transplantation is the only therapeutic approach for patients presenting end-stage pulmonary failure. Despite progress made in organ preservation and immunosuppression, primary graft dysfunction and obliterative bronchiolitis still hamper short-term and long-term outcomes, respectively. Interleukin-17 recently emerged as a major actor in several immuno-inflammatory disorders. Clinical and experimental evidence also suggest the implication of interleukin-17 or type 17 CD4+ T cells in lung rejection. We therefore investigated the contribution of this cytokine to graft pathology in a murine model of tracheal transplantation that recapitulates pathological features of lung rejection including the development of obliterative airway disease.<p>We first demonstrated that interleukin-17 contributes to inflammatory lesions in the early phase post-transplantation. Interleukin-17 was found to be produced by &61543;&61540;+ T cells and CD4+ T cells infiltrating the graft and interleukin-17 neutralization significantly reduced the development of epithelial lesions together with inhibition of interleukin-6 and heat-shock-protein 70 gene transcription.<p>We then investigated the contribution of interleukin-17 to obliterative airway disease. Although interleukin-17 did not play a dominant role in absence of immunosuppression, it was found to contribute to airway pathology in animals receiving cyclosporin A. Under this treatment, we first observed dramatic changes in the composition of the lymphocyte populations infiltrating the graft: the numbers of CD8+ T cells producing interferon-&61543; and type 1 CD4+ T cells were dramatically decreased while the numbers of type 17, and also type 2 CD4+ T cells were unaffected. The pathological relevance of these findings was first demonstrated by the prolongation of graft survival afforded by the depletion of CD4+ T cells in cyclosporin A-treated animals. Furthermore, graft rejection was also delayed in mice genetically deficient in either interleukin-17 or interleukin-4, providing evidence that type 17 and type 2 CD4+ T cells actively contribute to graft rejection in cyclosporin A-treated recipients. On the other hand, parallel experiments in interferon-&61543;-deficient mice revealed that interferon-& / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Afin de mieux comprendre la physiopathologie et de mieux caractériser les différents types de tumeurs thyroïdiennes, notre travail s’inscrit dans un projet de recherche visant à identifier des biomarqueurs (signatures moléculaires) et à développer des outils permettant le diagnostic, le pronostic et le traitement de ces tumeurs. Afin d’arriver à cet objectif, les profils d’expression de différents types de tumeurs thyroïdiennes sont étudiés, ainsi que leurs modèles in vitro. L’un des mécanismes physiopathologiques rencontré dans le développement de tumeurs est la dérégulation ou l’expression aberrante de microARN. Il a, par ailleurs, été rapporté que cette famille d’ARN pourrait fournir de bons classifieurs moléculaires. Nous nous sommes dès lors demandés quelle pouvait être l’implication de ces microARN dans le développement des tumeurs thyroïdiennes, et s’ils pouvaient fournir un bon outil de classification. <p><p>Ainsi, dans la première partie de cette thèse, nous avons caractérisé les profils d’expression miRNA d’une tumeur bénigne différenciée, l’adénome autonome hyperfonctionnel. Afin d’aller au-delà d’une simple description des régulations miRNA observées, nous avons également étudié les profils d’expression ARNm. Au travers d’algorithmes de prédiction de cibles ARNm de miRNA, nous avons pu proposer des hypothèses quant à la signification des régulations observées. De plus, en utilisant un test fonctionnel luciférase, nous avons montré que deux miRNA (hsa-miR-144 et hsa-miR-451) peuvent lier le 3’UTR et réprimer l’expression d’une phosphodiestérase (PDE4D), mettant ainsi en évidence un mécanisme de rétrocontrôle négatif du niveau d’AMPc dans ce type de tumeur. <p><p>Outre les adénomes autonomes, nous avons également étudié les profils d’expression des microARN dans les adénomes et carcinomes folliculaires, afin de mieux comprendre leurs physiopathologies et d’étudier le pouvoir discriminant des miRNA pour la distinction de ces deux types de tumeurs. Nos résultats, encore partiels, remettent en question l’actuelle classification des adénomes et carcinomes folliculaires en deux groupes distincts. Nos données vont plutôt vers un continuum de tumeurs appartenant à une classe unique mais présentant des stades d’évolution différents. <p><p>Afin de pouvoir étudier plus en profondeur les mécanismes tumoraux, il est nécessaire d’avoir à sa disposition de bons modèles in vitro. Nous avons étudié la représentativité des cultures primaires de thyrocytes humains sains et de lignées cellulaires thyroïdiennes humaines cancéreuses pour l’étude des microARN dans les tumeurs thyroïdiennes. Nos résultats indiquent que les longs temps de stimulation des cultures primaires par la TSH ou l’EGF/sérum ne mimiquent respectivement pas les adénomes autonomes ou les carcinomes papillaires, comme c’est le cas au niveau des ARNm. Par contre, il apparaît clairement que les lignées cellulaires, du point de vue des miRNA, ont toutes évolué vers un phénotype commun, dédifférencié. Elles représentent dès lors un bon modèle pour l’étude des cancers thyroïdiens anaplasiques.<p><p>Nos résultats nous ont également amenés à nous poser des questions sur la stabilité des miRNA. Nous avons ainsi entrepris d’en étudier la demi-vie. Nous avons mis au point une stratégie expérimentale permettant d’en étudier la stabilité dans des conditions les plus physiologiques possibles. Ceci nous a permis d’obtenir un atlas de demi-vies des miRNA dans la lignée cellulaire BCPAP. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

During development of the cerebral cortex, the various neuronal subtypes have to reach their correct final position in the post mitotic compartment where they complete their maturation and eventually establish functional networks. Precise positioning of individual neurons is acquired through tight regulation of the multiple transitions that neurons undergo on their way to the cortical plate. Neurons of the cerebral cortex are organized in layers and columns. Although several molecular mechanisms have been identified that control the final position of neurons along the radial dimension of the cortex (i.e. layer specificity), much less is known about how their final tangential, or mediolateral, distribution is controlled. However this may have a direct impact on the structural and functional organization of cortical columns, since sister neurons derived from the same progenitor display selective patterns of connectivity with each other and/or share similar functional properties. Here we studied the role of B-ephrins in the control of migration of cortical pyramidal neurons. Gain of function experiments using in utero electroporation of ephrin-B1 revealed a striking alteration of the tangential distribution of pyramidal neurons during the multipolar stage of radial migration, resulting in clustering of the pyramidal neurons in the cortical plate. Conversely, clonal analysis of migrating neurons in ephrin-B1 knockout mice showed a wider mediolateral dispersion of cortical neurons. Static and dynamic analyses of migrating neurons revealed that ephrin-B1 modulates the morphology of pyramidal neurons during their multipolar phase, thereby restricting their tangential migration at that stage. Our results demonstrate that ephrin-B1 is a specific inhibitor of non-radial migration of pyramidal neurons, thereby controlling the pattern of cortical columns. These data shed new light on this important aspect of pyramidal neuronal migration, and illustrate how alterations of patterns of migration can affect cortical column organization. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The proposal of this work was to determine the contribution of functional MR imaging techniques, i.e. secretin-enhanced MRCP (S-MRCP) and dynamic contrast-enhanced magnetic resonance (DCE-MR) imaging in the quantitative assessment of exocrine pancreatic function and perfusion.<p><p>The pancreas is both an exocrine and endocrine organ, though the exocrine tissue accounts for more than 90%. The exocrine pancreas is specialized in the synthesis and storage of digestive enzymes and in bicarbonate and water secretion in response respectively to various secretagogues (CCK, ach, GRP, VIP,…) and to secretin. <p>The arterial supply of the pancreas derives from branches of the celiac trunk and of the superior mesenteric artery. The microvascularity of the exocrine and the endocrine parts of the gland are anatomically and functionally separated, with differentially regulated blood perfusion. <p>Based on the knowledge of a close relationship between the activity of the gland and its blood supply, in normal conditions pancreatic perfusion responds to the functional state of the exocrine parenchyma: increased demands for exocrine secretions are associated with increased pancreatic blood flow. <p>The pancreatic gland can be involved at different degrees of severity in acute and chronic inflammatory processes due to various causes. In both processes microcirculatory changes occur and the pancreatic exocrine function can be impaired. Moreover, an exiguous microvascular component characterizes pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) related to a prominent stroma.<p><p><p>In the first section of this thesis, quantitative assessment of the pancreatic exocrine secretions was performed with S-MRCP in physiologic and non-physiologic conditions. The stimulating effect of secretin as well as the inhibitory effect of somatostatin on normal pancreas, both administered at different dose-regimens, were tested. The results of these investigations showed that quantitative S-MRCP is able to detect changes in pancreatic exocrine secretions correlated to the degree of stimulation or inhibition. <p>In pathologic settings, pancreatic exocrine secretions were assessed in chronic pancreatitis patients showing different degrees of severity, before and after endoscopic pancreatic duct drainage procedures (PDDP). In the group of patients presenting a reduced pancreatic exocrine reserve before treatment, quantitative S-MRCP showed a short-term improvement after PDDP. <p><p>In the second section, the feasibility and the reproducibility of DCE-MR imaging to quantify regional pancreatic perfusion was firstly investigated. DCE-MR imaging was performed in normal volunteers. Reference values for regional pancreatic perfusion were achieved with an intra-individual variability of 21%.<p>DCE-MR investigations were repeated during secretin stimulation and disclosed a significant increase of regional pancreatic perfusion in all individuals. <p>Secondly, DCE-MR imaging investigated benign and malignant focal pancreatic solid lesions and non tumoral tissue in patients undergoing pancreatic surgical resection. The purpose was to correlate DCE-MR quantitative parameters, (reflecting perfusion and/or permeability and the distribution volume fraction) with histologic features such as the degree of fibrosis and the microvascular density (MVD) in the corresponding tissues. A significant correlation was found between DCE-MR and histologic parameters: Ktrans was negatively correlated with the degree of fibrosis (high fibrosis was correlated with low perfusion), while the distribution volume fraction was positively correlated with the degree of fibrosis and with MVD (larger EES was correlated with high fibrosis and higher MVD). <p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Friedreich’s ataxia (FRDA) is an autosomal recessive inherited disorder affecting approximately 1 every 40,000 individuals in Western Europe, is characterized by progressive gait and limb ataxia, dysarthria, areflexia, loss of vibratory and position sense, and a progressive weakness of central origin. Additional features particularly include an hypertrophic cardiomyopathy that can cause premature death. A large GAA repeat expansion in the first intron of the FXN gene is the most common mutation underlying FRDA. Patients show severely reduced levels of the FXN-encoded mitochondrial protein frataxin.<p>Frataxin function is not yet completely elucidated. In frataxin deficiency conditions abnormalities of iron metabolism occur: decreased activities of iron-sulfur cluster (ISC) containing proteins, accumulation of iron in mitochondria and depletion in the cytosol, enhanced cellular iron uptake, and, in some models, reduced heme synthesis. <p>Evidence of oxidative stress has also been found in most though not all models of frataxin deficiency. Accordingly, yfh1-deficient yeast and cells from FRDA patients are highly sensitive to oxidants. Respiratory chain dysfunction further aggravate oxidative stress by increasing leakage of electrons and the formation of superoxide. Frataxin deficient cells not only generate more free radicals, but, they also show a reduced ability to mobilize antioxidant defenses, in particular to induce superoxide dismutase 2 (SOD2).<p>Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) isoform-gamma play a key role in numerous cellular functions and is a key regulator of mitochondrial biogenesis and of the ROS metabolism. Recruitment of the PPAR coactivator-1a (PGC-1a) mediates many effects of the PPAR-γ activation.<p>In a first work we assessed the potential beneficial effects of a potent PPAR-gamma agonist on frataxin expression in primary fibroblasts from healthy controls and FRDA patients, and Neuroblastoma cells. We used the APAF molecule (1-0-hexadecyl-2-azelaoyl-sn-glycero-3-phosphocoline; C33H66NO9P). Our results show that this compound is able to increase frataxin amount both at transcriptional and post-transcriptional level. At a dose of 20µM frataxin mRNA significantly increases in both controls (p=0.03) and FRDA patients (p=0.002) fibroblasts (1). The finding was confirmed in Neuroblastoma cells (p=0.042). According to previous publications APAF, as others PPAR-gamma agonists is able to up-regulate PGC-1a transcription.<p>In a second part of the study we investigate the role of the PPAR-gamma/PGC-1a pathway in the pathogenesis of FRDA. We performed a microarray analysis of heart and skeletal muscle in a mouse model of frataxin deficiency and we found molecular evidence of increased lipogenesis in skeletal muscle and alteration of fiber-type composition in heart, consistent with insulin resistance and cardiomyopathy, respectively. Since the PPAR-gamma pathway is known to regulate both processes, we hypothesized that dysregulation of this pathway could play a key role in frataxin deficiency. We confirmed this by showing a coordinate dysregulation of Pgc1a and the transcription factor Srebp1 in cellular and animal models of frataxin deficiency, and in cells from FRDA patients, who have marked insulin resistance. Particularly, PGC-1a was found significantly reduced (2) in primary fibroblasts and lymphocytes from FRDA patients (p<0.05). Furthermore, PGC-1a mRNA levels strongly correlate with frataxin relative mRNA levels (r2=0.9, p<0.001). According to this observation, in C2C12 myoblasts, PGC-1a and a reporter gene under the control of the PGC-1a promoter are rapidly down-regulated (p<0.05) when frataxin expression is inhibited by an shRNA in vitro. To further investigate this relation, we then generate PGC-1a deficient fibroblasts cells using a specific siRNA; at 72 hours of transfection frataxin was found down-regulate (p<0.05) in control cells. <p>Taken together those data indicate that some mechanism directly links an early effect of frataxin deficiency with reduced PGC-1a transcription in this cell type, and presumably in other cells that also down-regulate PGC-1α when frataxin levels are low.<p>Finally, since PGC-1a has also emerged as a key factor in the induction of many antioxidant programs in response to oxidative stress, both in vivo and in vitro, in particular in neurons, we tested whether the PGC-1a down-regulation occurring in FRDA cells could be in part responsible for the blunted antioxidant response observed in frataxin deficiency.<p>Using primary fibroblasts from FRDA patients we found reduced SOD2 levels (p<0.05), according to PGC1& / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

1. Sphingolipid-cholesterol domains (lipid rafts) in normal human and dog thyroid follicular cells are not involved in thyrotropin receptor signalling. <p>Thyroid hormone regulates growth and development throughout the animal kingdom. The thyroid which secretes it, is controlled by TSH and its receptor TSHR. TSH and its receptor TSHR act through TSHR-coupled G proteins to control thyroid functions, with a stronger coupling of the TSHR with Gs protein than with Gq protein in human thyrocytes. Gq is not activated by TSH/TSHR in dog, whereas dog TSHR activates it in CHO transfected cells. To better understand TSHR and its downstream effectors G proteins, we attempted to answer the questions by the role of “lipid rafts/caveolae” in TSH action.<p>Lipid rafts/caveolae are sphingolipids-cholesterol-enriched microdomains on plasma membrane that have been proposed to play a role in signal transduction. By concentrating the signal molecules, lipid rafts/caveolae increase the efficiency of the interactions between the molecules and sequestrate them from the bulk membranes. The compartmentation of signal proteins in lipid rafts/caveolae might provide a possible explanation for the relationship between TSHR and G proteins in human and dog thyroctyes.<p>To answer these questions, we first tested the existence of such lipid microdomains in human and dog thyrocytes. By northernblot and RT-PCR of caveolin-1 mRNA, we demonstrated its existence in thyrocytes. The immunohistochemistry of caveolin-1 showed that caveolin/caveolae are present on the apical membrane of thyrocytes, opposite to the TSHR localization on the basolateral membranes. The isolation of lipid rafts/caveolae by Triton X-100/OptiPrep density experiments showed that TSHR and Gq are not in the rafts, even though other proteins such as insulin receptor, flotillin-2 and partially Gs are present in these lipid domains, as expected. Testing the function of the TSH receptor on its main cascade (Gs-Adenylyl cyclase-cAMP) after treating the follicles with Methyl β-cyclodextrin (a cholesterol chelator), we observed no modification of the cAMP levels by this treatment. This is in agreement with our conclusion that the TSHR-Gs-cAMP pathway does not involve the lipid rafts/caveolae domain.<p>TSH-activated signalling does not take place in these membrane domains. Therefore, the differences between species, concerning the TSHR-G proteins coupling cannot be explained by the presence of these membrane domains.<p>2. Species specific thyroid signal transduction: conserved physiology, diverged mechanisms<p>As mentioned above, Gq proteins are activated in human but not in dog thyroid, in response to TSHR. However the dog TSH receptor is able to activate Gq, as demonstrated in transfected CHO cells. Thus, different thyroid signal transduction pathways exist in different species. <p>In this study, we investigated the effects of TSH on its two signal transduction cascades, the cAMP pathway and the phospholipase C – IP3 – DAG pathway, as measured by cAMP levels and inositol phosphate generation. We also measured the effects of TSH and of agents stimulating specifically one of these cascades, forskolin for the cAMP pathway and Ca++ ionophore (ionomycin) and phorbolmyristate ester (TPA) for the phospholipase C pathway, on markers of thyroid hormone synthesis (H2O2 generation and iodide binding to proteins) and on thyroid hormone secretion in vitro in the various thyroids. <p>We demonstrated that in all species investigated, the TSH receptor activates both hormone synthesis and secretion. While in some species, including humans, rats and mice, the TSH receptor activates both the cAMP and phospholipase C– IP3 – DAG cascades, in others (e.g. dog) it only stimulates the first. The cAMP pathway activates the limiting step in thyroid hormone synthesis, the generation of H2O2, in dog, rat and mice but not in human, pig, horse and beef. Thus physiology remains but the pathways to achieve it differ. On a practical point of view, these results allow to choose adequate animal models for investigating different aspects of human thyroid signalling.<p><p>3. Duoxes -TPO association and its regulation in human thyrocytes: the thyroxisome<p>Duox (Dual Oxidase) and TPO (thyroid peroxidase) are the crucial enzymes for the thyroid hormones biosynthesis (T3/T4). TPO uses the hydrogen peroxide (H2O2) produced by Duox1 and Duox2 isoenzymes to covalently link oxidized iodide to tyrosines of thyroglobulin and couple the iodinated tyrosines to form triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4). An excess of H2O2 is considered to be toxic for cells although at appropriate concentrations H2O2 may carry out signalling functions. Even though thyrocytes show a better resistance to H2O2 than other cells, it would be beneficial for thyrocytes if Duox and TPO localize closely to increase the working efficiency and avoid an excessive H2O2 spillage. In this study, we explored the association of Duox with TPO, and the possible factors affecting their interaction in the human thyrocyte model. This association was established by co-immunoprecipitation approaches on purified plasma membranes from human thyrocytes and COS-7 transfected cells. <p>Our results show that 1) Duox and TPO localize closely at the plasma membranes of human thyrocytes, 2) this association is up-regulated through the Gq-PLC-Ca2+-PKC pathway and down-regulated through the Gs-cAMP-PKA pathway. 3) H2O2 directly increases the association of Duox and TPO. 4) Partial NH2- or COOH-terminal Duox1 and Duox2 proteins show different binding abilities with TPO in COS-7 transfected cells.<p>The association of the two proteins Duox and TPO thus supports our previous hypothesis of the thyroxisome, a pluriprotein plasma membrane complex in which elements of the iodination apparatus localize closely, thus optimizing working efficiency and minimizing H2O2 spillage. Defect in this association, independently of the catalytic efficiency of the enzyme, could therefore impair thyroid hormone synthesis and be harmful to thyroid cells, leading to thyroid insufficiency.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le séquençage de nombreux génomes eucaryotes indique que l’augmentation de la «biocomplexité» au cours de l’évolution n’est pas directement corrélée à l’accroissement du nombre de gènes. En d’autres termes, nous sommes plus que la somme de nos gènes et l’ère post-génomique actuelle promet de cerner de façon plus précise les bases moléculaires de notre identité. A cet égard, il semble de plus en plus clair que l’épigénétique est riche d’une information qui se superpose à celle du code génétique. L’information épigénétique est principalement véhiculée par des modifications de l’ADN et des histones. La modification majeure de l’ADN est la méthylation de la cytosine qui est la marque d’une chromatine transcriptionnellement silencieuse. Quant aux histones, différentes modifications posttraductionnelles ont été décrites, comme l’acétylation, la phosphorylation, la méthylation et l’ubiquitinylation. L’ensemble de ces modifications constituerait un «code histone», dont le décryptage n’en est qu’à ses prémices, permettant d’associer à chaque combinaison de modifications un état particulier de la chromatine, et ainsi de l’expression génique. La méthylation des histones a longtemps été considérée comme irréversible mais l'identification récente de déméthylases des histones spécifiques de certains sites a révélé que cette modification est régulée de façon dynamique et réversible. La découverte de ces enzymes a ouvert de nouveaux axes de recherche dans le domaine de l'épigénétique (Klose and Zhang, 2007). <p><p>Au cours de ma thèse de doctorat, nous nous sommes intéressés à la déméthylase PADI4 (peptidylarginine déiminase 4) qui convertit des résidus arginines des histones H3 et H4, associés à l'activation des gènes, en résidus citrullines, ce qui a pour conséquence d'entraîner une répression transcriptionnelle. Cette réaction porte le nom plus particulier de déimination/citrullination des histones. A l’heure actuelle, il est primordial de cerner comment la déméthylation des histones, et plus précisément la peptidylarginine deiminase 4 (PADI4), réprime la transcription. <p><p>Dans un premier temps, nous avons mis en évidence un lien mécanistique entre la deméthylation et la désacétylation des histones. Nous avons montré que PADI4 interagit avec l’histone désacétylase HDAC1. Cette enzyme est responsable du décrochage des groupements acétyls des histones, conduisant à la fermeture de la chromatine. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine indiquent que PADI4 et HDAC1 s’associent au promoteur du gène de réponse aux oetrogènes pS2 simultanément et de manière cyclique. L’utilisation d’une construction shRNA dirigée contre la protéine endogène HDAC1 indique que la liaison de PADI4 au promoteur du gène pS2 est dépendante de la présence de HDAC1.<p><p>Dans la deuxième partie de notre travail, un lien mécanistique entre la déméthylation des histones par PADI4 et la méthylation de l’ADN a été mis en évidence. La méthylation de l’ADN est catalysée par des enzymes, appelées méthyltransférases de l’ADN (DNMTs), qui transfèrent des résidus méthyls sur les cytosines. Nous avons montré que la protéine DNMT3A interagit avec PADI4. Nous avons également démontré que l’enzyme PADI4 était capable de citrulliner/déiminer (convertir des résidus arginines en résidus citrullines) la méthyltransférase de l’ADN DNMT3A in vitro et que cette citrullination de la protéine DNMT3A par PADI4 stabiliserait DNMT3A in vivo.<p><p>Enfin, nos récents travaux révèlent une relation mécanistique entre la protéine MeCP2, interprète des signaux de méthylation de l’ADN, et la protéine polycomb EZH2. Celle-ci possède une activité méthyltransférase d’histone sur les lysines 27 de l’histone H3. Nos données montrent que MeCP2 interagit avec EZH2 et que ces protéines fixent des régions promotrices communes. De plus, la déplétion en MeCP2 affecte la présence de EZH2 au niveau de ces régions communes.<p><p>En conclusion, ce travail de thèse devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de l’épigénétique. Plus particulièrement, il devrait aider à mieux cerner comment la première histone déméthylase décrite, la peptidylarginine déiminase 4 ou PADI4, verrouille l’expression génique.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le récepteur d'œstrogènes a (ROa), dont l'implication dans le développement du cancer du sein est clairement établie, appartient à la super-famille des récepteurs nucléaires qui sont des facteurs de transcription dont l'activité dépend d'un ligand régulateur, en l'occurrence le 17b-œstradiol. Le ROa régit l'expression de gènes nécessaires à la prolifération et à la différentiation cellulaire, ceci par association avec des séquences d'ADN situées à proximité de leur promoteur. Le ROa, une fois associé à son hormone, se défait des protéines qui le stabilisent dans une forme inactive (chaperonnes et corépresseurs) permettant ainsi le recrutement de protéines coactivatrices. Ces dissociations / associations se font de façon séquentielle selon un programme cyclique dans lequel la dégradation protéasomale du récepteur semble jouer un rôle clé.<p><p>Les thérapies visant à contrecarrer la progression des cancers mammaires hormono-dépendants sont principalement basées sur l'inactivation du ROa. A cette fin et à ce jour, deux stratégies sont mises en œuvre: l'inhibition de la production d'œstrogènes (inhibiteurs d'aromatases) et l'inhibition du ROa lui-même (anti-œstrogènes). Face à l'apparition de résistances à ces traitements, la recherche de nouvelles cibles s'avère nécessaire. En effet, que ce soit de façon indirecte (inhibiteurs d'aromatases) ou directe (anti-œstrogènes), toutes les molécules utilisées en clinique ciblent la poche de liaison de l'hormone. Une autre approche visant à entraver l'action du ROa serait l'inhibition du recrutement de ses coactivateurs. Ainsi, il a été récemment rapporté que des peptides ou des mimes peptidiques inhibant de tels recrutements pourraient effectivement être d'utilité thérapeutique. <p><p>Notre travail s'inscrit dans cette optique: l'étude du motif P295-T311 du ROa nous a permis de mettre en évidence une cible distincte de celles décrites ci-dessus. Ce motif semble être une région critique dans le contrôle de l'activité transcriptionnelle du ROa. Il est, en effet, sujet à phosphorylation, acétylation, méthylation, ubiquitination, SUMOylation et protéolyse. Par ailleurs, des études antérieures à ce travail ont suggéré son implication dans la liaison d'une protéine corégulatrice du ROa: la calmoduline (CaM), le principal senseur du calcium intracellulaire. Cependant, le rôle de cette association dans le processus d'activation du récepteur restait partiellement indéterminé.<p><p>\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

SHIP2 (SH2 domain-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase type 2) est un enzyme de la famille des inositol polyphosphate 5-phosphatases qui déphosphoryle le PtdIns(3,4,5)P3, second messager intervenant dans différentes voies de signalisation cellulaire et impliqué dans de nombreux processus biologiques.<p>La surexpression de SHIP2 en cellule, de même que son invalidation chez la souris, ont montré un rôle de cet enzyme dans le contrôle négatif de la cascade de signalisation de l’insuline et dans la sensibilité à cette hormone. Par ailleurs, plusieurs études de polymorphismes chez l’homme ont montré une association entre ce gène et le diabète de type2.<p>La découverte au sein de notre laboratoire de la délétion d’un motif semblable à ceux présents dans les régions déstabilisatrices de type AU-riche dans la région 3’non codante (3’UTR) du gène SHIP2 chez des patients atteints de diabète de type 2, nous a conduit à explorer le rôle de cette région dans le contrôle de l’expression de SHIP2.<p>Dans ce but, nous avons entrepris d’identifier des protéines capables de lier ce motif AU-riche et d’entraîner l’ARN de SHIP2 vers la dégradation, et ce par deux techniques distinctes :l’une in vivo chez la levure (le triple hybride) et l’autre in vitro, par l’intermédiaire d’une sonde ARN biotinylée. Malheureusement, aucune de ces deux techniques ne nous a permis d’identifier des protéines se liant à l’ARNm de SHIP2. D’autre part, l’analyse de souris génétiquement modifiées présentant dans la région 3’UTR de SHIP2 une mutation similaire à celle observée chez les patients diabétiques n’a pas montré une augmentation significative d’expression de SHIP2 comme on aurait pu s’y attendre.<p>Malgré les différentes techniques mises en place, nous ne sommes pas parvenus à caractériser le rôle joué par le 3’UTR de SHIP2 sur le contrôle de son expression.<p>Dans le but de caractériser l’effet d’une surexpression de SHIP2 et de déterminer si une surexpression de ce gène pouvait mimer le phénotype de diabète de type 2 observé au sein de la population, nous avons généré des souris transgéniques d’addition par transgenèse lentivirale.<p>Deux axes phénotypiques majeurs ont été explorés chez ces souris :le métabolisme du glucose et la prise de poids consécutive à divers régimes alimentaire.<p>Les souris transgéniques présentent un retard dans la captation du glucose en réponse à une surcharge en glucose, s’accompagnant d’un défaut de sécrétion d’insuline. Par contre, aucune altération de la sensibilité à l’insuline n’est observée suite à une injection de cette hormone. Cette absence d’altération de la sensibilité à l’insuline est également soutenue par le fait qu’aucune altération de la captation de glucose n’est observée chez des souris surexprimant le transgène spécifiquement dans le muscle squelettique.<p>Les analyses de prise de poids des souris transgéniques ont révélé une résistance à l’obésité des mâles transgéniques lorsqu’ils sont soumis à un régime alimentaire riche en graisse. Par contre, aucune différence n’est observée sous régime alimentaire conventionnel ou faible en graisse. La plus faible prise de poids des souris transgéniques sous régime riche en graisse s’accompagnant d’une plus faible prise de nourriture, un rôle de SHIP2 dans la régulation du comportement alimentaire et de l’appétit n’est pas à exclure.<p>En conclusion, la surexpression de SHIP2 chez la souris provoque une intolérance au glucose induite, en tout cas en partie, par une plus faible sécrétion d’insuline, ainsi qu’une résistance à l’obésité induite par un régime riche en graisse.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished