Les nucléotides, et tout particulièrement l’ATP, sont capables de moduler la fonction de l’un des principaux acteurs de la réponse immunitaire à savoir les cellules dendritiques (DC). Les DC expriment à leur surface de nombreux récepteurs P2X et P2Y dont le P2Y11, couplé à la voie de l’AMP cyclique (AMPc) et impliqué dans l’immunomodulation. L’ATP est capable, par son action sur le P2Y11, d’induire une semi-maturation des DC caractérisée entre autre par une diminution de la sécrétion d’IL-12 et une augmentation de la sécrétion d’IL-10. De plus, des données antérieures obtenues au laboratoire montrent que l’ATP confère également des propriétés immunosuppressives aux DC en stimulant l’expression de la thrombospondine-1 (TSP-1) et de l’indoléamine-2,3-dioxygénase (IDO).<p><p>Dans ce contexte, notre projet visait à établir un profil d’expression génique en réponse à l’ATP dans des DC humaines issues de monocytes (MoDC) afin d’avoir une vue globale de l’action de l’ATP sur les DC. Dans un premier temps, nous avons donc réalisé une étude cinétique comparant les profils d’expression génique en réponse à l’ATPγS, un agoniste plus stable que l’ATP, et à la prostaglandine E2 (PGE2), un activateur de l’AMPc induisant une semi-maturation des DC, par la technique de microarray. L’analyse de ces profils a mis en évidence une action précoce et large de l’ATPγS sur les MoDC. Un grand nombre de régulations obtenues ont confirmé les effets déjà connus de l’ATP sur les DC. Par ailleurs, nous avons confirmé par différentes techniques plusieurs nouvelles cibles de l’ATP impliquées dans l’inflammation et la réponse immunitaire (ex. CSF-1, NRP-1, VEGF).<p><p>En analysant plus en détail ces profils, nous avons observés la régulation de plusieurs gènes dont VEGF, AREG, EREG et HB-EGF, intervenant dans les processus d’angiogenèse et de tumorigenèse. Parmi ceux-ci, le gène AREG codant pour l’amphiréguline, un ligand de l’EGF récepteur (EGFR) était le gène le plus régulé dans notre profil microarray. Pour la première fois, nous avons démontré que les DC traitées à l’ATPγS en présence de LPS constituaient une importante source d’amphiréguline capable de stimuler la croissance de cellules musculaires lisses et de cellules tumorales LLC (Lewis Lung Carcinoma) in vitro. <p>Parallèlement, nous avons étudié l’implication des cellules dendritiques traitées à l’ATPγS sur la croissance tumorale in vivo. Pour ce faire, nous avons coinjecté, à des souris C57 black/6, des cellules tumorales LLC avec des surnageants issus de BMDC traitées au LPS ou au LPS+ATPγS. De cette façon, nous avons mis en évidence que des surnageants issus de BMDC traitées au LPS+ATPγS induisaient une augmentation significative de la masse tumorale par rapport aux surnageants issus de BMDC traités au LPS seul. Au moyen d’un anticorps bloquant anti-amphiréguline, nous avons démontré que cette augmentation de la masse tumorale était due à l’importante sécrétion d’amphiréguline par les BMDC traitées au LPS+ATPγS. De plus, nous avons observé une augmentation du nombre de vaisseaux positifs pour l’α-SMA, un des marqueurs des cellules musculaires lisses, dans les tumeurs issues de la coinjection de cellules LLC avec des surnageants de BMDC traitées au LPS+ATPγS. Pour finir, nous avons montré que les DC au sein des tumeurs LLC expriment non seulement le récepteur EGFR mais également l’amphiréguline. Ces différents résultats observés mettent en avant l’importance de l’ATP extracellulaire dans la croissance tumorale par son action sur les DC. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Friedreich’s ataxia (FRDA) is an inherited recessive disorder characterized by progressive neurological disability and heart disease. It is caused by a pathological intronic hyperexpansion of a GAA repeat in the FXN gene, encoding the essential mitochondrial protein frataxin. At the homozygous state, the GAA expansion induces a heterochromatin state with decreased histone acetylation and increased methylation, resulting in a partial deficiency of frataxin expression. This was established in cells from FRDA patients. We showed that the same chromatin changes exist in a GAA based mouse model, KIKI, generated in our laboratory. Furthermore, treatment of KIKI mice with a novel Histone Deacetylase Inhibitor (HDACi), 106, a pimelic diphenylamide that increases frataxin levels in FRDA cell culture, restored frataxin levels in the nervous system and heart of KIKI mice and induced histone hyperacetylation near the GAA repeat. As shown by microarrays, most of the differentially expressed genes in KIKI were corrected towards wild type. In an effort to improve the pharmacological profile of compound 106, we synthesized more compounds based on its structure and specificity. We characterized two of these compounds in FRDA patients’ peripheral blood lymphocytes and in the KIKI mouse model. We observed a sustained frataxin upregulation in both systems, and, by following the time course of the events, we concluded that the effects of these compounds last longer than the time of direct exposure to HDACi. Our results support the pre-clinical development of a therapeutic approach based on pimelic diphenylamide HDACis for FRDA. Laboratory tools to follow disease progression and assess drug efficacy are needed in a slowly progressive neurodegenerative disease such as FRDA. We used microarrays to characterize the gene expression profile in peripheral lymphocytes from FRDA patients, carriers and controls. We identified gene expression changes in heterozygous, clinically unaffected GAA expansion carriers, suggesting that they present a biochemical phenotype, consistent with data from animal models of frataxin deficiency. We identified a subset of genes changing in patients as a result of pathological frataxin deficiency establishing robust gene expression changes in peripheral lymphocytes. These changes can be used as a biomarker to monitor disease progression and potentially assess drug efficacy. To this end, we used he same methodology to characterize the gene expression profiles in peripheral lymphocytes after treatment with pimelic diphenylamide HDACi. This treatment had relevant effects on gene expression on peripheral patients’ blood lymphocytes. It increased frataxin levels in a dose-dependent manner, and partially rescued the gene expression phenotype associated with frataxin deficiency in the tested cell model, thus providing the first application of a biomarker gene set in FRDA. / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Aujourd’hui, il est clairement établi que les lymphocytes T (LT) du donneur stimulés chroniquement par les antigènes mineurs (mHAgs) du receveur sont responsables du développement de la maladie du greffon contre l’hôte (GVHD). Il devient dès lors primordial de mettre au point des mécanismes permettant de contrôler l’activité et la fonctionnalité des LT du donneur soumis à une stimulation antigénique persistante.<p>\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Notre travail a permis tout d’abord d’investiguer les effets des nucléotides extracellulaires sur les cellules<p>dendritiques (DCs) qui sont des cellules présentatrices d’antigènes capables d’initier et de réguler la<p>réponse immunitaire. Afin d’avoir une vue globale de l’action des nucléotides extracellulaires sur les DCs,<p>un profil d’expression génique de l’ATPgS – dérivé stable de l’ATP - a été réalisé par microarray dans les<p>cellules dendritiques dérivées de monocytes (MoDCs).<p>Notre groupe a préalablement montré que malgré que l’ATP est considéré comme un signal de danger, il<p>confère des propriétés immunosuppressives aux DCs (Marteau et al, 2005). Nous nous sommes focalisés<p>sur des régulations géniques pouvant être mises en relation avec un action anti-inflammatoire de l’ATP.<p>Nous avons ainsi démontré que l’ATP était capable d’inhiber la sécrétion des chimiokines MCP-1 et MIP-<p>1a initiée par l’action du LPS, ce qui a pour conséquence de diminuer la capacité des DCs à recruter des<p>monocytes ou d’autres DCs. Ce travail a fait l’objet d’une publication en tant que premier auteur<p>(Horckmans et al, 2005).<p>Un grand nombre d’autres gènes régulés liés à la réponse immune et à l’inflammation a été identifiée<p>dans le profil microarray de l’ATPgS. Nous avions notamment pu identifier une augmentation de la<p>sécrétion de VEGF-A en réponse à l’ATP, amplifiée en présence de LPS. Cette régulation est extrêmement<p>intéressante au vu de l’action immunosuppressive du VEGF sur les DCs. Par ailleurs, cette régulation<p>pourrait constituer un lien entre les DCs et l’angiogénese. Ce travail a fait l’objet d’une publication en tant<p>que premier co-auteur dans la revue Journal of Immunology (Bles et al, 2007).<p>En conclusion, nos données nous ont ainsi permis de montrer que les nucléotides adényliques peuvent<p>avoir par leur action sur les cellules dendritiques une action anti-inflammatoire voire pro-angiogénique,<p>en inhibant le recrutement leucocytaire et une action immunosuppressive en stimulant la sécrétion de<p>VEGF.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Malgré la disponibilité d’un traitement curatif et un vaccin largement utilisé, l’OMS estime qu’approximativement un tiers de la population mondiale est infectée par Mycobacterium tuberculosis, l’agent étiologique de la tuberculose, et qu’environ 2 millions de personnes en meurent chaque année. La compréhension de l’épidémiologie de la tuberculose et les actions de contrôle de la maladie ont été, récemment, compliquées par l’émergence de bacilles tuberculeux résistants aux antibiotiques et par la synergie fournie par la co-infection avec le VIH. Une tendance alarmante pour la santé publique est l’émergence de souches résistantes à plusieurs antibiotiques (multi-résistantes, MDR), définies comme des isolats résistants au moins à l’isoniazide (INH) et la rifampicine (RIF), les deux agents anti-tuberculeux les plus puissants.<p><p>La sélection de mutants résistants se produit chez le patient lorsque les taux d’antibiotiques présents dans le corps sont sub-thérapeutiques ou lorsque la thérapie est inappropriée. Un des facteurs favorisant est l’exceptionnelle durée de la chémothérapie. Le besoin de maintenir des taux élevés d’antibiotiques pendant des mois, combiné avec la toxicité inhérente des agents, résultent en une observance incomplète du traitement par le patient et le risque d’acquérir des résistances. La résistance aux antibiotiques chez M. tuberculosis résulte d’altérations dans des gènes chromosomiques spécifiques. Les causes génétiques de la résistance ont été définies pour certains antibiotiques bien que plusieurs inconnues persistent. <p><p>Le présent travail a consisté en l’étude du problème de la résistance aux antibiotiques anti-tuberculeux par différentes approches :l’analyse génétique des mécanismes de résistance, l’évaluation de l’activité thérapeutique de nouvelles molécules et la caractérisation du profil de résistance de souches cliniques. <p><p>L’acide p-aminosalicylique (PAS) est un antibiotique bactériostatique de deuxième ligne dont le mécanisme d'action sur le bacille tuberculeux est incompris. Récemment, en utilisant la mutagenèse par transposon, la résistance au PAS fut associée à des mutations de la thymidylate synthase encodée par le gène thyA. Suite à cette découverte, nous avons entrepris une étude moléculaire de souches cliniques et de mutants spontanés résistants au PAS. Des mutations du gène thyA furent identifiées chez seulement 37% des souches. En tout, vingt-quatre mutations différentes furent identifiées dans le gène thyA. Les séquences nucléotidiques de cinq autres gènes de la voie de synthèse du folate et de la thymine (dfrA, folC, folP1, folP2, et thyX) ainsi que de 3 gènes encodant des N-acétyltransférases (nhoA, aac1 et aac2) furent également analysées mais aucune mutation associée à la résistance au PAS n’a pu être mise en évidence. L’utilisation de techniques bioinformatiques de prédiction structurelle révèle que les mutations identifiées affectent soit la structure soit le site fonctionnel de ThyA. L’étude des profils de croissance des organismes résistants au PAS nous permit de constater que les organismes porteurs d’une mutation de la protéine ThyA présentent un profil de croissance constant en présence de concentrations croissantes de PAS. Les organismes résistants au PAS possédant une protéine ThyA sauvage répondent, quant à eux, aux concentrations croissantes de PAS de façon dose-dépendante, indiquant que le(s) mécanisme(s) alternatif(s) de résistance au PAS est (sont) dose-dépendant(s).<p><p>La thymidylate synthase est également une des cibles du 5-fluorouracil (5-FU), l’agent chimiothérapeutique le plus largement utilisé pour le traitement du cancer colorectal avancé. Etant donné l’augmentation du nombre de souches résistantes de M. tuberculosis, de nouveaux composés anti-tuberculeux sont nécessaires de façon urgente. Ici, nous avons évalué l’efficacité in vitro et in vivo du 5-FU sur M. tuberculosis. La concentration minimale inhibitrice du 5-FU fut déterminée sur une collection de souches cliniques sensibles et multi-résistantes ainsi que sur des mutants spontanés résistants au PAS. Tous les isolats montrèrent une sensibilité au 5-FU à des concentrations allant de 0.4 à 1.8 µg/ml, et ce indépendamment de leur profil de sensibilité/résistance aux agents anti-tuberculeux actuels. Les études in vivo du 5-FU (sur un modèle murin de tuberculose active) montrèrent une efficacité de celui-ci durant les deux premières semaines de traitement puis une perte d’activité à la troisième semaine, vraisemblablement engendrée par les effets secondaires du 5-FU.<p><p>L’éthionamide (ETH) est un autre antibiotique de deuxième ligne dont l’utilisation est limitée aux tuberculoses multi-résistantes étant donné les effets secondaires qu’il engendre. Ces dernières années, les études ont montré que l’ETH est un pro-médicament, transformé en forme active par l’enzyme monooxygénase EthA dont l’expression est contrôlée par le répresseur transcriptionnel EthR. Notre étude décrit l’élaboration d’inhibiteur d’EthR capable d’augmenter la sensibilité de M. tuberculosis à l’ETH suite à l’amélioration de son activation. Les composés synthétisés et sélectionnés pour leur capacité à inhiber l’interaction EthR-ADN furent co-cristallisés avec EthR. Les structures tridimensionnelles des complexes furent utilisées pour la synthèse d’analogues capables d’améliorer la puissance de l’ETH en culture. Les molécules les plus prometteuses furent testées sur un modèle murin de tuberculose. Pour un des inhibiteurs d’EthR testés, nous avons montré que sa co-administration avec l’ETH permet une réduction de la dose d’ETH utilisée de 3 fois, pour l’obtention d’une même réduction de charge mycobactérienne pulmonaire. Ce travail démontre la possibilité d’augmenter l’index thérapeutique de l’éthionamide en agissant pharmacologiquement sur le mécanisme régulateur de son activation.<p><p>Dans certaines régions du monde, le problème de la multi-résistance devient très présent. Nous avons étudié l’état de la situation à Mourmansk (Fédération russe), une région à haute incidence de tuberculose. La résistance aux antibiotiques et l’épidémiologie moléculaire de la tuberculose furent étudiées sur des isolats collectés en 2003 et 2004 dans cette région. Une extrêmement haute prévalence de tuberculose multi-résistante (MDR-TB) fut constatée à la fois pour les nouveaux cas (primaires) (26%) et les cas précédemment traités (72.9%). Le typage des souches MDR primaires révèle une appartenance au génotype Beijing pour la plupart des isolats (79.8%) et l’homogénéité génétique des souches suggère une transmission active au sein de la population. L’analyse moléculaire des gènes impliqués dans la résistance à l’INH et à la RIF montre la présence des mutations katG codon 315 et rpoB codon 531 chez, respectivement, 98,2% et 76,3% des isolats MDR-TB primaires. La haute fréquence de ces mutations « communes » suggère la possible utilisation de tests moléculaires ciblant spécifiquement ces mutations pour détecter rapidement la plupart des cas de MDR-TB.<p><p>Nos travaux illustrent les différentes voies à suivre pour maitriser le problème de la résistance aux antibiotiques :l’élucidation des mécanismes de résistance, le développement de nouveaux médicaments et la détection rapide des cas de résistance.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Background: Different types of cardiomyopathies are associated with variable hypertrophic response. <p>A number of growth factors are thought to play a role in pathologic cardiac remodeling. <p>Aims: We compared the modulation of the TGF-ƒÒ superfamily and IGF-1 signaling pathways and their target genes, the cell cycle regulatory proteins in tachycardia-induced dilated cardiomyopathy, a model with no detectable hypertrophy and in ischemic cardiomyopathy, a model with a marked hypertrophic reaction. <p>Methods: In the first study, endomyocardial biopsies were obtained weekly in 15 dogs, during the development of tachycardiomyopaty. Genes involved in the myostatin-TGF-ƒÒ-Activin-A/Smad signaling pathway, p21 and cyclin D were quantified and correlated to echocardiographic measures of hypertrophy. In the second study, myocardial tissue samples were obtained in 8 dogs with a healed myocardial infarction, in 8 dogs with heart failure induced by overpacing and in 7 healthy dogs. We measured gene expression of IGF-1, its receptor (IGF-1R) and cyclins A, B, D1, D2, D3 and E and correlated them to the level of hypertrophy. <p>Results: Tachycardiomyopathy was characterized by chambers dilation with no identifiable hypertrophy. Ischemic cardiomyopathy was characterized by eccentric hypertrophy. In tachycardiomyopathy, Activin-A mRNA was 4-fold higher than at baseline. Smad7 was overexpressed in severe heart failure; p21, a direct target gene of the Smad pathway was upregulated 8-fold and cyclin D1 was down-regulated. In that model, IGF-1 was overexpressed but neither IGF-1R nor any of the cyclins studied.<p> In ischemic cardiomyopathy, IGF-1, IGF-R, and cyclins B, D1, D3 and E gene expression were upregulated.<p> In tachycardiomyopathy, Activin-A and p21 were inversely correlated to the thickness of the interventricular septum. In normal dogs and in the both models of cardiomyopathy, IGF-1R was correlated to the thickness of the interventricular septum and to cyclins. <p>Conclusions: Taken together, these results agree with the notion that Activin-A, IGF and cyclins are involved in the modulation of hypertrophic response observed in cardiomyopathies. <p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La dimérisation des récepteurs couplés aux protéines G est un nouveau concept apparu dans la littérature au cours des quelques années qui ont précédé le début de notre travail. Bien qu’il soit clairement établi que les récepteurs sont capables de former des homo et des hétérodimères, les conséquences fonctionnelles de telles interactions demeurent souvent peu claires. Dans une étude précédente, le laboratoire d’accueil a montré que les récepteurs aux chimiokines CCR2 et CCR5 forment des homo et des hétérodimères de manière constitutive et identifié une coopérativité négative de liaison de nature allostérique entre les deux sites de liaison de CCR2 et CCR5 dans des cellules co-exprimant les deux récepteurs. Dans ce travail, nous avons étendu cette étude au récepteur CXCR4, structurellement plus éloigné que CCR2 et CCR5 entre eux. Nous montrons par une méthode biophysique se basant sur le transfert d’énergie de bioluminescence (le BRET) que CCR2, CCR5 et CXCR4 forment des homodimères et des hétérodimères de manière constitutive. De plus nous démontrons une coopérativité négative de liaison de nature allostérique des deux sites de liaisons pour les hétérodimères CCR2/CXCR4 et CCR5/CXCR4. lorsque CXCR4 est co-exprimé avec CCR2 ou CCR5, la chimiokine spécifique de CXCR4 (SDF-1α) inhibe la liaison du traceur spécifique de CCR2 (MCP-1) ou du traceur spécifique de CCR5 (MIP-1β), et vice-versa. La nature allostérique de ces interactions est démontrée par des expériences mesurant la dissociation de traceurs en présence ou non de compétiteurs. La coopérativité négative de liaison de nature allostérique des deux sites de liaisons est montrée également dans des cellules primaires, excluant tout effet indésirable dû à la surexpression de récepteurs. Nous montrons également que l’antagoniste spécifique de CXCR4 (AMD3100) inhibe la liaison du traceur spécifique de CCR2 (MCP-1) ou du traceur spécifique de CCR5 (MIP-1β), et vice-versa (TAK-779 vs SDF-1α), uniquement quand CXCR4 est co-exprimé respectivement avec CCR2 ou CCR5. Il s’agit là de la première preuve montrant que les interactions allostériques au sein d’hétérodimères de récepteurs aux chimiokines impliquent aussi des antagonistes, et qu’un antagoniste de récepteur aux chimiokines influence la réponse fonctionnelle d’un autre récepteur aux chimiokines auquel il ne se lie pas. De tels effets fonctionnels ont été montré dans des expériences de mobilisation de Ca++, de chimiotactisme sur lymphoblastes et dans des expériences d’air pouch in vivo. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatases, SHIP2, has been established as a regulator of the insulin cascade, of cell adhesion and spreading, actin structures, remodelling and cytoskeletal organization. However, the molecular mechanisms underlying these processes still needed additional investigations. Among different regulatory mechanisms, protein-protein interaction play an essential role. To better understand the molecular mechanism of SHIP2 in signalling pathway as well as to reveal novel roles of SHIP2, a two-hybrid was performed to search for SHIP2 protein interactors. JNK-interacting protein 1 (JIP1) and intersectin 1 (ITSN1) were two of the newly identified protein partners of SHIP2. In this thesis, we characterized the associations of SHIP2 with JIP1 and ITSN1 in different aspects as identifying the interacting domain involved, biochemical function regulations and cellular biological roles.<p><p>The JIP scaffold family of proteins associate with MAPK, MAPKK and MAPKKK creating functional signaling modules to control the specificity of signal transduction. JIP1 is characterized as a scaffold protein assembling JNK, MAPK kinase 7 (MKK7), mixed lineage kinase (MLK), dual leucine zipper-bearing kinase (DLK). It thus enhances the selectivity and effectiveness of kinase activation during JNK signaling. In this thesis, the SHIP2-JIP1 interaction has been confirmed both in overexpression system in COS-7 and CHO-IR cells, and in native cells of COS-7. Both the proline-rich (PR) domain (residues 359-487) and PTB domain of JIP1 participated in this interaction. Overexpression of SHIP2 in COS-7 cells up-regulated JIP1-mediated JNK activation and the tyrosine phosphorylations of both JIP1 and MLK3. These effects were independent of SHIP2 catalytic activity. By the use of kinase inhibitors, we showed that Abl and Src family tyrosine kinases might be implicated in the regulation of JIP1 tyrosine phosphorylation. The residue Y270 of JIP1, a potential target of Abl tyrosine kinase, was shown to be involved in SHIP2-increased JIP1 tyrosine phosphorylation. In an in vitro assay, JIP1 negatively regulated the catalytic activity of SHIP2. In addition, upon the stimulation of okadaic acid, the overexpression of SHIP2 caused less viability of COS-7 cells. These data provide a new molecular link between SHIP2 and JIP1-mediated JNK pathway, and may help explain the biochemical mechanisms of SHIP2 in cellular apoptosis, as well as in insulin pathway.<p> <p>Another protein partner, ITSN1, is a multi-domain protein which plays a role in endocytosis, MAPK signalling and actin cytoskeleton. The interaction between SHIP2 and ITSN1 was confirmed in overexpression systems in COS-7 cells, as well as at the physiological concentration with the endogenously expressed proteins in C2C12 and COS-7 cells. EGF stimulation did not modulate the association of SHIP2 and ITSN1. ITSN1-SH3D, A, C and E domains interacted with the C-terminal part of SHIP2 with the binding affinity as SH3D>SH3A>SH3C>SH3E. Upon the stimulation of EGF, the expression of SHIP2 may recruit ITSN1 short form (ITSN1-S) to cell membrane. The ITSN-mediated ERK1/2 and JNK activations in response to EGF were not modulated when SHIP2 or catalytic mutant of SHIP2 or TSHIP2 was overexpressed. The link between SHIP2 and ITSN may provide one of the molecular mechanisms used by SHIP2 to participate in receptor endocytosis regulation.<p><p>In conclusion, our data of the associations of SHIP2 with JIP1 and ITSN1 provide evidence for potential novel biochemical mechanisms of SHIP2 to be implicated in JNK pathway as well as EGF receptor endocytosis. JIP1 and ITSN1, which are both implicated in the JNK pathway, may also have a link through the common protein partner SHIP2, giving rise to potential interesting study goal. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Globalement, un tiers de la population mondiale est infectée par Mycobacterium tuberculosis, l'agent infectieux de la tuberculose (TB). Fort heureusement, seuls 5 à 10 % des individus infectés développent un jour une TB active. Les individus non malades restent cependant infectés à vie, on parle d'infection latente. Chaque année, 8-10 millions nouveaux cas de tuberculose active sont recensés et M. tuberculosis est responsable de 1,5 à 2 millions de décès. Depuis plus d'une décennie, M. tuberculosis s'est étroitement associé à l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine. Cette alliance néfaste représente une importante menace pour les pays en voie de développement, car ces 2 pathogènes déciment les forces vives de ces populations. Il faut malheureusement rajouter à ce triste tableau une fréquence grandissante de souches multi-résistantes, voire extensivement multi-résistantes. Face à ces souches, les avancées thérapeutiques du siècle dernier sont pratiquement réduites à néant. <p>Considérant ces données, il est désormais crucial d'améliorer nos outils de dépistage de l'infection latente, de diagnostic de la maladie active, de prévention (vaccins) et de traitement. Pour atteindre ces objectifs, une des pistes est la caractérisation détaillée des réponses immunitaires. En comparant les réponses immunitaires des sujets infectés de manière latente à celles liées à la maladie active, nous pourrons peut-être comprendre certains mécanismes de protection. L'étude des réponses immunitaires induites par la « Heparin-Binding-Hemagglutinin » (HBHA) s'est faite dans cet objectif. La HBHA est une adhésine exprimée par le complexe M. tuberculosis. Elle est impliquée dans la dissémination extrapulmonaire du bacille et constitue donc un facteur de virulence. Par ailleurs, une vaccination de souris par seulement 3 doses de 5 µg de HBHA suffit à protéger de l'infection avec une efficacité comparable à celle du vaccin BCG. Chez l'homme, les sujets sains mais infectés développent d'importantes sécrétions d'interféron-gamma (IFN-γ) en réponse à cet antigène, alors que la majorité des patients tuberculeux ne le font pas. Cette différence est importante pour comprendre une des raisons d'échappement de M. tuberculosis au contrôle immunitaire. La HBHA est une protéine méthylée et la méthylation s’avère essentielle pour ses propriétés immunoprotectrices. <p>Nos travaux présentés ici se sont axés sur deux éléments de la réponse immunitaire à la HBHA chez l'homme :d'une part, l'exploitation de la réponse périphérique d'IFN-γ à la HBHA comme outil de dépistage de l'infection latente et, d'autre part, l'étude des raisons de la faible sécrétion d'IFN-γ spécifique de la HBHA lors de la maladie active.<p> <p>L'évaluation de la sécrétion périphérique d'IFN-γ en réponse à la HBHA a permis de démontrer rétrospectivement que celle-ci permet de détecter plus de 90 % des sujets réagissant positivement à l'injection intradermique de tuberculine. De manière intéressante, l'utilisation d'un test commercial, le QuantiFERON TB Gold IT (QFT-IT) n'a permis de détecter que la moitié des sujets infectés sains. De notre point de vue, le QFT-IT ne peut être recommandé seul pour le dépistage systématique de l'infection latente par M. tuberculosis. De manière parallèle, un test de stimulation basé uniquement sur la sécrétion d’IFN-γ suite à une stimulation à l'ESAT-6, composant du QFT-IT, n'a pas permis d'augmenter la sensibilité, ni d'ajouter une plus-value au test basé sur la HBHA. A l'instar de l'intradermoréaction à la tuberculine, le dépistage de la maladie active reste décevant que ce soit par l'utilisation de la HBHA ou de l'ESAT-6.<p>La TB active est caractérisée par une basse sécrétion périphérique d'IFN-γ en réponse à la stimulation par la HBHA. Cette faible sécrétion est cependant réversible, puisque un traitement efficace permet d'atteindre des taux d'IFN-γ significativement plus élevés. Ceci nous démontre qu'il s'agit d'une suppression associée à la phase active de l'infection. Nous avons d'abord évalué l'importance de la modulation de la sécrétion d'IFN-γ en réponse à la HBHA par 2 cytokines immunomodulatrices, l'interleukine-10 (IL-10) et le Transforming-Growth-Factor-Beta (TGF-ß). De manière intéressante, alors que ces 2 cytokines sont associées à l'infection par M. tuberculosis, la HBHA n'est inductrice ni d'IL-10, ni de TGF-ß. Les lymphocytes T régulateurs (Treg) expriment 2 marqueurs d'intérêt :le CD25, composant du récepteur à l'IL-2, et Foxp3, un gène régulateur majeur des cellules Treg. Ces cellules sont décrites comme suppressives de réponses immunitaires déclenchées par des antigènes du Soi et du non-Soi. Nous avons montré que la proportion de lymphocytes Treg périphériques est augmentée en cas de TB active. Par ailleurs, nous avons également démontré que ces cellules suppriment la sécrétion d'IFN-γ et la prolifération induite par la HBHA après stimulation des cellules mononucléées sanguines périphériques de patients tuberculeux in vitro. Cependant, la réponse anti-HBHA des patients tuberculeux, qui est démasquée par la déplétion des lymphocytes Treg, n'est pas dirigée contre des épitopes protecteurs. En effet, la méthylation n'influence pas leur sécrétion d'IFN-γ. De ce point de vue, les lymphocytes Treg sont impliqués dans la maladie tuberculeuse et influencent négativement les réponses dirigées contre un antigène protecteur. Cependant, il semble que la TB active soit également associée à une ignorance d'épitopes protecteurs.<p>Enfin, nous avons également démontré qu'il était possible d'induire des lymphocytes Treg au départ de cellules sanguines périphériques de sujets infectés sains. En effet, la stimulation in vitro des cellules sanguines périphériques en présence de BCG et de TGF-ß est un moyen rapide pour induire l'apparition de lymphocytes Treg fonctionnels in vitro. Ceci nous interroge quant aux rôles des lymphocytes Treg dans la pathogenèse de la maladie. En effet, un excès de TGF-ß circulant est observé dans certaines conditions cliniques à haut-risque de TB post-primaire. De ce point de vue, les lymphocytes Treg pourraient être des acteurs déterminant dans la perte du contrôle à long terme de l'infection et, par là, pourraient être des cibles thérapeutiques d'intérêts lors de l'infection par M. tuberculosis. /Mycobacterium tuberculosis is the causative agent of tuberculosis (TB). It is estimated approximately one third of the World’s population is infected with M. tuberculosis. Fortunately, only 5 to 10 % of the infected individuals will develop the disease throughout their life. However, the other healthy infected individuals remain infected for life: this is the latent TB infection (LTBI). Every year, 8 to 10 million new cases of TB are recorded globally, and about 2 to 3 million of people die from the disease. During the last several decades the co-infection of M. tuberculosis and the human immunodeficiency virus have worsened the picture. This dreadful association currently affects mostly the poorest people of the World. Unfortunately, bad news never stands alone. We now witness increasing emergence of multi-drug-resistant and even of extensively-multi-drug-resistant M. tuberculosis strains. Against these strains current therapeutics are virtually useless. <p>The development of new tools for prevention (vaccines), diagnostics and treatment is crucial. In order to fulfill these objectives, detailed studies on the immune responses is one of the main tracks to explore. Indeed, the comparison of immune responses in LTBI subjects with those in TB patients may provide some clues to understand immune mechanisms of protection. Studies of the immune responses that are specific to Heparin-Binding-Hemagglutinin (HBHA) may be one of these clues. HBHA is an adhesin, which is expressed by the micro-organisms of the M. tuberculosis complex. It largely contributes to the extrapulmonary dissemination of the tubercle bacilli. Hence, HBHA may be qualified as an important virulence factor. Furthermore, vaccination of mice with three doses of only 5 µg HBHA each affords the same level of protection as vaccination with BCG. In humans, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from LTBI subjects secrete significant levels of IFN-γ in response to HBHA, whereas PBMC from TB patients do not. This discrepancy may be a cornerstone in the understanding of some of the mechanisms underlying the immune escape mediated by M. tuberculosis. HBHA is a methylated protein, and the methylation is crucial for its immuno-protective properties. <p>This work focused on 2 major issues of the HBHA-specific immune response in humans: the use of the peripheral IFN-γ secretion in response to HBHA as a diagnostic tool for LTBI and the analysis of the underlying mechanisms to the low IFN-γ secretion during active TB.<p> <p>In our study, the measurement of HBHA-specific IFN-γ secretion resulted in the detection of more than 90 % of the tuberculin-skin-test (TST) positive LTBI. Strikingly, the QuantiFERON TB Gold IT (QFT-IT), a commercial test, failed to identify those LTBI subjects in more than 50 % of the cases. Therefore, we cannot recommend the use of QFT-IT alone instead of the TST for the detection of LTBI. Similarly, a test relying on the detection of IFN-γ secretion upon ESAT-6 stimulation, one of the antigens used in the QFT-IT, was not sufficiently sensitive for the LTBI detection, nor did it improve the sensitivity or the specificity of the HBHA-based test. In contrast to the diagnosis of LTBI, the tests based on HBHA- or ESAT-6-induced IFN-γ secretions displayed poor sensitivity for the diagnosis of active TB.<p>During active TB, the HBHA-specific IFN-γ secretion in the periphery is low. However, this weak secretion is reversible upon effective treatment, as the IFN-γ response to HBHA is increased after completion of chemotherapy. This is strongly suggestive of an immune suppression during active disease. Therefore, we have first evaluated the role of two immunomodulatory cytokines, interleukin-10 (IL-10) and Transforming-Growth-Factor-Beta (TGF-ß), in the suppression of the HBHA-specific IFN-γ secretion. We found that neutralization of neither IL-10 nor TGF-ß with specific antibodies induced HBHA-specific IFN-γ secretion by PBMC of TB patients in vitro. In contrast, depletion of regulatory T cells (Treg) that express 2 major markers, CD25, a constituent of the IL-2 receptor, and Foxp3, a master regulatory gene, resulted in increased HBHA-specific IFN-γ secretion by the PBMC of TB patients. These cells are known to be involved in the suppression of immune responses to both Self and non-Self antigens. We further show that the size of the peripheral Treg cell population increases during active disease. In addition to suppressing the HBHA-specific IFN-γ secretion these cells suppress T cell proliferation in response to HBHA in vitro. However, even after depletion of the Treg cells, the uncovered HBHA-specific immune responses are not directed to the methylated epitopes during TB disease. <p>Finally, we show that Treg cells can be induced (or expanded) from the PBMC of LTBI subjects. Stimulation of those PBMC with BCG in the presence of TGF-ß resulted in a quick appearance of functional Treg cells in vitro. This observation strongly suggests a role of Treg cells in the pathogenesis of TB, in particular in the progression of latency to reactivation. Interestingly, excessive concentration of TGF-ß, associated with various clinical conditions, is high risk factor for post-primary TB. Thus, Treg cells may result in the loss of immune control against latent M. tuberculosis infection. Therefore, Treg cells may represent potential therapeutic targets during M. tuberculosis infection. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Shigella provoque la dysenterie bacillaire en envahissant les muqueuses du colon. Cette maladie diarrhéique est responsable d’un million de décès par an essentiellement dans les pays en voie développement. Les gènes nécessaires àl’entrée dans les cellules hôtes sont regroupés sur un fragment d’ADN plasmidique de 30-kb. Celui-ci contient deux types de gènes, les gènes ipa(B, C et D) et ipgcodant pour des protéines responsables de l’entrée de la bactérie dans les cellules, et les gènes mxi/spacodant pour un système de sécrétion appelétype III (SST3) nécessaire àla sécrétion des facteurs de virulence. Les gènes mxi/spaetipa/ipgsont exprimés à37°C et les protéines Ipa/Ipgrestent dans le cytoplasme jusqu’àce que le SST3 soit activéau contact de la cellule hôte. Ce contact induit l’internalisation de la bactérie par macropinocytose, suivie de sa dissémination intra-et intercellulaire. Des observations en microscopie électronique (ME) montrent que le SST3 est composéde trois parties: i) une aiguille dont la longueur est régulée à50 nm par la protéine Spa32, ii) un corps basal qui traverse les membranes interneet externe ainsi que le peptidoglycane, et iii) un bulbe cytoplasmique. Le SST3 est le dispositif principal de virulence et permet l’injection de facteurs de virulences du cytoplasme bactérien vers celui de la cellule cible. Shigelladoit sécréter ces protéines de manière ordonnée. Très peu de travaux ont abordécette question. L’objectif principal de ce travail de thèse a étéd’étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la hiérarchie de sécrétion.Nous avons principalement investiguéle rôle de 3 protéines: Spa32, Spa40 et MxiC dans la sécrétion. Nous avons montré, par des études génétiques, que contrairement aux études publiées sur les protéines homologues, Spa32 n’agit pas comme un «molecularruler»pour réguler la taille de l’aiguille. Nous avons montréque cette régulation nécessite l’interaction de Spa32 via ses résidus 206-246 au domaine C-terminal de Spa40 (Spa40C) (Botteaux et al. 2008a). Ayant identifiécette interaction avec Spa40, l’étape suivante de notre travail a portésur la caractérisation de la fonction du gène spa40par des méthodes génétique, biochimique et structurale (ME). Nos résultats montrent que Spa40 joue un rôle important dans l’assemblage du SST3. Des plus, nous avons mis en évidence de nouvelles interactions impliquant Spa40C et des composants du SST3 (Botteaux et al. in preparation).Parallèlement àces travaux, nous avons montréque l’inactivation du gène mxiCaboutit àune dérégulation spécifique de la sécrétion des effecteurs sans altérer celle des translocateurs IpaB et IpaC. Cette augmentation de sécrétion est due àune augmentation de transcription des gènes tardifs, conséquence de la sécrétion précoce de l’anti-activateur transcriptionnel, OspD1 (Botteaux et al. 2008b). De plus, nous avons montréque MxiC est un substrat de l’appareil de sécrétion et que cette sécrétion est associée àsa fonction. Finalement, la mise en évidence d’une interaction entre MxiC et Spa47, l’ATPase du SST3 nous permet de proposer un modèle régulant la hiérarchie de sécrétion des effecteurs.Dans une autre partie de notre travail, nous avons identifié, par des expériences de ME et d’immunomarquage, que l’invasineIpaD est localisée au sommet de l’aiguille du SST3 oùelle lui sert de bouchon. Enfin, de manière très intéressante, nous avons montréque des anticorps anti-IpaD neutralisent l’entrée de Shigelladans les cellules (Sani, Botteaux et al. 2007, dépôt de brevet). IpaD, étant conservée dans les isolats invasifs de Shigella, représente donc un réel candidat vaccinal pouvant pallier la diversitédes sérotypesbactériens.En conclusion, nos travaux représentent une contribution importante àla compréhension des mécanismes de virulence bactériens et dépassent le cadre de Shigellapuisque les systèmes de sécrétion sont hautement conservés parmi plusieurs pathogènes. L’identification de drogues pouvant interférer avec ces systèmes de sécrétion représente une voie d’avenir pour le développement de nouveaux agents anti-infectieux. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished