Apesar de vários avanços no combate ao câncer, a incidência do câncer de pele tipo melanoma e a mortalidade relacionada a essa doença tem aumentado. Considerando-se que a radiação ultravioleta (UV) é o principal agente causador de diversos danos à pele, inclusive o câncer de pele, é de grande importância medir de forma adequada as propriedades fotoprotetoras dos filtros solares. Diante dos problemas provocados pelo uso de filtros solares, as pesquisas têm se voltado no sentido de encontrar produtos naturais com propriedades antioxidantes visto que já foi demonstrado que muitos desses agentes naturais possuem efeitos anticarcinogênico, e antimutagênico. Assim, um dos objetivos desse trabalho foi a avaliação de três formulações fotoprotetoras comerciais por meio de parâmetros bioquímicos não comumente utilizados, mas que refletem o efeito dessas formulações no sistema antioxidante natural da pele e também no processo inflamatório induzido pela radiação UV. Esses efeitos foram mensurados in vivo em camundongos sem pelos, utilizando-se como marcadores o antioxidante não enzimático glutationa reduzida (GSH), enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD), a enzima mieloperoxidase (MPO) e as citocinas IL-1? e TNF-?. Outro importante objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de um extrato de soja biotransformado (ESB) pelo fungo A. awamori em células de melanoma humano das linhagens 451LU e A375, altamente metastáticas, e estudar os mecanismos de ação pelos quais o extrato induz a morte celular por apoptose nestas células e também avaliar o potencial desse extrato para a prevenção e tratamento do câncer de pele. Os resultados mostraram que com relação ao processo inflamatório induzido pela radiação UVB, verificou-se que o FPS, apesar de avaliar somente o eritema, é um bom indicador do nível de proteção da pele, uma vez que todas as formulações apresentaram um potencial protetor contra o aumento da atividade da MPO e liberação das citocinas pró-inflamatórias IL-1? e TNF-?. No entanto, as formulações não forneceram proteção contra a depleção do antioxidante endógeno GSH e, apesar de possuírem mesmo FPS 15 essas formulações apresentaram diferentes níveis de proteção com relação à redução da atividade da enzima SOD induzida pela radiação UV. Os resultados referentes ao estudo do ESB mostraram que o tratamento das células de melanoma altamente invasivas com o extrato resultou em inibição do crescimento/viabiliade das células associado com a indução de apoptose. As análises revelaram que o ESB resultou em indução da clivagem de PARP e ativação das caspases-3, -7 e -8; aumento da expressão de TNF-R2 e da expressão de TRAIL e do receptor DR4. Além disso, o tratamento das células de melanoma com o extrato ESB aumentou a fosforilação e ativação de IKK, degradação de I?B? e translocação de p65/NF?B para o núcleo. Apesar de ser geralmente aceito que a ativação do NF-?B seja responsável pela resistência à apoptose, neste estudo foi demonstrado que a estimulação da via do NF-?B é necessária pela indução da apoptose mediada pelo extrato ESB. Finalmente, conclui-se que as formulações fotoprotetoras devem ser avaliadas de forma mais profunda, empregando-se diferentes métodos a fim de se garantir formulações mais eficazes tanto contra os danos induzidos tanto pela radiação UVB quanto pela radiação UVA. Além disso, esses estudos identificaram uma atividade anticâncer do extrato ESB que é altamente relevante para a quimioprevenção/quimioterapia contra o câncer de pele tipo melanoma. / Despite several advances in fighting cancer, the incidence of melanoma type skin cancer and the mortality related to this disease have increased. Considering that ultraviolet radiation (UV) is the main causative agent of various skin damages, including skin cancer, it is of great importance to adequately measure the photoprotective properties of sunscreens. Considering the problems caused by the use of sunscreens, researches have been focused towards finding natural products with antioxidant properties as it has been shown that many of these natural agents possess anticarcinogenic and antimutagenic effects. Thus, an objective of this study was to evaluate three marketed photoprotective formulations through biochemical parameters not commonly used, but which reflect the effect of these formulations on the skin\'s natural antioxidant system and also in the inflammatory process induced by UV radiation. These effects were measured in vivo in hairless mice, employing as markers reduced glutathione (GSH), a non-enzymatic antioxidant; superoxide dismutase (SOD), an antioxidant enzyme; myeloperoxidase (MPO) enzyme and IL-1? and TNF-? cytokines. Another important objective of this study was to evaluate the effect of a biotransformed soy extract (BSE) by the A. awamori fungus against 451LU and A375 human melanoma cell strains, highly metastatic, and to study the action mechanisms by which the extract induces cell death by apoptosis in these cells; in addition it was intended to evaluate the potential of this extract for the prevention and treatment of skin cancer. The results demonstrated that regarding the inflammatory process induced by UVB irradiation, it was found that the FPS, although only assessing the erythema, is a good indicator of the level of skin protection, since all formulations showed a protector potential against the increased MPO activity and the release of IL-1? and TNF-? pro-inflammatory cytokines. Nevertheless, the formulations did not provide protection against the depletion of the GSH endogenous antioxidant and, despite having the same nominal SPF (SPF=15), these formulations showed different levels of protection with respect to the reduction of SOD activity induced by UV radiation. The results of the BSE study demonstrated that the treatment of highly invasive melanoma cells with the extract resulted in the cell growth/viability inhibition associated with the induction of apoptosis. The analysis revealed that BSE resulted in induction of PARP cleavage and activation of caspase-3, -7 and -8, increased expression of TNF-R2 and expression of TRAIL and DR4 receptor. Furthermore, the treatment of melanoma cells with BSE extract increased phosphorylation and activation of IKK, degradation of I?B? and translocation of p65/NF?B to the nucleus. Although it is generally accepted that the activation of NF-kB is responsible for resistance to apoptosis, this study demonstrated that the stimulation of NF-?B is required for the induction of apoptosis mediated by BSE extract. Finally, it is concluded that the photoprotective formulations should be more deeply evaluated, using different methods in order to ensure more effective formulations against damages induced both by UVB radiation and UVA radiation. In addition, these studies identified an anticancer activity of the BSE extract that is highly relevant to chemoprevention/chemotherapy against melanoma type skin cancer.

Em decorrência da destruição da camada de ozônio pela poluição, a incidência da radiação ultravioleta sobre a Terra tem aumentado, e consequentemente, o número de casos de câncer de pele tem elevado cada vez mais. Diversos estudos têm demonstrado que os danos causados pela radiação solar à pele são causados frequentemente pela geração de radicais livres e ativação de mediadores do processo inflamatório. Estudos têm concluído que os filtros solares são capazes de penetrarem na pele e agirem como fontes de formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) quando submetidos à radiação ultravioleta, o que leva a uma preocupação de que as moléculas fotoprotetoras podem ser geradoras de EROs ao invés de prevenir a formação dessas espécies pelo bloqueio da radiação solar. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos dos filtros solares 3- benzofenona (3-BZ), octilmetoxicinamato (OMC) e salicilato de octila (OS) na pele de camundongos sem pêlos submetida ou não à radiação UVB. Além disso, a retenção cutânea dos filtros solares foi avaliada in vitro utilizando pele de orelha de porco em células de difusão e in vivo em pele de camundongos sem pêlos. Os resultados de retenção cutânea in vitro demonstraram que a formulação gel creme promoveu maior retenção dos filtros solares na pele em comparação às formulações loção e creme. Além disso, a 3-BZ apresentou a maior retenção na pele quando comparadas as retenções dos filtros solares veiculados na mesma formulação. Todos os filtros solares penetraram na pele de camundongos sem pêlos após 1 hora da aplicação da formulação gel creme, o que garantiu a presença dos filtros solares na derme e epiderme no momento da exposição à radiação UVB. A formulação adicionada dos filtros solares preveniu em 76% a depleção de GSH induzida pela radiação UVB. Entretanto, o tratamento dos animais com a formulação contendo os filtros solares não foi capaz de impedir o aumento das atividades da metaloproteinase-9 e mieloperoxidases induzido pela radiação. Além disso, a utilização da formulação adicionada dos filtros solares em associação à exposição à radiação UVB provocou uma diminuição da atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase presente na pele. Desta forma, considerando os parâmetros avaliados neste estudo, a formulação fotoprotetora parece não proteger a pele contra os danos causados pela radiação UVB quanto deveria. Além disso, estes filtros parecem ser instáveis frente à radiação o que comprometendo assim a eficácia e segurança dos mesmos. / Due to the destruction of the ozone layer by pollution, the incidence of ultraviolet radiation on Earth has enlarged and, consequently, the number of cases of skin cancer has increased even more. Several studies have shown that the damages caused by solar radiation to the skin are usually caused by free radical generation and activation of inflammatory mediators. Several studies have concluded that sunscreens are able to penetrate the skin and act as sources of formation of reactive oxygen species (ROS) under ultraviolet radiation exposition, leading, therefore, to the concern regarding the possibility of sunscreen molecules generate ROS instead of preventing the formation of these species by blocking sunlight. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of benzophenone-3 (3-BZ), octylmethoxycinnamate (OMC) and octyl salicylate (OS) sunscreens in the skin of hairless mice exposed or not to UVB radiation. Furthermore, the sunscreen skin retention was in vitro assessed using pig ear skin in diffusion cells and in vivo assessed using hairless mice. The results demonstrated that the cream gel rendered higher epidermal concentrations of the evaluated filters compared to the lotion and cream formulations. Comparing the skin retention amounts of each filter in the same formulation, 3-BZ showed higher skin retention ability than OMC and OS. In addition, all sunscreens penetrated the skin of hairless mice after 1 hour of the applied gel cream formulation, which guaranteed the presence of sunscreen in the dermis plus epidermis at the time of UVB exposure. The formulation of sunscreens prevented by 76% the GSH depletion induced by UVB radiation. However, the treatment of the animals with the sunscreens loaded-formulation was not able to inhibit the increase of metalloproteinase-9 and myeloperoxidase activities induced by radiation. Furthermore, the use of sunscreens loaded-formulation in combination with UVB radiation exposition caused the decrease in the amounts of the superoxide dismutase antioxidant enzyme present in skin. Thus, considering the parameters evaluated in this study, the sunscreens loaded-formulation does not seem to effectively protect skin against damages caused by UVB radiation as it was supposed to. Moreover, these filters seem to be unstable against the radiation and thus compromising their efficacy and safety.

Peroxinitrito (ONOO- + ONOOR), o produto da reação controlada por difusão do óxido nítrico com o ânion radical superóxido, tem recebido muita atenção como possível mediador dos efeitos deletérios associados a uma superprodução de óxido nítrico. O peroxinitrito é um potente oxidante que é capaz de oxidar e nitrar várias biomoléculas cujos mecanismos contribuímos para esclarecer. Particularmente relevante foi demonstrar inequívocamente, por EPR de fluxo, que a rápida reação entre peroxinitrito e o biologicamente abundante dióxido de carbono, produz dióxido de nitrogênio e ânion radical carbonato em rendimentos de aproximadamente 35%. Sugerimos então, que o peroxinitrito deveria atuar na maioria dos ambientes biológicos através de seus radicais derivados que produziriam radicais de biomoléculas. Consubstanciamos essa sugestão pelo estudo da oxidação dos biotióis cisteína, glutationa e BSA-cys34 por peroxinitrito e peroxinitrito/dióxido de carbono. Também, demonstramos que a reação entre o nitróxido tempol e os radicais derivados do peroxinitrito é uma etapa relevante para que o tempol redirecione a reatividade do peroxinitrito de nitração para nitrosação de biomoléculas. Finalmente, demonstramos que existem outras potenciais fontes biológicas de dióxido de nitrogênio e anion radical carbonato como a atividade peroxidásica da enzima superóxido dismutase e a enzima xantina oxidase. / Peroxynitrite (ONOO- + ONOOR), which is formed by the diffusion-controlled reaction between nitric oxide and superoxide anion, has been receiving increasing attention as a mediator of the deleterious effects associated with an overproduction of nitric oxide. Peroxynitrite is a strong oxidant that is able to oxidize and nitrate a variety of biotargets by mechanisms that this work has contributed to establish. Particularly relevant, was the unequivocal demonstration by rapid flow EPR that the rapid reaction between peroxynitrite and the biologically ubiquitous carbon dioxide produces nitrogen dioxide and carbonate radical anion in yields of around 35%. This led us to suggest that in most biological environments peroxynitrite would act through its derived radicals that would oxidize biomolecules to radicals. This hypothesis was clearly supported by our studies of biothioI (cysteine, glutathioneand BSA-cys34) oxidation by peroxynitrite and peroxynitrite/carbon dioxide. In addition, we demonstrated that the reaction between the nitroxide tempol and peroxynitrite-derived radicals is an important step of the mechanism by which tempol diverts peroxynitrite reactivity from nitration to nitrosation of biomolecules. Finally, we demonstrated that there are other potential sources of nitrogen dioxide and carbonate radical anion such as the peroxidase activity of the enzyme Cu,Zn-superoxide dismutase and the enzyme xanthine oxidase turnover.

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T23:59:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_AliceTavaresReis_M.pdf: 3292132 bytes, checksum: ee5318f5b87992964c9d97bedc343f00 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Em 1998, foi relatada a transferência lateral do gene sodC do gênero Haemophilus para a espécie Neisseria meningitidis. Sabe-se que, nestes dois grupos a dinâmica deste gene é bastante distinta. Este trabalho tem por objetivo estimar árvores filogenéticas que possam apontar qual a espécie do gênero Haemophilus compartilhou o gene sodC com a espécie N. meningitidis. Testes de seleção positiva foram empregados no intuito de avaliar quais forças evolutivas estão subjacentes ao processo de diversificação molecular do gene nestas espécies ao longo do tempo. Além disso, foi realizada uma modelagem protéica computacional por homogia para avaliar quais substituições de aminoácidos tinham impacto no processo adaptativo da enzima nas espécies consideradas. Ao se reconstruir uma filogenia para o gene sodC, foi constatado que a origem deste gene na espécie H. influenzae é distinta. Um grupo de linhagens recebeu o gene, provavelmente por transferência lateral, da espécie H. haemolyticus, enquanto o outro grupo recebeu o gene da espécie H. parainfluenzae. Neste grupo, o gene sofreu pseudogeneização. Foi observado também que as sequências de N. meningitidis agrupam com as sequências que compartilham um ancestral comum com a espécie H. haemolyticus, porém as sequências do meningococo formam um ramo distinto dentro deste clado. Dada à alta clonalidade das sequências de N. meningitidis, foi constatado que o evento de transferência lateral de genes foi muito recente na escala do tempo. O teste de seleção positiva demonstrou que seleção positiva está atuando especificamente no ramo da árvore que compartilha um ancestral comum com a espécie H. haemolyticus, através da modificação de uma alanina por uma serina na posição 72, embora a nota geral da árvore tenha sido menor que 1. Sabe-se que pseudogenes, por não codificarem uma proteína ativa e, portanto, por não estarem sob nenhum tipo de restrição funcional, estão sob uma ação maior da deriva genética. Portanto, diferentes forças evolutivas estão governando a evolução deste gene nas espécies consideradas. A modelagem protéica concluiu que tal modificação contribuiu para o aumento do potencial redox do sítio ativo. Desta forma, a ação da seleção positiva sob um único resíduo de aminoácido foi benéfica para a função da enzima como um todo / Abstract: In 1998, it was reported the lateral transfer of the sodC gene from the genus Haemophilus to Neisseria meningitidis. It is known that this two groups show a quite distinct dynamics of this gene. This study aims to estimate phylogenetic trees that might point to which species of the genus Haemophilus shared the sodC gene with N. meningitidis. In addition, tests of positive selection were employed in order to assess which evolutionary forces are governing the process of molecular diversification of the gene in these species through time. Moreover, we performed a computational protein modeling by homology to asses which amino acids substitutions had an impact on the adaptative process of the enzyme in the species considered. A phylogeny of the sodC gene was reconstructed and it was found that this gene in H. influenzae has two different origins. A group of lineages has received the gene, probably by lateral transfer, from H. haemolyticus, whereas the other group has received the gene from H. parainfluenzae. In the latter, the gene has become a pseudogene. It was also observed that the sequences from N. meningitides group together with those sequences that share a common ancestor with H. haemolyticus, but they form a distinct branch within this clade. Given the high clonality of the sequences from N. meningitidis, it was found that the lateral gene transfer event is very recent in the time scale. A test of positive selection showed that positive selection is acting specifically in the branch that shares a common ancestor with H. haemolyticus through the substitution of an alanine to a serine at position 72, though the overall score of the tree is less than one. It is known that pseudogenes do not encode active proteins and therefore they are not under any kind of functional constraints, so they are under greater influence of genetic drift. Thus, it was concluded that different forces are driving the evolution of this gene in the species considered here. Protein modeling concluded that this modification contributed to the increase in the redox potencial of the active site. Thus the action of positive selection under a single amino acid residue was beneficial to the function of the enzyme as whole / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Diabetes mellitus (DM) refers to a group of common metabolic disorders that share the phenotype of hyperglycemia, is a chronic condition that arises when the pancreas does not produce enough insulin or when the body can not effectively use the insulin produced.The condition of chronic hyperglycemia promotes an imbalance between the production of free radicals and endogenous antioxidant defense, causing oxidative stress and finally lipid peroxidation, structures and cell membranes rich in lipids. Quercetin (QUE) is a flavonoid that has antioxidant and anti-inflammatory properties and is therefore investigated as a possible adjuvant in the treatment of diabetes. In this study we analyzed the actions of excess free radicals, promoted by type 1 diabetes mellitus (DM T1) at both systemic and mainly in the cholinergic system. Moreover, the possible effects of antioxidant protection and anti-inflammatory of QUE were analysed. We used 130 male Wistar rats, weighing 160 to 250 g and divided into 2 groups: non-diabetic and diabetic, which are divided into 5 treatments: 0.9% saline, 25% ethanol and QUE (5, 25 and 50 mg/kg).The induction of DM T1 occurred with a single intraperitoneal injection of 70 mg/kg streptozotocin (STZ). Fifteen days later, the treatment with QUE for 40 days started. At the end of the experiment behavioral tests and collection of biological material (blood and tissues) were performed. The untreated diabetic group compared to non-diabetic control showed: reduction of the islets and beta-cell population, weight loss, chronic hyperglycemia, leukopenia associated with neutropenia, decreased insulin and albumin, increase in fructosamine, triglycerides, urea, alkaline phosphatase (ALP), alanine aminotransferase (ALT), in addition to protein fractions of beta and gamma globulin.The increase of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) levels was accompanied by a reduction in the concentration of hepatic superoxide dismutase. Failed aversive memory formation and anxious behavior were observed in these animals, as well as increase in the activity of acetylcholinesterase (AChE) in brain structures and sites (cortex, hippocampus, striatum and synaptosomes) and TBARS (cortex, hippocampus and striatum). Diabetic rats treated with QUE in relation to diabetic control had increased albumin (50 mg/kg), reduction in betaglobulins (25 and 50 mg/kg) and gamma globulins (50 mg/kg), decreased triglycerides (5, 25 and 50 mg/kg). Quercetin reverted the aversive memory failure and showed anxiolytic properties. AChE activity were decreased in the cortex (50 mg/kg), hippocampus (5 and 50 mg/kg) and synaptosomes (50 mg/kg). Levels of TBARS were reduced in the cortex, hippocampus and striatum (5, 25 and 50 mg/kg). Quercetin increased the concentration of insulin in non-diabetic and diabetic groups (5, 25 and 50 mg/kg). When administered in non-diabetic animals, QUE increased the uneasiness of the animals (50 mg/kg) increased AChE activity in the hippocampus (5, 25 and 50 mg/kg), striatum (5 mg/kg) and synaptosomes (25 mg/kg), lowering in the cortex (5 mg/kg), furthermore, increased the level of TBARS in the cortex (25 mg/kg).From these results we conclude that QUE have antioxidant and anti-inflammatory properties which may be used in conjunction with treatment of diabetes. However, it also had undesirable properties, such as pro-oxidant effect and induces insulin resistance. / Diabetes melito (DM) refere-se a um grupo de distúrbios metabólicos comuns que compartilham o fenótipo da hiperglicemia, sendo uma condição crônica que surge quando o pâncreas não produz insulina em quantidade suficiente ou quando o organismo não consegue utilizar de modo eficaz a insulina produzida. A condição de hiperglicemia crônica favorece o desequilíbrio entre a produção de radicais livres e a defesa antioxidante endógena, gerando o estresse oxidativo e por fim a peroxidação lipídica de estruturas e membranas celulares, ricas em lipídios. A quercetina (QUE) é um flavonoide que apresenta propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, sendo por isso, investigada como possível adjuvante no tratamento do DM. No presente trabalho foram analisadas as ações do excesso de radicais livres, promovido pelo diabetes melito tipo 1 (DM T1) tanto em nível sistêmico como, principalmente, no sistema colinérgico. Além disso, os possíveis efeitos de proteção antioxidante e anti-inflamatória da QUE. Foram utilizados 130 ratos Wistar, machos, pesando entre 160 a 250 g, distribuidos em 2 grupos: não diabéticos e diabéticos, sendo cada um deles divididos em 5 tratamentos: salina 0,9%, etanol 25% e QUE (5, 25 e 50 mg/Kg). A indução do DM T1 se deu com uma única injeção intraperitoneal de 70 mg/Kg de estreptozotocina (STZ). Quinze dias depois, teve início o tratamento com QUE por 40 dias. Ao término do experimento, foram realizados os testes comportamentais e a coleta de material biológico (sangue e tecidos corporais). O grupo diabético sem tratamento em relação ao controle não diabético apresentou: redução das ilhotas de Langerhans e da população de células beta, perda de peso, hiperglicemia crônica, leucopenia associada à neutropenia, redução na insulina e albumina, elevação na frutosamina, triglicerídeos, ureia, fosfatase alcalina (FA), alanina aminotransferase (ALT), além das frações proteicas de beta e gamaglobulinas. Houve aumento das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) sérico e redução na atividade de superóxido dismutase hepática. Falha na formação de memória aversiva e comportamento ansioso foram observados nesses animais, bem como, elevação na atividade da acetilcolinesterase (AChE) nas estruturas e sítios cerebrais (córtex, hipocampo, estriado e sinaptossomas) e TBARS (córtex, hipocampo e estriado). Os ratos diabéticos tratados com QUE em relação ao grupo controle diabético: apresentaram elevação na albumina (50 mg/Kg), redução nas betaglobulinas (25 e 50 mg/Kg) e gamaglobulinas (50 mg/Kg), diminuição dos triglicerídeos (5, 25 e 50 mg/Kg). A quercetina nas concentrações utilizadas reverteu a falha de memória aversiva e apresentou propriedades ansiolíticas. A atividade da AChE foi reduzida: no córtex (50 mg/Kg), no hipocampo (5 e 50 mg/Kg) e sinaptossomas (50 mg/Kg). Houve diminuição nos níveis séricos das TBARS no córtex, hipocampo e estriado (5, 25 e 50 mg/Kg). A quercetina elevou a concentração da insulina, nos grupos não diabéticos e diabéticos (5, 25 e 50 mg/Kg). Quando administrada em animais não diabéticos a QUE aumentou a inquietação dos animais (50 mg/Kg); aumentou a atividade da AChE no hipocampo (5, 25 e 50 mg/Kg), estriado (5 mg/Kg) e sinaptossomas (25 mg/Kg), diminuindo no córtex (5 mg/Kg). Além disso, aumentou o nível de TBARS no córtex (25 mg/Kg). A partir desses resultados conclui-se que a QUE possui propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias que podem ser utilizadas no tratamento auxiliar do DM. Contudo, também apresentou propriedades não desejáveis, como efeito pró-oxidante, o que sugere a resistência à insulina.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Oxidative stress is involved in several neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis. Oxidative stress seems to be involved in the pathology of dementia/amnesia. It has been suggested that oxidative stress impairs the muscarinic cholinergic system triggering Alzheimer's disease. The muscarinic antagonist scopolamine has been used to induce amnesia in animals. This experimental model has been used in screening anti-amnesic drugs that could be useful for the treatment of dementia. The aim of this study was to evaluate the possible in vitro antioxidant effect of a series of pyrazoline derivatives newly synthesized: (1) 5-hydroxy-3-methyl-5-trifluoromethyl-4,5-dihydro-1H-carbaldehyde-pyrazole, (2) 5-hydroxy-3-methyl-5- trifluoromethyl-4,5-dihydro-1H-1-acetyl-pyrazole, (3) 5-hydroxy-3-methyl-5-trifluoromethyl-4,5-dihydro-1H-carboxyamide-pyrazole, (4) 5-hydroxy-3-methyl-5-trifluoromethyl-4,5-dihydro-1H-1-benzoyl-pyrazole, (5) 5-hydroxy-3-methyl-5-trifluoromethyl-4,5-dihydro-1H-1-(2- hydroxybenzoyl)-pyrazole and (6) 5-hydroxy-3-methyl-5-trifluoromethyl-4,5-dihydro-1H-1-(4-methoxybenzoyl)-pyrazole. Besides, considering the possible involvement of oxidative stress in dementia, the compound that was the most effective in vitro was assessed concerning to its ability to prevent the memory deficit and oxidative stress in a scopolamine-induced amnesia model. Compound (5) had the highest antioxidant capacity in vitro, since it reduced lipid peroxidation (TBARS) basal and stimulated by the pro-oxidants iron, hydrogen peroxide and sodium nitroprusside, having significant effects from 15 μM onwards (p<0.05). Compound (5) also protected against hydrogen peroxide-induced glutathione oxidation, with a significant effect at the concentration of 150 μM (p<0.05). This compound also had the highest total antioxidant activity, demonstrated by its ability to remove the radical 1,1-dyphenyl-2-pycrylhydrazyl (DPPH). Compounds (1) and (4) also reduced lipid peroxidation basal and stimulated by iron and sodium nitroprusside, having significant effects from 15 μM onwards (p<0.05). Compound (2) had the highest ability to reduce iron (p<0.05). Scopolamine administration 30 min before training session resulted in shorter latency to step-down during the test session of the inhibitory avoidance task (p<0.05). Pretreatment with pyrazole compound (5) had no effect per se on the step-down latency. However, pretreatment with compound (5) (100 μmol/kg) 30 min before scopolamine did prevent the amnesic effect of scopolamine (p<0.05). No significant effect of scopolamine or pyrazole treatment was observed on any of the oxidative stress markers evaluated (thiobarbituric acid reactive substances, non-protein sulfhydrylic groups content and activity of enzymes superoxide dismutase and catalase) suggesting that the protective effect of compound (5) was not related to a possible antioxidant activity. Results revealed that pyrazole compound (5) has in vitro antioxidant activity as well as neuroprotective activity in a model of amnesia. These findings suggest that compound (5) could be a promising drug for the treatment of Alzheimer´s disease. However, further studies are needed to elucidate the mechanisms involved in the antiamnesic effect of this compound, as well as its effect on other dementia models. / O estresse oxidativo está envolvido em diversas doenças neurodegenerativas importantes, tais como a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e a esclerose lateral amiotrófica. O estresse oxidativo parece estar envolvido na patologia da demência/amnésia, tendo sido sugerido que as alterações cerebrais decorrentes deste causam danos ao sistema colinérgico muscarínico e que desta forma desencadeiam a doença de Alzheimer. A escopolamina, um antagonista muscarínico, tem sido usado para induzir amnésia em animais, em um modelo experimental para a triagem de drogas que poderiam ser úteis no tratamento da demência. O principal objetivo deste estudo foi avaliar o possível efeito antioxidante in vitro de uma série de derivados pirazolínicos recém sintetizados: (1) 5-hidroxi-3-metil-5-trifluorometil-4,5-diidro-1H-carbaldeido-pirazol, (2) 5-hidroxi-3-metil-5- trifluorometil-4,5-diidro-1H-1-acetil-pirazol, (3) 5-hidroxi-3-metil-5-trifluorometil-4,5-diidro-1Hcarboxiamida- pirazol, (4) 5-hidroxi-3-metil-5-trifluorometil-4,5-diidro-1H-1-benzoil-pirazol, (5) 5-hidroxi-3-metil-5-trifluorometil-4,5-diidro-1H-1-(2-hidroxibenzoil)-pirazol e (6) 5-hidroxi-3-metil-5-trifluorometil-4,5-diidro-1H-1-(4-methoxibenzoil)-pirazol. Além disso, considerando o possível envolvimento do estresse oxidativo na demência, foi avaliada a capacidade do composto mais efetivo in vitro, em prevenir o déficit de memória e o estresse oxidativo em um modelo de amnésia induzida por escopolamina. O derivado pirazolínico (5) apresentou maior capacidade antioxidante in vitro, pois foi o mais efetivo para reduzir a lipoperoxidação (TBARS) basal e induzida pelos pró-oxidantes ferro, peróxido de hidrogênio e nitroprussiato de sódio, tendo efeitos significativos a partir de 15 μM (p<0,05). O composto (5) também protegeu a glutationa da oxidação induzida por peróxido de hidrogênio, tendo efeito significativo na concentração de 150 μM (p<0,05). Este composto também foi o que teve maior atividade antioxidante total, demonstrada pela sua capacidade de remover o radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH). Os compostos (1) e (4) também reduziram a lipoperoxidação basal e induzida por ferro e nitroprussiato de sódio, tendo efeitos significativos a partir de 15 μM (p<0,05). O composto (2) apresentou a maior capacidade de redução de ferro (p<0,05). A administração de escopolamina 30 min antes do treino provocou amnésia, medida como a redução na latência para descer da plataforma no teste de esquiva inibitória (p<0.05). O pré-tratamento com o composto (5) 30 min antes da escopolamina não apresentou efeito per se na latência, mas preveniu o efeito amnésico da escopolamina, na dose de 100 μmol/kg (p<0.05). Não foi observado efeito significativo da escopolamina ou do composto (5) em qualquer dos marcadores de estresse oxidativo avaliados (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, grupos tiólicos não protéicos e atividade das enzimas superóxido dismutase e catalase), sugerindo que o efeito protetor do composto (5) não está relacionado à sua atividade antioxidante. Os resultados obtidos demonstram que o composto (5) apresenta atividade antioxidante in vitro e neuroprotetora em um modelo de amnésia, sugerindo que este composto pode ser promissor para o tratamento da doença de Alzheimer. No entanto, outros estudos são necessários para elucidar os mecanismos envolvidos na ação anti-amnésica deste composto, bem como o seu efeito em outros modelos de demência.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Lead is a heavy metal that accumulates primarily in kidney, where exerts its nephrotoxic effects. Several studies suggest that the oxidative stress is an important molecular mechanism for the toxic effects of lead in kidney and in other organs. Cytosolic thioredoxin reductase (TrxR1) is a selenoflavoprotein involved in many processes modulating intracellular reactive oxygen species levels. The aims of this study were to evaluate the effects of acute and chronic exposure to lead acetate on renal TrxR1 activity and on other oxidative stress parameters (d-aminolevulinic acid dehydratase activity, glutathione Stransferase, non-protein thiol groups, lipid peroxidation, and antioxidant enzymes in kidneys), as well as on plasmatic indicators of renal function (creatinine, uric acid and phosphate) in rats. In acute exposure, rats received a single intraperitoneal injection of 25 or 50 mg/kg lead acetate and were killed 6, 24 or 48 h later. In chronic exposure, rats received a daily intraperitoneal injection of lead acetate (5 or 25 mg/kg) during 30 days and were killed at 31st day. In our study, acute exposure to 25 mg/kg lead acetate increased superoxide dismutase (SOD) and TrxR-1 activity (after 6, 24, and 48 h), while exposure to 50 mg/kg lead acetate increased catalase (CAT) activity (after 48h) and inhibited d-aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALA-D) activity (after 6, 24, and 48 hs) in kidneys (P < 0.05). Chronic exposure to 5 mg/kg lead acetate inhibited δ-ALA-D and increased glutathione S-transferase (GST), non protein sulfhydryl groups (NPSH), CAT, TrxR-1, and uric acid plasma levels, while exposure to 25 mg/kg lead acetate reduced body weight and δ -ALA-D, but increased GST, NPSH, and uric acid plasma levels (P < 0.05). No changes were observed in thiobarbituric acid reactive substances, glutathione peroxidase, creatinine or inorganic phosphate levels after either acute or chronic exposure. In conclusion, lead exposure caused a marked increase in the TrxR1 activity in the kidney of rats and this change may be an early indicator of acute exposure to low lead doses. However, further studies are needed to clarify the biological meaning of this induction as well as the mechanism involved in such effect. / O chumbo é um metal pesado que acumula-se preferencialmente nos rins, onde exerce seus efeitos nefrotóxicos. Muitos estudos sugerem que o estresse oxidativo seja um importante mecanismo molecular para os efeitos tóxicos do chumbo no rim e em outros órgãos. A tioredoxina redutase citosólica (TrxR1) é uma selenoflavoproteína envolvida em muitos processos reguladores dos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio. Os objetivos deste estudo foram avaliar os efeitos da exposição aguda e crônica ao acetato de chumbo sobre a atividade da TrxR1 renal e sobre outros parâmetros de estresse oxidativo (atividade da δ-aminolevulinato desidratase, glutationa S-transferase, grupos tiólicos nãoprotéicos, peroxidação lipídica e enzimas antioxidantes nos rins), bem como sobre os indicadores plasmáticos da função renal (creatinina, ácido úrico e fosfato) em ratos. Na exposição aguda, os ratos receberam uma única injeção intraperitoneal de 25 ou 50 mg/kg de acetato de chumbo e foram mortos 6, 24 ou 48 horas mais tarde. Na exposição crônica, os ratos receberam uma injeção intraperitoneal diária de acetato de chumbo (5 ou 25 mg/kg) durante 30 dias e foram mortos no 31° dia. Em nosso estudo, a exposição aguda a 25 mg/kg de acetato de chumbo aumentou a atividade da superóxido dismutase (SOD) e da TrxR1 (após 6, 24 e 48 h), enquanto que a exposição a 50 mg/kg de acetato de chumbo aumentou a atividade da catalase (CAT) (após 48 h) e inibiu a atividade da δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D) (após 6, 24, 48 h) nos rins (p<0,05). A exposição crônica a 5 mg/kg de acetato de chumbo inibiu a δ-ALA-D e aumentou a glutationa S-transferase (GST), níveis de grupos tiólicos não-protéicos (SHNP), CAT, TrxR1 e níveis plasmáticos de ácido úrico (p<0,05), enquanto que a exposição a 25 mg/kg de acetato de chumbo reduziu o peso corporal e a δ-ALA-D, mas aumentou a GST, SHNP e os níveis plasmáticos de ácido de ácido úrico (p<0,05). Não houve alterações nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), na atividade da glutationa peroxidase (GPx) e nos níveis plasmáticos de creatinina e fosfato inorgânico tanto após a exposição aguda como após a exposição crônica. Conclui-se que a exposição ao chumbo causou um aumento significativo na atividade da TrxR1 renal de ratos e esta alteração pode ser um indicador primário da exposição aguda a baixas doses de chumbo. Entretanto, será necessária a realização de mais estudos para elucidar o significado biológico desta indução, bem como o mecanismo envolvido em tal efeito.

The accelerated bone loss that occurs during menopause and becomes more prone in the postmenopausal period is mediated by the ending of estrogen production. This bone loss can be a threat for women in this period of life concerning to the lead toxicity. Around 95% of the lead accumulated in the body is stored in the bones and may be mobilized to the bloodstream during bone demineralization, posing a potential risk. On the other hand, an adequate calcium supplementation seems to reduce gastrointestinal lead absorption. However, studies carried out in the United States revealed relatively high lead levels in calcium supplements. In the present study, we evaluated the content of lead in calcium supplements available in Brazil. We also investigated the effect of calcium supplementation and bone diseases on blood lead levels, δ-aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALAD) activity, δ-ALAD reactivation index and antioxidant enzymes activities in postmenopausal women non-occupationally exposed to lead. Two studies were conducted, one with a cross-sectional design and another with a prospective design. Biochemical parameters were evaluated in both studies. In the prospective study these parameters were evaluated before and after three months of calcium supplementation. A total of 11 calcium-based products were selected and their lead and calcium content were determined by graphite furnace and flame atomic absorption spectrometry, respectively. Blood lead was assessed by inductively coupled plasma mass spectrometry and bone mineral density (BMD) was evaluated at the lumbar spine (BMD L1-L4) and femoral neck (BMD femur) by dual energy X-ray absorptiometry. δ-ALAD activity and antioxidant enzymes activities were determined in whole blood using spectrophotometric methods. δ-ALAD reactivation index was determined by measuring enzyme activity in the presence of 3 mM ZnCl2 and 10 mM DL-dithiothreitol. The lowest lead content per gram of calcium was found in bonemeal (< limit of quantification) and the highest lead content per gram of calcium was found in dolomite (2.3±1.2 μg. g-1 of measured calcium). No differences were observed in δ-ALAD activity or δ-ALAD reactivation index between postmenopausal women with and without bone diseases, both in the cross-sectional and in the prospective study. In the prospective study, three months of calcium supplementation increased blood lead levels in osteopenia (4.6 μg/dL) when compared with control group (3.7 μg/dL) and decreased alkaline phosphatase activity in all groups: control (66.2 vs. 71.9 U/L before the beginning of the treatment) osteopenia (67.1 vs. 71.1 U/L) and osteoporosis (83.9 vs. 86.1 U/L). Catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) activities were not different between postmenopausal women with and without bone diseases, both in the cross-sectional and in the prospective study. However, gluthatione peroxidase (GPx) activity was significantly higher in osteopenia group (23.32 μmol NADPH/g Hb/min) as compared to control group (18.56 μmol NADPH/g Hb/min) in the cross-sectional study. This finding was interpreted as a defense response to counteract the overproduction of reactive oxygen species in women with osteopenia. Results of the cross-sectional study indicated that bone resorption associated to osteopenia/osteoporosis does not pose a risk of lead toxicity in postmenopausal women exposed to background lead levels. However, results of the prospective suggest that three months of calcium supplementation contributed to a small, but significant increase of blood lead levels in postmenopausal women with bone disease. Although lead levels found in calcium supplements were below the limits established in the United States, it is important to regulate the allowed lead levels in calcium supplements in Brazil through of a specific legislation. A monitoring program of lead levels would also be important, because our results revealed that calcium supplements are a small lead source. Despite being a low lead source, it could cause deleterious effects, mainly in women in the postmenopausal. / A acelerada perda óssea que ocorre durante a menopausa e torna-se mais acentuada no período pós-menopáusico, mediada pelo término na produção de estrogênio, pode constituir uma ameaça para mulheres nessa fase da vida, no que diz respeito à toxicidade do chumbo. Aproximadamente 95% do chumbo acumulado no organismo está depositado nos ossos e com a desmineralização óssea o metal passa para a corrente sanguínea, constituindo um risco potencial. Por outro lado, uma adequada suplementação de cálcio parece reduzir a absorção gastrintestinal de chumbo. No entanto, estudos realizados nos Estados Unidos revelaram níveis relativamente elevados de chumbo em suplementos de cálcio. No presente estudo, nós avaliamos o conteúdo de chumbo nos suplementos de cálcio disponíveis no Brasil. Investigamos também os efeitos da suplementação de cálcio e da doença óssea sobre os níveis sanguíneos de chumbo, a atividade da enzima δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALAD), índice de reativação da δ-ALAD e a atividade de enzimas antioxidantes em mulheres pós-menopáusicas não expostas ocupacionalmente ao chumbo. Foi realizado um estudo transversal e outro prospectivo, onde em ambos os estudos foram avaliados os parâmetros bioquímicos; sendo que no estudo prospectivo esses parâmetros foram avaliados antes e após três meses de suplementação de cálcio. Um total de 11 produtos à base de cálcio foram selecionados e o conteúdo de chumbo e cálcio foi determinado por espectrometria de absorção atômica com forno de grafite e de chama, respectivamente. Os níveis de chumbo sanguíneo foram medidos por espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente e a densidade mineral óssea (DMO) foi determinada na lombar (DMO L1-L4) e no colo do fêmur (DMO fêmur) por absorciometria de duplo feixe de raios-X. A atividade da δ-ALAD e das enzimas antioxidantes foram determinados em sangue total usando métodos espectrofotométricos. O índice de reativação da δ-ALAD foi determinado pela medida da atividade da enzima em presença de 3 mM de ZnCl2 e 10 mM de DL-ditiotreitol. A menor quantidade de chumbo por grama de cálcio foi encontrada nos suplementos de cálcio à base de ossos (< que o limite de detecção) e a maior quantidade de chumbo por grama de cálcio foi encontrada na dolomita (2,3±1,2 μg.g-1 de cálcio medido). Nenhuma diferença foi observada na atividade da δ-ALAD ou no índice de reativação da δ-ALAD entre as mulheres pós-menopáusicas com e sem doença óssea, em ambos os estudos, transversal e prospectivo. No estudo prospectivo, três meses de suplementação de cálcio aumentou os níveis de chumbo sanguíneo no grupo com osteopenia (4,6 μg/dL) quando comparado ao grupo controle (3,7 μg/dL) e diminuiu a atividade da fosfatase alcalina em todos os grupos: controle (66,2 vs. 71,9 U/L antes do início do tratamento) osteopenia (67,1 vs. 71,1 U/L) e osteoporose (83,9 vs. 86,1 U/L). A atividade da catalase (CAT) e da superóxido dismutase (SOD) não foram diferentes entre as mulheres pós-menopáusicas com e sem doença óssea, em ambos os estudos, transversal e prospectivo. No entanto, a atividade da glutationa peroxidase (GPx) foi significativamente maior no grupo osteopenia (23,32 μmol NADPH/g Hb/min) quando comparado ao grupo controle (18,56 μmol NADPH/g Hb/min) no estudo transversal. Esse resultado foi interpretado como uma resposta defensiva contra a produção excessiva de espécies reativas de oxigênio nas mulheres com osteopenia. Os resultados do estudo transversal indicaram que a reabsorção óssea associada com osteopenia/osteoporose não representa um risco de toxicidade do chumbo em mulheres na pós-menopausa expostas a baixos níveis de chumbo. No entanto, os resultados do estudo prospectivo sugerem que três meses de suplementação de cálcio contribuíram para um pequeno, mas significativo aumento nos níveis sanguíneos de chumbo em mulheres na pós-menopausa com doença óssea. Embora os níveis de chumbo encontrados nos suplementos de cálcio tenham ficado abaixo dos limites estabelecidos nos Estados Unidos, faz-se necessário a regulamentação, através de uma legislação específica, dos níveis permitidos de chumbo em suplementos de cálcio no Brasil. Também seria importante um programa de monitoramento de tais níveis, pois através dos nossos resultados constatamos que os suplementos de cálcio atuam como uma pequena fonte de chumbo, mas que poderá vir a causar efeitos deletérios, principalmente em mulheres na pós-menopausa.

Catecol e catecolaminas foram ensaiados sobre as atividades NADPH e NADH oxidásica dos microssomos. Quantidades catalíticas de adrenalina aumentam de duas a três vezes a velocidade de oxidação do NADPH, após um pequeno período de indução. O efeito da adrenalina é suprimido pela superóxido dismutase, se a enzima é adicionada antes de iniciada a reação. O efeito catalítico é atribuído a dois produtos de oxidação da adrenalina pelo íon superóxido; à quinona, produto de oxidação de dois elétrons e ao adrenocromo, produto de oxidação de quatro elétrons. Provavelmente, o adrenocromo reoxida a NADPH citocromo c redutase, e a quinona formada reage com oxigênio, regenerando adrenocromo. A adrenalina não mostrou qualquer efeito sobre a atividade NADH oxidásica, nem sobre a atividade NADPH oxidásica, estimulada por menadiona. Provavelmente, durante estes processos, dois elétrons são transferidos simultaneamente ao oxigênio. Catecol e catecolaminas duplicam a velocidade de oxidação do NADH em presença de quantidades catalíticas de NADH-citocromo b5 redutase e citocromo b5. Este resultado sugere a formação do íon superóxido, durante a autoxidação do citocromo b5. Catecol e p-hidroquinona promovem, cataliticamente, a oxidação da oxihemoglobina e oximioglobina à forma ferri. A velocidade de oxidação da oxihemoglobina mostra dependência de primeira ordem em relação à concentração de hemeproteína e de meia ordem em relação ao difenol ; contudo a altas concentrações dos catalisadores observa-se saturação, com valores de Vmáx similares para ambos os difenóis. É proposto que uma quinona , inicialmente formada, oxida a oxihemeproteína com liberação de oxigênio; por sua vez, a semiquinona oxida uma segunda molécula de oxihemeproteína, sendo que o oxigênio ligado recebe dois elétrons. Exceto para o caso da oximioglobina, que é mais reativa, a forma reduzida do catalisador deve estar presente para se opor ao desaparecimento da semiquinona por dismutação. Desde que se observa a liberação de oxigênio, esperada para a formação de água, o sistema pode ser considerado modelo de oxidase terminal. Infere-se tentativamente, que a oxihemoglobina tem estrutura HbFe2+ ...O2, e que a velocidade da oxidação catalisada é limitada pela velocidade de produção da verdadeira forma reativa, a estrutura ferri-superóxido, HbFe3+...O-2. / Catechol and catecholamines have been assayed upon the microsomal NADPH and NADH oxidase activities. Adrenaline shows a catalytic effect on the NADPH oxidation characterized by a small lag. The two-to three fold increase in rate can be supressed by dismutase if the enzyme is added before superoxide the reaction begins. The catalytic effect is ascribed to two products of adrenaline oxidation by the superoxide ion; to the quinone, the two electron oxidation product, and to the adrenochrome, the four electron oxidation product. Presumably, the adrenochrome reoxidizes the NADPH-cytochrome c reductase, and the formed quinone reacts with oxygen and regenerates the adrenochrome. Adrenaline neither changed, the NADH oxidase activity nor the menadione-stimulated NADPH oxidase activity. Presumably in these processes, two electrons are simultaneously transferred to the oxygen. Catechol and catecholamines doubled the rate of autoxidation of NADH in the presence of catalytic amounts of NADH-cytochrome b5 reductase and cytochrome b5 This result suggests superoxide ion formation in the autoxidation of the cytochrome. Catechol and p-hydroquinone catalytically promote the oxidation of oxyhemoglobin and oxymyoglobin to the ferri-form. Kinetic data for oxyhemoglobin oxidation indicates a first-order dependence upon the hemoprotein concentration and half-order dependence upon diphenol; however at high catalyst concentration, saturation is observed with similar Vmax values for both diphenols despite the difference in reactivity. It is proposed that initially formed quinone oxidizes the hemoprotein with oxygen release; in turn the semiquinone oxidizes a second molecule of hemoprotein and regenerates the quinone, with the bound oxygen acquiring two electrons. Except for the more reactive oxymyoglobin, the reduced form of the catalyst must be present to oppose semiquinone disappearance by dismutation, Since the expected release of 02 for water formation is observed, the system may be considered a model for terminal oxidase. It is tentatively inferred that oxyhemoglobin has the structure HbFe2+...02 and that the rate of the catalyzed oxidation is limited by the rate of generation of the true reacting form, the superoxide ferri structure, HbFe3+...0-2.

Superóxido dismutases (SODs) são metaloenzimas que convertem o ânion superóxido em oxigênio molecular (O2) e peróxido de hidrogênio (H2O2). A presença de metal nessas enzimas está diretamente relacionada com seus mecanismos de catálise e com suas estruturas tridimensionais. Evolucionariamente, FeSOD e MnSOD podem ter evoluído de um gene ancestral comum, porque possuem sequências homólogas e estruturas cristalográficas sobreponíveis. Entretanto, a nível catalítico, ambas as proteínas divergiram o suficiente para que seus metais não possam ser intercambiáveis, produzindo uma enzima funcional, indicando que essas proteínas possuem alta especificidade por metal. O objetivo deste projeto de pesquisa é Identificar os determinantes estruturais do ajuste fino da especificidade por metal de MnSOD e FeSOD. Inicialmente, pretendese selecionar resíduos para mutagênese sítio-dirigida em TrMnSOD e TbFeSODB2, a partir de análise de acoplamento estatístico (SCA). Em seguida, mutantes serão construídos, expressos, purificados e cristalizados. A estrutura tridimensional dos mutantes será resolvida por cristalografia e sua atividade enzimática determinada, bem como a acomodação estrutural dos metais por Resonância Paramagnética Eletrônica. Nossa hipótese de trabalho é que através de SCA é possível elencar resíduos de aminoácidos candidatos para mutagênese sítio-dirigida para desenhar novas SODs, com características intermediárias de ligação por Fe/Mn, como possibilidade de interconversão de especificidade, caminhando na história evolutiva dessas moléculas. / Superoxide dismutases (SODs) are metalloenzymes that convert the superoxide anion in molecular oxygen (O2) and hydrogen peroxide (H2O2). The metal in the catalytic center of such enzymes is directly related to their catalysis mechanisms and tridimensional structures. Evolutionarily, FeSOD and MnSOD may have evolved from a common ancestor, because both proteins have homologous primary sequences and superposable crystallographic structures. However, at the catalytic level, both proteins diverged sufficiently to prevent interchange of their metallic centers, which would generate non-functional enzymes, indicating that these proteins have high metal specificity. The objective of this research project is to identify structural determinants of Fe/MnSODs necessary to metal specificity. We intend to use statistical coupling analysis (SCA) to select amino acid residues for site-directed mutagenesis in TrMnSOD e TbFeSODB2. Mutant genes will be constructed and their proteins expressed, purified and crystallized. The tridimensional structure of such mutants will be solved by X-ray crystallography and their enzymatic activities determined, as well as their electron paramagnetic resonance spectra. We hypothesize that SCA is useful to identify amino acid candidates for site-directed mutagenesis to design new SODs with intermediated Fe/Mn specificity, and even metal specificity interconversion, by studying the evolutionary history of these proteins.