A Terapia Fotodinâmica é um tratamento promissor no cura de várias doenças oftalmológicas e dermatológicas, assim como tumores. Este tratamento utiliza a combinação de luz e um composto fotossensível na presença de oxigênio. Neste trabalho objetivamos entender mecanismos de fotossensibilização em membranas. Para isso, estudamos os efeitos de irradiação em Vesículas Unilamelares Gigantes (GUVs) compostas de POPC e Cardiolipina (CL) e POPC e Colesterol (Col), contendo uma molécula fotoativa (diC12-porf) ancorada à superfície dessas membranas. GUVs compostas por POPC e POPC:Col na presença da molécula fotoativa reagem ao estímulo da luz exibindo um aumento de área seguido de flutuações. O mesmo foi observado para membranas de POPC contendo menos que 50mol% de CL. Já para composições contendo 50mol% de CL, a membrana passa a formar domínios lipídicos podendo ou não ser destruída durante a irradiação. Estes domínios podem ser suprimidos com a adição de EDTA (agente quelante de íons divalentes) na solução. Ao adicionarmos CaCl2 ao meio externo das GUVs contendo EDTA, percebemos que o efeito dos domínios e destruição da membrana reaparece. Tal fato evidencia que íons Ca++ presentes em solução devem complexar com as cargas da CL, levando à formação de domínios lipídicos. Ao quantificar o aumento de área sofrido pelas membranas percebemos que a presença de CL na membrana de POPC inibe o aumento de área para concentrações acima de 40mol% de CL. Já a presença de Col na membrana parece não contribuir significativamente para o aumento de área, embora o mesmo sofra oxidação. Além disso, evidenciou-se que na presença de CL/Col o tempo de fotoclareamento de diC12-porf é muito maior do que na ausência destes. Estes resultados evidenciam que a inclusão de CL na membrana oferece um número maior de sítios de reação para o oxigênio singlete reduzindo a foto-degradação da molécula fotoativa. Já a inclusão de Col aumenta o tempo de vida da molécula fotoativa provavelmente devido ao fato da dupla ligação do Col estar mais próxima ao centro produtor de oxigênio singlete do que a dupla ligação do POPC. / Photodynamic Therapy is a promising treatment for the cure of many diseases, like tumors. This treatment uses a combination of light and a photosensitive molecule in the presence of oxygen. In this way, our objective is to understand photosensibilization mechanisms on membranes. For this purpose, we studied the effects of irradiation in Giant Unilamelar Vesicles (GUVs) composed of POPC and Cardiolipin (CL) and POPC and Cholesterol (Chol) in the presence of a photosensitive molecule (diC12-porf). When the GUVs composed of POPC or POPC and Cholesterol (Chol) in the presence of the photosensitive molecule were irradiated, increase in surface area followed by fluctuations was observed. For GUVs composed of low concentrations of CL, the membrane photo-response was similar to that observed for pure POPC. For GUVs composed of 50 mol% CL different responses to light irradiation were observed. Some lipid domains appear for GUVs in water under irradiation and the GUV might be destroyed. When the irradiation was done in the presence of EDTA (chelant agent), the formation of the domains was prevented. Further addition of CaCl2 to this solution induced the formation of domains again leading eventually to membrane disruption. These results suggest that divalent cations have effect on the binding to CL negative polar heads, favoring lipid domain formation. We quantified the area increase obtained for the GUVs. For GUVs composed of CL we observed that until 40mol% of CL, the maximum expansion reached by the membrane area was similar to that obtained for pure POPC. For 50mol% of CL the increase of area is smaller than that found for GUVs composed only by POPC. For GUVs composed of Chol the behavior of the area is similar to that found for POPC. This means that the increase of area is mainly related to POPC peroxidation, although Chol hydroperoxide must be concomitantly formed too. Further, we observed that the diC12-porf photobleaching characteristic time for GUVs composed of CL/Chol is greater than that noted for GUVs composed of POPC. This means that when we introduce CL we are increasing the possibilities of reaction of the singlet oxygen and the photosensitive molecule is protected. The insertion of Chol in the membrane also protects the photosensitive molecule.

A Indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) é uma enzima que apresenta um importante papel na prevenção da rejeição fetal. A IDO demonstra efeitos na supressão da ativação de células T por catabolizar o aminoácido essencial Triptofano. Nós estudamos a expressão da IDO em cultura celulares de placenta com a adição individual de Estradiol, Progesterona, Interferon , Triptofano e 1-Metil-Triptofano com o uso de citometria de fluxo, imunocitoquímica e quantificação celular, imunofluorescência, peroxidação lipídica, análise das fases do ciclo celular, imunoblotting e PCR em placentas bovinas nos três trimestres gestacionais. A quantificação celular revelou que em bovinos a atividade da IDO aumenta com o avanço do período gestacional e, sua expressão varia de acordo com os fatores, sendo o mesmo padrão observado pela imunofluorescência. O Imunoblotting mostrou a presença de possíveis isoformas desta proteína na espécie bovina que ainda não foram identificadas. A investigação pela lipoperoxidação revelou que os hormônios modularam diferencialmente a produção de radicais peroxidados nos três terços de gestação e, possivelmente atuam como fatores indutores de proliferação. As células placentárias apresentaram padrões diferenciados de proliferação e apoptose ao longo da gestação, principalmente nos tratamentos com Estradiol e Progesterona, sendo também variantes com outros fatores em todos os grupos. Observou-se que a Progesterona atua na maturação das células placentárias independente da concentração utilizada. Em todos os grupos uma grande proporção de células apresentava-se em estado de quiescência (G1). No terceiro trimestre foi detectado um aumento no número de células em G2/M, indicando a parada da capacidade proliferativa ou de progressão no ciclo celular (\"arrest\"). Maior taxa de apoptose foi observada nos animais de segundo trimestre gestacional. Baseados nisso, podemos concluir que a IDO é suscetível ao controle pelos mecanismos testados, o que nos leva a formular hipóteses de implantação de possíveis mecanismos terapêuticos para a reprodução com a participação da IDO. / Indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) is an enzyme that plays an important role in preventing fetal rejection. IDO is related to the suppression of the T-cells activation due to the catabolism of essential amino acid Triptophan. We studied the expression of IDO in bovine placenta cell culture with individual supplementation of factors as Estrogen, Progesterone, Interferon , Triptophan and 1-Methyl-Triptophan. Evaluations were made by flow cytometry, immunocitochemistry and cellular quantification, lipidic peroxidation, cell cycle phases, imunoblotting, PCR and immunofluorescency in the three trimesters of pregnancy. Cellular quantification demonstrated that in bovines the activity of the IDO increases during pregnancy, and its expression is factor-dependent, which was also observed in immunofluorescency. Imunoblotting demonstrated the presence of possible unknown protein isoforms in bovine. Lipoperoxidation evaluation demonstrated that hormones distinguishingly modulated the production of peroxide radicals in the three trimesters of pregnancy and, possibly acting as inductive factors of proliferation. Placental cells demonstrated differentiated patterns of proliferation and apoptosis during the gestation, mainly in the presence of Estrogen and Progesterone, besides variant rates were also observed under other factors. Independent of the concentration, Progesterone influenced placental cells maturation. All groups presented great ratio of cells in quiescence state (G1). In third trimester, G2/M high rates indicated a pause in proliferative capacity or in cell cycle progression (arrest). High apoptosis rates were observed in animals at second pregnancy trimester. Based on the presented, we concluded that IDO is susceptible to be controlled by the applied-factors, what lead us to think about hypothetical therapeuthic mechnism for reproduction with the participation of IDO.

O estresse oxidativo está relacionado ao Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) e é provável que o desequilíbrio entre a geração de radicais livres e antioxidantes esteja envolvido com o agravamento do estado de saúde. Objetivo: Estudar a peroxidação lipídica e componentes de defesa antioxidante no LES. Casuística e métodos: Foram estudados 54 pacientes com LES, separados em dois grupos: Grupo Doença Ativa (n=25) e Grupo Doença Inativa (n=29) e 12 Controles. Para o Grupo Doença Ativa, dois subgrupos foram constituídos considerando o status do processo inflamatório: Agudo e Crônico. Foi analisada a oxidação de lipídios [malondialdeído (MDA)]; de proteínas (grupo carbonila) e de DNA (Teste do Cometa). A defesa antioxidante foi quantificada por superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH-Px), α-tocoferol plasmático e vitamina C plasmática. A excreção urinária de α-tocoferol foi igualmente determinada. Os dados foram analisados pelo teste não-paramétrico de Kruskall-Wallis e referidos como mediana e valores mínimos e máximos. Resultados: Os níveis de MDA não diferiram entre os grupos e corresponderam a 0,71 (0,30-1,81); 0,61 (0,11-1,82) e 0,53 (0,34-1,04) µmol/L para os grupos Doença Ativa, Doença Inativa e Controle, respectivamente ( p > 0,05), embora incremento de peroxidação lipídica tenha sido observado para os pacientes com comprometimento renal (p > 0,05). A análise do grupo carbonila demonstrou medianas similares entre os grupos testados (p > 0,05) enquanto a freqüência do momento da cauda não mostrou haver variação importante quanto a esse parâmetro. Para os Grupos Doença Ativa, Doença Inativa e Controle os valores de SOD foram 1707,10 (853,52-2634,80); 1696,20 (909,35-2704,50) e 1870,40 (1506,60-2345,80) U/g Hb (p > 0,05) enquanto para GSH-Px os níveis da enzima equivaleram a 19,27 (10,15-44,13); 20,60 (5 ,90-41 ,59) e 16,84 (10,97-30,07) U/g Hb (p > 0,05), respectivamente. Quando comparados os dados de vitamina C plasmática, similaridade entre os grupos foi observada. As medianas para os Grupos Doença Ativa, Doença Inativa e Controle foram 36,01 ; 48,67 e 59,32 ) µmol/L (p > 0,05), respectivamente. A correlação entre os níveis da vitamina e o grau de atividade da doença foi significativa. A análise do α-tocoferol plasmático revelou valores de mediana normais ( p > 0,05). A excreção 120 urinária de α-tocoferol não diferiu entre os grupos (p > 0,05) exceto quando a comparação considerou o status do processo inflamatório pois a excreção urinária da vitamina foi de 0,79 ) µmo1/24 h para o Subgrupo Processo Inflamatório Agudo contra 0,31 ) µmo1/24 h do Subgrupo Processo Inflamatório Crônico (p > 0,05). Conclusão: A peroxidação lipídica não aumentou em conseqüência da atividade da doença porém mostrou-se maior na presença de acometimento renal. Ainda que excreção aumentada de α-tocoferol tenha sido observada, os dados não permitiram estabelecer a importância do achado em relação à defesa antioxidante. / Oxidative stress is related to Systemic Lupus Erythematosus (SLE) and imbalance between free radical and antioxidant generation is probably involved in the worsening of patient health. Objective: To study lipid peroxidation and the components of antioxidant defense in SLE. Cases and methods: The study was conducted on 54 patients with SLE divided into two groups: Active Disease Group (n=25) and Inactive Disease Group (n=29), and on 12 Controls. The Active Disease Group was subdivided into two subgroups, Acute and Chronic, according to inflammatory process status. Lipid [malondialdehyde (MDA)], protein (carbonyl group) and DNA (Comet Assay) oxidation was determined. The antioxidant defense was quantified on the basis of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), plasma α-tocopherol, and plasma vitamin C. Urinary α-tocopherol excretion was also determined. Data were analyzed statistically by the nonparametric Kruskall-Wallis test and are reported as median and range. Results: MDA levels did not differ between groups and were 0.71 (0.30-1.81), 0.61 (0.11-1.82) and 0.53 (0 .34-1.04) µmol/L for the Active Disease, Inactive Disease and Control Groups, respectively (p > 0.05), although an increase in lipid peroxidation was observed in patients with impaired renal function (p > 0.05). Analysis of the carbonyl group demonstrated similar medians for all groups tested (p > 0.05), whereas no significant variation was detected in the frequency of tail moment. SOD values were 1707.10 (853.52-2634.80), 1696.20 (909.35-2704.50) and 1870.40 (1506.60-2345.80) U/g Hb for the Active Disease, Inactive Disease and Control Groups, respectively (p > 0.05), and GSH-Px levels were 19.27 (10.15-44.13); 20.82 (9 .68-41 .59) and 16.84 (10.97-30.07) U/g Hb (p > 0.05), respectively. Plasma vitamin C levels were similar for all groups, with medians of 36.01 , 48.67 and 59.32 µmol/L (p > 0.05) for the Active Disease, Inactive Disease and Control Groups, respectively. There was a significant correlation between vitamin C levels and degree of disease activity. Analysis of plasma α-tocopherol revealed normal median values (p > 0.05). Urinary α-tocopherol excretion did not differ between groups (p > 0.05) except when inflammatory process status was considered, with an excretion rate of 0.79 µmo1/24 h for the Acute Inflammatory Process Subgroup as opposed to 0.31 µmo1/24 h for the Chronic Inflammatory Process Subgroup (p > 0.05). Conclusion: Lipid peroxidation did not increase as a consequence of disease activity but was higher in the presence of renal involvement. Even though increased α-tocopherol excretion was observed, the data obtained did not permit us to establish the importance of this finding with respect to antioxidant defense.

Neste trabalho investigamos efeitos de fotoirradiação e toxinas sob membranas celulares miméticas. Foram utilizadas, como modelo de membranas lipídicas, vesiculas unilamelares gigantes (GUVs) compostas pro lipídeos oxidados e não oxidados observadas por microscopia ótica de contraste de fase. Inicialmente estudamos a foto-resposta de membranas compostas por POPC e POPG dispersas em solução contendo azul de metileno (MB). Na sequência, estudamos o efeito de toxinas formadoras de poros, Esticolisina I (ST I) e Esticolisina II (ST II), em membranas contendo lipídeos oxidados e não oxidados. Os resultados de MB (10 µM) disperso em solução de membranas compostas por POPC e o lipídeo aniônico POPG indicaram que o aumento da densidade de carga negativa nas membranas das GUVs, que favorece a ligação da moléculas positivamente carregadas como MB nas membranas, tem como consequência um aumento de permeabilidade da membrana muito mais rápído em relação a membranas compostas apenas por POPC. Isto se deve ao fato que a localização preferencial do MB na membrana de POPC:POPG favorece a formação de oxigênio singlete próximo a dupla ligação da cadeia alquílica, dando início a reação de peroxidação lipídica de maneira mais efetiva que em membrana de POPC. Os resultados da ação das toxinas STI e STII (21 nM) em GUVs contendo lipídeos não oxidados PC e esfingomielina evidenciam que apenas STII é capaz de permear estas membranas a esta concentração. Mais ainda, nossos resultados sugerem que a existência de separação de fases fluida-gel na bicamada lipidica composta por PC:SM (razão molar 1:1) favorece a ação da toxina StII. Ao analisarmos membranas contendo lipídeos hidroperoxidados (POPC-OOH) dispersas em solução contendo STII (21 nM) observamos um aumento de permeabilidade na membrana num conjunto de GUVs, associado a formação de poros, apenas em bicamadas lipídicas formadas por misturas de lipídeos oxidados (POPC) e não oxidados (POPC-OOH). Quanto maior a concentração de lipídeos oxidados na membrana mais rapidamente ocorre o aumento de permeabilidade. / In this work we investigate the effects of photoirradiation and toxins on mimetic cell membranes. As a model of lipid membranes, giant unilamellar vesicles (GUVs) composed of oxidized and oxidized pro-lipids were observed by optical phase contrast microscopy. Initially we studied the photo-response of membranes composed of POPC and POPG dispersed in solution containing methylene blue (MB). Following, we studied the effect of pore-forming toxins, Sticolysin I (ST I) and Sticolysin II (ST II), on membranes containing oxidized and non-oxidized lipids. The results of MB (10 M) dispersed in solution of membranes composed of POPC and the anionic lipid POPG indicated that the increase in the negative charge density in the membranes of GUVs, which favors the binding of positively charged molecules as MB in the membranes, consequently increases membrane permeability in regard to membranes composed only of POPC. This is due to the fact that the preferred location of the MB in the POPC: POPG membrane favors the formation of singlet oxygen near the double bond of the alkyl chain, initiating the lipid peroxidation reaction more effectively than in the POPC membrane. The results of the action of the STI and STII toxins (21 nM) on GUVs containing non oxidised lipids PC and sphingomyelin show that only STII is able to permeate these membranes at this concentration. Moreover, our results suggest that the existence of fluid-gel phase separation in the lipid bilayer composed of PC:SM (molar ratio 1:1) favors the action of the StII toxin. When analyzing membranes containing hydroperoxidized lipids (POPC-OOH) dispersed in solution containing STII (21 nM) we observed an increase in membrane permeability in a set of GUVs, associated with pore formation, only in lipid bilayers formed by mixtures of oxidized lipids (POPC-OOH) and non-oxidized ones. The higher the concentration of oxidized lipids in the membrane, the faster the permeability increases.

Made available in DSpace on 2017-07-21T18:53:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tiago Margraf.pdf: 3444633 bytes, checksum: 00ddc78a605b890f5109af10a0c0c5e6 (MD5) Previous issue date: 2015-11-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Worldwide, the consumption of purple grape juice has grown since several studies point to the potential health benefits, combined with a balanced diet and regular physical exercise. These potential benefits are related to the bioactive compounds present in this fruit and other plants, responsible for the inhibition of reactive oxygen and nitrogen species, formed in oxidative and inflammatory processes in the human body. In this context, researchers have tried and tested fast, inexpensive, accurate and reproducible methods, which are able estimating the content of bioactive compounds in beverages and foods. In this scenario, the objectives of this study were divided in two experimental chapters, where the Chapter II had as purpose to test and validate a more selective spectrophotometric method than the Folin-Ciocalteu assay, to quantify the content of phenolic compounds in grape juice. Already the Chapter III had as purpose to characterize n = 62 juices Brazilian purple grapes from different geographic origins (RS, PR and SC), agronomic (organic and conventional) and genotypic (Bordo, Isabel and Concord) about its physicochemical and chemical properties, and in vitro antioxidant activity using chemical and biological systems. The results showed that the Prussian Blue method has low detection (0.27 mg L-1) and quantification limit (0.92 mg L-1), and a high association (r = 0.923, p < 0.0001) with the standard method of Folin-Ciocalteu reagent for the grape juice matrix, and also a faster reaction and high selectivity compared to the Folin-Ciocalteu assay. Furthermore, the geographical origin and the grape variety proved to be the most important factors in distinguishing juices (p < 0.05) for antioxidant activity and some chemical markers. However for the organic and conventional juices, except for some phenolic acids determined by high-performance liquid chromatography, there were no statistically significant distinctions (p > 0.05). A total of n = 18 grape juices were characterized by presenting high, intermediate and low antioxidant activity in vitro using four different methodologies (Scavenging of ABTS●+ radical; Ferric-reducing antioxidant power - FRAP; Total reducing power; and Reducing potential of the hydrophilic phenolic compounds - RPHPC) and were subjected to analysis of the inhibition of lipid peroxidation at 37 °C by means of a biological assay in buffered medium at pH 7.4. The inhibition of lipid peroxidation of the grape juice showed a significant correlation (r ≥ 0.505; p ≤ 0.02) with other antioxidant activity assays, concluding that the antioxidant activity in vitro of Brazilian purple grape juice has association either by chemical methods or by biological means. / Em todo o mundo, o consumo de sucos de uva roxa tem crescido, visto que vários estudos apontam os potenciais benefícios à saúde, aliados a uma alimentação equilibrada e a prática regular de exercícios físicos. Esses potenciais benefícios estão relacionados com os compostos bioativos presentes nesta fruta e em demais vegetais, responsáveis pela inibição de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, formadas em processos oxidativos e inflamatórios no corpo humano. Nesse contexto, pesquisadores têm testado e validado metodologias rápidas, baratas, precisas e reprodutíveis, que possibilitem estimar o conteúdo de compostos bioativos em bebidas e alimentos. Nesse cenário, os objetivos deste estudo foram divididos em dois capítulos experimentais, dos quais o Capítulo II objetivou testar e validar uma metodologia espectrofotométrica mais seletiva que o Folin-Ciocalteu para quantificar o teor de compostos fenólicos totais em suco de uva. Já no Capítulo III, objetivou-se caracterizar n=62 sucos de uvas roxas brasileiros de diferentes origens geográficas (RS, PR, e SC), agronômicas (orgânicos e convencionais), e genotípicas (Bordô, Isabel, e Concord) quanto às suas propriedades físico-químicas, químicas, e atividade antioxidante in vitro usando sistemas químicos e biológico. Os resultados mostraram que o método do Azul da Prússia apresentou um baixo limite de detecção (0,27 mg L-1) e quantificação (0,92 mg L-1), e uma alta associação (r = 0,923; p<0,0001) com o método padrão de Folin-Ciocalteu para a matriz de suco de uva, além de menor tempo de reação e alta seletividade comparado ao ensaio de Folin-Ciocalteu. A origem geográfica e a variedade de uva mostraram-se os fatores mais importantes na distinção dos sucos (p<0,05) para atividade antioxidante e alguns marcadores químicos. Já para os sucos orgânicos e convencionais, com exceção para alguns ácidos fenólicos determinados por cromatografia líquida de alta eficiência, não foram encontradas distinções estatisticamente significativas (p>0,05). Um total de n=18 sucos de uva foram caracterizados por apresentarem alta, intermediária e baixa atividade antioxidante in vitro usando quatro metodologias diferentes (Seqüestro de radicais ABTS●+; Poder antioxidante de redução do ferro - FRAP; Poder redutor total; Potencial redutor dos compostos fenólicos hidrofílicos - PRCFH) e foram sujeitados à análise de inibição da peroxidação lipídica a 37 oC por meio de um ensaio biológico em meio tamponado em pH 7,4. A inibição da peroxidação lipídica dos sucos de uva apresentou uma correlação significativa (r ≥ 0,505; p ≤ 0,02) com outros ensaios de atividade antioxidante, concluindo-se que a atividade antioxidante in vitro de suco de uva roxa brasileiro apresenta associação tanto por métodos químico quanto em meio biológico. Palavras-chave: cultivo orgânico, peroxidação lipídica, capacidade redutora, análise multivariada, Vitis sp.

Made available in DSpace on 2017-07-21T20:00:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lilian Prione.pdf: 1165937 bytes, checksum: d73d6916708640fa9af6db139db8b8c2 (MD5) Previous issue date: 2014-02-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Herbicides are widely used to increase crop production and account for 35% of all agrochemicals applied annually. After application, the herbicides can remain in the soil as hazardous residues. Mesotrione, (2-[4-methylsulfonyl-2-nitrobenzoyl]1,3-cyclohenanedione), is the active ingredient of Callisto, an herbicide commonly used in corn. Pantoea ananatis CCT 7673, an Enterobacteria isolated from water, has been previously cited as mesotrione-degrading strain. The aim of this study was to evaluate the influence of mesotrione and Callisto as oxidative stress-inducing agents for cellular metabolism of Pantoea ananatis CCT7673 and identify possible mechanisms of tolerance. SOD, CAT and GR activities were evaluated in non-denaturing PAGE and CAT, GR and GST in spectrophotometer. Also, the rates of malonaldehyde (MDA), superoxid and peroxide hydrogen (H2O2) were measured in a spectrophotometer. Minimal medium with no herbicide (MM) was used as control. Lipid peroxidation, superoxide and peroxide hydrogen quantification and SOD, CAT, GR and GST activities were analyzed before and after degradation of mesotrione. The herbicide proved to be the cause of oxidative stress, according to peroxide hydrogen data. Unexpectedly, the rates of lipid peroxidation (MDA) and GR showed to be lower in the presence of the herbicide when compared to the control, with no changes in bacterial growth. The activity of GST was higher in mesotrione treatment in comparison to control and Callisto, during and after degradation. These results suggest that this enzyme may be related to the mesotrione degradation, probably by cometabolism. The rates of lipid peroxidation were shown to be lower in the presence of the herbicide compared to the control, with no changes in growth rates when exposed to herbicide. P. ananatis CCT 7673 showed changes in the saturation of membrane lipids. These changes may interfere with herbicide entry into the cell. These characteristics may be associated with a level of phenotypic plasticity in P. ananatis CCT 7673, making this an interesting bacterium for studies of herbicide tolerance and evolution of microbiota in environments subjected to different degrees of selective pressure model. / Herbicidas são amplamente utilizados para aumentar a produção agrícola e são responsáveis por 35% de todos os agrotóxicos aplicados anualmente. Após a aplicação, os herbicidas podem permanecer no solo como resíduos perigosos. O mesotrione (2 - [ 4 - metilsulfonil - 2 - nitrobenzoil ] 1,3- cyclohenanedione ) é o ingrediente ativo de Callisto, um herbicida utilizado no milho . Pantoea ananatis CCT 7673, é uma enterobactéria isolada de água e foi previamente caracterizada como linhagem degradadora do mesotrione. Os objetivos deste trabalho foram o avaliar a influência do mesotrione e Callisto como agentes indutores de estresse oxidativo para o metabolismo celular de Pantoea ananatis CCT7673, bem como identificar possíveis mecanismos de tolerância a estes herbicidas. As atividades enzimáticas de SOD, CAT e GR foram avaliadas em PAGE não desnaturante e de CAT, GR e GST em espectrofotômetro. Além disto, as taxas de malondialdeído (MDA), radical superóxido e peróxido de hidrogênio (H2O2) foram medidas em espectrofotômetro. Todas as análises foram realizadas antes e após a degradação do mesotrione. Meio mínimo sem herbicida (MM) foi utilizado como controle. O herbicida provou ser agente causal do estresse oxidativo pelos dados de peróxido de hidrogênio. Inesperadamente, as taxas de MDA e GR mostraram-se inferiores nos tratamentos com herbicida em relação ao controle, sem alteração no crecimento bacteriano. A atividade de glutationa-S-transferase foi maior no tratamento com mesotrione em comparação com o controle e Callisto, durante e após a degradação. Estes resultados sugerem que essa enzima pode estar relacionada com o processo de degradação do mesotrione, provavelmente por cometabolismo. As taxas de peroxidação lipídica mostraram ser menores na presença do herbicida em comparação com o controle, sem mudanças na taxa de crescimento Quando exposta ao herbicida, P. ananatis CCT 7673 apresentou alterações na saturação de lipídios de membrana. Estas mudanças podem interferir na entrada do herbicida na célula. Tais características podem estar associadas a um nível de plasticidade fenotípica em P. ananatis CCT 7673, tornando essa bactéria um modelo interessante para estudos de tolerância a herbicidas e evolução de microbiotas em ambientes submetidos a diferentes graus de pressão seletiva.

Made available in DSpace on 2017-07-21T20:00:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luiz Ricardo Olchanheski.pdf: 1069422 bytes, checksum: 4a8faf74d88ea768a689fc8a9a055a56 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Paraná / The intensive use of agrochemicals has assumed an important role in increasing agricultural production; however, one of the impacts has been changes in population structure of microbiota in the soil, which need to tolerate the xenobiotics that are applied in order to survive. A pertinent question is whether these mechanisms are selected by the presence of different agrochemicals in soils, or if there are constitutive mechanisms of adaptation. The aim of this study was to evaluate the defense system of an un-environmental strain, E. coli DH5-α, in relation to the herbicide mesotrione, which had no prior contact with the soil. The results showed that this strain was able to tolerate higher doses of the herbicide, and that the determination of the herbicide by a method developed and validated by high performance liquid chromatography (HPLC), made it possible to determine the complete disappearance of mesotrione in the sample after 3 h of exposure. Growth rates in the treatment with the herbicide were lower than the control, prior to the period of degradation, showing the toxic effect on the bacterial cells. As regards defense systems, it was noted that changes in the saturation of the membrane lipids reduced the damage caused by reactive oxygen species and possibly hindered the entry of xenobiotics in the cell, as well as activating GST enzyme activity in the antioxidant system and in the metabolizing process of the herbicide. Considering that E. coli DH5-α showed no previous contact with mesotrione, the defense system found in this strain can be considered as general and non-specific. This strategy may be interesting in the adaptation of bacterial strains in agricultural soils, which are subject to changing herbicides in an ever more intense manner. / O uso intensivo de agroquímicos tem assumido um papel relevante no aumento da produção agrícola, mas um dos impactos gerados é a mudança na estrutura populacional de microbiotas de solo, que precisam tolerar os xenobióticos aplicados para sobreviver. Uma pergunta pertinente é se os mecanismos de tolerância são selecionados pela presença de diferentes agroquímicos em solo, ou se há mecanismos constitutivos de adaptação. O objetivo deste trabalho foi avaliar o sistema de defesa de uma linhagem não ambiental, a E. coli DH5-α, em relação ao herbicida mesotrione, com o qual não houve contato prévio em solo. Resultados obtidos mostraram que esta linhagem foi capaz de tolerar elevadas doses do herbicida, e a determinação do herbicida por um método desenvolvido e validado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) permitiu determinar que após 3 horas não foi possível detectar o herbicida nas amostras avaliadas. Taxas de crescimento no tratamento com o herbicida foram menores em relação ao controle nos tempos anteriores ao período de degradação, mostrando o efeito tóxico sobre as células bacterianas. Como sistemas de defesa, constataram-se a alteração na saturação dos lipídeos de membrana, diminuindo os danos causados pelas espécies ativas de oxigênio e possivelmente dificultando a entrada do xenobiótico na célula, além da atuação da enzima GST no sistema antioxidante e no processo de metabolização do herbicida. Considerando que a E. coli DH5-α não apresentou um contato prévio com o mesotrione, o sistema de defesa encontrado nesta linhagem pode ser considerado como geral e não específico. Esta estratégia pode ser interessante na adaptação de linhagens bacterianas em solos agrícolas, os quais são submetidos a regimes de trocas de herbicidas de maneira cada vez mais intensa.

O estresse oxidativo (EO), fenômeno decorrente do desequilíbrio entre a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO) e/ou depleção antioxidante (AO), está envolvido na patogênese de diversas doenças e desordens, incluindo o diabetes mellitus tipo 2 (DM2) e a doença periodontal. Uma das conseqüências da geração excessiva das ERO é a destruição tecidual promovida pela peroxidação lipídica, e para combater estes efeitos deletérios, o organismo desenvolveu mecanismos de defesa, como os AO e peroxidases. Objetivos: Avaliar o comportamento dos marcadores de EO na saliva total (SALT) de pacientes com ou sem DM2, portadores ou não de periodontite crônica generalizada (PCG); e verificar e comparar o efeito do tratamento periodontal não-cirúrgico (TPNC) sobre esses marcadores entre os pacientes. Materiais e Métodos: 121 pacientes participaram deste estudo e foram alocados em 4 grupos: diabéticos com PCG (DMPC), diabéticos sem PCG (DM), pacientes sistemicamente saudáveis com PCG (PC) e pacientes sistemicamente saudáveis e sem periodontite (C). Os índices de Placa (IP), nível clínico de inserção (NCI), profundidade clínica de sondagem (PCS) e sangramento à sondagem (SS) foram coletados para a avaliação dos parâmetros clínicos periodontais. Foram também coletadas amostras de sangue periférico e SALT para analisar respectivamente a hemoglobina glicada (HbA1c) e os marcadores de EO, superóxido dismutase (SOD), estado total de antioxidante (TAS) e substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) e peroxidase salivar (SPO). As coletas foram realizadas no baseline e após 30 dias do tratamento, previamente à avaliação e reavaliação clínica. Os pacientes DMCP e PC passaram por TPNC, e os DM e C, receberam apenas orientação de higiene oral e profilaxia. Resultados: No baseline, os grupos DMPC e PC apresentaram valores significativamente maiores dos parâmetros clínicos PCS, SS, IP e NCI quando comparados aos grupos DM e C (p<0.05). Após o TPNC, todos esses parâmetros mostraram melhoras significativas (p<0,05). A HbA1c foi significativamente maior no grupo DMPC quando comparado com DM no baseline (p<0,05), no entanto, o TPNC não promoveu melhora significativa após 1 e 3 meses de acompanhamento glicêmico, ainda que, a redução percentual (0,4%) observada possa ser considerada importante. Quanto aos marcadores, no grupo DMPC os valores de TBARS foram significativamente menores comparados aos grupos DM, PC e C (p<0.05), e os de SPO foi significativamente maior em relação aos grupos PC e C (p<0.05), com correlação negativa entre TBARS e SPO (r=-0.35; p=0.002), enquanto que os valores de TAS e SOD não mostraram diferenças significativas entre os grupos estudados (p>0.05). Após o TPNC, os níveis de TBARS aumentaram significativamente, e os de SPO diminuíram significativamente apenas no grupo DMPC (p<0.05 e p<0.05), ao passo que os valores de SOD e TAS permaneceram inalterados nos dois grupos. Conclusão: No baseline, os valores de TBARS e de SPO estiveram alterados nos pacientes DMPC com resultados que mostram correlação inversa entre TBARS/SPO, e após o TPNC houve nova alteração. O comportamento dos marcadores de EO na saliva mostrou a busca pelo ponto de equilíbrio por diversas vias e que este pode ser alterado pelo uso de medicamentos, como a metformina. / Oxidative stress (OS), resulting phenomenon from reactive oxidative species (ROS) and/or antioxidant (AO) depletion imbalance, is involved in many diseases and disorders pathogenesis, including type 2 diabetes mellitus (T2DM) and periodontal disease. One of the ROS excessive generation consequences is the tissue destruction promoted by lipid peroxidation. To strike ROS deleterious effects, the organism developed several defense mechanisms, such as AO and peroxidase systems. Objectives: To evaluate the OS markers behavior in whole saliva (WS) of patients who has or not T2DM, with or without generalized chronic periodontitis (GCP); and to verify and to compare non-surgical periodontal treatment (NSPT) effect on these markers. Material and Methods: 121 patients participated of this study and were allocated in 4 groups: diabetics with chronic periodontitis (DMPC), diabetics periodontally heathy (DM), sistemically healthy with chronic periodontitis (PC) and sistemically and periodontally healthy patients (C). Plaque index (PI), clinical attachment level (CAL), probing depth (PD) and bleeding on probing (BOP) were collected for periodontal clinical paramethers. Peripheral blood and WS samples were collected respectively for glycated hemoglobin (HbA1c) and OS markers, such as superoxide dismutase (SOD), total antioxidant status (TAS), thiobarbituric acid reacting substances (TBARS) and salivary peroxidase (SPO), assessment. Collections were performed at baseline and 30 days after treatment, previously to clinical evaluation and reevaluation. GCP patients (DMPC and PC) were submitted to NSPT, and those with periodontal health (DM and C) received oral hygiene instructions and prophilaxys only. Results: At baseline, DMPC and PC patients showed PD, BOP, PI and CAL higher levels when compared to DM and C groups (p<0.05). After NSPT, all these clinical parameters had significant improvement (p<0.05) in both groups. HbA1c medians were significantly higher in DMPC when compared to DM, at baseline, however, the NSPT did not improved after 1 and 3 months of glicemic control, though percentual reduction (0.4%) observed at clinical point of view might be considered important. As to laboratorial analysis, in DMPC group, TBARS levels were significantly decreased compared to DM, PC and C (p<0.05), and SPO activity were significantly higher than PC and C (p<0.05), with negative correlation between TBARS and SPO (r=-0.35; p=0.002), while TAS levels and SOD activity did not show any significant differences among studied groups (p>0.05). After NSPT, TBARS levels increased significantly, and SPO decreased significantly only in DMPC group (p<0.05 and p<0.05), whereas SOD and TAS values remained unchanged in DMPC and PC groups. Conclusion: At baseline, TBARS levels and SPO activity have been altered in DMPC patients and with results that showed inverse correlation between TBARS/SPO, and after NSPT, another modification occurred. OS markers levels behavior in WS showed a search for balance and this might be changed by medication use, as metformin.

O café, rico em substâncias bioativas, está entre os maiores contribuintes para a ingestão de antioxidantes em vários países. O tipo de torra dos grãos influencia em sua atividade antioxidante. Estudos indicam que o consumo moderado de café filtrado está envolvido na redução do risco de doenças crônicas não-transmissíveis, geralmente associadas entre si e que se constituem em graves problemas de saúde pública. Entretanto, a literatura não apresenta consenso sobre a ação benéfica do café na redução do risco destas doenças. Objetivos: Comparar a atividade antioxidante de dois graus de torras de café (torra média-clara e média) e seus efeitos sobre biomarcadores de risco cardiovascular em indivíduos saudáveis. Métodos: A caracterização de antioxidantes nas bebidas foi realizada pelas análises de compostos fenólicos totais, perfil de ácidos fenólicos, cafeína, melanoidinas e capacidade antioxidante total - TAC (sequestro do radical DPPH e capacidade de absorbância do radical oxigênio - ORAC). Após 1 semana de washout, vinte voluntários saudáveis (20 a 65 anos) ingeriram café filtrado preparado com torra média-clara ou torra média por 4 semanas e com o outro tipo de torra por mais 4 semanas em um ensaio clínico randomizado do tipo crossover, o qual durou 9 semanas. Lipídeos plasmáticos, lipoproteína (a), homocisteína total, biomarcadores glicêmicos e pressão arterial de 24 horas foram medidos antes do período de intervenção a após a ingestão de cada torra. A atividade antioxidante foi avaliada no plasma e em eritrócitos respectivamente pela TAC (kit Total Antioxidant Status e ORAC) e da atividade das enzimas antioxidantes (superóxido dismutase - SOD, glutationa peroxidase - GPx e catalase - CAT). A capacidade de inibição da peroxidação lipídica foi avaliada no plasma pelas determinações de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) oxidadas e 8-isoprostano. Biomarcadores inflamatórios relacionados à disfunção endotelial foram medidos no plasma por imunoensaios. Resultados: Vinte voluntários saudáveis (49,5 + 8,9 anos) foram avaliados. A torra média-clara apresentou maior teor de ácidos clorogênicos (334 mg/150 mL; p < 0,001) e menor teor de cafeína (231 mg/150 mL; p = 0,003) que a torra média (210 mg/150 mL e 244 mg/150 mL, respectivamente). Os teores de melanoidinas foram significamente maiores na torra média (p < 0,001). A TAC não diferiu entre as bebidas. A ingestão de ambas as torras causou aumento nas concentrações de colesterol total e LDL (10 e 12 por cento para a torra média-clara; 12 por cento e 14 por cento para a torra média) (p < 0,05). A ingestão da torra média também aumentou a concentração da lipoproteína de alta densidade (HDL) em 7 por cento (p = 0,003). Houve aumento nos índices de Castelli após o consumo da torra média-clara (5 por cento no índice I; p = 0,01 e de 6 por cento no índice II; p = 0,03). O TAS dos indivíduos aumentou 21 por cento e 26 por cento , respectivamente, após consumo da torra média-clara e média (p < 0,001). Os indivíduos também tiveram aumento de 13 por cento e 13 por cento na atividade da CAT, 52 por cento e 75 por cento na SOD e 62 por cento e 49 por cento na GPx após a ingestão da torra média-clara e torra média (p < 0,001), respectivamente. Ambas as torras aumentaram as concentrações da molécula de adesão celular vascular-1 solúvel (sVCAM-1), sendo 18 por cento para a torra média-clara e 14 por cento para a torra média) (p < 0,05). A concentração de fibrinogênio plasmático aumentou 8 por cento após ingestão da torra média (p = 0,01) e a selectina-E solúvel (sE-selectina) aumentou 12 por cento após a torra média-clara (p = 0,02). Embora o consumo de café tenha elevado os níveis de colesterol total e LDL, não se relacionou à alteração de homocisteína total, lipoproteína (a) e biomarcadores de diabetes e de peroxidação lipídica. Conclusão: O consumo moderado de café filtrado apresentou alguns efeitos maléficos sobre o perfil de risco cardiovascular em indivíduos saudáveis, independente de sua atividade antioxidante / Introduction: Coffee is rich in bioactive substances and it is among the major contributors to the total antioxidant ingestion in several countries. The roasting degree of coffee is important for its antioxidant activity. Studies indicate that the moderate consumption of filtered coffee is involved in the prevention of chronic diseases, which are usually associated and constitute serious problems of public health. However, literature does not present consensus about the beneficial effects of coffee in the prevention of these diseases. Objectives: To compare the antioxidant activity of the two coffee roasts (medium light and medium roast) and their effects on biomarkers of the cardiovascular risk in healthy volunteers. Methods: The antioxidant characterization of the coffee beverages was performed by the total phenolic content analysis, phenolic profile, caffeine, melanoidins and total antioxidant capacity - TAC (DPPH radical scavenging capacity and Oxygen radical absorbance capacity - ORAC assays). After 1-week washout, twenty healthy volunteers (20 to 65 years old) consumed medium light roast or medium roast paperfiltered coffee for 4 weeks and then switched to the other roast for an additional 4 weeks in a randomized crossover trial that lasted 9 weeks. Plasma lipids, lipoprotein (a), total homocysteine, serum glycemic biomarkers, and twenty-four hours blood pressure were measured at baseline and after each intervention. Levels of total antioxidant status (TAS) and ORAC were evaluated in plasma, and antioxidant enzymes activities (superoxide dismutase - SOD, glutathione peroxidase - GPx and catalase - CAT) in erythrocytes. Lipid peroxidation inhibition capacity was determined in plasma by oxidized LDL and 8-isoprostane assays. Endothelial dysfunction-related inflammation biomarkers were measured in plasma by immunoassays. Results: Twenty healthy volunteers (49.5 + 8.9 years) were evaluated. Medium light roast coffee showed higher chlorogenic acids (334 mg/150 mL; p < 0.001) and less caffeine (231 mg/150 mL; p = 0.003) than medium roasting (210 mg/150 mL and 244 mg/150 mL, respectively). Melanoidins were significant higher in medium roast than medium light roast (p < 0.001). There was an increase in the Castelli indexes after medium light roast consumption (5 per cent in the index I; p = 0.01, and 6 per cent in the index II; p = 0.03). No significant differences were observed for TAC between the medium light roast and medium roast. Both roasts increased plasma total cholesterol and LDL concentrations (10 per cent , and 12 per cent for medium light roast; 12 per cent , and 14 per cent for medium roast, respectively) (p < 0.05). Medium roast also increased HDL concentration by 7 per cent (p = 0.003). Compared with baseline, subjects had an increase of 21 per cent and 26 per cent in TAS, 13 per cent and 13 per cent in CAT, 52 per cent and 75 per cent in SOD, and 62 per cent and 49 per cent in GPx after medium light and medium roast consumption (p < 0.001), respectively. Both roasts increased soluble vascular cell adhesion molecule-1 (sVCAM-1) concentrations (18 per cent for medium light roast and 14 per cent for medium roast) (p < 0.05). Plasma fibrinogen concentration increased 8 per cent after medium roast intake (p = 0.01), and soluble E-selectin (sE-selectin) increased 12 per cent after medium light roast intake (p = 0.02). Although coffee beverages have increased total cholesterol and LDL levels, they were not related to elevation in total homocysteine, lipoprotein (a), and biomarkers of diabetes and lipid peroxidation. Conclusion: Moderate paper-filtered coffee consumption may have some undesirable impact on cardiovascular risk in healthy subjects regardless of its antioxidant content.

As células-tronco são capazes de se diferenciarem em praticamente todos os tipos celulares, podendo ser utilizadas em terapias de substituição em várias doenças. Células de linhagens hepáticas embrionárias e fetais pode ser uma fonte importante para a terapia celular em indivíduos com doenças hepáticas, pois possuem um alto índice de diferenciação em hepatócitos e células do ducto biliar. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial e o controle da resposta proliferativa de células do broto hepático de ratos Fischer 344 em cultura. A obtenção das células do broto hepático foi realizada nos períodos 12,5; 14,5 e 16,5 dias de gestação e os fragmentos foram cultivados em meio DMEM-F12. A caracterização morfológica foi realizada em microscopia invertida de luz e eletrônica de varredura. A caracterização dos marcadores de células mesenquimais, do citoesqueleto, progressão e fases do ciclo celular, morte celular, e do potencial elétrico mitocondrial foram realizadas por citometria de fluxo. A função bioquímica foi realizada pela análise das transaminases hepáticas e pela produção de radicais livres lipoperoxidados. Os resultados encontrados no acasalamento dos ratos isogênicos da linhagem Fischer 344 seguiu o protocolo de 12 h de luz, alcançando o índice reprodutivo satisfatório e reprodutível. O isolamento e separação do broto hepático desta linhagem de ratos permitiu a obtenção, expansão e caracterização de uma cultura primária nos diferentes dias de gestação 12,5; 14,5 e 16,5. Os aspectos morfológicos encontrados foram de células fusiformes do tipo fibroblast-like para todos os períodos de gestação em cultura. As análises das transaminases hepáticas TGO e TGP, mostraram se em concentrações menores no período 12,5 dias de gestação. A expressão dos marcadores de células-tronco de origem mesenquimais (CD90, Nanog, Oct ¾ e STRO1), marcadores do citoesqueleto (CK8, CK18 e Desmina), marcadores envolvidos na checagem e progressão do ciclo celular (P53, P21, P27 e Ciclina D1) e marcadores envolvidos na morte celular (Anexina V/PI, Caspase 3, Bax, Bad e Bcl2) mostraram diferencialmente expressos, nos diferentes períodos gestacionais. A análise do potencial elétrico mitocondrial nos períodos de gestação de 14,5 e 16,5 dias, foi maior na proporção de células inativas com menor capacidade funcional ou metabólica, quando comparada ao período de 12,5 dias ou mesmo em relação ao hepatócito normal de um rato adulto. Análise das fases do ciclo celular observou-se uma concentração de célula na fase G0/G1, repercutindo na modulação da capacidade de proliferação e aumento na proporção de células com DNA fragmentado, nas CBH no período de 16,5 dias em comparação aos demais períodos e ao hepatócito normal. O aumento da fragmentação do DNA em média de 3,5 e 2,3 vezes, respectivamente nos períodos de 12,5 e 14,5 dias de gestação. A capacidade de síntese e de divisão celular das CBH foi mantida em todos os períodos de gestação. Os radicais livres lipoperoxidados mostraram quantidades insignificantes em CBH nos diferentes dias de gestação. / Stem cells are able to differentiate into virtually all cell types and can be used in replacement therapies in various diseases. Cells of embryonic and fetal liver lines can be an important source for cell therapy in patients with liver disease because they have a high rate of differentiation into hepatocytes and biliary duct cells. The aim of this study was to evaluate the potential and control of the proliferative response of liver bud cells during the maturation of hepatocytes in culture. The acquirement of liver bud cells was performed for 12.5, 14.5 and 16.5 days of gestation and the fragments were cultured in DMEM-F12. Morphological characterization was performed on inverted light microscopy and scanning electron microscopy. The characterization of mesenchymal cell markers, cytoskeleton, and progression stages of the cell cycle, cell death and mitochondrial electric potential were performed by flow cytometry. The biochemical function was performed by analysis of liver transaminases and the production of free radicals lipoperoxidados. The results found in rats\' mating isogenic Fischer 344 followed the protocol of 12 hours of light reaching the reproductive rate satisfactory. The isolation and separation of the liver bud of this strain of mice allowed the isolation, expansion and characterization of a primary culture at different days of gestation, 12.5, 14.5 and 16.5 days. The morphological features were found of spindle cell type to fibroblast-like cells of the liver bud in culture. Analyses of hepatic transaminases GOT and GPT showed lower concentrations in the period 12.5 days of gestation. The expression of stem cell markers of mesenchymal origin (CD90, Nanog, Oct STRO1 and ¾), cytoskeletal markers (CK8, CK18 and desmin) markers involved in checking and cell cycle progression (P53, P21, P27 and Cyclin D1) and markers involved in apoptosis (Annexin V / PI, caspase 3, Bax, Bad and Bcl2) showed differentially expressed in different gestational periods. In the analysis of mitochondrial electrical potential in the gestation periods of 14.5 and 16.5 days, it was observed the higher proportion of quiescent cells with lower metabolic of functional capacity when compared to the periodo of 12.5 days or even compared to a normal hepatocyte adult rat. In the analysis of cell cycle phases it was observed the concentration of cell in the G0/G1 phase, resulting in modulation of proliferation capacity and the increase in the proportion of cells with fragmented DNA, CBH in the period 16.5 days compared to other periods and the normal hepatocyte. The increase of DNA fragmentation on average 3.5 and 2.3 times respectively in the periods of 12.5 and 14.5 days of gestation. The synthesis and cellular division of CBH was maintained in all stages of pregnancy. The free radicals lipoperoxidados showed insignificant amounts of CBH in the days of gestation.