O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, que tem, como hospedeiros definitivos, os canídeos, e, como hospedeiros intermediários mais comuns, ungulados domésticos e o homem. Este parasito é o agente etiológico da hidatidose cística, zoonose hiperendêmica no Cone Sul da América do Sul, incluindo o sul do Brasil. Para o estabelecimento e manutenção do cisto hidático por longos períodos de tempo (infecção crônica), o parasito secreta e expõe ao seu hospedeiro numerosas proteínas, que podem apresentar tanto atividade imunomoduladora, como estar relacionadas a atividades fisiológicas do parasito. As proteínas 14-3-3 constituem uma família altamente conservada de moléculas reguladoras eucarióticas, que são capazes de interagir com diferentes proteínas ligantes em diversos contextos celulares, regulando funções biológicas complexas. Em E. granulosus, foram identificadas cinco proteínas 14-3-3, sendo três isoformas ζ e duas isoformas ε. Essas proteínas podem estar envolvidas em interações parasito-hospedeiro que propiciam o estabelecimento e o desenvolvimento da forma larval patogênica (metacestódeo). Para a futura caracterização funcional da proteína 14-3-3e1 de E. granulousus (Eg14-3-3ε1), já detectada em componentes do metacestódeo, a sua sequência codificadora foi expressada em Escherichia coli. A clonagem foi realizada em dois vetores plasmidiais distintos (pGEX-TEV e pET-26b), para permitir a expressão em E. coli da proteína Eg14-3-3ε1 recombinante no citoplasma, em fusão com a GST, e no espaço periplásmatico, com cauda de histidina, respectivamente. A solubilização da Eg14-3-3ε1 em fusão com a GST foi obtida com 0,5% de sarcosil, mas no entanto não foi possível a sua purificação. A proteína Eg14-3-3ε1 com cauda de histidina foi obtida por extração da fração periplasmática seguida da purificação por cromatografia de afinidade, tendo sido obtido um rendimento final de 0,5 mg/l de cultura. A proteína Eg14-3-3ε1 recombinante purificada será futuramente utilizada em ensaios funcionais, buscando inicialmente a identificação de seus ligantes proteicos dentre o repertório de proteínas do parasito e do hospedeiro, no contexto da infecção crônica. / Echinococcus granulosus is a parasitc platyhelminth of the Cestoda class, wich has, canids as definitive hosts, domestic ungulates and humans as intermediate hosts. This parasite is the causative agent of cystic hydatid disease, a hyperendemic zoonosis in the Southern Cone of South America, including Southern Brazil. In order to the establishment and maintenance of hydatid cyst for a long period of time, the parasite secrets and exposes to its host numerous proteins, which may have immunomodulatory activity as well to be related to physiological activities of the parasite. The 14-3-3 proteins are a family of highly conserved eukaryotic regulatory molecules that are able to interact with different partner proteins in different cellular contexts, regulating complex biological functions. In E. granulosus five 14-3-3 proteins have been identified, three ζ isoform and two ε isoform. These proteins may be involved in host-parasite interactions that favor the establishment and growth of the pathogenic larval form (metacestode). For future functional characterization of the 14-3-3ε1 protein from E. granulousus (Eg14-3-3ε1) previously detected in metacestode components, its coding sequence was expressed in Escherichia coli. The cloning was done into two different plasmid vectors (pGEX-TEV and pET-26b), to produce recombinant Eg14-3-3ε1 protein in E. coli, in the cytoplasm, in fusion with GST, and periplasmatic with histidine tail, respectively. Solubilization of Eg14-3-3ε1 fused with GST was achieved with 0.5% sarcosil, yet it was not possible to purify it. The Eg14-3-3ε1 protein with histidine tail was obtained by extracting the periplasmic fraction from E. coli cultures, followed of purification by affinity chromatography, yielding 0.5 mg/l. The recombinant Eg14-3-3ε1 protein will be used in functional assays, initially aiming at the identification of protein ligands from the repertoire of proteins from the parasite and from host in the context of chronic infection.

Antibacterial agents are composed of a diverse group and many such agents have entered common usage through experience with little information on their mechanism of action. Study of the mechanism of action of an antimicrobial agent provides an insight into resistance mechanisms, toxicological problems and the design and development of new agents or combinations. The primary target of most antimicrobial agents (excluding antibiotics) is the cytoplasmic membrane and associated enzymes. Membrane-active agents can cause a change in the fluidity and/or permeability of the cytoplasmic membrane. Such changes can be determined by the leakage of cellular constituents such as potassium ions, nucleotides and their constituents and amino acids. The effect of an anti bacterial agent on the cytoplasmic membrane can also be determined by elucidating the effect of the antibacterial agent on the activity of membrane-bound enzymes and substrate uptake.

As plantas possuem um arsenal de substâncias utilizadas como defesa contra patógenos e predadores. A possibilidade de utilizar tais substâncias como biopesticidas revolucionou o estudo das proteínas tóxicas. Proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) e as ureases estão entre as proteínas que são abundantes em plantas. RIPs tipo 2 como a ricina, são muito tóxicas, e podem despurinar ribossomos de várias espécies e induzir lesão em DNA, levando à interrupção da síntese protéica e morte de células. Menos tóxicas que a ricina, a maior parte das RIPs conhecidas são do tipo 1 com apenas uma cadeia polipeptídica de 25 - 32 kDa. As ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas dependentes de níquel, que catalisam a hidrólise da uréia para formar amônia e dióxido de carbono. A semente do feijão-de-porco, Canavalia ensiformis, é fonte rica de isoformas de urease, entre elas, a canatoxina (CNTX). A proteína CNTX apresenta atividade inseticida contra diferentes espécies de insetos, e sua toxicidade depende da liberação de um peptídeo interno de 10kDa (pepcanatox), que ocorre por ação das catepsinas do sistema digestivo dos insetos suscetíveis. Um peptídeo equivalente ao pepcanatox foi obtido por expressão heteróloga em Escherichia coli - Jaburetox-2Ec, o qual apresentou atividade tóxica contra Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus e Blatella germanica. Nesse trabalho demonstramos a atividade inseticida de cinco RIPs tipo 1 (PAP-S, gelonina, momordina, saporina-S6 e licnina) em Spodoptera frugiperda e Anticarsia gemmatalis. As RIPs mostraram um efeito entomotóxico espécie-específico para as lagartas, sendo que momordina foi a menos tóxica nos bioensaios. Perda de peso mais pronunciada foi observada em S. frugiperda no 4° dia após o início dos ensaios e para a A. gemmatalis, no 10° dia. A indução da mortalidade (larval e/ou pupal) foi de 57,13% para os tratamentos em A. gemmatalis e 29,45% para S. frugiperda. Para investigar o efeito deterrente de RIPs tipo 1 em insetos, verificou-se, através do teste cometa, o nível de danos ao DNA em tecidos de S. frugiperda e A. gemmatalis que ingeriram um total de 40 μg de RIPs. Os insetos tratados com RIPs mostraram um valor 2 a 3 vezes maior de células com sinais de dano de DNA do que o controle. O dano de DNA poderia ser conseqüência do estresse oxidativo, assim analisou-se atividade de enzimas antioxidantes CAT e SOD e níveis de peroxidação lipídica (TBARS) nos extratos celulares dos insetos, mas não houve uma correlação entre dano de DNA e marcadores de estresse oxidativo. O peptídeo recombinante derivado de urease, jaburetox-2Ec, induziu uma mortalidade de 100% de S. frugiperda após ingestão de 47μg do peptídeo. Em contraste com os dados obtidos com as RIPs, o jaburetox-2Ec não causou lesões no DNA ou alterações em marcadores do balanço redox em S. frugiperda evidenciando um mecanismo de ação distinto. Em linhagens de células de insetos em cultura (Tn5B e UFL-AG-286), a análise citomorfológica sugeriu a ocorrência de citotoxicidade e lise celular com exposição a 80 e 10 μg do jaburetox-2Ec, após 4 e 7 dias de incubação, respectivamente. Para compreender a ação do peptídeo entomotóxico em células de insetos, realizou-se testes de citotoxicidade utilizando o kit CyTotox-GloP TM P incubando-se células UFL-AG-286 e Sf21 com jaburetox-2Ec. Os resultados com esse kit não foram conclusivos, sugerindo que o peptídeo recombinante seria capaz de inibir as proteases intracelulares liberadas na lise celular. Nossos resultados mostraram que RIPs tipo 1 e o jaburetox-2Ec têm efeito inseticida em lepidópteros por mecanismos distintos, sendo que as RIPs tipo 1 induzem lesão de DNA em A. gemmatalis e S. frugiperda, enquanto que jaburetox-2Ec induz alterações ainda não identificadas, que resultam em morte do inseto. / The plants have an arsenal of substances used as a defense against pathogens and predators. The possibility of using these substances as biopesticides revolutionized the study of toxic proteins. Ribosomes-inactivating proteins (RIPs) and ureases are among the proteins that are abundant in plants. Type 2 RIPS, such as ricin, are highly toxic and depurinate ribosomes of different species and induce DNA damage, arresting protein synthesis and leading to cell death. Less toxic, most of the known RIPs are type 1, composed of a single polypeptide chain of 25-32 kDa. Ureases (EC 3.5.1.5) are nickel dependent metalloenzymes that catalyze the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide. The seed of jackbean (Canavalia ensiformis) is a rich source of ureases isoforms, one of which is canatoxin (CNTX). The protein CNTX presents insecticidal activity and its toxicity relies on an internal ~10 kDa peptide (pepcanatox) released upon hydrolysis of CNTX by digestive cathepsins of susceptible insects. A peptide equivalent to pepcanatox obtained by heterologous expression in Escherichia coli - Jaburetox-2EC, showed insecticidal activity against Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus and Blatella germanica. In this study we demonstrated the insecticidal activity of five type 1 RIPs (PAP-S, gelonin, momordin, saporin-S6 and lychnin) in Spodoptera frugiperda and Anticarsia gemmatalis. The entomotoxic effect of RIPs was species-specific and momordin was shown to be the less toxic in the bioassays. S. frugiperda had a more pronounced weight loss on the 4th day of treatment and A. gemmatalis on the 10th day. Mortality (larval and/or pupal) rate reached 57.13% for A. gemmatalis and 29.45% for S. frugiperda. To investigate the deterrent effect of type 1 RIPs in insects, the levels of DNA damage were evaluated using the comet test in tissues homogenates of S. frugiperda and A. gemmatalis fed a total of 40μg of RIPs. The RIPs-treated insects showed 2 to 3 times more cells with DNA damage, as compared to controls. To test whether DNA damage could be consequent to oxidative stress, the activity of the antioxidant enzymes SOD and CAT and levels of lipid peroxidation (TBARS) were assayed in cellular extracts of S. frugiperda and A. gemmatalis fed 40 μg RIPs, but no correlations were found between DNA damage and stress markers. The urease-derived recombinant peptide, jaburetox-2Ec, induced 100% mortality of S. frugiperda fed 47 μg peptide. In contrast to the results observed for type 1 RIPs, treatment of S. frugiperda with jaburetox-2Ec did not cause damage in DNA nor modifications in redox balance markers, indicating a distinct mechanism of action. Microscopic analysis of lepidopteran insect cells in culture (lines Tn5B and UFL-AG-286) suggested cytotoxicity and cell lysis induced by incubation with 80 and 10 μg jaburetox- 2Ec, after 4 and 7 days, respectively. Aiming to understand the mode of action of the entomotoxic peptide in insects cells, the CyTotox-GloP TM Pkit was used to detect cytotoxicity in UFL-AG-286 and Sf21 cells incubated with jaburetox-2Ec. Unexpectedly, the results were not conclusive since it appears that the recombinant peptide is able to inhibit the intracellular proteases released upon cell lysis, preventing the hydrolysis of fluorogenic substrate used in the kit. In conclusion, our results demonstrated that type 1 RIPs and jaburetox-2Ec are insecticidal to lepidopterans acting through distinct mechanisms. Thus type 1 RIPs induce DNA damage in A. gemmatalis and S. frugiperda, while jaburetox-2Ec induce yet to be identified physiological changes that lead to insect death.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2013-07-16T01:57:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O [receptor B1] para as [cininas] está normalmente ausente em condições fisiológicas, sendo expresso em processos inflamatórios ou infecciosos. Este estudo avaliou alguns dos mecanismos envolvidos na indução do receptor B1 após o tratamento com o [lipopolissacarídeo] de E. Coli (LPS) na pata de rato. A injeção do agonista seletivo dos receptores B1, a [des-Arg9-bradicinina] (DABK), produziu [edema] de baixa intensidade na pata de ratos normais, enquanto o pré-tratamento local com LPS causou aumento tempo-dependente do edema à DABK, da ativação do [fator nuclear-kB] (NF-kB) e da expressão do RNAm para o receptor B1. Os inibidores de síntese protéica, cicloheximida ou dexametasona, ou da ativação do NF-kB, PDTC ou TLCK, reduziram significativamente a resposta edematogênica à DABK nos animais tratados com LPS. O edema à DABK também foi inibido de forma significativa pelos anticorpos anti-IL-1b ou anti-TNF-a, pela IL-10 ou pelo antagonista do receptor de IL-1, IRA. A indução dos receptores B1 pelo LPS foi acompanhada por um aumento marcante dos níveis de IL-1b e TNF-a, da expressão da sintase do óxido nítrico induzida (iNOS) e da migração de [neutrófilos]. Os inibidores da migração celular, fucoidina ou anticorpo anti-CD18, o antagonista de PAF WEB 2086 ou o anticorpo anti-PMN também reduziram significativamente o edema mediado pelos receptores B1. Por fim, os inibidores de NOS, L-NOARG, aminoguanidina e 1400W também inibiram marcadamente o edema à DABK. Estes dados sugerem que a produção de [citocinas] e de óxido nítrico, a ativação do NF-kB e o influxo de neutrófilos são eventos importantes para a indução dos receptores B1 após o tratamento com LPS.

CARVALHO, Fátima Cristiane Teles de. Influências exôgenas na qualidade bacteriológica da água, solo e camarão (Litopenaeus vannamei), em quatro fazendas de camarão do Estado do Ceará. 2006. 87 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Marinhas Tropicais) - Universidade Federal do Ceará, Instituto de Ciências do Mar, Fortaleza, 2006. / Submitted by Debora Oliveira (deby_borboletinha@hotmail.com) on 2011-11-25T15:28:55Z No. of bitstreams: 1 2006_dis_fctdcarvalho.pdf: 1074909 bytes, checksum: 70a95311bb90d6fa8060cd66892f0469 (MD5) / Approved for entry into archive by Nadsa Cid(nadsa@ufc.br) on 2011-12-02T19:19:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_dis_fctdcarvalho.pdf: 1074909 bytes, checksum: 70a95311bb90d6fa8060cd66892f0469 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-12-02T19:19:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_dis_fctdcarvalho.pdf: 1074909 bytes, checksum: 70a95311bb90d6fa8060cd66892f0469 (MD5) Previous issue date: 2006 / The objective of the present study was to evaluate the influence of the environment upon marine shrimp farming with regard to bacteriological quality of the water, pond sediments and livestock (Litopenaeus vannamei). The study was carried out on four shrimp farms in Ceará (1, 2, 3 and 4). Of the eight samplings performed, 3 involved water (one outside the farm-PEX, one at the pumping site-PB, and one in the pond-PV); 3 involved sediment (at locations PEX, PB and PV), and two consisted of harvested and processed shrimp. Samplings Were carried out in different seasons (dry, intermediary and rainy) and totaled 288 individual samples (108 water; 108 sediment; 72 shrimp). The most probable numbers (MPN) of total coliforms (TC), fecal coliforms (FC) and Escherichia coli were determined and samples were investigated for Salmonella strains. The bacteriological contamination observed on the shrimp farms was predominantly caused by TC and FC and was most intense during the intermediary season. Farms 2 and 4 yielded the highest concentrations of FC in water and sediment, respectively, at sampling locations PEX and PB during the three seasons. No shrimp sample presented E. coli values above those permitted by the European Commission (EU). However, on account of the Salmonella values observed, Farms 2 and 4 would be barred from exporting shrimp to the EU. In addition, water sampled at Farm 3 contained Salmonella strains capable of infecting the livestock. Only Farm 1 presented an exogenous and endogenous environment free of fecal contamination. The presence of Salmonella and E. coli in water and shrimp samples is disquieting, considering the fact that theses pathogens are of fecal origin and that their natural habitat is the intestinal tract of warm-blooded animals. / O presente estudo teve por objetivo pesquisar a influência do meio exógeno à carcinicultura na qualidade bacteriológica da água, sedimento dos viveiros e no camarão de cultivo (Litopenaeus vannamei). Foram realizadas oito coletas em quatro Fazendas 1, 2, 3 e 4, sendo três de água (ponto externo-PEX, ponto de bombeamento-PB e viveiro-PV) e três de sedimento (PEX, PB e PV) e duas amostras de camarão (despescado e processado). As coletas foram realizadas em diferentes períodos sazonais (seco, intermediário e chuvoso), perfazendo um total de 288 amostras, sendo 108 de água, 108 de sedimento e 72 de camarão. Foi determinado o Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais (CT), fecais (CF), e de Escherichia coli, além da pesquisa e identificação de Salmonella. Os resultados mostram que a contaminação microbiológica das fazendas é feita predominantemente por CT e CF, com maior intensidade na estação intermediária. As Fazendas que apresentaram valores mais elevados de CF nas três estações foram as Fazendas 2 (PEX e PB) e 4 (PEX e PB) nas amostras de água e sedimento, respectivamente. Nenhuma amostra de camarão, das fazendas, apresentou valores acima do permitido para E. coli pela Comissão Européia (CE). Porém se o parâmetro considerado for a presença de Salmonella, as Fazendas 4 e 2 não estariam habilitadas a exportar os crustáceos para países da União da Comunidade Européia. E ainda, das águas da fazenda 3 também foram isoladas Salmonella o que facilmente poderia contaminar os camarões cultivados. Dentre as quatro fazendas, somente a Fazenda 1, não apresentou ambiente endógeno e exógeno contaminado com material fecal. A detecção de Salmonella e a presença de E. coli nas amostras de água e camarão é preocupante, uma vez que estes patógenos são de origem fecal e seu habitat é o trato intestinal dos animais de sangue quente e pecilotérmicos.

SANTOS, A. K. S. Diagnóstico molecular e caracterização dos genes de virulência de infecção por Escherichia coli enteropatogênica em crianças no Semiárido Brasileiro. 2015. 110 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Carolinda Oliveira (ppgmm@ufc.br) on 2017-07-11T12:40:12Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_aksdossantos.pdf: 2114374 bytes, checksum: 97c602dc080778ec9538704944699720 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2017-07-11T13:49:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_aksdossantos.pdf: 2114374 bytes, checksum: 97c602dc080778ec9538704944699720 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-11T13:49:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_aksdossantos.pdf: 2114374 bytes, checksum: 97c602dc080778ec9538704944699720 (MD5) Previous issue date: 2015-07-13 / The Escherichia coli diarrheagenic (DEC) are important pathogens associated with intestinal infections. Among these, Escherichia coli (EPEC) is one of the most important etiological agents for the diagnosis of diarrhea in infantos. However, the epidemiology of infections by these pathogens remain poorly elucidated in much of the world, so this study aimed to evaluate the impact of EPEC infection in children with and without diarrhea 2-36 months of life of the Brazilian semiarid, study type observational case-control, which also examined the presence or absence of diarrhea in children participating. The study population consisted of 365 cases and 365 controls, and the cases, children with diarrhea history in the 14 days before you check for the study. Socioeconomic parameters were evaluated through epidemiological questionnaire. The diagnosis of EPEC was carried out by xMAP (Bioplex 200) based on the eaeA genes (chromosomal) and bfpA (plasmid). Samples identified as EPEC were analyzed for five Polymerase Chain Reactions (PCR) of the Multiplex type for 19 EPEC virulence factors widely investigated in literature: espB, espD, tir, espC, espZ, espL, Ler, Map, espG, espH, nleE, nleF, nleB, paa, nleC, nleD, espJ, cesT and espP. Among the 730 children, EPEC was diagnosed in 118 children. The typical EPEC proved in 1.7% of cases (6/365) and 0.6% of controls (2/635). While atypical EPEC was detected in 13.7% of cases (50/365) and 16.4% of controls (60/365). And all samples isolated EPEC genes read, cest, and espB were the most prevalent (67.7%; 58.4%; 54.2% and 52.5%) respectively. These are associated with the global regulation of pathogenicity island bacteria, as well as the secretion and translocation various effector proteins into the host cell, and microtubule destruction and disruption tight junctions. In contrast, the lowest prevalence of the tir gene was (4,2% - 5/118), an important component of bacterial adhesion to host cell. The prevalence of the espD gene, associated with liposaccharide membrane pore translocation protein, was significantly associated with cases (p = 0.0354) as compared to controls. In the hierarchical combination analysis of the virulence genes the data suggest that three groups of genes were important and associated with the cases compared to the controls. The presence of the Paa gene, related to the protein associated with enterocyte adhesion injury, but in the absence of other virulence genes such as espH, espJ and espG, related to actin polymerization, inhibition of phagocytosis and effector translocation blocker T3SS , Respectively, are associated with cases compared to controls. A set of virulence genes, the presence of espJ and in the absence of nleF. And another set of virulence genes, with presence of espC, and in the absence of espP. The data also showed that in the hierarchical combinations of the virulence genes, such as the presence of espP and in the absence of nleF, as well as the presence of espG and in the absence of tir were associated with protection in the controls compared to the cases. The data suggest that the prevalence of EPEC is relatively high in this child population in the Brazilian semi-arid region. / As cepas Escherichia coli diarreiogênicas (DEC) são importantes patógenos associados às infecções intestinais. Dentre estes, a Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um dos agentes etiológicos mais relevantes para o diagnóstico de diarreias em infantos. Contudo a epidemiologia das infecções por esses patógenos permanecem pouco elucidadas em grande parte do mundo. Este trabalho objetivou avaliar o impacto da infecção por EPEC em crianças com e sem diarreia de 2-36 meses de vida no Semiárido Brasileiro, em estudo do tipo observacional caso-controle, que também examinou a presença ou ausência de diarreia nas crianças participantes. A população estudada consistiu em 730 crianças, 365 casos e 365 controles, sendo os casos, crianças com histórico de diarreia nos 14 dias antes à seleção para o estudo. Foram avaliados parâmetros socioeconômicos através de questionário epidemiológico. O diagnóstico de EPEC foi realizado pela técnica de xMAP (Bioplex 200) com base nos genes eaeA (cromossomal) e bfpA (plasmidial). As amostras identificadas como EPEC foram analisadas por cinco Reações em Cadeia da Polimerase (PCR) do tipo Multiplex para 19 fatores de virulência de EPEC amplamente investigados na literatura: espB, espD, tir, espC, espZ, espL, Ler, Map, espG, espH, nleE, nleF, nleB, paa, nleC, nleD, espJ, cesT e espP. Entre as 730 crianças, a EPEC foi diagnosticada em 118 crianças. A EPEC típica mostrou-se em 1,7% dos casos (6/365) e em 0,6% dos controles (2/635). Enquanto a EPEC atípica foi detectado em 13,7% dos casos (50/365) e 16,4% dos controles (60/365). E de todas as amostras de EPEC isoladas, os genes ler, cesT, espB e espG foram os mais prevalentes (67,7%; 58,4%; 54,2%; e 52,5%), respectivamente. Estes estão associados com a regulação global da ilha de patogenicidade da bactéria, assim como a secreção e a translocação de diversas proteínas efetoras para dentro da célula do hospedeiro, e a destruição de micro túbulos e ruptura das junções firmes entre as células intestinais. Em contrapartida, o gene de menor prevalência foi o tir (4,2% - 5/118), importante componente para a aderência bacteriana a célula do hospedeiro. A prevalência do gene espD, associado com a proteína de translocação dos poros da membrana de lipossacarídeo, foi significativamente associado com os casos (p=0,0354) quando comparados com os controles. Na análise de combinação hierárquica dos genes de virulência os dados sugerem que três grupos de genes que foram importantes e associados com os casos comparados com os controles. A presença do gene Paa, relacionado com a proteína associado a lesão de aderência do enterócito, mas na ausência de outros genes de virulência como o espH, espJ e espG, relacionados com polimerização de actina, inibição de fagocitose e bloqueador de translocação de efetor T3SS, respectivamente, estão associados com os casos comparados com os controles. Um conjunto de genes de virulência, a presença de espJ e na ausência de nleF. E outro conjunto de genes de virulência, com presença de espC, e na ausência de espP. Os dados mostraram também que nas combinações hierárquicas dos genes de virulência, tais como a presença de espJ e na ausência de nleF, bem como a presença de espG e na ausência de tir foram associados com proteção nos controles comparados com os casos. Os dados sugerem que a prevalência de EPEC é relativamente alta nesta população infantil no semiárido brasileiro.

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente, em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, cujo sequenciamento completo do genoma a capacita como um interessante modelo para o estudo da regulação da FBN. No genoma de P. riograndensis foram identificados três agrupamentos contendo genes relacionados à FBN. Um deles, com uma organização estrutural menos conservada, foi considerado inativo a partir de análises de PCR em tempo real e de atividade de promotor. Os outros dois tiveram seus transcritos identificados e induzidos sob condições de fixação de nitrogênio, sendo um deles responsável pela codificação de um sistema alternativo da nitrogenase, independente de molibdênio. Esse sistema alternativo foi identificado como sendo aquele composto apenas por ferro e validado tanto pela análise das sequências dos genes estruturais, como pela atividade enzimática em meio sem molibdênio. Sequências localizadas a aproximadamente 250 pares de bases (pb) a montante do início da tradução dos primeiros genes dos dois agrupamentos funcionais também tiveram suas atividades como regiões reguladoras validadas pelo reconhecimento em Escherichia coli, com um provável padrão de iniciação da transcrição constitutivo. Uma menor atividade de transcrição foi observada no fragmento de 500 pb localizado a montante do agrupamento dos genes da nitrogenase alternativa, indicando a presença de regiões contendo motivos de regulação negativa do processo. Investigações mais detalhadas dessas sequências podem revelar padrões inéditos para a regulação da FBN em bactérias Gram-positivas, em geral, e em P. riograndensis, em particular. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gramnegative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis is a Gram-positive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. In P. riograndensis genome three cluster comprising BNF related genes were identified. One of them, displaying a less conserved structural organization, was stated as inactive from real time PCR and promoter activity analysis. The other ones had their transcripts identified and responded to nitrogen fixation conditions. One of the active clusters comprises genes coding for an alternative nitrogenase system independent of molybdenum, the iron-only system. This alternative system was validated by enzymatic activity under Mo-depleted conditions. Sequences 250 base pairs (bp) upstream from the first open reading frame (ORF) of each active cluster had their promoter activities validated by recognizing in Escherichia coli, showing a probable constitutive expression pattern. A weaker promoter activity was identified in a fragment 500 bp upstream of the first ORF from the alternative cluster, suggesting the presence of a negative regulation motif. Future investigations may provide us with new patterns of BNF regulation in Gram-positive bacteria, in general, and in P. riograndensis in particular.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) compreende uma das seis categorias diarreiogênicas da espécie. Atualmente, ela é dividida em duas subcategorias, EPEC típica (tEPEC) e EPEC atípica (aEPEC), tendo por base a presença do plasmídio EAF (EPEC adherence factor), que só ocorre entre as tEPEC. As EPEC promovem, no epitélio intestinal, a lesão attaching and effacing (A/E), cujos determinantes genéticos estão localizados em uma ilha de patogenicidade denominada região LEE (locus of enterocyte effacement). Um dos genes presentes nessa região, o gene eae, codifica uma proteína de membrana externa (intimina) responsável pela aderência íntima às células intestinais, observada na lesão A/E. Uma característica fenotípica marcante das tEPEC é a produção do padrão de adesão localizada (AL), no qual são observadas microcolônias bacterianas compactas sobre células HeLa e HEp-2, após 3 horas de contato. O padrão AL está associado com a expressão da fímbria denominada bundle-forming pilus (BFP), que é codificada pelo plasmídio EAF e promove agregação bactéria-bactéria, dentro das microcolônias, bem como a interação inicial, que precede a aderência íntima mediada por intimina. Por outro lado, a maioria das aEPEC promove a formação de microcolônias mais frouxas, após ensaios mais prolongados (ensaios de 6 horas), o que caracteriza a chamada adesão semelhante à AL (AL-like). Durante um estudo anterior, sobre o potencial de virulência de 59 amostras de aEPEC, foi observado que 9 delas produziam AL típica (em 6 horas), mesmo na ausência de BFP. Após um amplo estudo das suas características fenotipicas e genotipicas, uma amostra (1551-2) foi selecionada para a identificação da estrutura responsável pela formação de microcolônias compactas. Ensaios de microscopia eletrônica revelaram que o padrão AL da amostra 1551-2 refletia bactérias internalizadas e que um mutante não-polar em eae (1551-2:eae- ), perdia essa propriedade, embora continuasse aderindo de forma difusa (AD). O seqüenciamento da região variável do gene eae revelou que a intimina da amostra 1551-2 pertence ao subtipo omicron (ο). Para caracterizar a adesina responsável pela AD no mutante 1551-2:eae- , foram obtidos mutantes não aderentes utilizando-se o transposon Mini-Tn10. Um desses mutantes foi empregado para a absorção de um soro produzido com a amostra 1551- 2:eae- Esse soro foi capaz de inibir a adesão da amostra 1551-2:eae- a células HeLa e, em ensaios de immunoblot, revelou uma banda de aproximadamente 25 kDa. Podemos concluir que o padrão AL da amostra 1551-2 reflete um processo de internalização provavelmente mediado por intimina, e que novos fatores de virulência, possivelmente uma proteína de ~25 kDa, poderiam desempenhar importante papel na interação de amostras de aEPEC in vitro. / Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) comprise one of the 6 diarrheagenic categories of the species. Presently, it is sub-grouped into two sub-categories, typical EPEC (tEPEC) and atypical EPEC (aEPEC), based on the presence of the EAF (EPEC adherence factor) plasmid, which occurs only in tEPEC. EPEC promote, in the intestinal epithelium, an attaching and effacing lesion (A/E) whose genetic determinants are located in a pathogenicity island named LEE (locus of enterocyte effacement). One of the LEE genes, the eae gene, encodes an outer membrane protein (intimin), which is responsible for the intimate adherence to the intestinal cells, observed in the A/E lesions. A marked phenotypic characteristic of tEPEC is the production of the localized pattern of adherence (LA), where compact bacterial microcolonies are detected on HeLa and HEp-2 cells, after 3 hours of contact. The LA pattern is associated with the expression of the bundle-forming pilus (BFP), which is encoded on the EAF plasmid and promotes bacterium-bacterium aggregation within the microcolonies as well as the initial interaction that precedes the intimate adherence by intimin. On the other hand, most aEPEC form microcolonies looser than those seen in LA, after more prolonged assays (6 h assays), a phenotype that characterizes the so called LA-like pattern of adherence. During a previous study on the virulence potential of 59 strains of aEPEC, it was observed that 9 of them produced typical LA, even in the absence of BFP. After an ample analysis of their phenotypic and genotypic characteristics, one strain (1551-2) was selected for the identification of the structure responsible for compact microcolony formation in this strain. Electron microscopy assays have revealed that the LA pattern of strain 1551-2 reflected, in fact, internalized bacteria, and that a non-polar mutant in eae (1551-2:eae- ), had lost this property but maintained a strong diffuse adherence. Sequencing experiments of the variable region of the 1551-2 intimin molecule revealed that it corresponds to intimin subtype omicron (ο). To further characterize the adhesin responsible for the diffuse adherence phenotype in strain 1551-2:eae- , non-adherent mutants were obtained by transposon mutagenesis with Mini-Tn10. One of these non-adherent mutants was then used to absorb an antiserum produced against strain 1551-2:eae- . This absorbed antiserum inhibited the diffuse adherence of strain 1551-2:eae- to HeLa cells and, in immunoblot experiments, it has revealed a protein band of approximately 25kDa. From the data presented in this study, it is possible to conclude that the LA phenotype of aEPEC strain 1551-2 comprises, rather, an internalization process probably mediated by intimin, and that novel virulence factors, possibly a ~25 kDa protein, could play an important role in the interaction of aEPEC strains in vitro. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:54Z : No. of bitstreams: 1 Publico-115.pdf: 983090 bytes, checksum: 7f674d882f7cc66c5e1e6fe6b081c85c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior e Programa Brasil Alemanha / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Escherichia coli Enteropatogênica (EPEC) produz lesão attaching/effacing (A/E) em células eucarióticas mediada pela adesina de membrana externa intimina. EPEC são sub-agrupadas em típica (tEPEC) e atípica (aEPEC). Recentemente demonstramos que a amostra de aEPEC 1551-2 (sorotipo O não-tipável, não-móvel) invade células HeLa por um processo dependente da expressão de intimina do subtipo omicron. Neste estudo, avaliamos se amostras de aEPEC expressando diferentes subtipos de intimina também são invasoras utilizando ensaios quantitativos de proteção com gentamicina. Também avaliamos se aEPECs invadem células intestinais diferenciadas T84 e Caco-2. Cinco das seis amostras testadas invadiram células HeLa e T84 numa faixa de 13.3%-20.9% e 5.8%-17.8%, respectivamente, do total de bactérias associadas às células. As amostras estudadas foram significantemente mais invasoras que a amostra protótipo de tEPEC E2348/69 (1.4% e 0.5% em células HeLa e T84, respectivamente). A amostra 1551-2 foi ainda testada em células Caco-2 diferenciadas, o que resultou num índice de invasão semelhante àqueles obtidos em células T84 (7,5%±1,7) e também significantemente maior que a tEPEC E2348/69 (1,8%±0,6). A invasão de células T84 foi confirmada por microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos ainda que a invasão de células HeLa por aEPEC 1551-2 depende de filamentos de actina, mas não de microtúbulos. Além disso, a infecção de monocamadas não diferenciadas e o rompimento das tight junctions aumentaram a eficiência da invasão de células T84, sugerindo uma via de invasão preferencial pela superfície não diferenciada. Em resumo, amostras de aEPEC podem invadir cultura de células in vitro com eficiência variável e independentemente de subtipo de intimina. / Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) produce attaching/effacing (A/E) lesions on eukaryotic cells mediated by the outer membrane adhesin Intimin. EPEC are subgrouped into typical (tEPEC) and atypical (aEPEC). We have recently demonstrated that aEPEC strain 1551-2 (serotype O non-typable, non-motile) invades HeLa cells by a process dependent on the expression of intimin subtype omicron. In this study, we evaluated whether aEPEC strains expressing other intimin subtypes are also invasive using the quantitative gentamicin protection assay. We also evaluated whether aEPEC invade intestinal differentiated T84 cells. Five of six strains invaded HeLa and T84 cells in a range of 13.3%-20.9% and 5.8%-17.8%, respectively, of the total cellassociated bacteria. The strains studied were significantly more invasive than prototype tEPEC strain E2348/69 (1.4% and 0.5% in HeLa and T84 cells, respectively). aEPEC strain 1551-2 was also tested in differentiated Caco-2 cells, resulting in an invasion index similar to that obtained in T84 cells (7.5%±1.7%). This strain was also significantly more invasive than prototype tEPEC strain E2348/69 (1.8%±0.6%). Invasiveness of T84 cells was confirmed by transmission electron microscopy. We also showed that invasion of HeLa cells by aEPEC 1551-2 depended on actin filaments, but not on microtubules. In addition, infection of non-differentiated monolayers and disruption of tight junctions enhanced its invasion efficiency in T84 cells, suggesting preferential invasion via a non-differentiated surface. In summary, aEPEC strains may invade intestinal cells in vitro with varying efficiencies and independently of the intimin subtype. / CAPES - Probral: 281/07 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

PRATA, Mara de Moura Gondim. Avaliação dos mecanismos de proliferação e tipos de morte celular na lesão induzida pela Escherichia coli enteroagregativa e sua modulação por alanil-glutamina e betacaroteno. 2013. 122 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-01-24T12:17:24Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_mmgprata.pdf: 4389191 bytes, checksum: 4ea88bc81357c4bd79732d4483ceb88a (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-01-24T12:17:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_mmgprata.pdf: 4389191 bytes, checksum: 4ea88bc81357c4bd79732d4483ceb88a (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-24T12:17:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_mmgprata.pdf: 4389191 bytes, checksum: 4ea88bc81357c4bd79732d4483ceb88a (MD5) Previous issue date: 2013 / Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is among the most important agents associated with persistent diarrhea (DP) and was prevalent in studies in children in poor communities in the city of Fortaleza. EAEC cause intestinal injury and inflammation leading to DP and, when combined with malnutrition, can cause a cognitive deficit and infant growth impairment. The current study examined in vitro (IEC-6 and HEp-2) intestinal pathophysiology of three strains: EAEC wild type, EAEC 042 (positive control) and non-pathogenic E.coli HS as well as the role of alanyl-glutamine (AG) and beta-carotene in the mechanisms of proliferation, apoptosis and necrosis in response to the injury caused by EAEC strains. The wild type strain was isolated from a malnourished child. Intestinal cells viability assay in showed a significant reduction (p<0.05) after post-infection with EAEC strains at concentrations of 105UFC/mL in 12, 24 and 48 hours. However, the E.coli HS only changed the intestinal cell viability after 48 hours. EAEC post-infected intestinal cells presented mRNA transcription decrease (p<0.05) of c-jun and c-fos at the period of zero, 6 and 12 hours after infection was terminated, but E.coli HS showed this decrease only after 12h of infection. Intestinal cell apoptosis increased after infection by all strains 24h of infection. However, the cell damage remained intense in the cells treated only with EAEC strains. EAEC 042 increased cell necrosis (p<0.05) in all evaluated periods, but the wild type strain caused damage with only at the period of 24h. All infected cells had a mRNA transcription increase of caspase 8 gene (p<0.05) in12h. NF-kB mRNA transcription increase (p<0.05) was seen in infected cells only in the period of 12h. While transcription levels of IL-8 were extremely high immediately after the infection was interrupted (0h), that was a drastic reduction at 12h after the end of infection. The wild type strain caused a reduction in cell viability linked apoptosis. However, EAEC 042 induced this decrease as also cellular necrosis. E. coli HS showed a different infection profile probably because its lack of virulence genes. AG 1mM supplementation was able to enhance cell proliferation (p<0.05) associated with apoptosis and necrosis reduction (p<0.05) in post-infected cells at the periods of 12, 24 and 48h. However, the presence of AG 1mM in infected cells did not affect the mRNA transcription low levels of c-jun and c-fos as seen after EAEC infection, and failed to block caspase 8 mRNA transcription increase (p<0.05). The IL-8 mRNA transcription temporal reduction was not associated with AG treatment in post-infected cells. Supplementation with AG had positive effects on epithelial protection against damage caused by both EAEC strains in proliferation assay and inhibition of cell death. However, since caspase 8 mRNA transcription decrease was not observed after AG treatment, AG anti-apoptosis feature could be probably related to another mechanism. Beta-carotene cell damage reversal on cell viability assay was statistical significant (p<0.05) 24 hours after infection was ended. Beta-carotene caused 48h apoptosis and necrosis (p<0.05) in wild type strain post-infected cells. Infected cells treated with beta-carotene could not block c-jun and c-fos mRNA transcription reduction and also failed to inhibit caspase 8 mRNA transcription, but beta-carotene itself increased levels of caspase 3 at the period of 12h after infection. Beta-carotene was shown to be potentially harmful to intestinal cells causing cell death probably related to its pro-oxidant effects. / A Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) está entre os mais importantes agentes associados às doenças diarreicas persistentes (DP) e mostrou-se prevalente em estudos na população infantil em comunidades carentes da cidade de Fortaleza. A EAEC causa lesão e inflamação intestinal levando a DP e, quando associada à desnutrição, pode ocasionar um déficit cognitivo e redução do crescimento infantil. Este estudo analisou in vitro (IEC-6 e HEp-2), o papel da alanil-glutamina (AG) e do betacaroteno nos mecanismos de proliferação, apoptose e necrose e em resposta a lesão intestinal induzida por uma cepa EAEC selvagem (LDI001), uma cepa controle EAEC 042 e uma cepa de E. coli HS comensal. A cepa LDI001 foi isolada de uma criança desnutrida. Na viabilidade celular houve uma redução significativa (p<0.05) pós-infecção com as EAECs nas concentrações de 105UFC/mL nos tempos de 12, 24 e 48 horas. Contudo, a cepa comensal apenas alterou no tempo tardio (48h). As células lesionadas por EAEC diminuíram a transcrição (p<0.05) do mRNA dos genes c-jun e c-fos e, apenas tardiamente (12h), com a cepa comensal. A apoptose celular aumentou (p<0.05) após a infecção com todas as cepas em 24h. Porém, o dano persistiu elevado apenas nas células tratadas com as cepas de EAEC. A cepa 042 aumentou as células necróticas (p<0.05) em todos os tempos, embora a LDI001 causou o dano apenas em 24h.Todas as células infectadas sofreram aumento da transcrição (p<0.05) de caspase 8 em 12h. Houve aumento trascricional (p<0.05) de NF-kB em 12h nas células infectadas. Enquanto os níveis de transcrição de IL-8 foram altos imediatamente ao termino da infecção (0h) e houve redução em 12h. A LDI001 causou redução da viabilidade celular vinculada à sua ação apoptótica. A EAEC 042 induziu danos tanto pela apoptose como a necrose celular. A cepa comensal mostrou um perfil diferenciado das outras cepas provavelmente por não apresentar genes de virulência. A suplementação com AG 1mM foi capaz de aumentar a proliferação celular (p<0.05) associado a redução da apoptose e necrose (p<0.05) nas células pós-infectadas nos tempos de 12, 24 e 48h. Contudo, a presença de AG 1mM nas células infectadas não alterou os baixos níveis transcricionais de c-jun e c-fos promovidos pela infecção, e não conseguiu bloquear a transcrição significante (p<0.05) de caspase 8. Os níveis de transcrição de NF-kB ainda permaneceu aumentado (p<0.05) na presença de AG em células pós-infectadas no tempo de 12h. Percebeu-se a continua redução temporal da transcrição de IL-8 não estava associada ao tratamento das células infectadas com AG 1mM. A suplementação com AG obteve efeitos positivos na proteção epitelial contra os danos causados pela infecção das cepas tanto nos processos proliferativos quanto na inibição de morte celular. Contudo, a alanil-glutamina não bloqueou a transcrição de caspase 8 podendo sua função antiapoptótica estar relacionada a outra via de ação no presente modelo em estudo. O tratamento com betacaroteno promoveu a reversão do dano na viabilidade celular significativa (p<0.05) apenas em 24h após infecção. Enquanto a presença do betacaroteno em células pós-infectadas com EAEC selvagem causou aumento de apoptose e necrose (p<0.05) em 48h. Células infectadas tratadas com betacaroteno não aumentaram os níveis de c-jun e c-fos e também não conseguiram bloquear a transcrição de caspase 8 e aumentaram (p<0.05) os níveis de caspase 3 no tempo de 12h. O betacaroteno mostrou-se potencialmente lesivo às células causando morte celular, provavelmente, relacionado aos seus efeitos prooxidantes.