Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La transcription fidèle d’un gène lors de son activation nécessite l’assemblage d’un ensemble de protéines autour du promoteur. Parmi ces protéines, le complexe TFIIH joue un rôle central et important au travers de ses sous-unités enzymatiques. Des mutations dans les sous-unités XPB, XPD et p8/TTD-A de TFIIH conduisent à trois maladies autosomiques récessives distinctes : xeroderma pigmentosum (XP), parfois associés avec le syndrome de Cockayne (XP/CS) et la trichothiodystrophie (TTD). En étudiant différentes mutations dans ces trois sous unités de TFIIH, nous avons montré que chaque mutation analysée conduit à une dérégulation transcriptionnelle spécifique du gène RARβ2, gène cible des RAR. L’intégrité architecturale et enzymatique de TFIIH conditionne le bon recrutement du complexe TFIIH et également des facteurs de réparation par excision de nucléotides (NER). TFIIH muté perturbe leur recrutement et par conséquence compromet le remodelage de la chromatine médiée par les facteurs NER tels que les modifications post-traductionnelles (PTMs) des histones, l’induction des cassures de l’ADN, la déméthylation de l’ADN et les boucles de chromatine. Par conséquence, en plus de ses activités enzymatiques, TFIIH forme une plate-forme afin de recruter les facteurs NER et orchestres les fonctions connexes de la transcription. Cette pénétrance variable parmi les mutants donne lieu à un gradient de phénotype observé chez les patients TTD, XP ou XP/CS. / Fidelity in transcription of the gene requires assembly of set of proteins around the promoter,upon gene activation. The TFIIH complex is central among these proteins and plays a key role through its enzymatic subunits. Mutations in TFIIH subunits XPB, XPD and p8/TTD-A leads to three distinct autosomal recessive disorders: xeroderma pigmentosum (XP), sometimes associated with Cockayne’s syndrome (XP/CS) and trichothiodystrophy (TTD). By studying the different mutation in these three subunits of TFIIH from mentioned genetic disease models, we have shown that each mutation analyzed led to a specific transcriptional dysregulation of theRAR-target gene RAR 2. The architectural and enzymatic integrity of TFIIH condition the appropriate recruitment of TFIIH complex and further the arrival of the Nucleotide ExcisionRepair (NER) factors. By disturbing their recruitment, mutated TFIIH consequently compromised the chromatin remodeling mediated by NER factors such as histones posttranslational modifications (PTMs), DNA breaks induction, DNA demethylation and genelooping. Hence it can be concluded that in addition to its enzymatic activities, TFIIH provide a platform to recruit the NER factors and orchestrates the related functions in transcription. Such varying penetrance among mutants gives rise to a phenotype gradient as observed in TTD, XPor XP/CS patients.

Le xeroderma pigmentosum (XP) est une affection autosomique récessive avec déficience dans un système de réparation de l'ADN appelé réparation de l'excision des nucléotides (NER). Le XP comprend 7 groupes de complémentation, de XPA à XPG. Le xeroderma pigmentosum type C (XPC) est l'une des formes les plus courantes en Europe, aux Etats-Unis et au Japon. Les hétérozygotes ne sont pas affectés, alors que les homozygotes ont une sensibilité au soleil précoce et sévère qui endommage la peau et les yeux. La maladie commence au début de la vie avec la première exposition à la lumière du soleil. L'âge médian d'apparition est de 1 à 2 ans, la peau présentant rapidement les signes associés habituellement à des années d'exposition au soleil. Le terme XP fait référence au phénotype qui inclut la xérose et l'hyperpigmentation. Cependant, l'altération du phénotype pigmentaire de la peau associée aux effets du rayonnement UV, qui est parmi les premières manifestations cliniques dans la plupart des troubles NER, a été relativement négligée jusqu'à présent, sans étude systématique. En conséquence, l'objectif principal de cette thèse est d'étudier le mécanisme par lequel la déficience en protéine XPC affecte la pigmentation. Nos données cliniques ont révélé que les manifestations pigmentaires chez les patients XP-C apparaissent progressivement pour être manifestes vers l'âge de deux ans sous forme, dans les zones exposées au soleil, de nombreuses taches hypo- et hyper-pigmentées. De plus, le phénotype pigmentaire (c'est-à-dire la distribution des taches hypo- et hyper-pigmentées) des patients XP-C examiné sur une longue période de temps a révélé un profil relativement stable dans l'espace. L'analyse des zones hypo- et hyper-pigmentées de la peau chez les patients XP-C a montré que le nombre de mélanocytes et la quantité de mélanine sont significativement diminués dans la zone hypo pigmentée. L'analyse protéomique sur les taches hypo- et hyper-pigmentées a été réalisée et a permis d’identifier des voies de signalsation d’intérêt. Pour étudier en détail le mécanisme moléculaire soustendant l'effet de la déficience en XPC sur la pigmentation, nous avons utilisé la peau reconstruite humaine, qui reproduit de nombreuses caractéristiques morphologiques et moléculaires de la peau humaine. Les résultats montrent que l'extinction du gène XPC dans les mélanocytes en utilisant la technologie CRISPR/ Cas9 pourrait être utilisé comme un modèle pour reproduire la maladie en raison de la rareté des patients. / Xeroderma pigmentosum (XP) is an autosomal recessive disorder with deficiency in aDNA repair system called nucleotide excision repair (NER). XP comes into 7 complementationgroups, XPA-XPG. Xeroderma pigmentosum type C (XPC) is one of the morecommon forms in Europe, USA and Japan. Heterozygotes are unaffected, while homozygoteshave an early and severe sun sensitivity which damages the skin and eyes.The disease begins in early life with the first exposure to sunlight. The median age ofonset is 1–2 years of age, with skin rapidly exhibiting the signs associated with years ofsun exposure. The term XP refers to the phenotype that includes xerosis and hyperpigmentation.However, alteration in the skin pigmentary phenotype associated with theeffects of UV radiation which is among the first clinical manifestations in most of theNER disorders, has been neglected up to now and it has not studied in detail. Accordingly,the main objective of this thesis is to investigate the mechanism by which XPC deficiencyaffects pigmentation.Our clinical data revealed that pigmentary manifestations in XP-C patients often appearprogressively and are characteristic by two years of age as an abnormal increasednumber of lentigines in sun-exposed areas with the typical appearance of hypo- andhyperpigmentation spots. Moreover, pigmentary phenotype (i.e. distribution of hypoandhyper-pigmented spots) of XP-C patients examined over a long period of time revealeda relatively spatially stable profile. Analysis of the hypo- and hyper-pigmentedareas of the skin isolated from XP-C patients showed that the number of melanocytesand melanin quantity are significantly decreased in the hypo-pigmented area. Proteomicanalysis on hypo- and hyper-pigmented spots identified some molecular targets thatwere expressed differently in these spots. To investigate in detail the molecular mechanismunderlying the effect of XPC deficiency on pigmentation, human reconstructedskin, which mimics many morphological and molecular characteristics of normal humanskin was used for modeling XPC. Our results showed that silencing of XPC inmelanocyte using CRISPR/ Cas9 technology could be used as a useful model to counteractthe scarcity of patient samples.

Divers agents environnementaux peuvent causer des dommages à l’ADN qui, si non réparés, peuvent mener à des mutations et éventuellement le cancer. Des mécanismes de réparation sont donc nécessaires afin de maintenir l’intégrité du génome. Un de ces mécanismes est la réparation par excision de nucléotides (NER) qui va réparer des dommages qui causent une distorsion dans l’hélice d’ADN comme ceux formés par les rayons UV. La NER se divise en deux sous-voies : la réparation global du génome (GGNER), responsable de réparer l’ADN transcriptionnelement inactif ainsi que le brin nontranscrit de gènes actifs, et la réparation couplée à la transcription(TC-NER), responsable de réparer le brin transcrit de gènes actifs. La TC-NER ne diffère de la GG-NER que par la méthode de reconnaissance du dommage et va réparer les dommages plus rapidement que la GG-NER. Chez Saccharomyces cerevisiae, les gènes de l’ARN ribosomal peuvent exister en 2 états distinct dans la cellule, soit actifs et transcrits par l’ARN polymerase I ou soit inactifs et recouverts de nucléosomes. Des études ont démontré que suite à une irradiation aux UV, il y avait fermeture des gènes ribosomaux actifs et réouverture au fur et à mesure que les dommages sont réparés. De plus, il a été démontré, qu’après irradiation, il y avait une présence plus importante d’ARN polymerase I au début du gène qu’à la fin. Ces évidences suggèrent que la TC-NER va réparer les dommages au début du gène et que son influence va diminuer au fur et à mesure qu’on avance dans le gène. Ainsi, les travaux présentés dans ce mémoire vise à évaluer l’impact de la TC-NER sur la cinétique de réparation de l’ADN ribosomal. À cet effet, une série d'extension d’amorces ont été effectuées dans différentes régions du gène de l’ARN ribosmal 35S. Ces analyses ont montré que la réparation des dommages UV au début du gène est médiée par la TCNER alors que plus loin dans le gène, la réparation est médiée en plus grande partie par la GG-NER. De plus, l’analyse de la réparation dans la région terminatrice de la transcription a montré que la TC-NER s’arrête au site principal de terminaison T1 dans une souche WT. Alors que dans une souche ayant un défaut dans le terminaison de la transcription, rpal2A, la TC-NER arrête au site terminaison secondaire T2. Dans une autre souche déficiente dans la terminaison, nsi1[triangle], le TC-NER n’est pas détectable après le site T1, mais une réparation plus rapide est observée après le site T2. [symboles non conformes]

The number of publications in the biomedical field increases exponentially, which makes the task of keeping up with current research more and more difficult. However, rapid advances in the field of Natural Language Processing (NLP) offer possible solutions to this problem. In this thesis we focus on investigating three main questions of importance for utilizing the field of NLP, or more specifically the two subfields Named Entity Recognition (NER) and Large Language Models (LLM), to help solve this problem. The questions are; comparing LLM performance to NER models on NER-tasks, the importance of normalization, and how the analysis is affected by the availability of data. We find for the first question that the two models offer a reasonably comparable performance for the specific task we are looking at. For the second question, we find that normalization plays a substantial role in improving the results for tasks involving data synthesis and analysis. Lastly, for the third question, we find that it is important to have access to full papers in most cases since important information can be hidden outside of the abstracts.

La synthèse d’ARN messagers résulte d’une cascade d’évènements temporellement et spatialement orchestrée. Au moment de l’initiation de la transcription, divers facteurs tels que les facteurs généraux de transcription, le complexe Médiateur, des co-activateurs, des facteurs de remodelage de la chromatine ainsi que l’ARN polymérase II sont recrutés au niveau de la région promotrice du gène. Certains facteurs de la voie NER de réparation de l’ADN sont également recrutés. En utilisant des cellules de patients porteurs de mutations dans les gènes MED12 (sous-unité du Médiateur) ou XPC (facteur initiant la voie NER), nous avons pu étudier le rôle de ces protéines dans la transcription. Les patients MED12 sont notamment caractérisés par une lourde déficience intellectuelle et des malformations congénitales. Nous avons montré que MED12 est impliqué dans le contrôle de certains gènes de réponse immédiate comme JUN, qui contribue notamment au développent et à la plasticité cérébrale. L’expression de ce dernier est affectée par les mutations de MED12, mais différemment en fonction de la position de la mutation, apportant une possible indication sur l’origine des variations phénotypiques observées chez les patients. En parallèle, les patients XPC se caractérisent par une forte photosensibilité. Nous avons montré que la protéine XPC, en collaboration avec le facteur E2F1, est impliquée dans le recrutement de l’histone acetyl-transférase GCN5 au niveau du promoteur d’un certain nombre de gènes. Cette dernière permet notamment l’a modification de l’environnement chromatinien, en coopération avec le facteur général de transcription TFIIH et participe ainsi à l’initiation de la transcription. En plus d’approfondir la compréhension des mécanismes régissant la transcription, ces résultats ont permis de mieux comprendre l’étiologie des maladies associées aux mutations. / The synthesis of messenger RNA is a highly regulated process. During transcription initiation, a large number of proteins are recruited to gene promoter, including the RNA polymerase II, general transcription factors, co-activators, chromatin remodellers and the Mediator complex. Some DNA repair factors from the NER pathway are also recruited. Using cells derived from patients bearing mutations in either MED12 gene or XPC gene, we studied the roles of such proteins in transcription. MED12 patients are mostly characterised by intellectual disability and developmental delay. We showed that MED12 is implicated in the transcription regulation of immediate early genes like JUN, known for its role in neurological development and neuronal plasticity. JUN expression is markedly altered by MED12 mutations. We also showed that the position of the mutation influences this alteration, bringing possible explanation for inter-patients symptom variability. Meanwhile, XPC patients are mostly characterized by photosensitivity. We showed that XPC protein, which engages one of the NER pathways, is implicated in chromatin post-translational modification. Together with E2F1, it helps the recruitment of GCN5 acetyl-transferase to promoter of a certain set of genes. On the promoter, GCN5 notably cooperates with TFIIH to modify the chromatin environment during transcription initiation. In addition to help the comprehension of the transcription mechanisms, these results bring knew insight into the aetiology of mutations associated diseases.

Les mutations dans les gènes codant pour les facteurs NER donnent lieu à des maladies autosomiques récessives telles que Xeroderma pigmentosum (XP), le syndrome de Cockayne (CS) et la trichothiodystrophie (TTD). Les phénotypes associés à ces syndromes génétiques se caractérisent par une sensibilité extrême à la lumière UV, avec prédisposition accrue à certains cancers (pour XP et XP / CS combiné, principalement), ainsi qu’un retard mental et des signes de progeria (pour CS et XP / CS combiné). Si on peut admettre une corrélation entre réparation de l'ADN endommagé et sensibilité aux UV / cancer, celle avec les symptômes neurologiques/progéroïdes est encore sujet à débat. Une explication pourrait provenir du rôle des facteurs NER dans la régulation de la transcription. Nous proposons une vue d’ensemble des roles de XPG et XPC dans la régulation de la transcription en absence des stress exogènes et comment CSA et CSB orchestrent l’arret de la transcription après une attaque génotoxique. XPC était capable d’interagir stablement avec la methyltransferase NSD3. Des mutations dans XPC altèrent le transcriptôme et la distribution des H3K36me3. Les mutations dans XPG dérégulent l’expression génique et XPG est capable d’etre recruté sur l’ensemble du genôme avec TFIIH. CSA et CSB faisant partie de la machinerie ubiquitin/proteasôme, régulent le recrutement de facteurs fixant l’ADN et contrôlant le programme transcriptionnel après irradiation aux UV. Nos donnés mettent en évidence le rôle des facteurs NER dans la transcription et leur défaut d’action provoque les maladies XP et XP/CS. En plus, nos données fournissent des explications sur le méchanisme d’arrêt de la transcription après un stress genotoxique et pose la question de l’origine du phenotype CS. / Mutations in genes coding for NER factors give rise to autosomal recessive diseases such as Xeroderma pigmentosum (XP), Cockayne syndrome (CS), and trichothiodystrophy (TTD). The phenotypes associated with these genetic syndromes spans from extreme sensitivity to UV light, with increased predisposition to cancer (for XP and combined XP/CS, mostly), mental retardation and progeria (for CS and combined XP/CS). Whether the correlation between defective DNA repair reactions and UV-sensitivity/cancer may be more intuitive, a link with neurological/progeroid symptoms is still a matter of debate. As a possible explanation, it has been proposed a connection between NER and transcription regulation. We propose additional insights on XPG and XPC roles in transcription regulation in absence of exogenous stress and how CSA and CSB orchestrate transcription arrest due to genotoxic attack. XPC was able to stably interact with NSD3 methyltransferase. Mutations in XPC also disturbed the transcriptome and the H3K36me3 distribution. Mutations in XPG deregulate gene expression and XPG is able to be recruited genome wide together with TFIIH. CSA and CSB can, as part of the ubiquitin/proteasome machinery, regulate the recruitment timing of DNA binding factors and control transcriptional program after UV irradiation. Hence, our data shed more light in NER factors role in transcription and their defective action as a cause of XP and XP/CS disorders. Additionally, our data provide explanations on the mechanism of transcription arrest following genotoxic stress and pose questions about the origins of CS phenotype.

Les résultats du criblage siRNA destiné à identifier de nouveaux acteurs de la NER, sont en court d’exploitation mais nous mettons déjà en évidence le rôle de certains gènes impliqués dans la biochimie des ARNm comme ceux empêchant la formation des hybrides ARN/ADN dans l’efficacité de réparation des lésions UV. En étudiant le rôle de la methyltransférase DOT1L, nous avons montré que son absence dans des fibroblastes embryonnaires de souris (MEFDOT1L) conduit à une sensibilité de ces cellules aux irradiations UV alors que la réparation des lésions produites par cette irradiation est intacte. L’absence de DOT1L conduit en réalité à une inhibition de l’initiation de la transcription des gènes après irradiation. Au niveau mécanistique, des expériences de STRIP-FRAP ont établit que DOT1L assurait l’association de l'ARN polymérase II à la chromatine après irradiation UV. Dans une analyse plus détaillée, nous avons montré que DOT1L favorisait la formation du complexe de pré-initiation au niveau du promoteur des gènes de ménage ainsi que l'apparition de marques d’euchromatine transcriptionnellement actives. Bien que l'expression des gène de ménage soit inhibée, une analyse transcriptomique montre que les gènes pro-apoptotiques sont fortement transactivés chez les MEFDOT1L après irradiation. Le traitement à la trichostatine A, qui relaxe la chromatine, diminue la transactivation des gènes apoptotiques et restore l’initiation de la transcription et la survie aux UV. Sur la base de ces données, nous proposons que DOT1L garde structure de la chromatine ouverte après UV. / As a result of siRNA screening we identified new players at the interface between NER machinery and chromatin. Despite it is ongoing study we already highlighted that certain genes which are involved in the biochemistry of mRNA such as splicing and preventing the formation of RNA:DNA hybrids are important for efficient repair of UV damage. Studying the role of histone H3 lysine 79 methyltransferase DOT1L, we have shown that its absence in mouse embryonic fibroblasts leads to high sensitivity of these cells to UV irradiation while the repair of lesions produced by UV irradiation remains intact. The absence of DOT1L leads to an inhibition of the initiation of gene transcription after UV irradiation. At the mechanistic level, STRIP-FRAP experiments have established that DOT1L assured the association of RNA polymerase II to the chromatin after UV irradiation. In a more detailed analysis, we show that DOT1L favors the formation of pre-initiation complex at the promoter of housekeeping genes as well as the appearance of marks of the transcriptionally active euchromatin. Although the expression of the housekeeping gene is inhibited, a transcriptomic analysis shows that the proapoptotic genes are highly transactivated in DOT1L depleted cells after UV irradiation. Treatment with trichostatin A, which relaxes the chromatin, lowers the transactivation of proapoptotic genes and restores the transcription initiation as well as cell survival after UV. On the basis of these data, we propose that DOT1L keeps the opened chromatin structure after UV irradiation.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:10:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Julliane Tamara Araujo de Melo.pdf: 3651115 bytes, checksum: d9a05a183487ffcfb8bd75edd16acd9d (MD5) Previous issue date: 2010-06-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Riboflavin is a vitamin very important in aerobic organisms, as a precursor of many coenzymes involved in the electron transporter chain. However, after photosensitization of riboflavin with UV or visible light, it generates reactive oxygen species (ROS), which can oxidize the DNA. The repair of oxidative lesions on DNA occurs through the base excision repair pathway (BER), where APE1 endonuclease plays a central role. On the other hand, the nucleotide excision repair pathway (NER) repairs helix-distorting lesions. Recently, it was described the participation of NERproteins in the repair of oxidative damage and in stimulation of repair function fromAPE1. The aim of this research was to evaluate the cytotoxic effects of photosensitized riboflavin (RF*) in cells proficient and deficient in NER, correlating with APE1 expression. For this propose, the cells were treated with RF* and it was performed the cell viability assay, extraction of whole proteins, cells fractionation, immunoblotting, indirect immunofluorescence and analysis of polymorphisms of BER gens. The results evidenced that cells deficient in XPA and CSB proteins were more sensitive to RF*. However, XPC-deficient cells presented similar resistance to MRC5- SV cells, which is proficient in NER. These results indicate that XPA and CSB proteins have an important role on repair of oxidative lesions induced by RF*. Additionally, it was evidenced that single nucleotide polymorphisms (SNPs) in BER enzymes may influence in sensitivity of NER-deficient cell lines. Concerning the APE1 expression, the results showed that expression of this protein after treatment with RF* only changed in XPC-deficient cells. Though, it was observed that APE1 is recruited and is bound to chromatin in MRC5-SV and XPA cells after treatment with RF*. The results also showed the induction of DNA damage after treatment with RF*, through the analysis of-H2AX, since the treatment promoted an increase of endogenous levels of this phosphorylated protein, which acts signaling double strand-break on DNA. On the other hand, in XPC-deficient cells, regardless of resistance of RF*, the endogenous levels of APE1 are extremely reduced when compared with other cell lines and APE1 is not bound to chromatin after treatment with RF*. These results conclude that RF* was able to induce cell death in NERdeficient cells, where XPA and CSB cells were more sensitive when compared with MRC5-SV and XPC-deficient cells. This last result is potentially very interesting, since XPC-deficient cell line presents low levels of APE1. Additionally, the results evidenced that APE1 protein can be involved in the repair of oxidative damage induced by RF*, because APE1 is recruited and bound strongly to chromatin after treatment. / A riboflavina ? uma vitamina de fundamental import?ncia em organismos aer?bios, sendo precursora de importantes coenzimas que participam da cadeia transportadora de el?trons. Contudo, ap?s a sensibiliza??o da riboflavina com luz UV ou luz vis?vel, observou-se a forma??o de esp?cies reativas de oxig?nio (EROs), as quais podem oxidar o DNA. O reparo de les?es oxidativas no DNA ocorre principalmente atrav?s da via de reparo por excis?o de bases (BER), na qual a endonuclease APE1 exerce um papel central. Por sua vez, a via de reparo por excis?o de nucleot?deos (NER) atua reparando les?es no DNA que causam distor??es na dupla h?lice. Recentemente tem sido descrito a participa??o da via NER na remo??o de danos oxidativos e na estimula??o da fun??o de reparo de APE1. Desta forma, o objetivo desta pesquisa foi analisar os efeitos citot?xicos da riboflavina fotossensibilizada (RF*) em c?lulas proficientes e deficientes na via NER, correlacionando ? express?o de APE1. Para tanto, as linhagens proficientes e deficientes no NER foram submetidas ao tratamento com RF* e em seguida foram realizados os ensaios de viabilidade celular, extra??o de prote?nas totais, fracionamento celular, immunoblotting, imunofluoresc?ncia indireta e a an?lise de polimorfismos em genes da via BER. Os resultados evidenciaram perfis de sensibilidade distintos ao estresse oxidativo induzido pela RF*, onde as linhagens XPA e CSB foram mais sens?veis, enquanto a linhagem XPC mostrou resist?ncia similar ? linhagem MRC5-SV, a qual ? proficiente na via NER. Esses resultados indicam que as prote?nas XPA e CSB possuem um importante papel no reparo das les?es oxidativas induzidas pela RF*. Al?m disso, foi demonstrado que polimorfismos em um ?nico nucleot?deo (SNPs) em enzimas do BER podem influenciar na sensibilidade dessas linhagens. Em rela??o ?s an?lises dos n?veis de express?o de APE1, os resultados mostraram que houve altera??o na express?o dessa prote?na ap?s o tratamento com RF* somente na linhagem deficiente em XPC. Por?m, observou-se que APE1 ? recrutada e se torna ligada ? cromatina ap?s o tratamento nas linhagens MRC5-SV e XPA. Os resultados tamb?m comprovaram a indu??o de danos ap?s o tratamento com RF* atrav?s do estudo da prote?na-H2AX, pois o tratamento provocou um aumento nos n?veis end?genos desta prote?na fosforilada, a qual atua na sinaliza??o de quebras de fita dupla no DNA. Por?m, na linhagem XPC, al?m de ter sido observado uma curva de sobreviv?ncia semelhante ? linhagem MRC5-SV, os n?veis end?genos de APE1 s?o significativamente reduzidos quando comparados com as outras linhagens e APE1 n?o se encontra ligada ? cromatina ap?s tratamento com RF*. Conclui-se que a RF* foi capaz de induzir a morte celular em linhagens deficientes no sistema de reparo por excis?o de nucleot?deos, onde as linhagens XPA e CSB foram mais sens?veis quando comparadas ? linhagem normal MRC5-SV e ? linhagem XPC. Este ?ltimo resultado ? potencialmente interessante, considerando que a linhagem XPC apresenta baixos n?veis prot?icos de APE1. Adicionalmente, os resultados comprovaram que a prote?na APE1 pode estar envolvida no reparo de danos oxidativos causados pela RF*, j? que APE1 ? recrutada na cromatina e se liga fortemente a esta ap?s o tratamento.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:10:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaRST_DISSERT.pdf: 1422698 bytes, checksum: e73998b03faa562a4c08ff6ab012f0cc (MD5) Previous issue date: 2011-09-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Reactive oxygen species (ROS) are continuously generated and can be derived from cellular metabolism or induced by exogenous factors, in addition, have the capacity to damage molecules like DNA and proteins. BER is considered the main route of DNA damage oxidative repair, however, several studies have demonstrated the importance of the proteins participation of other ways to correct these injuries. NER enzymes deficiency, such as CSB and XPC, acting in the damage recognition step in the two subways this system influences the effectiveness of oxidative damage repair. However, the mechanisms by which cells deficient in these enzymes respond to oxidative stress and its consequences still need to be better understood. Thus, the aim of this study was to perform a proteomic analysis of cell lines proficient and deficient in NER, exposed to oxidative stress, in order to identify proteins involved, directly or not, in response to oxidative stress and DNA repair. For this, three strains of human fibroblasts, MRC5-SV, CS1AN (CSBdeficient) and XP4PA (XPC-deficient) were treated with photosensitized riboflavin and then carried out the differentially expressed proteins identification by mass spectrometry. From the results, it was observed in MRC5-SV increase expression in most of the proteins involved in cellular defense, an expected response to a normal cell line subjected to stress. CS1AN showed a response disjointed, it is not possible to establish many interactions between the proteins identified, may be one explanation for their sensitivity to treatment with riboflavin and other oxidants and increased cell death probably by induction of pro-apoptotic pathways. Already XP4PA showed higher expression of apoptosis-blocking proteins, as there was inhibition or reduced expression of others involved with the activation of this process, suggesting the activation of an anti-apoptotic mechanism in this lineage, which may help explain the high susceptibility to develop cancers in XPC individuals. These results also contribute to elucidate action mechanisms of NER in oxidative damage and the understanding of important routes in the oxidative stress correlation, repair and malignant tumors formation / Esp?cies reativas de oxig?nio (EROs) s?o geradas, continuamente, podendo ser provenientes do metabolismo celular ou induzidas por fatores ex?genos, al?m disso, apresentam a capacidade de danificar mol?culas, como DNA e prote?nas. BER ? considerada a principal via de reparo de danos oxidativos ao DNA, entretanto, diversos estudos tem demonstrado a import?ncia da participa??o de prote?nas de outras vias na corre??o destas les?es. A defici?ncia de algumas enzimas da via NER, como CSB e XPC, que atuam na etapa de reconhecimento da les?o nas duas subvias deste sistema, influencia na efic?cia do reparo de danos oxidativos. Entretanto, os mecanismos atrav?s dos quais, c?lulas deficientes nestas enzimas respondem ao estresse oxidativo e suas conseq??ncias ainda necessitam ser mais bem esclarecidos. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi realizar uma an?lise prote?mica de linhagens celulares proficiente e deficiente em NER, expostas ao estresse oxidativo, de modo a identificar prote?nas envolvidas, diretamente ou n?o, na resposta ao estresse oxidativo e reparo de DNA. Para isto, tr?s linhagens de fibroblastos humanos, MRC5-SV, CS1AN (deficiente em CSB) e XP4PA (deficiente em XPC), foram tratadas com riboflavina fotosenssibilizada e, em seguida, foi realizada a identifica??o das prote?nas diferencialmente expressas atrav?s do seq?enciamento de pept?deos por espectrometria de massas. A partir dos resultados, observou-se que a linhagem MRC5-SV apresenta aumento de express?o na maioria das prote?nas envolvidas com a defesa celular, sendo uma resposta esperada para uma linhagem celular normal submetida a estresse. A linhagem CS1AN demonstrou uma resposta desarticulada, n?o sendo poss?vel estabelecer muitas intera??es entre as prote?nas identificadas, podendo ser uma explica??o para sua sensibilidade a tratamentos com riboflavina e outros agentes oxidantes e aumento da morte celular provavelmente por indu??o das vias pr?apopt?ticas. J? linhagem XP4PA apresentou maior express?o de prote?nas bloqueadoras da apoptose, assim como, houve a inibi??o ou redu??o da express?o de outras envolvidas com a ativa??o deste processo, sugerindo a ativa??o de um circuito anti-apopt?tico nesta linhagem, o que pode ajudar a explicar a alta susceptibilidade de indiv?duos XPC a desenvolvimento de c?nceres. Estes resultados tamb?m contribuir?o para o esclarecimento dos mecanismos de atua??o de NER em danos oxidativos e para a compreens?o de vias importantes na correla??o do estresse oxidativo, reparo e forma??o de tumores mal?gnos