Monoclonal antibody-based immunotherapy has emerged as a promising treatment for B-cell lymphoma, with Rituximab (RTX) IgG1 targeting the CD20 surface protein showing significant clinical success in combination with chemotherapy (Bello & Sotomayor 2007). However, not all patients respond to RTX, whereby further studies are warranted to improve RTX efficacy. In this study, an in-house ELISA method was optimized to analyze cytokines from supernatants from human B cell lymphoma cell lines and monocytic cell cultures. Basal levels of the pro-inflammatory tumor necrosis factor α (TNF-α) and the immunosuppressive interleukin 10(IL-10) cytokines were investigated. The study shows several factors that can affect cytokine measurements in cell lines, such as time of culture, cell passage numbers, and incubation times of standards and samples in the ELISA. Furthermore, the correlation between IL-10 secretion of cell lines and phagocytosis was investigated using supernatant samples from phagocytosis assays of B-cell lymphoma cells treated with RTX and anti-CD47 mAbs. Notably, the pattern of IL-10 production from the samples varied depending on the treated antibodies and not by the intensity of the phagocytosis induced by the mAbs.In summary, this study shows that ELISA methods need to be tailored for analysis of cytokines in cell cultures, and highlights that cytokine levels not necessarily correspond to phagocytosis intensity induced by therapeutic mAbs.

A toxoplasmose é uma protozoose de alta prevalência no Brasil, causada pelo Toxoplasma gondii, sendo transmitida pela ingestão de alimentos contaminados com oocistos, excretados em fezes de felinos, ou cistos, em carnes cruas ou mal cozidas. A doença é usualmente assintomática, mas em fetos ou pacientes com imunodepressão, pode ser devastadora. Neste trabalho, estudamos a prevalência sorológica da infecção em animais de diferentes regiões do estado de São Paulo, tanto de vida livre, cães (200/ABC) como indicadores ambientais, e gatos (100/São Paulo) como hospedeiros definitivos, e em animais de produção, bovinos (200/Taquarituba), suínos (200/Osasco), caprinos( 200/Botucatu), ovinos (200/São Manuel) e frangos de corte(185/Botucatu), além de estudos parasitológicos em gatos e águas sob suspeita. Foram padronizados ELISA para cada espécie animal, utilizando índices adequados e reprodutíveis, com confirmação por Western Blotting e determinação da avidez em amostras positivas. A prevalência da toxoplasmose animal foi determinada sendo crescente em suínos (8.5%), bovinos (11%), caprinos (17%), ovinos (31%), felinos (40%) e cães (50,5%), não sendo encontrada em frangos de corte. Em suínos, caprinos, cães e gatos, a freqüência de anticorpos de baixa avidez sugere que a transmissão da infecção é constante durante a vida do animal, mas em bovinos e ovinos não foram encontrados anticorpos de baixa avidez, sugerindo infecção precoce ou sazonal na vida do animal. Pela alta taxa de infecção recente em felinos, é possível prever uma fração significativa de animais excretando oocistos, embora sem comprovação parasitológica. A avaliação da presença de anticorpos anti-T.gondii deve ser criteriosa, sendo que os reagentes de hemaglutinação para uso humano fornecem resultados erráticos nesta medida. A pesquisa de oocistos na água é de baixa sensibilidade, devendo ser feita em materiais colhidos no período de suspeita da transmissão. Em São Paulo, o risco de transmissão da toxoplasmose está relacionado a quase todas as fontes de infecção pesquisadas, tornando necessários estudos para o melhor manejo dos animais de consumo humano e tratamento de água, com eliminação de gatos errantes. / Toxoplasmosis, caused by Toxoplasma gondii and highly prevalent protozoan disease in Brazil, is mainly transmitted by ingestion of contaminated food and water, both by oocysts, excreted in cat feces, or cysts from undercooked meat from warm-blooded animals. Usually asymptomatic, it is extremely severe in the fetus or immunosuppressed patients. In this work, we studied the serological prevalence of toxoplasmosis in animals from several regions of the São Paulo State, both free living, as dogs (ABC) as environmental contamination index, and cats (São Paulo, as definitive hosts, or livestock as cattle (Taquarituba), swine (Osasco), goats (Botucatu), sheep (São Manuel) and fowls (São Paulo), with parasitological studies in cats and suspicious drinking water. We standardized ELISA for each species, using reproducible and adequate indexes, with Western blot confirmation and avidity assays in positive samples. Toxoplasmosis prevalence was increasing in swine (8.5%), cattle (11%), goats (17%), sheep (31%), cats (40%) and dogs (50.5%), without positive sample in fowls. Goats, pigs, dogs and cats presented 5-20% low avidity antibody samples, suggesting sustained transmission during animal life, but cattle and sheep presented only high avidity samples, suggesting an seasonal or early in life infection. Due to the high recent infection rate in cats, it is possible to preview a significant oocyst excreting cat frequency, despite parasitological evidence. Antibody determination must be carefully evaluated, as human hemagglutination reagents give erratic information. Oocyst detection in drinking water presented very low sensitivity and must be performed only in water collected at the period of the infection. In São Paulo, almost all of tested sources are able of toxoplasmosis transmission, reinforcing the need of better management of livestock, adequate water treatment and elimination of free living cats.

A doença celíaca (DC) é uma doença inflamatória induzida pela ingestão de glúten em indivíduos geneticamente predispostos e seu tratamento é baseado em uma dieta sem glúten por toda a vida. A doença celíaca refratária é um problema comum que afeta de 10% a 19% dos pacientes célicos tratados. Provavelmente, a contaminação da dieta por glúten é uma das razões principais para a persistência de sintomas em pacientes celíacos tratados, assim como a ingestão inadvertida de glúten, devido a rotulagem incorreta. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a confiabilidade dos rótulos dos alimentos brasileiros processados, através de testes de contaminação de glúten nos seguintes grupos (a) produtos \"livres de glúten\" - preparados especificamente para a população celíaca; (b) produtos \"naturalmente sem glúten\" feitos com arroz, milho, soja e mandioca, utilizados por toda a população e (c) produtos rotulados com \"contém glúten\", mas que não apresentam glúten em sua composição no rótulo. Foram analisados 213 produtos alimentícios agrupados em: 115 produtos do grupo \"sem glúten\"; 86 produtos do grupo \"naturalmente sem glúten\" e 12 produtos do grupo rotulados com \"contém glúten\". O teor de glúten foi detectado e quantificado por ELISA-R5 (Ridascreen®gliadin) e os resultados foram expressos em ppm e mg/100 g de alimento. A linha de corte foi estabelecida em 20 ppm para a contaminação de glúten. Todas as contaminações por glúten foram confirmadas por Western-blotting. Resultados: (a) alimentos livres de glúten 15 das 115 (13%) apresentaram contaminação por glúten (20 ppm), (b) grupo de alimentos naturalmente sem glúten - 8 de 86 (9,3%) apresentaram contaminação por glúten (20 ppm); (c) grupo de alimentos rotulados com contem glúten - somente 2 de 12 (16,7%) apresentaram contaminação por glúten (20 ppm). A análise de Western-blotting confirmou 36 das 38 (95%) contaminações encontradas no ELISA-R5. CONCLUSÕES: Ambos os grupos de alimentos \"sem glúten\" e \"naturalmente sem glúten\" comercializados no Brasil apresentaram razoável porcentagem de contaminação por glúten, o que dificulta a realização de uma dieta adequada ao paciente celíaco. O grupo de alimentos rotulado \"com glúten\" não apresentou 100% de contaminação, o que revela que a rotulagem desses produtos deve ser feita como uma medida preventiva. Uma maior chance de contaminação pelo glúten foi observada para os produtos a base de arroz (13,6x), soja (13,3x) e milho (9,3x), mas não naqueles à base de mandioca. Em média, encontramos 10,8% (23 de 213) de contaminação de glúten para os alimentos analisados, um panorama positivo para a população brasileira celíaca, principalmente devido ao uso da mandioca, uma alternativa para a farinha de trigo. No entanto, a contaminação de glúten encontrada mostra a importância da quantificação de glúten em todos os alimentos industrializados. / Celiac disease (CD) is an inflammatory disorder induced by ingestion of gluten in genetically predisposed individuals and its treatment is based on a life-time gluten-free diet. Nonresponsive celiac disease is a common problem affecting from 10% to 19% of treated celiac patients. Probably a gluten contamination in diet is one of the major reasons for symptoms persistence in celiac patients as well as an inadvertent gluten intake due to a misleading nutritional label. The aim of this study was to evaluate the reliability of Brazilian processed food labels by testing gluten contamination in (a) gluten-free products - prepared specifically for the celiac population; (b) in naturally gluten-free products made with rice, corn, soy bean and cassava and used by all population and (c) in not gluten-free products labeled to contain gluten but not having it in their composition. We analyzed 213 food samples grouped accordingly to its type: 115 samples of \"gluten-free food, 86 samples of \"naturally gluten-free food and 12 samples of not-gluten free labeled products. The gluten content was detected and quantified by ELISA-R5 (Ridascreen® Gliadin) and the results were expressed in ppm and mg/100 g of food. A cut-off line was established in 20 ppm for gluten contamination. All gluten contaminations were confirmed by Western-blotting. Results: (a) Gluten-free foods - we found 100 of 115 samples (87%) with no contamination (< 20 ppm) and 15 of 115 (13%) showed gluten contamination 20 ppm; (b) Naturally Gluten-free foods - we found 78 of 86 samples (90,7%) showing no contamination (< 20 ppm) and 8 of 86 (9,3%) with gluten levels 20 ppm; (c) Not gluten-free foods - we found 10 of 12 samples (83,3%) showing no contamination (< 20 ppm) and 2 of 12 (16,7%) with gluten contamination 20 ppm. The Western-blotting analysis confirmed 36 of 38 (95%) contaminations found in the ELISA-R5. CONCLUSIONS: Both \"gluten-free and \"naturally gluten-free foods commercialized in Brazil have presented some gluten contamination making a restricted gluten-free diet hard to be achieved by the celiac population. Unexpectedly the not gluten-free group was not entirely contaminated showing a preventive measure in labeling by food companies. A higher odds ratio for gluten contamination was observed for products made with rice (13.6), soy bean (13.3) and corn (9.3) but not to cassava products (not significant). In general, we found a 10.8% (23 of 213) of gluten contamination for all food products analyzed, a positive panorama for the Brazilian celiac population mainly due to cassava products, an alternative for wheat starch. Nevertheless the gluten contamination found here leads us to the importance for a gluten quantification in all industrialized food to guarantee an appropriated diet to the Brazilian celiac group

Sete suínos com 2 meses de idade foram infectados experimentalmente com cerca de 200.000 ovos de T. solium administrados por via oral. Ao término do experimento (140 dias) os animais não apresentaram aspectos clínicos de cisticercose pelo exame de inspeção da língua; portanto eles poderiam ser classificados como animais saudáveis pelos exames usuais de inspeção utilizados em matadouros. Todos os animais foram sacrificados e a musculatura, cérebro e órgãos viscerais foram seccionados em finos pedaços para a procura de cistos. O número de cisticercos encontrados em cada animal variou de 1 a 85 (média 33,7 e desvio padrão 31,3), caracterizando-os como animais com infecção branda. Amostras de sangue dos animais infectados experimentalmente foram submetidas a imunoensaios para a pesquisa de anticorpos (ELISA Indireto, utilizando como antígeno o líquido vesicular de Taenia crassiceps; imunoblot 18/14, oriundo de antígeno de Taenia crassiceps purificado com anticorpos monoclonais e imunoblot LLGP, utilizando glicoproteínas de T. solium purificadas com lentil lectina) e para pesquisa de antígeno (ELISA Sanduíche e ELISA Direto, ambos utilizando o anticorpo monoclonal anti-ES-Tcra). O teste ELISA Direto não apresentou reatividade em qualquer amostra de soro dos diferentes animais infectados no momento do abate (t140). Foi encontrada positividade de 71% e 57%, respectivamente, para os testes ELISA Indireto para a pesquisa de anticorpos e ELISA Sanduíche para a pesquisa de antígenos nestes tempos. Pelo imunoblot (IB) 18/14 e IB LLGP, respectivamente 5 (71 %) e 6 (86%) dos animais infectados experimentalmente foram positivos no t140. O uso de ensaios imunoenzimáticos para a detecção de anticorpos específicos (IB) somados ao ELISA Sanduíche para pesquisa de antígeno permitiu que todos os animais com infecção branda fossem detectados. Dessa forma, o uso de ensaios imunoenzimáticos para detecção de anticorpos e/ou antígenos mostrou-se mais útil que o exame clínico e/ou post-mortem para a triagem de cisticercose suína em animais com infecção branda. / Seven 2-month-old swine were orally experimentally infected with approximately 200,000 eggs of Taenia solium. At the end of the experiment (140 days) the animals did not show clinical aspects of cysticercosis or parasites in tongue inspection; therefore they could be mistaken as healthy animals by usual inspection exams used in slaughterhouses. All of them were slaughtered and their whole muscles, brain and visceral organs were cut into thin slices searching for cysts. The number of cysts found in each animal varies from 1 to 85 (mean value 33.7 and standard deviation 31.3) characterizing them as slightly infected animals. Blood samples of experimentally infected animals were submitted to immunoassays for antibody detection (Indirect ELISA, using vesicular fluid antigen from Taenia crassiceps; immunoblot 18/14, from T.crassiceps antigen purified by monoclonal antibodies and immunoblot LLGP, using lentil lectin purified glycoproteins of T. solium) and for antigen detection (Sandwich ELISA and Direct ELISA, both using monoclonal antibodies anti-ES-Tcra). The Direct ELISA assay did not show any reactivity with all serum samples from the different animals at the slaughtered moment (t140). The positivity was 71% and 57% by the Indirect ELISA for searching antibodies and by the Sandwich ELISA for searching antigens, respectively. By immunoblot (IB) 18/14 and IB LLGP 5 (71 %) and 6 (86%) experimentally infected animals were positive at t140, respectively. The use of immunoassays for detecting specific antibodies (IB) together with Sandwich ELISA for antigen detection allow the detection of all slightly infected animals. Thus, the use of immunoassays for antibodies and/or antigen detection showed they are more useful than usual clinical examination and/or tongue palpation for screening cysticercosis in slightly infected pigs.

O Neospora caninum é um protozoário filogeneticamente relacionado a vários coccídeos de importância em medicina veterinária e humana, além de ser um parasita intracelular obrigatório capaz de causar abortamentos em bovinos e paralisia neuromuscular em cães. O estudo de antígenos e proteínas recombinantes de N. caninum gerou uma série de informações para um melhor diagnóstico e diferenciação deste protozoário e demais agentes a ele relacionados. No presente trabalho, propomos a expressão do clone do gene da proteína interna Nc56 de N. caninum em sistema procarioto (Escherichia coli), para avaliar sua antigenicidade frente a soros de bovinos imunoreativos contra Neospora caninum e Toxoplasma gondii. Para tanto, estabelecemos as condições ideais de expressão da proteína (indução por 4 horas e concentração de L-arabinose de 0,2%) e posteriormente avaliamos duas formas de purificação do produto recombinante (cromatografia de afinidade por metal imobilizado e eluição direta do gel de SDS-PAGE), constatando que a eluição de proteínas recombinantes diretamente do gel de SDS-PAGE mostrou-se o procedimento mais adequado para evitar a presença de proteínas contaminantes advindas do sistema procarioto de expressão. Foi selecionado um painel de soros bovinos (animais de campo), previamente testados pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para avaliar sua reatividade para Neospora caninum e Toxoplasma gondii. Utilizamos o soro de um bezerro macho da raça Holandesa recém-nascido, colhido antes da administração de colostro materno (mãe soronegativa pela RIFI-Nc e RIFI-Tg) como controle negativo. O controle positivo foi obtido do mesmo bezerro após inoculação experimental de taquizoítos viáveis de N. caninum, quando este animal já apresentava seis meses de idade. O ELISA indireto foi realizado com microplacas de poliestireno com 96 cavidades de fundo chato sensibilizadas com 10 &mu;g/mL de proteína recombinante purificada Nc56 e apresentou altas densidades ópticas tanto para soros bovinos positivos na RIFI para N. caninum quanto para T. gondii, quando comparadas com a densidade óptica do soro controle negativo. A proteína recombinante purificada e o extrato bruto de proteínas solúveis em tampão desnaturante foram submetidos ao teste de Western-blotting, para avaliação de antigenicidade frente a soros de animais positivos e negativos para N. caninum e T. gondii, previamente testados por RIFI. Os resultados apresentados nas duas técnicas (ELISA e Western-blotting) demonstram que a proteína recombinante purificada Nc56 de N. caninum possui reatividade cruzada entre os dois coccídeos, não se prestando, portanto, para uso em sorodiagnóstico da neosporose. / Neospora caninum, a protozoa phylogenetically related to other coccidea, is an obligatory intracellular parasite, able to cause abortions in bovine and neuromuscular paralysis in dogs. Researches with Neospora caninum antigens and recombinant proteins leads to numerous information to a better diagnosis and differentiation of several coccidea. The purposes of this study were expressing the Neospora caninum inner protein Nc56 in a prokaryotic system (Escherichia coli) and evaluate its antigenicity with i>Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive bovine sera. It was established the ideal conditions to express the protein (4 hour induction and 0,2% L-arabinose concentration) and, after that, two protein purification systems were assayed (immobilized metal affinity chromatography and elution from polyacrylamide gel) resulting in a better protein recuperation the elution method. A panel of previous RIFI-tested bovine sera was selected to evaluate the immune reactivity of Nc56 protein with Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive sera. The negative control was obtained from a Neospora caninum and Toxoplasma gondii negative newborn male bovine and the positive control was obtained from the same animal (6 month old), after the inoculation of live Neospora caninum tachyzoits. The indirect ELISA assay was performed in 96-wells microtiters plates, coated with purified Nc56 recombinant protein (10 µg/mL), resulting in higher optical densities for Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive sera, when compared with negative control. The purified recombinant protein and the crude extract of soluble proteins in denaturing binding buffer were submitted to Western-blotting to evaluate its antigenicity with Neospora caninum and Toxoplasma gondii/i> positive sera. The results obtained in both techniques shown that Nc56 purified recombinant protein has cross reactivity between both coccidea, therefore, it is not indicated to be used as antigen in neosporosis serodiagnosis.

Anticorpos monoclonais (AcMo) anti-&#946;2GPI foram obtidos de hibridomas produzidos pela fusão de linfócitos de camundongos com células SP2-O, de mieloma murino. A imunização foi realizada com proteína purificada de plasma humano, por cromatografia de afinidade em resina Sepharose-Heparina 6 Fast Flow (GE Healthcare). Os AcMo produzidos pelos hibridomas K257, K2II-3, K233, K22, K237 e K2124 foram estudados quanto à sua capacidade de reconhecer o antígeno adsorvido em suporte sólido (dot-blot, imunoblot, ELISA direto) e em solução (ELISA indireto). Todos os clones foram cultivados e expandidos in vivo (ascite) e in vitro (cultura convencional). Pretende-se a substituição da expansão in vivo pela produção em biorreator. Os AcMo produzidos reconheceram a &#946;2GPI em imunoblot com sensibilidade e especificidade variáveis. O desempenho dos AcMo K22 e K2124 no reconhecimento da proteína adsorvida em placas de ELISA (Maxisorp, NUNC), mostrou-se promissor para o desenvolvimento de um teste ELISA direto (sanduíche), em substituição ao ELISA indireto (competição) atualmente utilizado. O AcMo K22 mostrou reatividade semelhante à do anticorpo comercial 5F7 (ICN) em todos os testes realizados. Tanto o anticorpo produzido pelo clone K22 quanto seus fragmentos Fab, obtidos através de digestão enzimática, foram utilizados para identificação e quantificação da proteína em plasma e tecidos de ratos submetidos a um modelo de sepse e translocação bacteriana. Os resultados obtidos demonstram que a modulação das concentrações plasmáticas de &#946;2GPI e sua distribuição hepática dependem da intensidade e da via de infecção, e sugerem a presença de imunocomplexos da proteína in vivo. / &#946;2-glycoprotein I (&#946;2GPI) detection is important for the accurate diagnostic of autoimmune and chronic inflammatory disease. This project was designed in order to obtain specific monoclonal antibodies (MoAb) that could replace or add to the commercially available 5F7. It is intended to achieve a convenient in vitro production, in the near future. The &#946;2GPI antigen was purified from human plasma through Heparin-Sepharose 6 FF (GE Healthcare) affinity chromatography. Six different hybridomas were generated after the fusion of immunized mouse lymphocytes with SP2-O murine myeloma cells. The anti-&#946;2 GPI MoAb K257, K2II-3, K233, K22, K237, and K2124 were purified after clone expansion from ascites (in vivo) and conventional cellular culture (in vitro). MoAb reactivity was evaluated towards the &#946;2GPI antigen either adsorbed to solid phase support (Dot-Blot, imunoblot, direct ELISA), or in solution (indirect ELISA). All clones were positive in immunoblot. MoAb K237, K257 e K2124 recognized cleaved forms of the protein. The K22, K2124 and K257 MoAb were promising for the development of direct ELISA. Best sensibility was obtained with K22 AcMo in comparison to commercial reference 5F7 (ICN) in all tests. Both AcMo K22 and its digestion product K22Fab, could be applied in assays for &#946;2GPI on plasma and tissues of rats with good performance.

Com o objetivo de avaliar os equinos alojados no Jóquei Clube de São Paulo, Brasil, quanto a presença de anticorpos contra Theileria equi e Babesia caballi, foram testadas 180 amostras de soro sanguíneo por meio da técnica de C-ELISA (Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), metodologia atualmente recomendada pela OIE (Organização Internacional de Epizootíases) por ter alta sensibilidade e especificidade. A frequência de animais com sorologia positiva para Theileria equi foi de 6,66% (12/180), para Babesia caballi foi de 22,3% (40/180) e para infecção concomitante foi de 6,66% (12/180). Os resultados sorológicos obtidos por este estudo revelam que 35,5% (64/180) dos animais possuem anticorpos contra a babesiose equina sendo que a maioria dos animais acometidos tem dois e três anos de idade e portanto estão há menos tempo no hipódromo. Fatores como a ausência de carrapatos vetores, o uso de terapias babesicidas repetidas e o longo tempo de permanência dos animais no Jóquei após o tratamento, favorecem a diminuição dos títulos de anticorpos sem que ocorra reinfecção. Esses fatores podem justificar o menor número de animais com sorologia positiva para a doença nos cavalos com idade acima de quatro anos. Considerando-se esses resultados sugere-se que os animais sejam avaliados sorologicamente ao ingressarem no Jóquei Clube de São Paulo para que o uso de medicamentos contra a doença seja feito de forma adequada e para que os sinais clínicos compatíveis com babesiose equina em animais sorologicamente negativos sejam melhor avaliados e considerados em diagnósticos diferenciais. / In order to evaluate the presence of antibodies against Theileria equi and Babesia caballi in horses kept at the Jockey Club in São Paulo city, Brazil, a total of 180 samples of blood serum was tested using the Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (C-ELISA test). This methodology has been recommended by the International Organization of Epizooties (IOE) due to its high sensitivity and specificity. The frequency of seropositive animals for Theileria equi, Babesia caballi and for both was 6.66% (12/180), 22.3% (40/180) and 6.66% (12/180), respectively. Serological results showed that 35.5% of the animals (64/180) had antibodies against equine piroplasmosis; they were from two to three years old and were at the Jockey Club for a shorter period of time. Factors such as absence of thick vectors, repeated therapy using babesicidal drugs and the long period of time that the animals stayed in the Jockey Club after treatment favoured the lowering of antibody titers with no reinfection. These factors might be responsible for the fewer number of animals with positive serology for the disease in horses over four years of age. Based on these findings, animals should be serologically evaluated at the time of entrance into the Jockey Club so that the use of drugs against the disease be performed properly and clinical signs suggestive of equine babesiosis in serologically negative animals be better evaluated and considered for differential diagnosis.

A contaminação da água para consumo humano por toxinas produzidas por cianobactérias é um problema de saúde pública e das autoridades em todo o mundo. Microcistina-LR (MCLR) é uma cianotoxina heptapeptídica cíclica que inibe as proteínas fosfatases PP1 E PP2A nos hepatócitos. Microcistinas são produzidas por diversos gêneros de cianobactérias e mais de 70 variações estruturais têm sido caracterizadas em florações naturais. Por serem haptenos, as microcistinas são incapazes de induzir uma resposta imune em animais. Conseqüentemente, foi necessário aplicar métodos de conjugação envolvendo a adição de uma proteína carreadora, mcKLH (cationized Keyhole Limpet Hemocyanin). Portanto, o objetivo inicial desta tese foi o de obter anticorpos monoclonal (em camundongos) e policlonal (em coelho) anti- MCLR. Com relação ao anticorpo monoclonal foram obtidos 9 hibridomas (k29, k210, k317, k248, k284, k290, k2161, k2226, k2232), sendo que apenas 5 se mostraram estáveis (k29, k317, k248, k284, k2232). Estes foram selecionados para serem isotipados, expandidos em líquido ascítico, purificados em coluna cromatográfica de proteína-A e titulados. Dentre estes cinco hibridomas secretores de anticorpos, o clone k317 foi o que melhor reconheceu (mais específico) a toxina MCLR. Os anticorpos do sobrenadante de meio de cultura do hibridoma e o fluido ascítico purificado foram identificados pelo ensaio ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) previamente padronizado. Mesmo sensibilizando a placa de ELISA com diferentes antígenos, tais como MCLR-cBSA, MCLR, MCLR, MCRR, MCYR e MCLA, o clone 17 foi o que apresentou melhor linearidade frente às variantes de microcistina. Portanto, o clone 17 (isótipo IgG1) obtido é muito promissor e será usado para detecção de MCLR na água para consumo humano através do desenvolvimento de um kit de ELISA competição. Com relação ao anticorpo policlonal, o antígeno de imunização foi MCLR-mcKLH, enquanto que o antígeno de sensibilização foi MCLR-cBSA para o ensaio de titulação de anticorpos de classe IgG por ELISA indireto. Na seqüencia, foi padronizado um ensaio ELISA competição utilizando somente a toxina MCLR como antígeno de sensibilização. Este método Caseína foi padronizado, validado e comparado com o kit comercial Abraxis®. O kit ELISA competição que utiliza anticorpo policlonal, nomeado como método Caseína, foi avaliado quanto Limite Inferior de Quantificação, Especificidade, Seletividade, influência do metanol no ensaio, Recuperação, Linearidade, Precisão, Exatidão e Robustez. Este método de triagem apresentou excelente resultado quando comparado ao kit comercial Abraxis®, pois foi capaz de detectar tanto variantes de microcistinas como nodularinas no ambiente aquático. O ensaio ELISA competição utilizando anticorpo policlonal anti-MCLR foi submetido à patente pela Agência USP de Inovação (I.N.P.I. 018090046230). / The contamination of drinking water by cyanobacterial toxins is a public health issue and a concern for water authorities throughout the world. Microcystin-LR (MCLR) is a hazardous cyclic heptapeptide cyanotoxin, which inhibits protein phosphatase PP1 and PP2A in hepatocytes. Microcystins are produced by several genera of cyanobacteria and presents more than 70 structural variations characterized in natural blooms. As haptens, microcystins are unable to invoke an immune response in animals. Consequently, the application of conjugation methods with an additional carrier protein, the KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) was necessary. The main objective of this study was to obtain monoclonal (in mice) and polyclonal (in rabbits) antibodies for reacting against MCLR. In what refers to monoclonal antibodies, 9 hybridomas (k29, k210, k317, k248, k284, k290, k2161, k2226, k2232) were obtained; however only 5 were stables (k29, k317, k248, k284, k2232). These were selected to be isotyped, expanded in ascitic fluid, purified by protein-A column chromatography and then, they were titrated. Out of these five antibody-secretor hybridomas, clone k317 was the best to recognize (more specific) the MCLR toxins. Antibodies in hybridoma cell culture supernatant and purified ascites fluid were identified by ELISA assay (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) as prior standardized. Even when sensitizing ELISA plate with different antigens, as MCLR-cBSA, MCLR, MCLR, MCRR, MCYR and MCLA, clone 17 presented the best linearity against microcystin variants. Therefore, the obtained clone 17 (isotype IgG1) is a promising clone and shall be used for detecting MCLR in drinking water through the development of a competitive ELISA immunoassay kit. In what refers to the polyclonal antibody, MCLR-mcKLH was used as immunization antigen, while MCLR-cBSA was used as sensitizing antigen for the IgG titration assay by indirect ELISA. In the sequence, a competition ELISA assay was standardized using the MCLR toxin as sensitizing antigen. This Casein method was standardized, validated and compared to the commercial kit Abraxis®. The competition ELISA kit using polyclonal antibody, known as Casein method, was analyzed concerning its Quantification Inferior Limit, Specificity, Selectivity, methanol influence of the assay, Recuperation, Linearity, Precision, Accuracy and Robustness. This screening method reached excellent results if compared to the commercial kit Abraxis®, for being able to detect both the microcystins variants and the nodularins in aquatic environmental. The competition ELISA assay using anti-MCLR polyclonal antibody was submitted to the grant of a patent by USP Innovation Agency (INPI 018090046230).

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:29:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VERISSA MARTINS TEIXEIRA.pdf: 734398 bytes, checksum: ba115878ec5516b813d6bc6eedc4c03d (MD5) Previous issue date: 2010-10-01 / Visceral Leishmaniasis (VL), a widespread disease, becomes relevant for its high incidence and lethality in different countries around the world. Brazil follows the global trend, reaching 21 federate units. In the state of the Tocantins the illness indices are high, especially in the city of Araguaína, among the most prevalent of the country. The VL behaves as typical zoonose, the sandflies as vector and the dog as the main reservoir. In the urban area these canids are considered the main infection source due to the high skin parasitism and the man proximity. The canine epidemic is still important for it generally comes from the human epidemic. The diagnosis of the human and canine infection is mainly based on serological methods, in which the Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) stands out. Due to the illness endemic character, the more effective diagnostic methods became primordially available. Aiming to provide safer results free of interferences, as unspecified and immune complex reactions, frequently observed in the immune diagnostic of the human and canine VL, accomplished in this research, variations of the ELISA in serum samples from 140 dogs from the Tocantins endemic region. Verifying if there are unspecified reactions in the ELISA tests urea was added to the samples as diluents. The reduction of the optic densities was observed in the tested samples, presuming that it was break in the weak links or of low antibodies. Glicine and Tris were added to evaluate the interference of the immune complexes in the ELISA test to evaluate the interference with the pH shock, proving that there was an increase of the absorbing rate. These results suggest that method is effective to eliminate the complex antibodies, which had been blocked by circulating antigens. It is believed that the results acquired in this work are relevant in the perspective of the constant search for the diagnostic improvement of infectious and parasitic illnesses. / A leishmaniose visceral (LV), enfermidade de ampla distribuição, torna-se relevante pela alta incidência e letalidade relatadas em diferentes países do mundo. O Brasil acompanha a tendência global, com 21 unidades federadas atingidas. No estado do Tocantins são altos os índices da doença, especialmente na cidade de Araguaína, encontrada entre as mais prevalentes do país. A LV comporta-se como uma típica zoonose, tendo um flebótomo como vetor e o cão como o principal reservatório. Na área urbana esses canídeos são considerados a principal fonte de infecção devido ao alto parasitismo cutâneo e à proximidade ao homem. A epidemia canina é ainda importante por geralmente preceder a epidemia humana. O diagnóstico da infecção humana e canina baseia-se principalmente em métodos sorológicos, entre eles se destaca o Ensaio Imunoenzimático (ELISA). Devido ao caráter endêmico da doença, torna-se primordial que métodos diagnósticos mais efetivos sejam disponibilizados. Com o objetivo de fornecer resultados mais seguros e livres de interferentes, como reações inespecíficas e imunocomplexos, frequentemente observados no imunodiagnóstico da LV humana e canina, realizou-se através deste trabalho, variações de Ensaio Imunoenzimático em amostras de soro de 140 cães procedentes de região endêmica do estado do Tocantins. Para verificar se havia reações inespecíficas em testes ELISA adicionou-se ureia como diluente das amostras. Observou-se a diminuição das densidades ópticas das amostras testadas, presumindo que houve a quebra de ligações fracas ou de anticorpos de baixa avidez. Para avaliar a interferência de imunocomplexos no ensaio ELISA foram adicionados Glicina e Tris, com choque de pH, constatando-se que houve aumento do título das absorbâncias. Estes resultados sugerem que o método é efetivo para eliminar os anticorpos complexados, antes bloqueados por antígenos circulantes. Acredita-se que os resultados obtidos através deste trabalho sejam relevantes na perspectiva da busca constante pelo aprimoramento diagnóstico de doenças infecciosas e parasitárias.

A toxoplasmose afeta cerca de um bilhão de pessoa em todo mundo, é geralmente assintomática, apesar de doença ocular ou doenças grave e letal em fetos, pacientes com HIV e transplantados. A sorologia é a principal ferramenta para o diagnóstico e determinação de incidência, que é uma tarefa difícil, devido à alta prevalência na maioria dos países. Estudos de incidência são ideais em crianças, mas este grupo é protegido pela sociedade e de difícil abordagem por métodos invasivos como a punção venosa. A saliva pode ser uma ótima alternativa por sua coleta não ser invasiva, aceitável para crianças, e conter pequenas quantidades de IgG, eliminada através da mucosa gengival e fluido crevicular. Métodos de detcção de anticorpos disponíveis no mercado estão focados em amostras de soro, com baixa sensibilidade e são raros os relatos de pesquisas com material biológico alternativo, como a saliva. Sendo assim, padronizamos imunoensaios com alta sensibilidade para detecção de anticorpos anti- T. gondii na saliva frente a amostras de soro de 20 voluntários adultos. A sensibilidade e especificidade dos nossos dot-ELISA e ELISA de captura com proteína A foram semelhantes entre soro e saliva. Também testamos 100 amostras de saliva de universitários em nossos ensaios, onde mostramos uma frequência da toxoplasmose de 19% (IC 95% 12-28%). Imunoensaios para detecção de IgG anti-T. gondii em saliva são uma ferramenta muito promissora para estudos epidemiológicos da toxoplasmose em crianças ou outros grupos protegidos. / Toxoplasmosis that affects about one billion people worldwide is usually asymptomatic, despite ocular disease and severe and lethal disease in fetuses, AIDS patients and transplant recipients. Serology is the main approach for diagnosis and incidence determination is a difficult task due to high prevalence in most countries. Incidence studies are feasible in children but this age group is protected and difficult to approach by invasive methods as venipuncture. Saliva could be obtained by non-invasive procedure, acceptable for children, and it contains small amounts of IgG from mucosal and gingival crevicular fluid. Available antibody detection methods are focused in serum samples, with low sensitivity and few reports of alternative biological material, like saliva. Here, we standardized immunoassays with high sensitivity for detection of anti-T. gondii IgG in paired saliva and serum sample from 20 adult volunteers, which allows DOT-ELISA and a Protein A IgG capture assay. The sensitivity and specificity of the saliva DOT-ELISA were similar to sera ELISA. We also tested 100 saliva samples from university graduates in all assays, showing 19% (95%CI 12-28%) frequency of toxoplasmosis in this group, lower than reported for our area. Protein A IgG capture saliva assay was also efficient with similar results. Immunoassay with saliva IgG for toxoplasmosis is a very promising tool for use for the epidemiology of toxoplasmosis in children or other protected groups.