Submitted by Pós graduação Farmácia (ppgfar@ufba.br) on 2017-05-15T19:02:04Z No. of bitstreams: 1 ELIZABETE DE JESUS.pdf: 2250219 bytes, checksum: 4edb78551b0744264cf70e273e7072bc (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2017-05-23T21:16:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ELIZABETE DE JESUS.pdf: 2250219 bytes, checksum: 4edb78551b0744264cf70e273e7072bc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-23T21:16:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ELIZABETE DE JESUS.pdf: 2250219 bytes, checksum: 4edb78551b0744264cf70e273e7072bc (MD5) / FAPESB / O diagnóstico definitivo da estrongiloidíase é realizado pela pesquisa de larvas nas fezes utilizando o método de Baermann-Moraes, apesar da cultura em placa de agar (CPA) apresentar maior sensibilidade. Na maioria das infecções pelo Strongyloides stercoralis, a carga parasitária é baixa e a eliminação das larvas se faz de maneira intermitente, comprometendo a eficácia e precisão do diagnóstico. A pesquisa de anticorpos circulantes através do imunoensaio (ELISA) possui elevada sensibilidade e é utilizado também no auxílio ao diagnóstico da estrongiloidíase. Os objetivos deste trabalho foram (1) comparar os métodos de CPA, Baermann-Moraes e sedimentação espontânea para o diagnóstico da estrongiloidíase (2) avaliar o padrão de migração das larvas de S. stercoralis e ancilostomídeos em placas de agar e o tempo para positividade das culturas, (3) avaliar a interferência da refrigeração das fezes na viabilidade das larvas e (4) padronizar o ELISA para pesquisa de anticorpos anti-S. stercoralis. Para avaliar as sensibilidades dos métodos parasitológicos foram utilizadas 725 amostras de fezes de pacientes atendidos no Laboratório de Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia, UFBA, e amostras de soros de 50 pacientes com S. stercoralis, 80 de indivíduos com outras parasitoses e 60 soros controles negativos. A CPA mostrou maior sensibilidade tanto para Strongyloides stercoralis (95%) como para os ancilostomídeos (77%). As sensibilidades da CPA e do método de Baermann-Moraes reduziram aproximadamente 50% quando as amostras foram conservadas a 4ºC. Através do padrão de migração das larvas foi possível realizar a diferenciação de 95,7% das amostras positivas para Strongyloides stercoralis e de 96,7% para os ancilostomídeos, confirmadas através da microscopia. O tempo de visualização macroscópica dos caminhos, deixados pelas larvas também variou significativamente (p < 0,05) entre S. stercoralis e ancilostomídeos, ocorrendo principalmente no primeiro e quarto dias de incubação, respectivamente. No ELISA para detecção de IgG a sensibilidade variou de 72 a 76%, e a especificidade foi de 92,8%, não apresentando diferenças significativas quando o antígeno foi tratado ou não com metaperiodato de sódio. Por outro lado, o ELISA para pesquisa de IgE apresentou sensibilidade de 80 % e após o tratamento do antígeno com metaperiodato de sódio reduziu para 74% (p > 0,05). Enquanto não houve variações nas especificidades, obtidas nos ensaios utilizando soros normais como controles negativos. O número de reações cruzadas de soros de pacientes com outras helmintoses aumentou em torno de 16% quando o antígeno foi tratado com o oxidante. Neste estudo, foi observado que houve uma redução nas médias das densidades ópticas dos soros de pacientes infectados com S. stercoralis com relação aos soros normais, quando o antígeno foi tratado com metaperiodato de sódio, demonstrando a importância dos epitopos glicosilados para o reconhecimento dos anticorpos anti-S. stercoralis. A depleção de IgG dos soros falso-negativos elevou a sensibilidade do ELISA-IgE, porém houve um aumento do número de reatividades cruzadas. A CPA é o método parasitológico mais sensível para o diagnóstico da estrongiloidíase e deve ser recomendado no diagnóstico de rotina. O ELISA pode ser utilizado no auxílio diagnóstico, principalmente em casos pacientes de imunossuprimidos ou antes de terapia imunossupressora. / Definitive diagnosis of strongyloidiasis is usually made by detection of larvae in stool samples using the Baermann-Moraes method, although fecal cultures in agar plate (CPA) have shown higher sensitivity. In the majority of Strongyloides stercoralis infections, the parasite load is low and the larvae output is irregular, influencing the effectiveness and accuracy of diagnosis. The detection of circulating antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has high sensitivity and it is also used as a tool for strongiloidiasis diagnosis. The objectives of this work were (1) to compare the methods of CPA, Baermann-Moraes and sedimentation for diagnosis of strongyloidiasis, (2) to evaluate the migration pattern of the S. stercoralis and hookworm larvae and the time for positivity of cultures, (3) to evaluate the influence of stool refrigeration on the viability of larvae and (4) to standardize the ELISA protocol to dilution serum anti-S. stercoralis IgG antibodies. To determine the sensitivity of the diagnosis methods, 725 stool samples from patients attending to the Clinical Laboratory Analysis of Faculty of Pharmacy, UFBA and serum samples from 50 patients with S. stercoralis, 80 with other parasitic infections and 60 negative control sera were used. The CPA was the most sensitive for both S. stercoralis (95%) and for hookworm (77%). The sensitivities of CPA and Baermann-Moraes decreased about 50% when samples were stored at 4º C. The migration pattern of larvae permitted the differentiation of 92 (95.7%) S. stercoralis and of 89 (96.7%) hookworm positive samples, confirmed by microscopy. The time for visible tracks on agar varied significantly (P < 0.05) between S. stercoralis and hookworms, occurring mainly in the first and fourth day of incubation, respectively. The sensitivity of ELISA for IgG anti-S. stercoralis range from 72% to 76%, and specificity was 91.7%, not showing significant differences when the antigen was treated or not with sodium metaperiodate. On the other hand, the ELISA for IgE had a sensitivity of 80% and after treatment of the antigen with sodium metaperiodate it significantly decreased to 74% (P > 0.05), while the specificities of ELISA-IgE, calculated using normal sera as negative controls, did not present significant variations. However, the number of cross-reactions in ELISA-IgE increased approximately 18% when the antigen was treated with the oxidizing agent. In this study, it was observed a reduction in the mean optical densities of sera from patients infected with S. stercoralis, compared with normal serum, when the antigen was treated with sodium metaperiodate, demonstrating the importance of glycosylated epitopes for the recognition by anti-S. stercoralis antibodies depletion of IgG from false-negative serum, increased the sensitivity of ELISA-IgE, even though there was an increase in cross-reactivity. The CPA is the most sensitive method for the parasitological diagnosis of strongyloidiasis and it should be recommended for routine diagnosis. ELISA should be used for diagnosis of S. stercoralis, especially in cases of immunosuppressed patients or before immunosuppressive therapy.

Submitted by Pós graduação Farmácia (ppgfar@ufba.br) on 2017-05-30T20:39:16Z No. of bitstreams: 1 Flavia-Thamires -farmacia-final.pdf: 2671133 bytes, checksum: d04fe328ab695f2547b14e8d937e5959 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2017-06-01T17:33:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Flavia-Thamires -farmacia-final.pdf: 2671133 bytes, checksum: d04fe328ab695f2547b14e8d937e5959 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-01T17:33:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Flavia-Thamires -farmacia-final.pdf: 2671133 bytes, checksum: d04fe328ab695f2547b14e8d937e5959 (MD5) / FAPESB / O diagnóstico dos coccídeos Cryptosporidium e Isospora belli é realizado principalmente pela pesquisa de oocistos em esfregaços fecais corados. Entretanto, não existe uma padronização na rotina laboratorial para a identificação microscópica desses coccídeos. O diagnóstico da Cryptosporidium pode também ser realizado pela detecção de coproantígenos por ensaio imunoenzimático (ELISA) ou pela amplificação do DNA através da reação em cadeia da polimerase (PCR), dispensando a identificação morfológica dos oocistos. Além disso, a análise do polimorfismo genético de fragmentos de restrição (PCR-RFLP) pode ser utilizada na caracterização das espécies de Cryptosporidium, permitindo um melhor entendimento da dinâmica da transmissão deste parasito. Os objetivos deste trabalho foram: (1) comparar as técnicas de concentração de formol-acetato de etila (FE) e sedimentação por centrifugação (SC), bem como as técnicas de coloração de Ziehl-Neelsen modificado (ZN), auramina (AR) e safranina (SF) na detecção de oocistos de Cryptosporidium e Isospora belli em amostras fecais; (2) comparar a microscopia com a pesquisa de coproantígeno para o diagnóstico de Cryptosporidium e avaliar os resultados discordantes utilizando a PCR e (3) caracterizar as espécies de Cryptosporidium de amostras fecais humanas, através da PCR-RFLP. Para comparação entre os métodos de concentração de oocistos, FE e SC, e as técnicas de coloração, ZN, AR e SF, foram utilizadas amostras fecais positivas para Cryptosporidium (n=27) e I. belli (n=15), conservadas em formalina a 10%. Os métodos foram avaliados quanto ao número de oocistos detectados e a qualidade microscópica dos esfregaços. Para comparação entre o método de ZN e ELISA para o diagnóstico de Cryptosporidium foram examinadas amostras fecais de 626 crianças de diferentes grupos. Posteriormente, todas as amostras positivas para Cryptosporidium obtidas no estudo, juntamente com outros isolados disponíveis no laboratório, foram submetidos à extração de DNA e análise por Nested-PCR/RFLP dos genes COWP e 18S rRNA, para determinação das espécies de Crptosporidium. Os métodos SC e ZN identificaram mais oocistos de ambos parasitos do que os demais métodos avaliados (p<0,05). Houve perda de oocistos no anel de detritos gordurosos no FE em praticamente todas as amostras de Cryptosporidium e I. belli. Por outro lado, os métodos FE e AR apresentaram menos artefatos nos esfregaços comparados aos demais, sendo classificados com qualidade microscópica superior. A frequência de Cryptosporidium nas crianças foi de 2,6% (16/626), sendo maior no grupo com doença diarreica, enfatizando a importância deste coccídeo como agente etiológico da diarreia infantil. A sensibilidade e especificidade do ELISA foram de 85,7% e 99,7%, respectivamente. A eficiência da amplificação do DNA de Cryptosporidium foi de 92% (23/25), considerando os resultados dos dois genes analisados. As espécies do parasito identificadas foram C. hominis (78,3%), C. felis (8,7%), C. parvum (4,3%) e mistura C. felis + C. hominis (8,7%). Esses dados são os primeiros de genotipagem de Cryptosporidium de indivíduos de Salvador, demonstrando a predominância de C. hominis nas infecções, e a elevada frequência de C. felis, sugerindo um provável papel de gatos na transmissão do parasito aos humanos em nosso meio. / The diagnosis of coccidia Isospora belli and Cryptosporidium is usually accomplished by identification of oocysts in stained fecal smears. However, there is a lack of standardization in the routine laboratory for microscopic identification of these coccidia. The diagnosis of Cryptosporidium can also be done by detecting coproantigens using the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) or by parasite DNA amplification by polymerase chain reaction (PCR), eliminating the need of morphological identification of oocysts. Furthermore, the analysis of restriction fragment length polymorphism of amplified DNA (RFLP-PCR) can be used to characterize the species of Cryptosporidium, allowing a better understanding of the transmission dynamics of the parasite. The objectives of this study were: (1) to compare the techniques of concentration of formalin-ethyl acetate (FE) and sedimentation by centrifugation (SC), as well as the techniques of modified Ziehl-Neelsen (ZN), auramin (AR) and safranin (SF) in the detection of Cryptosporidium and Isospora belli in stool samples, (2) to compare the microscopy with coproantigen detection for the diagnosis of Cryptosporidium and evaluate discordant results using PCR and (3) to characterize the species Cryptosporidium in human fecal samples by PCR-RFLP. To compare the methods for concentration, FE and SC, and staining of oocysts, ZN, AR and SF, there were used positive fecal samples for Cryptosporidium (n = 27) and I. belli (n = 15), preserved in 10% formalin. The methods were evaluated according the numbers of oocysts detected and the microscopic quality of smears. For comparison between ELISA and ZN for the diagnosis of Cryptosporidium in faecal samples, there were examined 626 stool samples from children of different groups. Subsequently, all positive samples for Cryptosporidium obtained in the study, along with other isolates available in the laboratory, were subjected to DNA extraction and analysis by Nested-PCR/RFLP of the COWP and 18S rRNA genes to determine the species of Crptosporidium. The SC and ZN methods identified more oocysts of both parasites than other methods tested (p <0.05). The loss of oocysts in the fatty debris layer of FE method was observed in all Cryptosporidium and I. belli samples. Moreover, the methods of FE and AR had fewer artifacts in smears compared to the others, being ranked with higher microscopic quality. The frequency of Cryptosporidium in children was 2.6% (16/626), being higher in patients with diarrheic disease, emphasizing the importance of this protozoan as etiologic agent of childhood diarrhea. The sensitivity and specificity of ELISA were 85.7% and 99.7%, respectively. The efficiency of amplification of Cryptosporidium DNA was 92% (23/25), considering the results of the two genes. The species of the parasite identified were C. hominis (78.3%), C. felis (8.7%), C. parvum (4.3%) and a mixture of C. felis + C. hominis (8.7%). To our knowledgment, these data represent the first genotyping study of Cryptosporidium from individuals of Salvador, demonstrating the dominance of C. hominis infection and the high frequency of C. felis, suggesting a potential role of cats in the transmission of the parasite to humans in our area.

MARTINS, C. H. S. Desigualdade isoperimétrica: aspectos históricos e uma abordagem para o ensino médio. 2016. 30f. Dissertação (Mestrado Profissional em Matemática) - Departamento de Matemática, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Jessyca Silva (jessyca@mat.ufc.br) on 2017-03-06T15:32:24Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_chsmartins.pdf: 555526 bytes, checksum: 8868d747ffd7a013dc7e9a39950f6b99 (MD5) / Rejected by Rocilda Sales (rocilda@ufc.br), reason: Ficha catalográfica e o Sumário não estão de acordo com os padrões adotados na UFC. on 2017-03-06T15:39:46Z (GMT) / Submitted by Jessyca Silva (jessyca@mat.ufc.br) on 2017-03-08T13:51:28Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_chsmartins.pdf: 14646883 bytes, checksum: ffc10a0c4a1110c572c44d1d66359c38 (MD5) / Approved for entry into archive by Rocilda Sales (rocilda@ufc.br) on 2017-03-08T15:16:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_chsmartins.pdf: 14646883 bytes, checksum: ffc10a0c4a1110c572c44d1d66359c38 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-08T15:16:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_chsmartins.pdf: 14646883 bytes, checksum: ffc10a0c4a1110c572c44d1d66359c38 (MD5) Previous issue date: 2016-01-15 / This dissertation aims to know the historical process of the emergence of mathematics and isoperimetric inequalities, as well as to present approaches of isoperimetric problems that can be used in high school. On order to achieve the objective of this research, bibliographical research was adopted as methodology. Despite the long existence of the study of the isoperimetric problem over time this is still the focus of many mathematicians. Many generalizations of isoperimetric inequalities in the most varied mathematical contexts are much studied in different areas of mathematical investigation. Ot is pertinent to note that demonstrations can be made in various ways and the approach to these formulas is scarcely mentioned in the books. The organization of school knowledge allows us to introduce a new pedagogical practice of the teacher, in which the process of reflection and interpretation about different procedures allows us to establish a relation between theory and everyday life. With the proposals here reported it is desired to continue adding new elements capable of enriching and making more accessible the process of construction of mathematical knowledge in this area. Since all mathematical theoretical knowledge that has existed before by actual experience, our preoccupation with contextualizing isoperimetric inequalities in their initial event, as well as punctuating some questions of the development of mathematics, proving how much it has arisen, is and will be relevant to the development of man. / Essa dissertação tem como objetivo conhecer o processo histórico do surgimento da matemática e das desigualdades isoperimétricas, bem como apresentar abordagens de desigualdades isoperimétricas que podem ser utilizadas no ensino médio. Para concretização do objetivo dessa pesquisa adotou-se como metodologia a pesquisa bibliográfica. Apesar da longa existência do estudo do problema isoperimétrico ao longo dos tempos este ainda é alvo da atenção de muitos matemáticos. Muitas generalizações de desigualdades isoperimétricas nos mais variados contextos matemáticos são muito estudadas em diferentes áreas de investigação matemática. Sendo pertinente observar que as demonstrações podem ser feitas de várias maneiras e a abordagem dessas fórmulas é pouco citada nos livros. A organização dos conhecimentos escolares permitem introduzir um novo fazer pedagógico do professor, na qual o processo de reflexão e interpretação sobre diferentes procedimentos permitem estabelecer uma relação entre a teoria e o cotidiano. Com as propostas aqui relatadas deseja-se continuar agregando novos elementos capazes de enriquecer e tornar mais acessível o processo de construção do conhecimento matemático nessa área. Visto que todo conhecimento teórico matemático que existe passou antes pela experiência real, daí nossa preocupação de contextualizar as desigualdades isoperimétricas em seu evento inicial, bem como pontuar algumas questões do desenvolvimento da matemática, provando o quanto seu surgimento foi, é e será relevante para o desenvolvimento do homem.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A candidíase nosocomial é grande preocupação em hospitais terciários em todo o mundo. A infecção ocorre geralmente em pacientes com doenças neoplásicas e degenerativas e é considerada a quarta causa mais freqüente de infecções sangüíneas. O diagnóstico da candidemia ou candidíase hematogênica tem sido problemático porque os sinais e sintomas clínicos são inespecíficos, o que conduz a atrasos no diagnóstico e, conseqüentemente, na terapia antifúngica apropriada. Desenvolvemos a técnica de ELISA de inibição para a detecção do antígeno de 65 kDa em modelo experimental de candidemia e para o diagnóstico de pacientes em UTI com suspeita de candidemia. Anticorpo monoclonal anti-65 kDa foi produzido e testado para a detecção do antígeno comum de 65 kDa produzido por C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis em modelos murinos candidemia. No modelo experimental o antígeno de 65 kDa foi detectado no soro do camundongos em concentrações variando de 0,012 a 3,25 μg / ml. Vinte pacientes com candidemia foram avaliados pelo teste de ELISA de inibição em soros seqüenciais. Dezesseis (80%) pacientes apresentavam o antígeno de 65 kDa em concentrações variando de 0,07 a 5,0 μg/ml. Os soros sequenciais de pacientes com candidemia apresentaram 3 diferentes padrões de antigenemia; 1 – clareamento total da antigenemia; 2-clareamento inicial e recidiva da antigenemia; e 3 – clareamento parcial da antigenemia. Nossos resultados indicam que a detecção da molécula de 65 kDa pode ser muito útil para o diagnóstico de candidemia por C. albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis. Avaliamos também um possível papel biológico da molécula de 65 kDa. Os ensaios demonstraram que a proteína de 65 kDa tem ligantes de fibronectina de matriz extracelular, tendo um possível papel da adesão do fungo no hospedeiro. / Nosocomial candidiasis is a major concern in tertiary care hospitals worldwide. This infection generally occurs in patients with degenerative and neoplastic diseases and is considered the fourth most frequent cause of bloodstream infections. Diagnosis of candidemia or hematogenous candidiasis has been problematic because clinical signs and symptoms are nonspecific, leading to delays in diagnosis and, consequently, in appropriate antifungal therapy. We developed an inhibition ELISA for detection of a 65 kDa-antigen in an experimental model of candidemia and for diagnosis of patients in ICUs with suspected candidemia. An anti-65 kDa monoclonal antibody was tested for detection of the 65 kDa antigen produced by C. albicans, C. tropicalis, and C. parapsilosis in murine candidemia models. The 65 kDa-antigen was detected in sera at concentrations ranging from 0.012 to 3.25 μg/ml. A total of 20 human patients with candidemia were then evaluated with the inhibition ELISA using sequential sera. Sixteen (80%) patients had the 65 kDa-antigen in concentrations ranging from 0.07 to 5.0 μg/ml. Sequential sera from patients with candidemia presented 3 different patterns of antigenemia of the 65 kDa molecule; 1- total clearance of antigenemia; 2-initial clearance and relapse of antigenemia; and 3- partial clearance of antigenemia. Our results indicate detection of the 65 kDa protein may be a valuable tool in the diagnosis of candidemia by C. albicans, C. tropicalis, and C. parapsilosis. We also evaluated a possible biological role of the molecule of 65 kDa from C. albicans. The tests showed that the protein of 65 kDa is bound to fibronectin from extracellular matrix, and a possible role of the adhesion of the fungus in the host. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 1998-09-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:16Z : No. of bitstreams: 1 Publico-1314a.pdf: 1547041 bytes, checksum: 5721c6a6789d2572f41f8e8e19258df4 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:16Z : No. of bitstreams: 2 Publico-1314a.pdf: 1547041 bytes, checksum: 5721c6a6789d2572f41f8e8e19258df4 (MD5) Publico-1314b.pdf: 1824367 bytes, checksum: 58636206749c6250ea31e3d8ce055272 (MD5) / A neuroesquistossomose é uma das manifestações ectópicas da esquistossomose. Das cinco principais espécies que causam doença no homem, apenas a espécie Schistosoma mansoni está presente no Brasil. E uma estimativa atual da prevalência desta parasitose em nosso meio gira é de 9 a 10%. Portanto, a manifestação neurológica da esquistossomose, apesar de pouco comum, em nosso meio assume relevada importância principalmente por ser muito incapacitante e por atingir uma população jovem. Apesar destes argumentos, a neuroesquistossomose é geralmente diagnosticada tardiamente. O diagnóstico é feito por exclusão de outras doenças e por suposição, quando há esquistossomose associado a alteração neurológica característica que esta espécie determina. Estes procedimentos podem induzir erro além de retardar o diagnóstico, principalmente em regiões endêmicas. Portanto, este trabalho prospectivo visou determinar o valor das reações de imunofluorescência indireta e reação imunoenzimática no líquido cefalorraquiano para o diagnóstico da neuroesquistossomose. Após apreciação e aprovação do protocolo de investigação pela Comissão de Ética Médica do Hospital São Paulo / Universidade Federal de São Paulo, foram coletadas amostras de líquido cefalorraquiano de pacientes de 4 grupos distintos: &#61656;Grupo I: pacientes com diagnóstico clínico de neuroesquistossomose, com protoparasitológico positivo para Schistosoma mansoni; líquido cefalorraquiano sem bloqueio do espaço subaracnoideo, mostrando processo inflamatório linfomonocitário predominante; excelente resposta clínica à terapêutica com praziquantel e decadron, com recuperação completa ou com discretas seqüelas. &#61656;Grupo II: pacientes com esquistossomose mansônica diagnostica por exame protoparasitológico positivo para Schistosoma mansoni, sem queixa neurológica e com o exame neurológico normal. &#61656;Grupo III: pacientes com neurocisticercose diagnosticada por reações imunobiológicas no líquido cefalorraquiano ou exame neurorradiológico compatível, sem esquistossomose. &#61656;Grupo IV: pacientes do ambulatório geral da neurologia, com doenças neurológicas variadas, que realizaram exame de líquido cefalorraquiano como parte da investigação neurológica. Estes pacientes não apresentavam esquistossomose nem cisticercose, comprovados por reações imunobiológicas e por exames radiológicos. As amostras de LCR foram submetidas às reações de imunofluorescência indireta, usando conjugados anti-IgG e anti-IgM, frente a preparados parafinados e congelados de antígenos de verme adulto macho e ovos maduros viáveis de Schistosoma mansoni. As amostras também foram submetidas ao exame imunoenzimático, utilizando conjugado anti-IgG, em antígenos solúveis de vermes adultos de Schistosoma mansoni. A análise dos resultados mostrou que reação mais indicada para o diagnóstico da neuroesquistossomose é a reação de imunofluorescência em corte parafinado de verme adulto de Schistosoma mansoni, usando como conjugado fluoresceínico o anti-IgM humano porque, das reações com alta especificidade (90,8%), é a que tem maior valor preditivo positivo (88,2%). A reação de imunofluorescência indireta em corte parafinado não detecta anticorpos anti-Schistosoma mansoni no líquido cefalorraquiano de pacientes esquistossomóticos sem comprometimento neurológico. A reação de imunofluorescência indireta em cortes congelados de antígenos, com conjugado anti-imunoglobulina humana G, pode ser positiva em pacientes com esquistossomose sem neuroesquistossomose. Nas amostras de LCR de pacientes com neurocisticercose, ocorreram reações inespecíficas independentemente do antígeno utilizado, especialmente na reação imunoenzimática, que chegou a ter 1/3 das amostras positivas neste grupo. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Master of Science / Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology / A. Sally Davis / Rift Valley fever virus (RVFV) is a mosquito-borne, zoonotic Phlebovirus that is a significant threat to ruminants and humans. RVFV is categorized as an overlap Select Agent by the Department of Health and Human Services and US Department of Agriculture. Therefore, the study of RVFV’s pathogenesis and the development of novel diagnostic tools for the prevention and control of outbreaks and virus spread is crucial. RVF is endemic to sub-Saharan Africa but has spread beyond the continent to the Arabian Peninsula indicating the competence of the virus to emerge in new areas. Thus, the high likelihood of RVF’s spread to other non- endemic countries also spurs the need for development and implementation of rapid diagnostic tests and surveillance programs. In the US, RVFV is a Select Agent, requiring BSL-3 enhanced containment practices for research work. First, we developed a method for the detection of RVFV RNA by reverse transcriptase real-time PCR (RT-qPCR) using non-infectious, formalin- fixed, paraffin-embedded tissues (FFPET). The results from FFPET RT-qPCR were compared to prior results for fresh-frozen tissues (FFT) RT-qPCR, as well as immunohistochemistry and histopathology completed on the same FFPET blocks. We developed a novel technique using a rapid and low cost magnetic bead extraction method for recovery of amplifiable RVFV RNA from FFPET. FFPET RT-qPCR can serve as an alternative tissue-based diagnostic test, which does not require a BSL-3 research facility. Second, we assessed the diagnostic accuracy and precision of a recombinant RVFV nucleoprotein based competitive ELISA (cELISA) assay to detect RVFV antibodies. The cELISA results were compared to the virus neutralization test, the gold standard serological assay for RVFV. This prototype cELISA is easy to implement, sensitive, specific, and safe test for the detection of antibodies to RVFV in diagnostic and surveillance applications. RVF is an important transboundary disease that should be monitored on a regular basis. The diagnostic tests developed and validated in this thesis could be used in endemic or non-endemic countries for the early detection of RVF and assist with the implementation of countermeasures against RVFV.

Slutsteget i immunförsvarets komplementaktivering innefattar en klyvning av komplementprotein C5, till C5a och C5b, vilket initierar bildandet av terminalt komplementkomplex (TCC) som i form av membran-attack-komplex (MAC) bildar cytotoxiska porer i bland annat gramnegativa bakterier. Bildandet av MAC kan blockeras av endogena regulatorer och TCC frisätts då som ett lösligt komplex, sC5b-9, i plasma. I examensarbetet studerades en variant av TCC, som i tidigare studier visats bildas oberoende av C3- och C5-konvertas när serum surgjorts till pH &lt; 7,0 in vitro. Syftet med studien var att studera om detta atypiska TCC (aTCC) bildades hos grisar, som i en mekonium aspirationssyndrom (MAS)-modell, erhållit ett sänkt systemiskt pH in vivo. I syftet ingick också att etablera en ELISA-baserad metod för att analysera aTCC. I en sandwich ELISA användes monoklonal anti-C5a/C5a (desArg) (klon T13/9) som fångande antikropp och monoklonal anti-C9 (klon aE11) som detekterande antikropp för att analysera aTCC i plasmaprover från 18 MAS-grisar, samt i ett kontrollmaterial bestående av grisserum som surgjorts till pH 6,8 och 6,4 in vitro. Mängden aTCC i kontrollproverna ökade när pH sänktes men innehållet av aTCC i plasmaproverna minskade över MAS-studiens förlopp. När den relativa förändringen i aTCC relaterades till MAS-grisarnas slutliga pH kunde ett signifikant samband ses (p = 0,02) som visade att en större förändring i aTCC sammanföll med ett lägre slutligt pH. Nivåerna av aTCC var generellt sett högre i plasmaproverna jämfört med kontrollproverna vilket skulle kunnat bero på skillnader i plasma vs serum avseende aTCC eller att proverna kom från grisar med olika ålder och vikt. Avsaknad av grisspecifik standard och negativ kontroll samt lågt signal/brusförhållande bidrar till felkällor för analysen och denna kräver fortsatt optimering. / The late steps of complement activation involves a cleavage of complement protein C5, to C5a and C5b, which initiates the formation of terminal complement complex (TCC). The final complex is referred to as the membrane-attack-complex (MAC) which forms cytotoxic pores in, inter alia, gram-negative bacteria. The formation of MAC can be inhibited by endogenous regulators and the TCC is then released as a soluble complex, sC5b-9, in plasma. In the degree project, another type of TCC was studied, which in previous studies had shown to form independently of C3 and C5 convertases when serum was acidified to pH &lt;7.0 in vitro. The purpose of the study was to investigate whether this atypical TCC (aTCC) was formed in piglets, which in a model of meconium aspiration syndrome (MAS), received a reduced systemic pH in vivo. The purpose was also to establish an ELISA for analyzing aTCC. Sandwich ELISA, with monoclonal anti-C5a / C5a (desArg) (clone T13/9) as a capture antibody and monoclonal anti-C9 (clone aE11) as a detection antibody, was used to analyse aTCC in plasma samples from 18 MAS piglets, and in control samples consisting of pig serum acidified to pH 6.8 and 6.4 in vitro. The amount of aTCC in the control samples increased when the pH was lowered, but the content of aTCC in the plasma samples decreased over the course of the MAS study. When the relative change in aTCC was related to the final pH of the MAS pigs, a significant relationship could be seen (p = 0.02) which showed that a major change in the aTCC coincided with a lower final pH. aTCC were generally higher in plasma samples compared with control samples, which could be due to differences in plasma vs serum for aTCC or that the samples came from pigs of different age and weight. Lack of pig-specific standard and negative control as well as low signal to noise ratio contribute to sources of error for the analysis and this requires continued optimization.

A Aflatoxina M1 (AFM1) é um metabólito tóxico que pode ser secretado no leite de animais contaminados com Aflatoxina B1 (AFB1). A ingestão do produto contaminado pode causar efeitos adversos de forma aguda ou crônica, sendo necessária não somente sua detecção, mas quantificação para um consumo seguro dos alimentos. Como os queijos coloniais são oriundos de pequenas propriedades rurais, muitas sem uma efetiva fiscalização e que são não somente consumidos pela família, mas também comercializados principalmente em pequenos estabelecimentos às margens de rodovias, este trabalho visa justamente avaliar o índice de contaminação em queijos coloniais produzidos artesanalmente comercializados em estabelecimentos às margens de rodovias de grande fluxo no vale do Taquari. Foram analisadas 15 amostras de queijos comercializados em estabelecimentos comerciais às margens das rodovias BR 386 e RS 287 na região do vale do Taquari, no estado do Rio Grande do Sul. A metodologia empregada na análise de Aflatoxina M1 envolveu uma partição líquido-líquido na etapa de extração e purificação e Enzimaimunoensaio em fase sólida (ELISA) para detecção e quantificação. O limite mínimo de detecção foi 16 ng/Kg (0,016 μg/Kg) e a avaliação da eficiência do método foi superior a 90% no teste de recuperação. Todas as amostras analisadas apresentaram níveis de AFM1, sendo que quatro delas apresentaram níveis superiores ao limite máximo toleradoestabelecido pela Comunidade Européia( 0,25μgKg). Nenhuma das amostras apresentou níveis superiores ao limite máximo tolerado definido pela legislação nacional (2,5 μg/Kg). Estes dados indicam a necessidade de um melhor controle na produção de queijos coloniais, principalmente das condições em que foram obtidas a matéria prima para o seu manufaturamento. / Aflatoxin M1 (AFM1) is a toxic metabolite that can be secreted into the milk of animals infected with Aflatoxin B1 (AFB1). Ingestion of the contaminated product may cause acute or chronic adverse effects, requiring not only its detection, but quantification for safe consumption of food. As the colonial cheeses come from small rural properties, many without an effective inspection and that are not only consumed by the family, but also marketed mainly in small establishments along roadsides, this work aims precisely to evaluate the contamination index in produced colonial cheeses traded in establishments along the banks of high-flow roads in the Taquari valley. Fifteen samples of cheeses marketed in commercial establishments along the BR 386 and RS 287 highways in the Taquari valley region in Rio Grande do Sul State were analyzed. The methodology used in the analysis of Aflatoxin M1 involved a liquid-liquid partition in step extraction and purification and solid phase enzyme immunoassay (ELISA) for detection and quantification. The minimum detection limit was 16 ng / kg (0.016 μg / kg) and the efficiency evaluation of the method was over 90% in the recovery test. All samples analyzed showed levels of AFM1, four of which presented levels above the maximum tolerated limit established by the European Community (0.25 μg kg). None of the samples had levels above the maximum tolerated limit defined by national legislation (2,5 μg / kg). These data indicate the need for a better control in the production of colonial cheeses, mainly from the conditions in which the raw material was obtained for its manufacture.

A doença de von Willebrand (DvW) é um defeito qualitativo/quantitativo do fator de von Willebrand (FvW), uma glicoproteína que desempenha um papel essencial na adesão e agregação plaquetária. Cães acometidos por esta diátese hemorrágica hereditária podem ser assintomáticos, ou apresentar sinais clínicos de um problema hemostático primário, especialmente hemorragias em superfícies mucosas. O diagnóstico da DvW baseia-se na quantificação do FvW plasmático, este sendo atualmente realizado por ELISA – antígeno FvW (Ag:FvW). O presente trabalho desenvolveu um ensaio para quantificação do Ag:FvW em amostras caninas e aplicou o teste em uma população de cães. Também determinou intervalos de referência para o ensaio e para tempos de coagulação. O ensaio apresentou R² médio de 0,9810, com coeficientes de variação intra-teste de 1,83 a 4,54% e entre-teste de 9,02 a 17,75%. Valores de referência para Ag:FvW, Tempo de Protrombina e Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada obtidos foram de 24,87 a 224,5%, 6,0 a 9,3 segundos e 15,2 a 24,5 segundos, respectivamente. Completando, foi feita uma revisão da literatura sobre a doença em cães. Em conclusão, a determinação do Ag:FvW é um teste essencial para pacientes com histórico de diátese hemorrágica sem coagulopatia e/ou trombocitopenia e pode ser conclusivo para o diagnóstico de DvW. Obter valores de referência para a população local e padronizar os reagentes e instrumentos utilizados são extremamente importantes para um diagnóstico acurado dos distúrbios de hemostasia. Finalmente, um caso clínico de um cão com DvW também foi descrito. / The von Willebrand disease (vWD) is a von Willebrand factor (vWF) quantitative/qualitative defect. This glycoprotein plays a crucial role on platelet adhesion and aggregation. Dogs affected by the hemorrhagic diathesis may be asymptomatics, or show clinical signs of a primary hemostatic disturbance, such as bleeding from mucosal surfaces. The diagnosis is based on vWF quantification by ELISA techniques – vWF antigen (vWF:Ag). The current study developed an assay for vWF:Ag quantification on canine samples, and the test was conducted on a dog population. Also, reference intervals were determined for this assay and for clotting times. The assay achieved a mean R² of 0.9810, with coefficient of variation for intra-assay of 1.83 to 4.54% and for inter-assay of 9.02 to 17.75%. The vWF:Ag assay, Prothrombin Time and activated Partial Thromboplastin Time reference intervals were 24.87 to 224.5%, 6.0 to 9.3 seconds and 15.2 to 24.5 seconds, respectively. In addition, a literature review about the disease in dogs was done. In conclusion, vWF:Ag determination is an essential assay for patients with hemorrhagic diathesis history without coagulopathy and/or thrombocytopenia, and might be conclusive for the disease diagnosis. Reference values for local population and standard protocols are extremely important for an accurate diagnosis of disorders of hemostasis. Finally, a case report of a dog with vWD was also described.

Evaluation of the antiviral effectiveness of ribavirin and acyclic nucleotide phosphonates to radish mosaic virus. Virus inoculation of plants with RaMV and immunological assay of the virus by ELISA. Subsequent application of antiviral agents and monitoring relative content of the virus in plants. Subsequent processing of data in tables and graphs, and then statistical evaluation.