Orientador: Leonardo Susumu Takahashi / Resumo: Os aminoácidos e seus metabólitos são importantes reguladores das principais vias metabólicas dos peixes, essenciais para manutenção, crescimento, reprodução, comportamento, imunidade e resistência a diversos agentes estressores. Nesse sentido, os objetivos dos trabalhos foram avaliar a influência que uma dieta deficiente em aminoácidos essenciais exerce na capacidade imune e oxidativa de tilápias do Nilo (O. niloticus) em fase de terminação, e averiguar a reposta imunológica e oxidativa de juvenis de tilápia alimentados com dieta contendo níveis crescentes de inclusão do aminoácido histidina desafiados com lipopolissacarídeo. Ao todo foram utilizadas 774 tilápias (264 em fase de terminação e 510 juvenis) em dois experimentos distintos com delineamentos inteiramente ao acaso. No primeiro ensaio foram avaliadas 11 dietas experimentais (controle e dietas deficientes em cada um dos dez aminoácidos essenciais) em variáveis do sistema imune não especifico e atividade hepática de enzimas do sistema antioxidante de tilápias, e o segundo, os níveis de inclusão de histidina na dieta sobre as mesmas variáveis, em juvenis de tilápias desafiados com lipopolissacarídeo. Os resultados mostraram que dietas deficientes em aminoácidos essenciais influenciam na capacidade imunomodulatória e oxidativa de tilápias em terminação, e o nível ideal de inclusão de histidina na dieta pode potencializar essas capacidades frente a um desafio. Investigar o efeito do metabolismo de aminoácidos no potencia... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Amino acids and their metabolites are important regulators of the main metabolic pathways of fish, essential for maintenance, growth, reproduction, behavior, immunity and resistance to various stressors. In this sense, the objectives of the works were to evaluate the influence that a diet deficient in essential amino acids has on the immune and oxidative capacity of Nile tilapia (O. niloticus) in the process of termination, and also to investigate the immune and oxidative response of juvenile tilapia fed a diet containing increasing levels of inclusion of the amino acid histidine challenged with lipopolysaccharide. In total, 774 tilapia (264 in the finishing phase and 510 juveniles) were used in two different experiments with completely randomized designs. In the first trial, 11 test diets (control and diets deficient in each of the ten essential amino acids) were evaluated on non-specific immune system variables and liver activity of tilapia antioxidant system enzymes, and the second, the levels of inclusion of histidine in the diet on the same variables, in tilapia juveniles challenged with lipopolysaccharide. The results show that diets deficient in essential amino acids influence the immunomodulatory and oxidative capacity of finishing tilapia, and the ideal level of histidine inclusion in the diet can enhance these capacities in the face of a challenge. Investigating the effect of amino acid metabolism on the immune and oxidative potential of tilapia can be a tool in hel... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Se determinó los niveles de las enzimas antioxidantes: Glutation Peroxidasa (GPx), Superóxido Dismutasa (SOD) y Catalasa (CAT); y la concentración de Malondialdehído (MDA) como un indicador de la peroxidación lipídica, en eritrocitos de 60 personas aparentemente sanas: 30 residentes de la altura (Cerro de Pasco, 4340 m.s.n.m.) y 30 residentes de nivel del mar (Lima, 150 m.s.n.m.). Se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los niveles eritrocitarios de Glutation peroxidasa de los nativos de altura (66,86 ± 8,97 U GPx / g Hb) y los de nivel del mar (37,78 ± 8,87 U GPx / g Hb), (p < 0,001). No se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los valores obtenidos para la Superóxido dismutasa de la altura y de nivel del mar: 4140,56 ± 1147,69 U SOD / g Hb vs. 4104,35 ± 1917,9 U SOD / g Hb, respectivamente. La actividad de la enzima Catalasa fue menor en los sujetos de altura (275,27 ± 44,21 k CAT / g Hb) en relación con los de nivel del mar (414,29 ± 81,07 k CAT / g Hb), siendo esta diferencia estadísticamente significativa (p < 0,001). Los niveles de Malondialdehído en los nativos de altura también fueron menores (8,60 ± 1,91 nMol MDA / g Hb) que los obtenidos a nivel del mar (11,16 ± 1,55 nMol MDA / g Hb), (p < 0,001). / It was determined the levels of the antioxidants enzymes: Glutathione Peroxidase (GPx), Superoxide Dismutase (SOD) and Catalase (CAT); and the concentration of Malondialdehyde (MDA) like an indicator of the lipid peroxidation in erythrocytes of 60 seemingly healthy people: 30 residents at the high altitude (Cerro de Pasco, 4340 m above sea level) and 30 residents at sea level (Lima, 150 m above sea level). It was found significant difference stadistic between erythrocyte levels of Glutathione peroxidase higher in the native of high altitude (66,86 ± 8,97 U GPx / g Hb) and people living at sea level (37,78 ± 8,87 U GPx / g Hb), (p < 0,001). It was not found significant difference stadistic between the values obtained of Superoxide dismutase at high altitude and sea level: 4140,56 ± 1147,69 U SOD / g Hb vs. 4104,35 ± 1917,9 U SOD / g Hb, respectively. The Catalase enzyme activity was smaller in subjects of high altitude (275,27 ± 44,21 k CAT / g Hb) that in subjects at sea level (414,29 ± 81,07 k CAT / g Hb), this difference was significant (p < 0,001). The levels of Malondialdehyde in the native of high altitude were also smaller (8,60 ± 1,91 nMol MDA / g Hb) that in those obtained at sea level (11,16 ± 1,55 nMol MDA / g Hb), (p < 0,001). / Tesis

A maca é uma raiz aromática com 52 a 76% de carboidratos e seu período de conservação pós-colheita é bastante longo, sem demonstrar sinais de deterioração. O mecanismo de degradação do amido e dos componentes da parede celular via ação enzimática não eram ainda conhecidos. O objetivo do trabalho foi caracterizar a ação de enzimas amilolíticas e pectinolíticas nessas raízes, bem como a morfologia do grânulo de amido e a composição centesimal. Os resultados mostraram que foi obtida a purificação parcial de &#946;-amilase com peso molecular aproximado de 57 kDa, com atividade máxima a 40,7 ºC e pH de 5,1. A pectinesterase foi extraída a pH 6,0 com maior atividade a 49,4ºC e pH 6,6 a maior atividade da poligalacturonase foi a 46 ºC e pH 5,4, quando extraída a pH 8,5.O teor de amido total foi de 8,92%, os grânulos apresentaram morfologia oval em observados em microscopia eletrônica de varredura (MEV). / Maca is an aromatic root that contends 52 to 76 per cent of carbohydrates and is very stable for a long period without signals of deterioration. The degradation mechanisms of the reserve carbohydrates and the cell wall components by enzymatic way had not been described yet. The main objective of this study was the identification of inner enzymes which degrades the starch and the pectins; the others objectives were the analysis and the morphology of the starch grains as well as the root\'s contend composition. The results showed that was obtained the partial purification of a &#946;- amylase, characterized by the molecular mass of 57 kDa, with a highest activity at 40.7 °C and pH 5.1. The pectinesterease was extracted with a pH of 6.0 and its maximum activity was at 49.4 °C and pH 6.6; the polygalacturonase was extracted with a pH of 8.5 and its top activity was achieved at 46 °C and pH 5.4. The total contend of starch was 8.92 % and the grains had an oval morphology observed by SEM.

Com o objetivo de estudar a potencialidade do emprego de termolisina como catalisador nas reações de incorporação de N-acil-asparagina a ésteres de aminoácidos e peptídeos, foram sintetizados os seguintes di- e tripeptídeos: Boc-Asn-Ile-OBzl, Z-Asn-Ile-OBzl, Moz-Asn-Ile-OBzl, Boc-Asn-Leu- OBzl, Z-Asn-Leu-OBzl, Moz-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OEt, Boc-Asn-Phe-OBzl, Z-Asn-Phe-OBzl, Moz-Asn-Phe-OBzl, Z-Asn-Phe- OEt, Z-Asn-Val-OBzl, Moz-Asp-Val-OBzl, Moz-Asn-Ile-Gly-OBzl, Moz-Asn-Ile-Ala-OBzl, Moz-Asn-Ile-Leu-OBzl e Moz-Asn- Ile-Phe-OBzl. Todos os peptídeos foram obtidos na forma pura, com bom rendimento e foram analisados e caracterizados por cromatografia em camada delgada, ponto de fusão, análise elementar, análise de aminoácidos e ressonância magnética protônica. Entre os grupos protetores de asparagina, benziloxicarbonil e p-metoxibenziloxicarbonil permitiram a obtenção dos dipeptídeos com excelentes rendimentos. Foi observado que os tripeptídeos requerem para a sua síntese menores concentração de enzima e tempo de reação em relação aos dipeptídeos. Não foi possível estabelecer a especificidade secundária da termolisina para o resíduo P\'2 pois os rendimentos dos tripeptídeos sintetizados não apresentaram diferença significativa. Foi também realizado um estudo metodológico para determinar as condições ótimas de síntese de Boc-Asn-Ile-OBzl, que consistiu em analisar a influência do pH, concentração de enzima, concentraçao e volume da solução de acetato de sódio, proporção entre os componentes carboxílico e amínico, temperatura e adição de solvente orgânico ao meio de reação. / With de objective of studying the potential for the use of thermolysin as a catalyst in reactions of incorporation of N-acyl-asparagine into esters of aminoacids and peptides, the following di- and tripeptides were synthesized: Boc-Asn-Ile-OBzl, Z-Asn-Ile-OBzl, Moz-Asn-Ile-OBzl, Boc-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OBzI, Moz-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OEt, Boc-Asn-Phe-OBzl,Z-Asn-Phe-OBzl, Moz-Asn-Phe-OBzl, Z-Z-Asn-Phe-OEt, Z-Asn-Val-OEt, Moz-Asn-Val-OBzl, Moz-Asn-Ile-Gly-OBzl, Moz-Asn-Ile-Ala-OBzl, Moz-Asn-Ile-Leu-OBzl e Moz-Asn-Ile-Phe-OBzl. All of these peptides were obtained in pure form in good yield and analyzed and characterized by thin layer chromatography, melting point, elemental analysis, aminoacid analysis and proton magnetic resonance. Among the protecting groups of asparagine, benzyloxycarbonyl and p-methoxybenzyloxycarbonyl gave excellent yields of the dipeptides. Relative to the dipeptides, the synthesis of the tripeptides was found to require lower enzyme concentrations and temperatures. Since the yields of the tripeptides failed to exhibit significant differences, it was not possible to establish the existence of a secondary specificity of thermolysin for the residue P\' 2 . A methodological study was also performed to determine the optimum conditions for synthesis of Boc-Asn-Ile-OBzl. This study consisted of an analysis of the influence of pH, enzyme concentration, concentration and volume of the solution of sodium acetate, relative proportions of the carboxyl and amino components, temperature, and addition of organic solvent to the reaction medium.

A proposta desse trabalho foi estudar o perfil de produção de enzimas hidrolíticas pelo fungo termófilo Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 quando cultivado em resíduos agroindustriais e utilizá-las nas formas bruta ou purificada na hidrólise da polpa celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Para tanto, estudou-se a cinética de produção de xilanases e celulases em fermentação sólida, utilizando quatro diferentes tipos de resíduos agrícolas: bagaço e palha de cana-de-açúcar, palha de trigo e sabugo de milho. Os extratos obtidos foram investigados quanto ao teor de xilanase, endoglucanase, exoglucanase, &#946;-glicosidase e &#946;-xilosidase. A palha de cana-de-açúcar induziu as maiores atividades de xilanase em 9 dias (1679,8 UI/g) e de &#946;-glicosidase em 6 dias (29,9 UI/g). Em sabugo de milho, o fungo produziu 46,0 UI/g de exoglucanase e 5,2 UI/g de &#946;-xilosidase, em 17 dias. A maior produção de endoglucanase ocorreu em bagaço de cana-de-açúcar em 9 dias (108,9 UI/g). A carga inicial de inóculo foi avaliada para o meio preparado com bagaço e verificou-se que o aumento de 104 vezes no número de ascósporos influenciou somente a produção de exoglucanase, que teve sua atividade aumentada em 10 vezes. Após a determinação das atividades enzimáticas, o extrato de sabugo de milho foi aplicado em uma coluna trocadora de ânions, DEAE Sepharose CL6B, equilibrada em pH 3,5 e 6,0; a fim de se obter as enzimas em sua forma purificada. Pôde-se isolar uma xilanase, uma endoglucanase e uma &#946;-glicosidase de massas molares 31,5 kDa, 32,4 kDa e 76,6 kDa, respectivamente. Os extratos enzimáticos do T. aurantiacus foram aplicados no bagaço de cana-de-açúcar in natura e na polpa celulósica do bagaço, obtendo 15 % de conversão enzimática da celulose (CEC), para ambos os substratos. Sendo assim, a polpa do bagaço de cana-de-açúcar foi pré-tratada com (1) proteases isoladas do abacaxi; (2) xilanase purificada de T. aurantiacus ou (3) ácido sulfúrico diluído. Em seguida foi feita a hidrólise do material pré-tratado com o extrato bruto de T. aurantiacus. O pré-tratamento com protease não teve efeito hidrolítico na polpa de bagaço, porém aumentou a CEC com as enzimas de T. aurantiacus de 9,4 % para 20,7 %. O pré-tratamento com a xilanase pura também não liberou açúcares redutores, contudo foi capaz de aumentar a CEC da polpa de bagaço para 30,0 %. O pré-tratamento com ácido diluído foi capaz de remover até 50 % da hemicelulose presente na polpa do bagaço, porém a remoção deste polissacarídeo não aumentou a CEC do bagaço com as enzimas de T. aurantiacus, mantendo o mesmo valor de CEC (15 %). / The purpose of this work was to study the production profile of hydrolytic enzymes of the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 when cultivated in agroindustrial residues and to use them in the forms crude or purified for the hydrolysis of the cellulosic pulp of the sugarcane bagasse. For so much, it was studied the kinetics of xylanases and cellulases production on solid fermentation, using four different types of agricultural residues: sugarcane bagasse, sugarcane straw, wheat straw and corn cob. The extracts obtained were investigated for xylanase, endoglucanase, exoglucanase, &#946;-glucosidase and &#946;-xylosidase activities. Sugarcane straw induced the highest level of xylanase at 9 days (1679.8 UI/g) and &#946;-glicosidase (29.9 UI/g) at 6 days. With corn cob, the fungus produced 46.0 UI/g of exoglucanase and 5.2 UI/g of &#946;-xylosidase at 17 days. The highest endoglucanase production occurred on sugarcane pulp (108.9 UI/g) at 9 days. The initial load of inocullum was evaluated for sugarcane bagasse medium and it was verified that the 10000 times increase of ascospores had influence only in the exoglucanase production, showing a 10 fold increase of its activity. The corn cob extracts were applied in an ion exchange column, DEAE Sepharose CL6B, in order to purify cellulases and hemicellulases presents in the extracts. It could be isolated a xylanase, an endoglucanase and a &#946;-glucosidase of 31.5 kDa, 32.4 kDa and 76.3 kDa, respectively. The enzymatic extracts of T. aurantiacus were tested on sugarcane bagasse in natura and on sugarcane bagasse pulp and 15 % of enzymatic conversion of the cellulose (CEC) was obtained from both substrates. A pretreatment of sugarcane bagasse pulp with (1) proteases isolated from pineapple; (2) xylanase purified of T. aurantiacus and (3) diluted sulfuric acid was performed. The pretreatment with protease did not present any hydrolytic effect on the sugarcane bagasse pulp, however it increased the final CEC with the enzymes of T. aurantiacus from 9.4 % to 20.7 %. The pretreatment with pure xylanase did not release sugars from pulp bagasse, however it was capable to increase the yield of the enzymatic hydrolysis of the pulp to 30.0 %. The pretreatment with diluted acid was capable to remove up to 50 % of the hemicellulose from the pulp, but CEC was maintained on 15 %.

Orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Marinonio Lopes Cornelio / Banca: Marcia Maria de Souza Moretti / Resumo: As pectinases são um grupo de enzimas capazes de degradar polissacarídeos pécticos (pectinas). Estas enzimas são utilizadas na indústria de produção de sucos de frutas, vinhos, têxtil, papel, chá, óleos e etc. O presente trabalho teve por objetivo produzir, purificar e caracterizar a pectinase exo-poligacturonase (exo-PG - EC 3.2.1.67) do fun-go termofílico Rhizomucor pusillus. A enzima foi produzida por cultivo submerso e puri-ficada por salting-out e cromatografia. Este método se revelou como o mais adequado empregando 95 % de sulfato de amônio, sendo que com esta técnica foi possível obter a enzima quase livre de contaminantes e com um rendimento de aproximadamente 74 %. Um passo subsequente de cromatografia de interação hidrofóbica é capaz de re-mover os contaminantes remanescentes. A enzima pura possui massa molecular ao redor de 43,5-47 kDa, pH ótimo de 4,0, temperatura ótima de 61 °C, é estável a uma faixa de pH que varia de 3,5 a 6,5, possui estabilidade térmica de 30 até 60 °C e é ati-vada na presença de Ca+2. O ponto isoelétrico da exo-PG é 6,2 e estudos termodinâ-micos mostraram se tratar de uma enzima termofílica, destacando seu tempo de meia-vida t1/2 de 2.310 min., a 50 °C. O perfil da hidrólise foi analisado por eletroforese capi-lar e os estudos indicam que a enzima em estudo apresenta um padrão de hidrólise sequencial (exo). A identificação dos aminoácidos por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e a comparação com bancos de dados revelou a maior identidade dos fragmentos sequenciados da exo-PG de R. pusillus com a enzima correspondente de Aspergillus fumigatus. Os testes de aplicação das enzimas do extrato bruto mostraram um aumento da extração de suco e um auxílio no processo de hidrólise, sendo que este não foi observado com a enzima pura / Abstract: Pectinases are a group of enzymes capable of degrading pectic polysaccharides (pec-tin). These enzymes are used in the industry for production of fruit juices, wines, tex-tiles, paper, tea, oils, etc. This study aimed to produce, purify and characterize an exo-poligacturonase (exo-PG - EC 3.2.1.67) from the thermophilic fungus Rhizomucor pu-sillus. The enzyme was produced by submerged cultivation and purified by chromatog-raphy and salting out. This has proved to be the most appropriate using 95 % ammoni-um sulfate, and with this technique it was possible to obtain the enzyme almost free of contaminants and with a yield of approximately 74 %. A subsequent step of hydropho-bic interaction chromatography is able to remove the remaining contaminants. The pure enzyme has molecular mass around 43.5-47 kDa, optimum pH of 4.0, optimum tem-perature of 61 °C, is stable at a pH range between 3.5 and 6.5, presents thermal stability from 30 to 60 °C and is activated in the presence Ca2+. The isoelectric point of the exo-PG is 6.2 and thermodynamic studies have shown that it is a thermophilic enzyme, highlighting its half-life t1/2 of 2,310 minutes at 50 °C. The profile of hydrolysis was ana-lyzed by capillary electrophoresis and studies indicate that the enzyme in this study has a pattern of sequential hydrolysis (exo). The identification of amino acids by mass spec-trometry MALDI-TOF and a comparison with data banks showed the highest identity of the sequenced fragments of exo-PG from R. pusillus with the corresponding enzyme from Aspergillus fumigatus. The application tests of the enzymes of the crude extract showed increased extra juice extraction and a higher yield in the hydrolysis process, but this was not observed with the pure enzyme / Mestre

A proposta desse trabalho foi estudar o perfil de produção de enzimas hidrolíticas pelo fungo termófilo Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 quando cultivado em resíduos agroindustriais e utilizá-las nas formas bruta ou purificada na hidrólise da polpa celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Para tanto, estudou-se a cinética de produção de xilanases e celulases em fermentação sólida, utilizando quatro diferentes tipos de resíduos agrícolas: bagaço e palha de cana-de-açúcar, palha de trigo e sabugo de milho. Os extratos obtidos foram investigados quanto ao teor de xilanase, endoglucanase, exoglucanase, &#946;-glicosidase e &#946;-xilosidase. A palha de cana-de-açúcar induziu as maiores atividades de xilanase em 9 dias (1679,8 UI/g) e de &#946;-glicosidase em 6 dias (29,9 UI/g). Em sabugo de milho, o fungo produziu 46,0 UI/g de exoglucanase e 5,2 UI/g de &#946;-xilosidase, em 17 dias. A maior produção de endoglucanase ocorreu em bagaço de cana-de-açúcar em 9 dias (108,9 UI/g). A carga inicial de inóculo foi avaliada para o meio preparado com bagaço e verificou-se que o aumento de 104 vezes no número de ascósporos influenciou somente a produção de exoglucanase, que teve sua atividade aumentada em 10 vezes. Após a determinação das atividades enzimáticas, o extrato de sabugo de milho foi aplicado em uma coluna trocadora de ânions, DEAE Sepharose CL6B, equilibrada em pH 3,5 e 6,0; a fim de se obter as enzimas em sua forma purificada. Pôde-se isolar uma xilanase, uma endoglucanase e uma &#946;-glicosidase de massas molares 31,5 kDa, 32,4 kDa e 76,6 kDa, respectivamente. Os extratos enzimáticos do T. aurantiacus foram aplicados no bagaço de cana-de-açúcar in natura e na polpa celulósica do bagaço, obtendo 15 % de conversão enzimática da celulose (CEC), para ambos os substratos. Sendo assim, a polpa do bagaço de cana-de-açúcar foi pré-tratada com (1) proteases isoladas do abacaxi; (2) xilanase purificada de T. aurantiacus ou (3) ácido sulfúrico diluído. Em seguida foi feita a hidrólise do material pré-tratado com o extrato bruto de T. aurantiacus. O pré-tratamento com protease não teve efeito hidrolítico na polpa de bagaço, porém aumentou a CEC com as enzimas de T. aurantiacus de 9,4 % para 20,7 %. O pré-tratamento com a xilanase pura também não liberou açúcares redutores, contudo foi capaz de aumentar a CEC da polpa de bagaço para 30,0 %. O pré-tratamento com ácido diluído foi capaz de remover até 50 % da hemicelulose presente na polpa do bagaço, porém a remoção deste polissacarídeo não aumentou a CEC do bagaço com as enzimas de T. aurantiacus, mantendo o mesmo valor de CEC (15 %). / The purpose of this work was to study the production profile of hydrolytic enzymes of the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 when cultivated in agroindustrial residues and to use them in the forms crude or purified for the hydrolysis of the cellulosic pulp of the sugarcane bagasse. For so much, it was studied the kinetics of xylanases and cellulases production on solid fermentation, using four different types of agricultural residues: sugarcane bagasse, sugarcane straw, wheat straw and corn cob. The extracts obtained were investigated for xylanase, endoglucanase, exoglucanase, &#946;-glucosidase and &#946;-xylosidase activities. Sugarcane straw induced the highest level of xylanase at 9 days (1679.8 UI/g) and &#946;-glicosidase (29.9 UI/g) at 6 days. With corn cob, the fungus produced 46.0 UI/g of exoglucanase and 5.2 UI/g of &#946;-xylosidase at 17 days. The highest endoglucanase production occurred on sugarcane pulp (108.9 UI/g) at 9 days. The initial load of inocullum was evaluated for sugarcane bagasse medium and it was verified that the 10000 times increase of ascospores had influence only in the exoglucanase production, showing a 10 fold increase of its activity. The corn cob extracts were applied in an ion exchange column, DEAE Sepharose CL6B, in order to purify cellulases and hemicellulases presents in the extracts. It could be isolated a xylanase, an endoglucanase and a &#946;-glucosidase of 31.5 kDa, 32.4 kDa and 76.3 kDa, respectively. The enzymatic extracts of T. aurantiacus were tested on sugarcane bagasse in natura and on sugarcane bagasse pulp and 15 % of enzymatic conversion of the cellulose (CEC) was obtained from both substrates. A pretreatment of sugarcane bagasse pulp with (1) proteases isolated from pineapple; (2) xylanase purified of T. aurantiacus and (3) diluted sulfuric acid was performed. The pretreatment with protease did not present any hydrolytic effect on the sugarcane bagasse pulp, however it increased the final CEC with the enzymes of T. aurantiacus from 9.4 % to 20.7 %. The pretreatment with pure xylanase did not release sugars from pulp bagasse, however it was capable to increase the yield of the enzymatic hydrolysis of the pulp to 30.0 %. The pretreatment with diluted acid was capable to remove up to 50 % of the hemicellulose from the pulp, but CEC was maintained on 15 %.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-22Bitstream added on 2014-06-13T21:02:03Z : No. of bitstreams: 1 dini_cm_dr_sjrp.pdf: 2530340 bytes, checksum: 59c3324738ac340007790baaae0b46b0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Proteases coagulantes microbianas catalisam a coagulação do leite, podendo substituir o coalho de bezerro. O objetivo deste trabalho foi estudar a protease do extrato enzimático do fungo Thermomucor indicae-seudaticae N31, obtido por fermentação em estado sólido (FES), e avaliar sua aplicação na fabricação de queijo maturado. Para avaliar a biomassa do fungo T. indicae-seudaticae N31 na FES foi utilizado o ergosterol como biomarcador. A biomassa, variou de 21,92 a 48,63 mg/g meio sólido na fermentação com farelo de trigo e de 30,18 a 81,67 mg/g meio sólido na fermentação com farelo de trigo e caseína. A condição de FES que resultou num extrato enzimático com alta atividade coagulante (AC) e baixa atividade proteolítica (AP) foi em 24 horas utilizando farelo de trigo como substrato. A AC deste extrato foi máxima em pH 5,7 e a 70°C; permaneceu estável na faixa de pH de 3,5 a 4,5 e foi termoestável até 45°C por 1 hora. A AP foi máxima em pH 5,5 e a 65°C, manteve aproximadamente 70% de estabilidade na faixa de pH de 5,0 a 7,0 e foi termoestável até 45°C por 1 hora. Dentre os inibidores de protease, o composto que mais afetou as atividades foi Pepstatin A. O extrato enzimático bruto foi concentrado por precipitação com álcool e foi cromatografado em resinas de filtração em gel (Sephadex G75) e troca iônica (Q Sepharose). AC e AP foram purificadas 43 e 16 vezes e exibiram recuperação de 1,3 e 0,5% das atividades iniciais, respectivamente. A AC da enzima purificada foi máxima em pH 5,3 e a 75°C, permaneceu estável na faixa de pH de 3,5 a 4,5 e foi termoestável até 60°C por 1 hora. Os íons cobre e níquel causaram maior perda de AC com 40 e 65% de inibição, respectivamente. As atividades foram novamente mais afetadas pela Pepstatin A. A AP da enzima purificada foi máxima... / Microbial coagulant proteases catalyze milk clotting, and so they can substitute rennet. The aim of this work was to study the proteolytic activity of the enzymatic extract from the fungus Thermomucor indicae-seudaticae N31, obtained through solid state fermentation (SSF), and evaluate its application in the production of ripened cheese. To evaluate microbial biomass in SSF ergosterol was used as a biomarker. Biomass of the fungus T. indicaeseudaticae N31, varied between 21.92 to 48.63 mg/g solid medium in fermentation with wheat bran and between 30.18 to 81.67 mg/g solid medium in fermentation with wheat bran and casein. The condition for FES that resulted in an enzymatic extract with high milkclotting activity (MCA) and low proteolytic activity (PA) was in 24 hours using wheat bran as substrate. MCA in this extract was maximum at pH 5.7, at 70°C, remained stable in pH range of 3.5 to 4.5, was thermostable up to 45°C for 1 hour. PA was maximum at pH 5.5 and at 65°C, kept approximately 70% of stability in the pH range of 5.0 to 7.0 and was thermostable up to 45°C for 1 hour. Among the protease inhibitors tested, the one that most affected the activities was Pepstatin A. The crude enzymatic extract was purified through precipitation with alcohol followed by gel filtration (Sephadex G75) and ion exchange (Q Sepharose) cromatographies. MCA and PA were purified 43 and 16-fold and exhibited 1.3 and 0.5% recovery of initial activities, respectively. MCA of the purified enzyme was maximum at pH 5.3 and at 75°C, remained stable in pH range of 3.5 to 4.5 and revealed high thermostability up to 60°C for 1 hour. Ions copper and nickel caused most loss of MCA with 40 and 65% of inhibition, respectively. The activities were again most affected by Pepstatin A. PA of purified enzyme was maximum at pH 5.5 and at 65°C... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Andréia Arantes Felício null (andreia_a.felicio@hotmail.com) on 2017-03-27T17:43:13Z No. of bitstreams: 1 Tese Andréia Arantes Felício.pdf: 4621912 bytes, checksum: fcb824edfc225a271b66a12fc039e014 (MD5) / Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: No campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” foi informado que seria disponibilizado o texto completo porém no campo “Data para a disponibilização do texto completo” foi informado que o texto completo deverá ser disponibilizado apenas 6 meses após a defesa. Caso opte pela disponibilização do texto completo apenas 6 meses após a defesa selecione no campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” a opção “Texto parcial”. Esta opção é utilizada caso você tenha planos de publicar seu trabalho em periódicos científicos ou em formato de livro, por exemplo e fará com que apenas as páginas pré-textuais, introdução, considerações e referências sejam disponibilizadas. Se optar por disponibilizar o texto completo de seu trabalho imediatamente selecione no campo “Data para a disponibilização do texto completo” a opção “Não se aplica (texto completo)”. Isso fará com que seu trabalho seja disponibilizado na íntegra no Repositório Institucional UNESP. Por favor, corrija esta informação realizando uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2017-03-29T19:14:18Z (GMT) / Submitted by Andréia Arantes Felício null (andreia_a.felicio@hotmail.com) on 2017-03-29T19:20:52Z No. of bitstreams: 1 Tese Andréia Arantes Felício.pdf: 4621912 bytes, checksum: fcb824edfc225a271b66a12fc039e014 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-03-29T19:24:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 felicio_aa_dr_sjrp.pdf: 4621912 bytes, checksum: fcb824edfc225a271b66a12fc039e014 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-29T19:24:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 felicio_aa_dr_sjrp.pdf: 4621912 bytes, checksum: fcb824edfc225a271b66a12fc039e014 (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Brasil é o principal produtor de cana-de-açúcar do mundo e, para que esta demanda seja suprida, muitos compostos químicos são aplicados nas culturas, visando controlar o surgimento e proliferação de pragas. Assim, faz-se o uso dos praguicidas, dentre eles, o diuron (N-(3,4-diclorofenil)-N,N-dimetiluréia), que é aplicado em plantações ao redor do mundo. O diuron pode ser biodegradado em outros três principais compostos o 3,4-dicloroanilina (DCA), 3,4-diclorofenilureia (DCPMU) e 2,4-diclorofenil-N-metilureia (DCPMU). Normalmente, o diuron é aplicado nas plantações juntamente com os alquilfenóis etoxilatos (APE), como o nonilfenol etoxilato (NPE) e o octilfenol etoxilato (OPE), compostos que facilitam a dispersão do diuron. Alguns estudos têm demonstrado que tanto o diuron quanto os alquilfenóis podem causar alterações enzimáticas e/ou estrogênicas em diversos organismos. Dentre as enzimas que podem ser alteradas, estão as enzimas de biotransformação, tanto de fase I (7-etoxirresorufina-O-deetilase – EROD, 7-pentóxiresorufinaO-desalquilase – PROD, 7-benzilóxiresorufina-O-desalquilase – BROD e a P450 aromatase), quanto as de fase II (glutationa-S-transferase – GST) e as proteínas de fase III (resistência a multixenobioticos – MXR). Outros parâmetros que podem sofrer alterações são os antioxidantes (superóxido dismutase – SOD, catalase – CAT, glutationa peroxidase – GPx, glutationa redutase – GR, glutationa-6-fosfato desidrogenase – G6PDH, aldeído desidrogenase – ALDH e peroxidação lipídica), que são os responsáveis pelo controle entre a produção e o combate às espécies reativas de oxigênio (ERO). Dentre os parâmetros endócrinos que podem ser alterados, e então utilizados como biomarcadores, estão as enzimas CYP3A e a 17β-hidroxiesteróide desidrogenase (17β-HSD) e ainda a proteína vitelogenina (Vtg). Assim o objetivo deste trabalho foi avaliar, em tilápias do Nilo (Oreochromis nilotucus) (1) quais os efeitos do diuron e seus metabólitos, em associação ou não, em diferentes concentrações e (2) quais os efeitos do diuron, seus metabólitos e os alquilfenois, em associação ou não em diferentes concentrações no fígado e nas brânquias de peixes expostos por 7 dias, utilizando os seguintes parametros, EROD, BROD, PROD, GST, MXR, SOD, CAT, GPx, G6PDH e peroxidação lipídica (MDA). Em uma terceira etapa, o objetivo do trabalho foi (3) avaliar parâmetros endócrinos em tilápias mozambique (Oreochromis mossambicus) expostas ao diuron, seus metabólitos e alquilfenóis, em associação ou não, em diferentes concentrações, expostas por 7 dias, em fígado e cérebro dos peixes expostos, analisando os seguintes parâmetros: 17β-HSD, P450 aromatase, CYP3A, vitelogenina e a biotransformação do xenobiótico (in vitro). Nossos resultados demonstraram que, em tilápias do Nilo expostas a esses contaminantes nas concentrações e no tempo de exposição utilizados, todos os biomarcadores analisados sofreram alguma alteração após a exposição, alguns mais expressivos como a EROD, MDA, GPx e G6PDH e outros menos. Os resultados obtidos após a exposição de tilápias mozambique aos contaminantes também nos mostraram alterações, confirmando que esses compostos podem ser considerados desreguladores endócrinos, já que todos os parâmetros endócrinos analisados foram alterados. Assim, os resultados obtidos nos mostraram que realmente o diuron, seus metabólitos e os alquilfenóis podem causar alterações bioquímicas em tilápias do Nilo e mozambique, expostos à concentrações ambientalmente relevantes por sete dias, sendo os metabólitos e os APs os principais compostos a causar alterações nos parâmetros analisados. / Brazil is the main sugar cane producer in the world, and to support these productions many chemical compounds have being apply in agriculture, aiming to control the appearance and proliferation of pests. Therefore, the use of pesticide, as diuron, (N- (3,4-dichlorophenyl) -N,N-dimethylurea), in some crops in the world is common. Diuron can be biodegraded in three others compounds, 3,4-dichloroaniline (DCA), 3,4-dichlorophenylurea (DCPU) and 2,4-dichlorophenyl-N-methylurea (DCPMU). Normally, diuron have being applied associated with alkylphenols ethoxylates (APE), like nonilphenol (NP) and octylphenol (OP), which increase the solubility and dispersion of the herbicide. Some studies have shown that diuron and alkylphenols can cause enzymatic and/or estrogenic changes, in various organisms. Therefore, biotransformation enzymes, phase I (7-ethoxirresorufin-O-deethylase – EROD, 7- pentaxirisorufin-O-dealkylase – PROD, 7-benzyloxysorufin-O-desalkylase – BROD and P450 aromatase), phase II (glutathione-S-transferase-GST) and phase III proteins (multixenobiotic resistance – MXR), and antioxidant parameters (superoxide dismutase – SOD, catalase – CAT, glutathione peroxidase – GPx, glutathione reductase – GR, glutathione-6-phosphate dehydrogenase – G6PDH, aldehyde dehydrogenase – ALDH and lipid peroxidation), which are responsible for the control between production and degradation of reactive oxygen species (ROS). The endocrine parameters that can be altered and used as biomarkers are the CYP3A and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase (17β-HSD) enzymes and the vitellogenin (Vtg) protein. All of these parameters can be altered after exposure of organisms to xenobiotics. Therefore, the aim of this work was evaluate the effects of (1) diuron and its metabolites, alone or in combination, in different concentrations, and the effect of (2) diuron, its metabolites and the alkyphenols, alone or in combination, in different concentration, in liver and gill of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) exposed for 7 days, using as parameters EROD, BROP, PROD, GST, MXR, SOD, CAT, GPx, G6PDH and lipid peroxidation (MDA). In a third step, the aim of the work as (3) evaluate endocrine parameters in mossambique tilapia (Oreochromis mossambicus), exposed to diuron, its metabolites and alkyphenols, alone or in combination, in different concentrations for 7 days, in liver and brain, using as parameters 17β-HSD, CYP3A, vitellogenin and xenobiotic biotransformation (in vitro). Our results demonstrated that all contaminants, at the concentration and time of exposure, can cause alteration in all biomarkers, some more than others, as EROD, MDA, GPx and G6PDH, in Nile tilapia, and the results obtained after mozambique tilapia exposure, to the contaminants, also showed changes, confirming that these compounds can be considered endocrine disruptors. Thus, the results showed that diuron, its metabolites and alkylphenols could cause biochemical changes in fish, Nile and mossambique tilapia, exposing to the environmentally relevant concentrations for seven days, being diruon metabolites and APs the main compounds to cause changes in the analyzed parameters. / FAPESP: 2014/18825-9

Orientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: Aline Aparecida Pizzirani Kleiner / Banca: Helia Hamuri Sato / Banca: Rosa dos Prazeres M.F. Inocentes / Banca: Marcia Regina Brochetto Braga / Resumo: Enzimas degradadoras de xilana, principal componente da hemicelulose, têm sido utilizadas em várias aplicações biotecnológicas, sendo que em alguns processos é necessário o uso de enzimas purificadas. Aplicações comerciais para as enzimas xilanolíticas envolvem a hidrólise enzimática da xilana, que está presente nos resíduos agrícolas e agroindustriais, sendo convertido a xilose e outros açúcares, que podem ser utilizados como substratos em processos fermentativos para a obtenção de proteínas celulares, combustíveis líquidos e outras substâncias químicas. A utilização destas enzimas também diminui a liberação de agentes poluentes em determinados efluentes, como da indústria de polpa de celulose. Xilanases e β- xilosidases são produzidas principalmente por bactérias e fungos, sendo que em geral, os fungos as produzem em níveis mais elevados. O gênero Penicillium apresenta espécies já caracterizadas como boas produtoras destas enzimas. Uma linhagem deste gênero, isolada de solo brasileiro, na região da Mata Atlântica e identificada como Penicillium sclerotiorum destacou-se por produzir xilanase em níveis elevados. O objetivo deste trabalho consistiu na avaliação da influência das condições de cultivo sobre a produção do complexo xilanolítico produzido por P. sclerotiorum, na caracterização físico-química desse sistema, bem como purificação e caracterização bioquímica de seus principais componentes. Por meio da determinação das condições ótimas de produção e da caracterização deste complexo enzimático foi possível estabelecer metodologias eficientes de purificação de xilanases e uma β-xilosidase. Através da caracterização físico-química das enzimas purificadas, foi possível avaliar seu potencial biotecnológico, visando futuras aplicações em processos industriais. / Abstract: Xylan degrading enzymes, the main component of hemicellulose, have been used in various biotechnological applications, and in some cases the use of purified enzymes is necessary. Commercial applications of xylanolytic enzymes involve the enzymatic hydrolysis of xylan, which is present in agricultural and agro-industrial wastes, and can be converted to xylose and other sugars, which can be further used as substrates in fermentation processes to obtaining cellular protein, liquid fuels and other chemicals. The utilization of these enzymes also decreases the release of certain pollutants in wastewater, as in the pulp and paper industry. Xylanases and β-xilosidases are mainly produced by bacteria and fungi, and in general, the fungi produce them at higher levels. The genus Penicillium presents species already characterized as good producers of these enzymes. One strain of this genus isolated from Brazilian soil in the Mata Atlântica region and identified as Penicillium sclerotiorum attracted attention by producing xylanase in high levels. The objective of this study was to evaluate the influence of culture conditions on the production of the xylanolytic complex produced by P. sclerotiorum to characterize physical and chemical properties of this system as well to purify and biochemical characterize its main components. By determining optimal conditions for production and by characterizing this enzymatic complex it was possible to establish efficient methodologies for purification of xylanases and one β-xylosidase. Through their physical and chemical characterization, it was possible to evaluate their biotechnological potential for future applications in industrial processes. / Doutor