Orientador: Renato Bonatelli Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-16T10:51:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Umbuzeiro_GiseladeAragao_M.pdf: 2232877 bytes, checksum: 4a58878edb7dd279319ab5baa54c6cd8 (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: Este trabalho teve por objetivo o isolamento e análise genética de mutantes com produção alterada de amiloglicosidase (AG) na linhagem HAP de Aspergillus niger. Foram estudados mutantes auxotróficos e morfológicos quanto à produção da enzima, observando-se que a maioria não apresentava alteração na produção de AG com relação à linhagem original HAP, com exceção das linhagens pdxlolvl e purl que apresentaram produção significativamente menor. Teste para avaliação da atividade enzimática na presença de inibidor específico para AG e dextrina limite como substrato mostrou que as medidas realizadas durante o trabalho referem-se principalmente à AG. A utilização da luz ultravioleta como mutagênico para obtenção de mutantes com produção diminuída de AG foi satisfatória, tendo sido obtida uma freqüência total de mutantes de 3;0%. Pela metodolog1a de pré-seleção empregada não foi conseguido nenhum mutante de produção aumentada. Testes de interação alélica mostraram que todas as mutações induzidas eram recessivas. No teste de complementação pelo menos dois genes que afetam a produção de AG parecem ter sido revelados, o lap61 e lap73 e/ou lap38. Análise mitótica dos segregantes mostrou ligação entre os genes nic_ fwn e olv e também evidenciou ligação entre o gene pab e o lap61 / Abstract: The claims of this work were iso1ation and genetical analysis of altered amylog1ucosldase production mutants using the HAP strain or Aspergillus niger. Enzyme production was studied in auxotrophs and morphologica1 mutants and most or them do not show AG production alterations, except pdxlolvl and purl strains showed significant decreased production comparing with the original strain HAP. Teste to evaluate enzimatic activity in presence of AG especific Inibitor and using limit dextrin as substrate showed that the activlty measured during this work was mainly the AG activity. The use of ultraviolet light as mutagenic to obtain decreased AG production mutants was satisfactory, and the total frequency or mutants was 3,0%. Pre-selection methodology was not efficient to obtain increasead AG production mutants. Alelic interaction tests showed that a11 the induced mutations were recessives. Complementation test showed at least two genes envolved in AG production, lap61 and lap73 and/or lap38. Mitotic analysis demonstrated linkage between the genes nic, f'wn and olv_ and between pab and lap61 / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas

Tese (livre-docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-16T12:26:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sodek_Ladaslav_LD.pdf: 6897795 bytes, checksum: deae339290b3e14c8838abebcfed60f6 (MD5) Previous issue date: 1980 / Resumo: As amidas glutamina e a asparagina são, reconhecidamente, importantes formas de transporte do nitrogênio em muitas plantas. Representam a fonte principal de nitrogênio para a síntese de proteína de reserva em sementes imaturas. Entretanto, nada se conhece a respeito da maneira pelo qual o nitrogênio desses aminoácidos se torna disponível para a biossíntese de outros aminoácidos protéicos. Objetivando esclarecer este ponto, foi realizada uma investigação sobre enzimas possivelmente envolvidas neste processo. O endosperma do milho foi escolhido para se estudar a utilização de glutamina, em virtude da importância deste composto no sistema de transporte dessa planta. Verificou-se que o endosperma apresentou atividade da enzima glutamina oxoglutarato amida transferase (GOGAT, E.C. 2.6.1.53), em níveis suficientemente altos para metabolizar toda glutamina translocada ao grão. A enzima apresentou um padrão de atividade bem definido durante a fase de maturação do endosperma, com um pico de atividade (Max. = 56 umoles GLU/min/endosperma) correspondente ao período de síntese mais intensa de proteína. Os dados sugerem que a glutamina pode ser metabolisada mediante amida para a posição 'alfa' do acetoglutarato. O glutamato assim formado poderia doar o nitrogênio para outros aminoácidos, mediante transaminação. Para se estudar a utilização de asparagina, foi escolhida a semente imatura de ervilha, em virtude da importância deste composto no seu sistema de transporte bem como no de outras leguminosas... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: It is well established that the amides glutamine and asparagine are important transport forms of nitrogen in many plants. They also represent the principal source of nitrogen for reserve protein synthesis in developing seeds. Since it is not known the nitrogen of these amino acids is made available for the biosynthesis of other protein amino acids in the developing seed, an investigation was made of enzymes possibly involved in this process. The utilization of glutamine was studied in the developing maize endosperm, in view of its importance as a transport compound in this plant. It was found that the endosperm contains glutamine: oxoglutarate amide transferase (GOGAT, E.C. 2.6.1.53) activity, at levels sufficient to metabolize all glutamine arriving via the translocation stream. The activity pattern throughout endosperm development revealed a well-defined peak (max. = 56 umoles GLU/min/endosperm) coinciding with the period of most active nitrogen accumulation. The data suggest that glutamine may be metabolized by transfer of the amide nitrogen to the 'alfa'-position of 'alfa'-ketoglutarate to form glutamate, via the GOGAT reaction, and subsequently to other amino acids via transamination reactions involving glutamate. The utilization of asparagines was studied in the developing seeds of pea, in view of its importance in the transport of nitrogen in this as well as other legumes... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Tese (livre-docencia) - Univer / Livre-Docente em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Claudio Luiz Messias / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T14:54:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JoseCarlosda_D.pdf: 4450525 bytes, checksum: 7e1132b352164c08417e5c5514db91de (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: O presente trabalho foi conduzido com a finalidade de se estudar através do índice enzimático, a obtenção de diferentes mutantes de M. anisopliae para não produção de exoenzimas amilase, lipase e protease e revertentes, utilizando luz ultravioleta. Também procurou-se caracterizar os mutantes e revertentes exoenzimáticos, através de eletroforese para os padrões de a-esterase e aspectos citológicos como comprimento de conídios e número de núcleos por conídio. Por fim, determinou-se a virulência dos mutantes e revertentes à ninfas de 3º estadio de Rhodnius prolixus. Para isso, empregaram-se as linhagens E9 e V14 de K.anisopliae var. anisopliae.. A mutante amilase- e lipase-apresentaram índices enzimáticos iguais a um, o que não ocorreram com os mutantes protease-. Todos os revertentes apresentaram fenótipo exoenzimáticos semelhante aos tipos selvagens. Não houve alteração na germinação, comprimento de conídios e número de núcleos por conídio dos mutantes e revertentes. O padrão eletroforético de a ¿esterase mostrou-se diferente somente nos mutantes lipase-, entretanto não houve alteração para os revertentes correspondentes lipase+. A virulência dos mutantes amilase- e lipase- diminuiu significativamente, enquanto os mutantes protease-, não mostraram redução significativa. Os revertentes restabeleceram a virulência em níveis semelhantes aos tipos selvagens / Abstract: The present work was conducted in order to study by means of enzimatyc index the obtainment of mutants of Metarhizium anisopliae var. anisoplae strains E9 e V14 wich lost or had some reduction in their capability to produce extracellular enzymes namely amylases, lipases and proteases as well their capability to produce extracellular enzymes namely amylases, lipases and proteases as well their reversion induced by ultraviolet light. The mutants and revertants were characterized electrophoretically for a -esterase pattern and cytologically for conidia size as well as number of nuclei. The virulence of mutants and revertant strains were evaluated in bioassays against third instar nymphae of Rhodnius prolixus. The mutant strains for amylase and lipase showed phenotypically similar to their parental strains, and it was not observed variation in length, germination and number of nuclei per conidia for both mutants and their revertants. The electrophoretic pattern for a ¿esterases was similar for most of the studied strains except for the mutant showing deficiency for lipolytic activity. The virulence of amylolytic and lipolytic mutants were reduced when compared to their parental strain, while the proteolytic mutants did not show any significant reduction. The virulence was restored for all revertant strains / Doutorado / Doutor em Ciências

Orientador : Ladaslav Sodek / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T16:15:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tonin_GeniSunta_D.pdf: 6851371 bytes, checksum: 078bcf21e6f8169af59d1b67df968c5a (MD5) Previous issue date: 1988 / Resumo: Na soja, as principais formas de transporte para nutrição dos frutos são os ureídeos (plantas noduladas) e asparagina (plantas não noduladas). Glutamina é encontrada em menor proporção. Estes compostos são metabolizados nos frutos de forma a tornar seu nitrogênio disponível para a síntese de proteínas de reserva na semente. A fim de verificar a influência das diversas fontes nitrogenadas sobre a atividade de enzimas chaves do seu metabolismo, cotilédones imaturos de soja (Glycine max L. Meril, cv Santa Rosa) foram cultivados in vitro durante 8 dias em meio definido, variando-se a fonte de N, ou seja, asparagina, glutamina ou o ureídeos alantoína ... O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Francisco Maugeri Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-18T04:29:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Curralero_IsabelCristinaBaddini_M.pdf: 4433878 bytes, checksum: 48fdad6d2e18843264780ad57ae74e38 (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: A produção de dextrana de baixo peso molecular através da reação enzimática com dextrana-sacarase bruta de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512 F foi estudada, utilizando várias concentrações de sacarose e maltose como aceptor. Na ausência de maltose, o aumento da concentração de sacarose levou à formação de polissacarideos de baixo peso molecular, além da dextrana nativa. O produto de reação nestes casos é bastante heterogêneo, havendo ainda redução do rendimento de dextranas totais com o aumento da concentração inicial de sacarose. Com a utilização de maltose foi detectado um aumento na produção das dextranas de baixo peso molecular, proporcional ao aumento do coeficiente R ([maltose]/[sacarose]) e da concentração de sacarose, com rendimentos em dextranas totais superiores àqueles obtidos na ausência de maltose. O melhor resultado foi obtido com concentração de sacarose de 300 g/l e de maltose de 6 g/l (R = 0,02). O rendimento alcançado foi de 77% em dextranas totais, com 86% destas correspondendo a uma espécie com peso molecular médio em torno de 4.000 daltons. / Abstract: The production of low molecular weight dextran during enzimatic reaction with raw dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512 F in different concentrations of sucrose and maltose as acceptor was studied. In the absence of maltose, the increase of sucrose concentration resulted both low molecular weight polysaccharide and native dextran formation. The product was very heterogeneous and with the increase of sucrose concentration, the yields of total dextrans decreased. Using maltose as acceptor, it was observed an increase in the production of low molecular weight dextran, proportionally to the increase of the R ratio ([maltose]/[sucrose]) and sucrose concentration. The yields of total dextrans was higher than that obtained in the absence of maltose. The best result was obtained with a sucrose concentration of 300 g/l and 6 g/l of maltose (R = 0,02). The dextran yield was 77%, with 86% of the product misture corresponding to a low molecular weight dextran with an average molecular weight near to 4.000 daltons. / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Orientador: Francisco Maugeri Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-18T19:03:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VilocheBazan_JuanHeraldo_M.pdf: 4323076 bytes, checksum: c173b7a1393c3663a354336fee533b4c (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: Este trabalho consiste na obtenção "in vitro" de dextrana clínica a partir da sacarose utilizando a enzima dextrana-sacarase obtida pela fermentação do Leuconostoc mesenteroides linhagem NRRL B512-F. A dextrana clínica, de peso molecular médio 40.000 daltons, tem sua aplicação consagrada como expansor volumétrico de sangue humano. A enzima foi produzida por fermentação e purificada usando ultrafiltração, separada com o uso de polietilenoglicol de peso molecular 1500 daltons e estocada a -10°C. O estudo da produção de dextrana clínica foi feito obedecendo 2 etapas de síntese, sendo que para cada uma delas foi realizado um delineamento experimental. No primeiro usou-se maltose como aceptor e no segundo dextrana de peso molecular 4676 daltons. O objetivo dó primeiro delineamento foi otimizar as condições para obtenção de dextrana de peso molecular próximo a 5000 daltons e no segundo para obtenção da dextrana clínica propriamente dita. Determinou-se o rendimento e a distribuição de pesos moleculares da dextrana produzida por um sistema de cromatografia de permeação em gel (HPLC). Os resultados do processo de síntese enzimática de dextrana, foram utilizados' ,para obtenção dos modelos de rendimento e distribuição de pesos moleculares em função da concentração de sacarose, relação R ([aceptor]/[sacarose]) e temperatura. Através da metodologia de superfície de resposta conclui-se que a concentração de sacarose é a variável que mais influencia no processo de síntese enzimática de dextrana. Os parâmetros, para produzir dextrana em torno de 40.000 daltons com maior rendimento, foram altas concentrações de sacarose (133,6 g/l), altos valores da relação R (0.0384)e baixas temperaturas (18.3°C). / Abstract: This study consists of the "in vitro" production of clinical dextran from sucrose using the enzyme dextransucrase obtained from Leuconostoc mesenteroides NRRl B512-F. Clinical dextran, whose average molecular weight is 40,000 daltons, is extensively used as a volume expander of human blood. The enzyme was produced by fermentation; purified by ultracentrifugation, separated using polyethylene glycol (mol. weight 1500 daltons) and stored at -10°C. The study of the production of clinical dextran was carried out according to the two steps of synthesis, an experimental design being produced for each step. In the first step maltose was used as an acceptor and in the second, dextran with a molecular weight of 4676 daltons. The objective of the first design was to optimize the conditions to obtain dextran with a molecular weight of about 5000 daltons, and the second design ained at obtaining the actual clinical dextran. The yield and the molecular weight distribution of the dextran produced was determined by a high performance gel permeation chromatography system (HPLC). The results of the process for the enzymatic synthesis of dextran were used to obtain models for the yield and the molecular weight distribution as conditions of sucrose concentrations, the ratio R and temperature. Using surface response methodology, it was conclucted that the sucrose concentration was the variable that most affected . the enzymatic synthesis of dextran. The parameters required to produced greater yields of dextran with a molecular weight of about 40,000 daltons were: high concentrations of sucrose (133,7 g/l), low temperatures (18,3°C) and high values to the relationship R (acceptor]/[sucrose]) of 0,0384. / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Orientador: Nora Marcela Haun Quiros / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T11:56:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Milagres_AdrianeMariaFerreira_D.pdf: 12688997 bytes, checksum: 8efdd97a43f2fb8a7a34a2dea35f113e (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: Neste estudo investigou ¿ se a possibilidade de utilização de um hidrolisado hemicelulósico, obtido a partir da hidrólise ácida branda do bagaço de cana-de-açúcar, como meio de cultura para crescimento de fungo Penicillium janthinellum e para produção de xilanases. As condições ótimas para crescimento do fungo e produção de xilanases em incubadoras com movimento rotatório foram: temperatura de 30ºC, pH inicial entre 5,0 e 6,0 e agitação 60 rpm.Sob essas condições, o crescimento celular esteve associado à síntese das enzimas b-xilosidades, b-glaucosidades, endoglucanases e exoglucanases foram pequenos. A produção de xilanases foi também realizada em fermentador de 4 l agitado mecanicamente em meio à base de hidrolisado hemicelulósico, tendo a atividade das xilanases assim produzidas se mostrado menor que a das obtidas em incubadora com movimento rotatório. Uma endoxilanase e uma b-xilosidase foram purificadas do fluido de cultivo do fungo. O estudo da influência do pH revelou um pH ótimo de 5,5 para a atividade da endoxilanase e de 6,0 para a b-xilosidase. Os valores ótimos de temperatura foram 50ºC e 60ºC para endoxilanase e b-xilosidase, respectivamente. Os principais produtos da hidrólise de xilana pela endoxilanase foram xilose, xilobiose e xilotriose. Os pesos moleculares da endoxilanas e b-xilosidade, determinados pó SDS-PAGE, foram 54 kDa e 74,3 kDa, respectivamente... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: This work investigates the possibility of utilizing a hemicellullosic hydrolysate obtained from mild acid hydrolysis of sugar cane bagasse as a culture medium for growing the fungus Penicillium janthinellum and for producing xylanases. The optimum conditions for the growth of fungus and the production of xylanases in a rotary incubator were: temperature of 30ºC, initial pH between 5.0 and 6.0 and agitation at 60 rpm. Under these conditions, cell growth was associated with the induction levels of the enzymes b-xylosidadses, b-glucosidases, endoglucanases and exoglucanases werw small. Xylanase production was also carried out in a 4 L mechanically agitated fermentor, using a hemicellulosic hidrolysate-based medium. The activity of the xylanases produced in this manner was lower than that of the xylanases pçoduced in the rotary incubator. An endoxylanase and a b-xylosidase were purified from the culture filtrate of the fungus. The study of the pH influence revealed an optimum pH 5.5 for endoxylanase activity and 6.0 for b-xylosidase. The optimum values of temperature were 50ºC and 60ºC for endoxylanase and b-xylosidase, respectively. The main products of xylan hydrolysis by endoxylanase were xylose, xylobiose and xylotriose... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências Biológicas

O processamento de celulose em moinho de bolas de porcelana produz um pó no qual se detecta a presença de radicais livres, por Ressonância Paramagnética Eletrônica. O espectro obtido e complexo e pode ser decomposto em pelo menos dois sinais: uma linha instável, eliminada apôs alguns dias de exposição ao ar, e outra estável, que decai lentamente por aquecimento a 400-500ºC, e desaparece a 900ºC. A moagem simultânea de celulose com amido, acrilamida, azul de dextrana e sacarose produz celulose quimicamente modificada. Por exemplo, no caso da acrilamida, dosagem pelo método kjeldahl revela a presença de ate 0,65% de nitrogênio no material obtido apôs lavagens exaustivas. A celulose moída na presença de vários reagentes foi submetida a ensaios de hidrólise e em alguns casos, mostrou-se significativamente mais suscetível ao ataque enzimático do que a celulose simplesmente moída. Os resultados deste trabalho mostram que a conversão enzimática de celulose em açucares redutores e sensível a uma pequena modificação no pré-tratamento mecanoquímico. / Cellulose processing on porcelain ball mill produce a powder in which one can detect free radicals by means of Electronic Paramagnetic Ressonance. The spectrum attained is complex and it may be decomposed in at least two signals: an unstable line that is eliminated after some days of exposition tc air and another stable line, which slowly decays due to heating at 400-500ºC and disapears at 900ºC. Cellulose simultaneously milled with starch, acrylamide, dextran blue and saccharose produce chemically modified cellulose. For instance, when using acrylamide one can detect, by means of the Kjeldhal method, the existence of nitrogen up to 0.65% in the material obtained after exhaustive washings. In some cases cellulose milled with several reactants seemed to be significantly more susceptible to the enzymatic attack during hydrolysis than cellulose milled without any reactant. The results of this work show that the enzymatic conversion of cellulose into reducible sugars is sensible to a little change in the mechano-chemical pre-treatment.

Evalúa el efecto del extracto acuoso de la papa nativa Solanum tuberosum “puca simi” sobre enzimas de detoxificación de fase II en un modelo de hiperbilirrubinemia. Emplea 28 ratas de cepa Rattus norvegicus de 200 a 250 g de peso en cuatro grupos de siete cada uno, a los que se le administra el siguiente tratamiento por vía orogástrica: Grupo I Control, suero fisiológico; Grupo II, Fenilhidrazina 60 mg/kg de peso; Grupo III, extracto de papa 665 mg/kg de peso; Grupo IV, extracto de papa y Fenilhidrazina. Determina los niveles de proteínas totales, bilirrubina total, malondialdehido (MDA), hematocrito y la actividad de glutatión S-transferasa (GST), UDP-glucuroniltransferasa. En el estudio fitoquímico se encuentran polifenoles, flavonoides y saponinas, se halla una disminución significativa (p <0,05) de los niveles de hematocrito, bilirrubina total en los grupos III y IV respecto a los grupos I y II. También se encuentra una disminución significativa (p < 0,05) de la lipoperoxidación en el grupo III (1,53 ng/g tej) y IV (1,56 ng/g tej) respecto al grupo II (2,03 ng/g tej) y grupo I (1,63 ng/g tej), asimismo la actividad específica de la UDP-glucuroniltransferasa aumenta significativamente (p < 0,01) en el grupo IV con respecto a los demás grupos, pero la actividad específica y total de la glutatión S-transferasa no exhibe ninguna diferencia significativa en los cuatro grupos, incrementa de manera significativa el efecto del GSH total en los grupos III y IV respecto a los grupos I y II (p< 0,05). Se concluye que el extracto de papa nativa “puca simi” contiene metabolitos secundarios que protegen la lipoperoxidación e incrementa de manera significativa la actividad de la UDP-glucuroniltransferasa, enzima de detoxificación de fase II. / Tesis

Seminario de Título para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / Actualmente, el uso de enzimas celulasas, debido a su capacidad de degradar celulosa, ha crecido enormemente y ha sido reportado en industrias como la alimentaria, cervecera y vitivinícola, en la industria alimentaria animal, industrias textil y de detergentes, papelera, y de biocombustibles. En la naturaleza estas enzimas son producidas por hongos y bacterias, y son principalmente secretadas al medio extracelular. Estas enzimas pertenecen a una familia compuesta de al menos tres grupos: exo-celobiohidrolasas (CBH), endo-β-1,4 glucanasa (EG) y β-glucosidasa (BG), las cuales forman parte de un complejo catalítico que actúa de manera sinérgica, en compañía de otras enzimas, degradadando la biomasa. Debido al requerimiento de degradar celulosa por parte de diferentes industrias y ante las condiciones en las cuales se realiza este proceso, como la alta temperatura, el diseño de nuevas enzimas, realizando modificaciones sobre secuencias de proteínas mesófilas ya existentes sugiere ser una buena alternativa. En un estudio anterior, con el fin de generar un método bioinformático predictivo para termoestabilización de proteínas, se analizó el efecto de la temperatura sobre la estructura de la exo-celobiohidrolasa I Cel7C del hongo Phanerochaete chrysosporium usando métodos de dinámica molecular. Como resultado de esto se propuso la introducción de tres puentes disúlfuro, cada uno para una proteína Cel7CDC mutante diferente, los que deberían aumentar la rigidez de la estructura a altas temperaturas, y por lo tanto, su termoestabilidad. Con el objetivo de corroborar experimentalmente el método de predicción bioinformática utilizado, en este trabajo se implementó uno de los tres puentes disúlfuros propuestos para Cel7CDC. Para esto se realizó mutación sitio dirigida mediante la técnica de PCR con partidores que contenían la mutación en su interior, con objeto de generar dos mutaciones puntuales en el gen codificante. Con esto se reemplazó la fenilalanina 325 y la glicina 379 de la cadena aminoacídica de la proteína madura, por cisteínas. Las variantes del gen generadas fueron clonadas en los vectores pBluescript II SK (+) y fueron perpetuadas en E. coli TOP10, y también en el vector pPIC9k para ser expresadas en P. pastoris KM71. Se realizó la transformación y la selección de las variantes de P. pastoris se llevó a cabo por prototrofía en ausencia de histidina y luego con concentraciones crecientes de G418 según protocolos de selección del vector pPIC9k. La selección fue verificada mediante PCR de colonias y secuenciación. La expresión se llevó a cabo según el manual de expresión en P. pastoris con el vector, y tras ser analizadas mediante ensayos de actividad y zimogramas, no se encontró actividad asociada a ellas.