A hemorragia intracerebral (HIC) é uma das principais causas de mortalidade em todo mundo, desencadeando eventos adversos e déficits neurológicos graves. A partir disso, essa tese teve como objetivo avaliar as respostas celulares e suas interações envolvidas na HIC e investigar os possíveis mecanismos que contribuem para os déficits sensório-motores relacionados, principalmente, à habilidade dos membros anteriores dos animais. Para isso foram realizados dois experimentos. Em ambos os animais de 90 dias foram submetidos à HIC induzida por colagenase no estriado dorsolateral. No primeiro experimento, após 24h, 72h e 7 dias os animais foram avaliados funcionalmente, e histologicamente quanto ao volume da lesão. Ainda, durante 6h, 24h, 72h e 7 dias, o estriado e o córtex foram avaliados quanto ao número de células neuronais, gliais, e em apoptose; a expressão de GFAP e S100B, no estriado e no córtex, a secreção de S100B, no soro e líquido cérebro-espinhal (LCE). A HIC provocou déficits sensório-motores e perda tecidual; induziu morte neuronal e gliose reativa no estriado. O córtex obteve uma resposta astrocitária similar, mas quanto à microglia houve um aumento apenas em 6h. A S100B correlacionou-se positivamente com o número de células gliais; e negativamente com a força e função dos membros anteriores dos animais lesados. No segundo experimento, foram avaliados o estado oxidativo, o nível de TNF-α, a atividade da glutamina sintetase (GS) e a captação de glutamato nos tempos de 6h, 24h, 72h e 7 dias pós-lesão. Após 6h da HIC houve aumento no nível de TNF-α e excitotoxicidade glutamatérgica; entretanto, a função de clearence astrocitário foi restabelecida 7 dias após o dano. A HIC gerou estresse oxidativo e aumento de antioxidantes endógenos, além disso, as espécies reativas de oxigênio (ERO) inibiram a atividade da GS em 24h e 7 dias após a lesão. A partir dos resultados obtidos, podemos concluir que a S100B atua na lesão hemorrágica produzindo respostas distintas, região dependente, contribuindo para o aumento das células gliais no estriado e córtex, correlacionando-se positivamente com os déficits funcionais. Este é o primeiro relato descrevendo a relação da S100B com as alterações celulares e funcionais durante a progressão da HIC experimental. Além disso, os mecanismos envolvidos na HIC demonstraram padrões e respostas envolvendo excitotoxicidade glutamatérgica e inflamação, que colaboraram para o dano oxidativo; em resposta ao estresse houve o aumento de antioxidantes endógenos que podem ter contribuído para o reestabelecimento da função astrocitária. / Intracerebral haemorrhage (ICH) is a major cause of mortality worldwide, triggering adverse events and serious neurological deficits. From this standpoint, this thesis aimed to evaluate the cellular responses and interactions involved in ICH and investigate the possible mechanisms that contribute to sensory-motor deficits, mainly related to the ability of the forelimbs of animals. For this, two experiments were conducted. In both, animals of 90 days of age were subjected to ICH induced by collagenase in dorsolateral striatum. In the first experiment, after 24h, 72h and 7 days, the animals were evaluated functionally, and histologically about the lesion volume. Also, at 6h, 24h, 72h and 7 days, the striatum and the cortex was evaluated as the number of neuronal, glial and apoptotic cells; the expression of GFAP and S100B, the striatum and cortex, S100B secretion in serum and cerebrospinal fluid (CSF). ICH caused sensorimotor deficits and tissue loss; induced neuronal death and reactive gliosis in the striatum. The cortex astrocyte obtained a similar response, but about the microglia there was an increase only at 6h. S100B was positively correlated with the number of glial cells; and negatively correlated with the strength and function of the forelimbs of injured animals. In the second experiment, were evaluated the oxidative state, the level of TNF-α, the activity of glutamine synthetase (GS) and glutamate uptake at 6h, 24h, 72h and 7 days post-injury. After 6h from ICH, there was an increase in TNF-α levels and glutamatergic excitotoxicity; however, the astrocyte clearance function was established 7 days after the damage. HIC generated oxidative stress and increase of endogenous antioxidants, in addition, reactive oxygen species (ROS) inhibited the activity of GS in 24h and 7 days after injury. Based on the results obtained, we can conclude that S100B acts in hemorrhagic lesions producing different responses, region-dependent, contributing to the increase in glial cells in the striatum and cortex, correlating positively with functional deficits. This is the first report describing the relation of S100B with cellular and functional changes during the progression of experimental ICH. Furthermore, the mechanisms involved in ICH displayed patterns and responses involving glutamatergic excitotoxicity and inflammation, that contributed to oxidative damage; in response to stress there was an increase of endogenous antioxidants which may have contributed to the re-establishment of astrocyte function.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Objetivos: Embora compreenda a mais prevalente desordem do movimento, a fisiopatologia do tremor essencial (TE) e ainda controversa. Conforme a hipotese mais aceita, trata-se de um tremor central causado por uma disfuncao do complexo olivar inferior, provavelmente secundario a uma hipofuncao do sistema GABAergico. Vilela Filho et al (2001), por outro lado, relataram o caso de uma paciente com TE da mao direita que foi completamente eliminado apos uma isquemia restrita ao putamen posterior contralateral e sugeriram que o TE poderia representar a manifestacao clinica da hiperatividade do putamen posterior. O presente estudo foi realizado para testar essa hipotese no mais frequentemente usado modelo animal de TE, o tremor induzido pela harmalina em ratos e, empregando-se o mapeamento fisiologico por estimulacao, melhor determinar a organizacao somatotopica do striatum no rato. Metodos: 54 ratos Wistar machos (peso=250-350g) foram aleatoriamente distribuidos em tres grupos: experimental-GE (n=26), controle cirurgico-GCC (n=18) e controle farmacologico-GCF (n=10). Animais do GE foram submetidos a estriatotomia posterior estereotaxica unilateral (coordenadas: 1.8mm posterior/4.6mm lateral/5.85mm inferior; eletrodo: 0.35mm em diametro externo e 1.0mm de ponta exposta; parametros da lesao eletrolitica: 5.0mA/6o/60Hz) apos estimulacao eletrica do alvo (parametros: 0.2, 0.5, 1.0 e 2.0mA/monopolar/6o/60Hz). Nos animais do GCC, o eletrodo foi introduzido no alvo e retirado, sem se proceder a estimulacao ou lesao. Animais do GCF serviram apenas como controles para os efeitos da harmalina, nao tendo sido operados. Todos os animais (7o dia pos-operatorio naqueles operados) receberam harmalina intraperitonial (20mg/kg/ml), tendo sido o tremor induzido filmado 45 e 110 minutos apos sua administracao. A intensidade do tremor apendicular foi avaliada, independentemente, por um observador ocegoo, enquanto a dos tremores axiais, bem como a latencia e duracao de todos os tremores, pelos pesquisadores. Apos o teste da harmalina, os animais do GE e GCC foram sacrificados e seus cerebros enviados para o exame histopatologico. Resultados: Conforme criterios estabelecidos, 13 animais foram excluidos do estudo. O tremor apendicular mostrou-se reduzido ipsolateralmente a cirurgia em 20/21 animais do GE e em 2/9 do GCC e assimetrico em 1/10 do GCF; tais diferencas foram estatisticamente significantes entre GE e GCC e GE e GCF, mas nao entre GCC e GCF. Curiosamente, a latencia e duracao dos tremores axiais foram menores no GCF que no GE e GCC. A percentagem de reducao media do tremor apendicular foi 43.70%±14.22, tendo sido maior nas patas anteriores que posteriores e apos a estriatotomia posterior direita que esquerda. Lesoes estriatais laterais proporcionaram melhores resultados que as mediais. Conclusoes: Esses resultados sao sugestivos de uma provavel participacao do striatum posterior no tremor induzido pela harmalina em ratos e reforcam a hipotese determinante da realizacao do presente estudo. Os resultados derivados do mapeamento fisiologico estriatal por estimulacao e da resposta do tremor a cirurgia, por sua vez, sugerem a seguinte organizacao somatotopica no striatum dorsal do rato: patas dianteiras (muito provavelmente superpostas), posteriores e ventrais; tronco e cauda, anteriores; e patas traseiras, em posicao intermediaria entre as duas anteriores, anterior e dorsalmente as patas dianteiras, situando-se a contralateral posteriormente a ipsolateral / Purposes: Although the most prevalent movement disorder, the pathophysiology of essential tremor (ET) remains controversial. The most accepted hypothesis is that it is a central tremor caused by a dysfunction of the inferior olivary complex, probably secondary to GABAergic system malfunctioning. Evidence for the involvement of the basal ganglia had never been presented. Vilela Filho et al (2001), though, reported a case of a patient with unilateral hand ET which was completely relieved after a stroke restricted to the contralateral posterior putamen and suggested that ET could be the clinical manifestation of posterior putamen hyperactivity. The present study was designed to evaluate this hypothesis in the most used model of ET, harmaline-induced tremor in rats, and, by stimulation mapping, to better determine the somatotopic organization of the rat striatum. Methods: 54 male Wistar rats, 250-350g, were randomly distributed in three groups: experimental-EG (n=26), surgical control-SCG (n=18), and pharmacological control-PCG (n=10) groups. EG animals underwent stereotactic unilateral posterior striatotomy (coordinates: 1.8 posterior/4.6 lateral/5.85mm inferior; electrode: 0.35mm in external diameter and 1.0mm exposed tip; electrolytic lesion parameters: 0.5mA/6”/60Hz) after target stimulation (parameters: 0.2, 0.5, 1.0, and 2.0mA/monopolar/6”/60Hz). SCG rats underwent electrode placement at the target and withdrawn without stimulation or lesioning (sham lesion). PCG served exclusively as controls for harmaline effects. All animals received (7th postoperative day in those of EG and SCG) IP harmaline (20mg/kg/ml) and the induced-tremor was video recorded 45` and 110` after the injection. Limb tremor intensity was independently evaluated by a blind observer, while axial tremors intensity, as well as latency and duration of both limb and axial tremors, were evaluated by the researchers. Animals of EG and SCG were killed after harmaline test and their brains sent to histopathology. Results: Obeying predetermined criteria, 13 animals were excluded from the study. Limb tremor was reduced ipsolaterally to the operation in 20/21 rats of EG and in 2/9 of SCG, and was asymmetric in 1/10 of PCG. Comparisons between EG x SCG and EG x PCG were statistically significant, but not between SCG x PCG. None of the rats presented tremor reduction contralateral to the operation. Curiously, latency and duration of axial tremors, but not of limb tremor, were lesser in PCG than in EG and SCG. The mean percentage of limb tremor reduction in animals of EG was 43.7%±14.22, being greater in anterior than in posterior paws, and after right than left striatotomy. Lateral lesions yielded better results than medial lesions. Conclusions: These results suggest that the posterior striatum is possibly involved with harmaline-induced tremor in rats and give support to our hypothesis, according to which hyperactivity of the posterior putamen may play a role in the genesis of ET. Data provided by stimulation mapping and tremor response to operation suggest the following somatotopic organization in the rat dorsal striatum: forepaws (probably overlapped), caudal and ventral; trunk and tail, rostral; and hind paws, in an intermediary position, dorsal and rostral to the forepaws, being the contralateral one caudal to the ipsolateral. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

As acidúrias D-2-hidroxiglutárica (D-2-HGA) e L-2-hidroxiglutárica (L-2-HGA) são doenças neurometabólicas hereditárias causadas pelas deficiências das atividades da D-2-hidroxiglutarato desidrogenase (D-2-HGA do tipo I) ou isocitrato desidrogenase 2 (D-2-HGA do tipo II) e L-2-hidroxiglutarato desidrogenase (L-2-HGA). Os pacientes afetados por essas doenças desenvolvem principalmente sintomas e sinais neurológicos como convulsões, coma e atrofia cerebral. As lesões cerebrais ocorrem majoritariamente nos gânglios da base (D-2-HGA e L-2-HGA) e no cerebelo (L-2-HGA). Bioquimicamente, a D-2-HGA e a L-2-HGA são caracterizadas pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária dos ácidos D-2-hidroxiglutárico (D-2-HG) e L-2-hidróxiglutárico (D-2-HG), respectivamente. Tendo em vista que a fisiopatologia da disfunção cerebral encontrada nestes pacientes ainda é pouco conhecida, o presente trabalho investigou os efeitos da administração intracerebral in vivo em ratos jovens dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre parâmetros de estresse oxidativo e sobre a histopatologia das principais estruturas afetadas nos pacientes com D-2-HGA (estriado) ou L-2-HGA (estriado e cerebelo). Inicialmente, avaliamos o efeito dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre os níveis de malondialdeído (MDA) e sobre a formação de carbonilas em estriado e cerebelo. Verificamos que ambos os ácidos orgânicos aumentaram significativamente os níveis de MDA (dano oxidativo lipídico) no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). Por outro lado, apenas o D-2-HG foi capaz de aumentar a formação de carbonilas (dano oxidativo proteico) no estriado. Além disso, o D-2-HG diminuiu as concentrações de glutationa reduzida (GSH) e as atividades enzimáticas da glutationa peroxidase (GPx) e da superóxido dismutase (SOD), além de aumentar as concentrações de glutationa oxidada (GSSG) no estriado. Já o L-2-HG foi capaz de diminuir as concentrações de GSH e de gutationa total (tGS), bem como a atividade da GPx e da glutationa redutase (GR). Por fim, o L-2-HG aumentou as concentrações de GSSG no estriado e no cerebelo. Também investigamos o efeito da administração intracerebral in vivo do D-2-HG e do L-2-HG sobre a oxidação de diclorofluorosceína (DCFH), produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) e sobre o conteúdo de nitratos e nitritos, com o objetivo de verificar quais as principais espécies reativas envolvidas nos danos induzidos por estes ácidos orgânicos. O D-2-HG aumentou os níveis de nitratos e nitritos, mas não foi capaz de alterar a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, indicando o envolvimento de espécies reativas de nitrogênio (ERN) nesses efeitos. Já o L-2-HG aumentou a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, não alterando o conteúdo de nitratos e nitritos. Tais resultados sugerem que o L-2-HG provavelmente induz as alterações observadas através do aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Também demonstramos que os antioxidantes melatonina, creatina, ácido ascórbico mais α-tocoferol (Vit C + E), N-acetilcisteína (NAC), maleato de dizocilpina (MK-801) e Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) foram capazes de prevenir o dano oxidativo lipídico e a diminuição das defesas antioxidantes induzidos pelo D-2-HG e pelo L-2-HG. Melatonina, creatina e a solução de Vit C + E preveniram vários efeitos induzidos pelo L-2-HG, enquanto o MK-801 e o L-NAME foram capazes de prevenir apenas os efeitos induzidos pelo D-2-HG e o NAC não preveniu os efeitos induzidos pelos dois ácidos orgânicos. Observamos ainda que os ácidos 3-metilglutacônico (3-MGT; estruturalmente similar ao D-2-HG) e L-2-hidróxi-3-metilvalérico (L-HMV; estruturalmente similar ao L-2-HG), não foram capazes de alterar esses parâmetros, sugerindo uma ação seletiva para as atividades pro-oxidantes induzidas pelos D-2-HG e L-2-HG. Finalmente, estudos histológicos mostraram que o D-2-HG e L-2-HG são capazes de alterar a morfologia tecidual no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). O D-2-HG causou vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico no estriado. Já o L-2-HG, além de causar vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico, também induziu necrose, formação de corpos granulares eosinofílicos e astrogliose (aumento da proteína ácida fibrilar glial). Também observamos em ratos injetados com L-2-HG perda da população neuronal (diminuição da imunodetecção da proteína neuronal nuclear específica) no estriado, enquanto que no cerebelo o L-2-HG induziu vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico. Concluindo, este trabalho foi o primeiro a demonstrar efeitos in vivo do D-2-HG e do L-2-HG (administração intracerebral) sobre parâmetros de estresse oxidativo e alterações histopatológicas em cérebro de ratos jovens. Presumimos que o comprometimento da homeostase redox possa estar associado às alterações histopatológicas observadas, podendo contribuir pelo menos em parte, para a neuropatologia encontrada nos pacientes afetados pela D-2-HGA e pela L-2-HGA. / D-2-hydroxyglutaric aciduria (D-2-HGA) and L-2-Hydroxyglutaric aciduria (L-2-HGA) are inherited neurometabolic disorders caused by enzymatic defects in D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (D-2-HGA type I) or isocitrate dehydrogenase 2 (D-2-HGA type II) and L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (L-2-HGA), respectively. Patients affected by these disorders develop severe neurological damage, which leads to seizures, coma and cerebral atrophy. Brain lesions occur mainly in the basal ganglia (D-2-HGA and L-2-HGA) and in cerebellum (L-2-HGA) Biochemically, D-2-HGA and L-2-HGA are characterized by tissue accumulation and high urinary excretion of D-2-hydroxyglutaric acid (D-2-HG) and L-2-hydroxyglutaric acid (L-2-HG), respectively. Since the pathophysiology of the tissue damage in these diseases is still poorly unknown, the present study investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG in adolescent rats on important parameters of oxidative stress and on the histopathology of the principal cerebral structures damaged in patients with D-2-HGA (striatum) and L-2-HGA (striatum and cerebellum). Initially, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on malondialdehyde (MDA) levels and carbonyl formation in striatum and cerebellum. We verified that both organic acids significantly elevated MDA levels (lipid oxidative damage) in striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG), whereas only D-2-HG was able to elevate carbonyl formation (protein oxidative damage) in striatum. Furthermore, D-2-HG and L-2-HG significantly diminished reduced glutathione (GSH) concentrations, glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD) activities, besides increasing oxidized glutathione (GSSG) concentrations in striatum. Otherwise, L-2-HG reduced GSH, total glutathione (tGS) concentrations and the activities of GPx and reductase glutathione (GR). Finally, L-2-HG augmented GSSG concentrations in striatum and cerebellum. In the next step of this work, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on 2’,7’-diclorofluorescein oxidation (DCFH), hydrogen peroxide production (H2O2) and nitrate and nitrite content in order to elucidate the main reactive species involved in the oxidative damage induced by these organic acids. D-2-HG elevated nitrate and nitrite content, whereas it did not change DCFH oxidation and H2O2 production, suggesting the involvement of reactive nitrogen species (RNS) in these effects. On the other hand, L-2-HG injection increased DCFH oxidation and H2O2 production, but did not change nitrate and nitrite content. These results suggest that L-2-HG-induced alterations occur by an elevated generation of reactive oxygen species (ROS). We also demonstrated that antioxidants such as melatonin, creatine, a mixture of ascorbic acid plus α-tocopherol (Vit C + E), N-acethylcysteine (NAC), dizocilpine maleate (MK-801) and Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) were able to prevent D-2-HG- and L-2-HG-induced lipid oxidative damage and the reduction of the antioxidant defenses induced by D-2-HG and L-2HG. Melatonin, creatine and Vit C + E prevented some of the effects induced by L-2-HG, whereas MK-801 and L-NAME were only able to prevent the D-2-HG-elicited effects and NAC did not prevent D-2-HG and L-2-HG-induced alterations. We also observed that 3-methylglutaconic (3-MGT, structurally similar to D-2-HG) and L-2-hydroxy-3-methylvaleric (L-HMV, structurally similar to L-2-HG) acids were not able to change these parameters, suggesting a selective effect on the pro-oxidant activities induced by D-2-HG- and L-2-HG. Finally, histological studies demonstrated that D-2-HG and L-2-HG were able to cause histopathological alterations in the striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG). D-2-HG provoked vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration in the striatum. Furthermore, L-2-HG induced vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration, necrosis, granular eosinophilic bodies, astrogliosis (glial fibrillary acidic protein (elevated glial fibrillary acidic protein immunostaining) and neuronal loss (decreased neuron-specific nuclear protein (NeuN) immunostaining) in striatum. On the other hand, L-2-HG provoked only vacuolation and lymphocytic and macrophage infiltration in the cerebellum. To the best of our knowledge this is the first report that demonstrates the influence of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on oxidative stress parameters and histopathological alterations in brain of adolescent rats. We presumed that the disturbance of cell redox homeostasis was probably associated with the histopathological abnormalities observed, that possibly contribute at least in part to the neuropathology of the brain injury of patients affected by D-2-HGA and L-2-HGA.

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Hiroaki Kihara / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, 2017. / O estriado é a maior estrutura dos núcleos basais (NB), recebendo inputs sinápticos de várias regiões. Ele está envolvido no controle de várias funções, incluindo a motora, cognitiva e emocional, além de ser essencial para a organização e execução de ações voluntárias. Os canais de junções comunicantes (JC) são responsáveis por vários processos essenciais, incluindo a sincronização da atividade neuronal e a propagação da apoptose em doenças neurodegenerativas. Por outro lado, o papel da comunicação mediada por Cx no desenvolvimento do SNC permanece mal compreendido. Neste estudo investigamos a expressão gênica e os níveis proteicos da Cx36, Cx43 e Cx45 no estriado de ratos ao longo do desenvolvimento, na idade de E19 (embrionária) P5, P10 (pós-natais) e P60 (adulto), usando PCR em tempo real e wester blotting, respectivamente. Em seguida, examinamos os possíveis papéis dos canais de Cx36, principal Cx neuronal, no estriado em desenvolvimento. Para esta finalidade, realizamos injeções bilaterais in vivo de quinina, um bloqueador seletivo de Cx36, no estriado de ratos P0. Nossos resultados mostraram que Cx36, Cx43 e Cx45 possuem níveis de RNAm distintos durante o desenvolvimento do estriado. Nós observados que os níveis da expressão gênica da Cx36 e Cx45 foram mais altos durante o desenvolvimento quando comparados com P60 (P <0,05), enquanto Cx43 teve níveis mais baixos durante o desenvolvimento, nas idades de E19 e P5, em relação à P60 (P <0,05). O nível proteico da Cx36 em E19 foi maior quando comparado com todas as idades avaliadas e com o adulto (P <0,05). Por outro lado, nós observamos baixos níveis proteicos para Cx43 e Cx45 em todas as idades de desenvolvimento, comparado com P60 (P <0,05). Para analisar os dados de imuno-histoquímica, foram empregadas ferramentas matemáticas para avaliar em detalhe as alterações no padrão de distribuição das Cx36 e Cx45. Verificou-se que a distribuição dos diferentes tamanhos clusters/aglomerados decai semelhante a uma lei de potência, mas com diferentes valores exponenciais para P0 e P60, revelando tamanho de clusters maiores em P0 (P <0,05). Para Cx43, observou-se que esta proteína esteve distribuída uniformemente em toda a região do estriado, incluindo no interior das fibras que formam esta estrutura, padrão não observado para P60. Os resultados estatísticos mostraram uma diferença robusta comparando esses dois padrões de distribuição da proteína (P <0,0002). Nossos resultados da injeção in vivo demonstraram que os comportamentos motivados, como a alimentação, foram gravemente prejudicados nos filhotes. Além disto, a ontogênese de alguns reflexos motores foi adiada, como os comportamentos de aversão ao precipício e de geotaxia negativa. Finalmente, investigamos as conseqüências funcionais do bloqueio de Cx36 realizado no desenvolvimento pós-natal, avaliando o comportamento do rato adulto. Nossos experimentos mostraram que tanto o condicionamento do medo ao som quanto a coordenação motora foram afetados, revelando padrões distintos dos animais controle. Em conclusão a primeira parte do estudo, fomos capazes de revelar padrões de expressão distintos de Cxs em desenvolvimento do estriado, que provavelmente estão relacionados com processos fundamentais durante o desenvolvimento. Pudemos, também, determinar que a comunicação feita pelos canais Cx36 desempenham papéis essenciais no desenvolvimento do SNC, como revelado por nossas observações no estriado. / The striatum is the largest structure of the basal ganglia (BG), receiving synaptic input from multiple regions. It is involved in the control of various aspects of motor, cognitive, and emotional functions, besides being essential for the organization and execution of voluntary actions. Gap junction (GJ) channels are responsible for several essential processes, including synchronization of neuronal activity and spreading of apoptosis in neurodegenerative diseases. On the other hand, the role of Cx-mediated communication in the development of the CNS remains poorly understood. In this study we investigated gene expression and protein levels of Cx36, Cx43 and Cx45 in the striatum of rats along its developmental ages of E19 (embrionary), P5, P10 (postnatal day) and P60 (adult) using real time PCR and western blotting, respectively. We next examined the possible roles of Cx36 channels, the main neuronal Cx, in the developing striatum. To this end, we performed in vivo bilateral injections of quinine, a selective Cx36 blocker, in the striatum of P0 rats. Our results showed that Cx36, Cx43 and Cx45 have distinct mRNA expression during the development of striatum. We observed that Cx36 and Cx45 gene expression levels were higher during the development when compared to P60 (P<0.05), while Cx43 was lower in developmental ages of E19 and P5 (P<0.05) comparing to P60. Cx36 protein levels at E19 were higher when compared with all evaluated ages and to P60 (P<0.05). On the other hand, we observed lower protein levels of Cx43 and Cx45 along all development ages compared to P60 (P<0.05). For immunofluorescence, we employed mathematical analyses to evaluate in detail changes in Cx36 and Cx45 distribution of clusters size evaluation. It was found that the distribution of the clusters size decays similarly with a power law, but with different exponent values for P0 and P60, revealing larger mean clusters at P0 (P<0.05). For Cx43, we observed that this protein was uniformly distributed in the whole striatum, including inside the fibers that forms this structure, pattern not seen for P60. Statistical results showed a robust difference comparing those two patterns of protein distribution (P<0.0002). Our results from in vivo injection showed that motivated behaviors, such as feeding, were severely impaired in rat pups. Moreover, ontogenesis of some motor reflexes was delayed, as supported by cliff avoidance and negative geotaxis behavior tests. Finally, we focused on the functional consequences of Cx36 blockade performed in postnatal development by evaluating adult behavior. Our experiments showed that both tone fear conditioning and motor coordination were affected, revealing distinct from control animals. In conclusion from first part of this study, we were able to disclose distinct expression patterns of Cxs in developing striatum, which are probably related to fundamental processes during the development. We were, also, able to determine that communication provided by Cx36 channels play essential roles in the developing of the CNS, as revealed by our observations in the striatum.

O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é associado ao comprometimento cognitivo, sendo capaz de induzir morte neuronal, de alterar o número e a morfologia das células astrocitárias, de aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BBB) e de promover dano neurovascular. O exercício físico, por outro lado, possui efeitos benéficos sobre o sistema nervoso central (SNC), induzindo plasticidade e melhorando o processo de aprendizagem, de memória e a atividade locomotora. Em nosso primeiro estudo, investigamos os efeitos de cinco semanas de exercício aeróbico sobre a prevenção ou reversão do déficit de memória espacial produzido pelo diabetes, e sobre alterações bioquímicas e imuno-histoquímicas de astrócitos no hipocampo, em ratos machos Wistar com DM1 induzido por estreptozotocina. Foram utilizados quatro grupos: controle não treinado (NTC); controle treinado (TC); diabético não treinado (NTD); e diabético treinado (TD). Neste estudo demonstramos que o exercício reverteu o dano na memória espacial causado pelo DM1, aumentou os níveis de glutationa (GSH) e de glutamina sintetase (GS) nos animais TC, mas não no grupo TD; aumentou a densidade de astrócitos GFAP positivos nos grupos TC e TD, e promoveu ramificação astrocitária no grupo TD. Não observamos nenhuma alteração na captação de glicose e de glutamato entre todos os grupos. No segundo estudo, com os mesmos grupos experimentais, avaliamos os efeitos do exercício sobre a memória de reconhecimento do novo objeto, sobre o comportamento motor no rotarod, e sobre a expressão das proteínas claudina-5 e aquaporina-4 (AQP4), proteínas associadas à integridade da BBB, no hipocampo e no estriado de animais diabéticos. Observamos que o exercício melhorou a memória não espacial e a habilidade motora nos animas TC e TD. O diabetes produziu uma diminuição da expressão da claudina-5 no hipocampo e no estriado, e reduziu os níveis de AQP4 hipocampal. O exercício preservou os níveis de claudina-5 no estriado dos animais TD, mas não no hipocampo, e não alterou os níveis reduzidos de AQP4 hipocampal produzidos pelo diabetes. Nossos resultados indicam que o exercício físico reverte o déficit de memória espacial induzido pelo DM1, melhora a memória de reconhecimento do novo objeto, e a atividade motora, induz importantes alterações morfológicas nas células astrocitárias, e afeta importantes componentes da BBB no estriado. Nossos dados contribuem para a compreensão dos benefícios comportamentais, motores, histofisiológicos e neuroquímicos do exercício físico no DM1. / Type 1 diabetes mellitus (T1DM) affects cognitive domains, induces neuronal death, changes in the number and in morphology of astrocytes, increases blood brain barrier (BBB) permeability and promotes neurovascular impairment. Physical exercise, on the other hand, has beneficial effects on brain functions, inducing brain plasticity and improving learning, memory and locomotor activity. In our first study, we investigated the effects of five weeks of aerobic exercise to prevent or reverse spatial memory deficits produced by diabetes and some biochemical and immunohistochemical changes in hippocampal astrocytes of streptozotocin-induced T1DM in male Wistar rats. The rats were divided in four groups: trained control (TC), non-trained control (NTC), trained diabetic (TD) and non-trained diabetic (NTD). In this study, we demonstrated that exercise reversed spatial memory impairments generated by T1DM, increased glutathione (GSH) and glutamine synthetase (GS) levels in TC animals, but not in TD rats; increased the density of GFAP immunoreactive astrocyte in TC and TD groups, and increased astrocyte ramification in TD group. Glucose and glutamate uptake were not affected. In the second study, using the same experimental groups, we evaluated the effects of exercise on novel object recognition task, on motor behavior in rotarod test, and on the expression of proteins related to BBB integrity, such as claudin-5 and aquaporin-4 (AQP4) in the hippocampus and striatum in diabetic rats. We showed that exercise enhanced the non-spatial memory performance and rotarod ability in the TC and TD animals. Diabetes produced a decrease in claudin-5 expression in the hippocampus and striatum and reduced AQP4 in the hippocampus. Physical exercise preserved the claudin-5 content in the striatum of TD rats, but not in the hippocampus, and the reduction of AQP4 levels produced by diabetes was not reversed by exercise. Our findings indicate that physical exercise reverses the cognitive deficits present in T1DM, improves novel object recognition task retention, enhances motor performance, induces important morphological astrocytic changes, and affects important structural components of the striatal BBB. Our date could enhance the knowledge regarding the behavioral, locomotor, histophysiological and neurochemical benefits of exercise in diabetes.

A hemorragia intracerebral (HIC) é uma das principais causas de mortalidade em todo mundo, desencadeando eventos adversos e déficits neurológicos graves. A partir disso, essa tese teve como objetivo avaliar as respostas celulares e suas interações envolvidas na HIC e investigar os possíveis mecanismos que contribuem para os déficits sensório-motores relacionados, principalmente, à habilidade dos membros anteriores dos animais. Para isso foram realizados dois experimentos. Em ambos os animais de 90 dias foram submetidos à HIC induzida por colagenase no estriado dorsolateral. No primeiro experimento, após 24h, 72h e 7 dias os animais foram avaliados funcionalmente, e histologicamente quanto ao volume da lesão. Ainda, durante 6h, 24h, 72h e 7 dias, o estriado e o córtex foram avaliados quanto ao número de células neuronais, gliais, e em apoptose; a expressão de GFAP e S100B, no estriado e no córtex, a secreção de S100B, no soro e líquido cérebro-espinhal (LCE). A HIC provocou déficits sensório-motores e perda tecidual; induziu morte neuronal e gliose reativa no estriado. O córtex obteve uma resposta astrocitária similar, mas quanto à microglia houve um aumento apenas em 6h. A S100B correlacionou-se positivamente com o número de células gliais; e negativamente com a força e função dos membros anteriores dos animais lesados. No segundo experimento, foram avaliados o estado oxidativo, o nível de TNF-α, a atividade da glutamina sintetase (GS) e a captação de glutamato nos tempos de 6h, 24h, 72h e 7 dias pós-lesão. Após 6h da HIC houve aumento no nível de TNF-α e excitotoxicidade glutamatérgica; entretanto, a função de clearence astrocitário foi restabelecida 7 dias após o dano. A HIC gerou estresse oxidativo e aumento de antioxidantes endógenos, além disso, as espécies reativas de oxigênio (ERO) inibiram a atividade da GS em 24h e 7 dias após a lesão. A partir dos resultados obtidos, podemos concluir que a S100B atua na lesão hemorrágica produzindo respostas distintas, região dependente, contribuindo para o aumento das células gliais no estriado e córtex, correlacionando-se positivamente com os déficits funcionais. Este é o primeiro relato descrevendo a relação da S100B com as alterações celulares e funcionais durante a progressão da HIC experimental. Além disso, os mecanismos envolvidos na HIC demonstraram padrões e respostas envolvendo excitotoxicidade glutamatérgica e inflamação, que colaboraram para o dano oxidativo; em resposta ao estresse houve o aumento de antioxidantes endógenos que podem ter contribuído para o reestabelecimento da função astrocitária. / Intracerebral haemorrhage (ICH) is a major cause of mortality worldwide, triggering adverse events and serious neurological deficits. From this standpoint, this thesis aimed to evaluate the cellular responses and interactions involved in ICH and investigate the possible mechanisms that contribute to sensory-motor deficits, mainly related to the ability of the forelimbs of animals. For this, two experiments were conducted. In both, animals of 90 days of age were subjected to ICH induced by collagenase in dorsolateral striatum. In the first experiment, after 24h, 72h and 7 days, the animals were evaluated functionally, and histologically about the lesion volume. Also, at 6h, 24h, 72h and 7 days, the striatum and the cortex was evaluated as the number of neuronal, glial and apoptotic cells; the expression of GFAP and S100B, the striatum and cortex, S100B secretion in serum and cerebrospinal fluid (CSF). ICH caused sensorimotor deficits and tissue loss; induced neuronal death and reactive gliosis in the striatum. The cortex astrocyte obtained a similar response, but about the microglia there was an increase only at 6h. S100B was positively correlated with the number of glial cells; and negatively correlated with the strength and function of the forelimbs of injured animals. In the second experiment, were evaluated the oxidative state, the level of TNF-α, the activity of glutamine synthetase (GS) and glutamate uptake at 6h, 24h, 72h and 7 days post-injury. After 6h from ICH, there was an increase in TNF-α levels and glutamatergic excitotoxicity; however, the astrocyte clearance function was established 7 days after the damage. HIC generated oxidative stress and increase of endogenous antioxidants, in addition, reactive oxygen species (ROS) inhibited the activity of GS in 24h and 7 days after injury. Based on the results obtained, we can conclude that S100B acts in hemorrhagic lesions producing different responses, region-dependent, contributing to the increase in glial cells in the striatum and cortex, correlating positively with functional deficits. This is the first report describing the relation of S100B with cellular and functional changes during the progression of experimental ICH. Furthermore, the mechanisms involved in ICH displayed patterns and responses involving glutamatergic excitotoxicity and inflammation, that contributed to oxidative damage; in response to stress there was an increase of endogenous antioxidants which may have contributed to the re-establishment of astrocyte function.

As acidúrias D-2-hidroxiglutárica (D-2-HGA) e L-2-hidroxiglutárica (L-2-HGA) são doenças neurometabólicas hereditárias causadas pelas deficiências das atividades da D-2-hidroxiglutarato desidrogenase (D-2-HGA do tipo I) ou isocitrato desidrogenase 2 (D-2-HGA do tipo II) e L-2-hidroxiglutarato desidrogenase (L-2-HGA). Os pacientes afetados por essas doenças desenvolvem principalmente sintomas e sinais neurológicos como convulsões, coma e atrofia cerebral. As lesões cerebrais ocorrem majoritariamente nos gânglios da base (D-2-HGA e L-2-HGA) e no cerebelo (L-2-HGA). Bioquimicamente, a D-2-HGA e a L-2-HGA são caracterizadas pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária dos ácidos D-2-hidroxiglutárico (D-2-HG) e L-2-hidróxiglutárico (D-2-HG), respectivamente. Tendo em vista que a fisiopatologia da disfunção cerebral encontrada nestes pacientes ainda é pouco conhecida, o presente trabalho investigou os efeitos da administração intracerebral in vivo em ratos jovens dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre parâmetros de estresse oxidativo e sobre a histopatologia das principais estruturas afetadas nos pacientes com D-2-HGA (estriado) ou L-2-HGA (estriado e cerebelo). Inicialmente, avaliamos o efeito dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre os níveis de malondialdeído (MDA) e sobre a formação de carbonilas em estriado e cerebelo. Verificamos que ambos os ácidos orgânicos aumentaram significativamente os níveis de MDA (dano oxidativo lipídico) no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). Por outro lado, apenas o D-2-HG foi capaz de aumentar a formação de carbonilas (dano oxidativo proteico) no estriado. Além disso, o D-2-HG diminuiu as concentrações de glutationa reduzida (GSH) e as atividades enzimáticas da glutationa peroxidase (GPx) e da superóxido dismutase (SOD), além de aumentar as concentrações de glutationa oxidada (GSSG) no estriado. Já o L-2-HG foi capaz de diminuir as concentrações de GSH e de gutationa total (tGS), bem como a atividade da GPx e da glutationa redutase (GR). Por fim, o L-2-HG aumentou as concentrações de GSSG no estriado e no cerebelo. Também investigamos o efeito da administração intracerebral in vivo do D-2-HG e do L-2-HG sobre a oxidação de diclorofluorosceína (DCFH), produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) e sobre o conteúdo de nitratos e nitritos, com o objetivo de verificar quais as principais espécies reativas envolvidas nos danos induzidos por estes ácidos orgânicos. O D-2-HG aumentou os níveis de nitratos e nitritos, mas não foi capaz de alterar a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, indicando o envolvimento de espécies reativas de nitrogênio (ERN) nesses efeitos. Já o L-2-HG aumentou a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, não alterando o conteúdo de nitratos e nitritos. Tais resultados sugerem que o L-2-HG provavelmente induz as alterações observadas através do aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Também demonstramos que os antioxidantes melatonina, creatina, ácido ascórbico mais α-tocoferol (Vit C + E), N-acetilcisteína (NAC), maleato de dizocilpina (MK-801) e Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) foram capazes de prevenir o dano oxidativo lipídico e a diminuição das defesas antioxidantes induzidos pelo D-2-HG e pelo L-2-HG. Melatonina, creatina e a solução de Vit C + E preveniram vários efeitos induzidos pelo L-2-HG, enquanto o MK-801 e o L-NAME foram capazes de prevenir apenas os efeitos induzidos pelo D-2-HG e o NAC não preveniu os efeitos induzidos pelos dois ácidos orgânicos. Observamos ainda que os ácidos 3-metilglutacônico (3-MGT; estruturalmente similar ao D-2-HG) e L-2-hidróxi-3-metilvalérico (L-HMV; estruturalmente similar ao L-2-HG), não foram capazes de alterar esses parâmetros, sugerindo uma ação seletiva para as atividades pro-oxidantes induzidas pelos D-2-HG e L-2-HG. Finalmente, estudos histológicos mostraram que o D-2-HG e L-2-HG são capazes de alterar a morfologia tecidual no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). O D-2-HG causou vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico no estriado. Já o L-2-HG, além de causar vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico, também induziu necrose, formação de corpos granulares eosinofílicos e astrogliose (aumento da proteína ácida fibrilar glial). Também observamos em ratos injetados com L-2-HG perda da população neuronal (diminuição da imunodetecção da proteína neuronal nuclear específica) no estriado, enquanto que no cerebelo o L-2-HG induziu vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico. Concluindo, este trabalho foi o primeiro a demonstrar efeitos in vivo do D-2-HG e do L-2-HG (administração intracerebral) sobre parâmetros de estresse oxidativo e alterações histopatológicas em cérebro de ratos jovens. Presumimos que o comprometimento da homeostase redox possa estar associado às alterações histopatológicas observadas, podendo contribuir pelo menos em parte, para a neuropatologia encontrada nos pacientes afetados pela D-2-HGA e pela L-2-HGA. / D-2-hydroxyglutaric aciduria (D-2-HGA) and L-2-Hydroxyglutaric aciduria (L-2-HGA) are inherited neurometabolic disorders caused by enzymatic defects in D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (D-2-HGA type I) or isocitrate dehydrogenase 2 (D-2-HGA type II) and L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (L-2-HGA), respectively. Patients affected by these disorders develop severe neurological damage, which leads to seizures, coma and cerebral atrophy. Brain lesions occur mainly in the basal ganglia (D-2-HGA and L-2-HGA) and in cerebellum (L-2-HGA) Biochemically, D-2-HGA and L-2-HGA are characterized by tissue accumulation and high urinary excretion of D-2-hydroxyglutaric acid (D-2-HG) and L-2-hydroxyglutaric acid (L-2-HG), respectively. Since the pathophysiology of the tissue damage in these diseases is still poorly unknown, the present study investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG in adolescent rats on important parameters of oxidative stress and on the histopathology of the principal cerebral structures damaged in patients with D-2-HGA (striatum) and L-2-HGA (striatum and cerebellum). Initially, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on malondialdehyde (MDA) levels and carbonyl formation in striatum and cerebellum. We verified that both organic acids significantly elevated MDA levels (lipid oxidative damage) in striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG), whereas only D-2-HG was able to elevate carbonyl formation (protein oxidative damage) in striatum. Furthermore, D-2-HG and L-2-HG significantly diminished reduced glutathione (GSH) concentrations, glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD) activities, besides increasing oxidized glutathione (GSSG) concentrations in striatum. Otherwise, L-2-HG reduced GSH, total glutathione (tGS) concentrations and the activities of GPx and reductase glutathione (GR). Finally, L-2-HG augmented GSSG concentrations in striatum and cerebellum. In the next step of this work, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on 2’,7’-diclorofluorescein oxidation (DCFH), hydrogen peroxide production (H2O2) and nitrate and nitrite content in order to elucidate the main reactive species involved in the oxidative damage induced by these organic acids. D-2-HG elevated nitrate and nitrite content, whereas it did not change DCFH oxidation and H2O2 production, suggesting the involvement of reactive nitrogen species (RNS) in these effects. On the other hand, L-2-HG injection increased DCFH oxidation and H2O2 production, but did not change nitrate and nitrite content. These results suggest that L-2-HG-induced alterations occur by an elevated generation of reactive oxygen species (ROS). We also demonstrated that antioxidants such as melatonin, creatine, a mixture of ascorbic acid plus α-tocopherol (Vit C + E), N-acethylcysteine (NAC), dizocilpine maleate (MK-801) and Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) were able to prevent D-2-HG- and L-2-HG-induced lipid oxidative damage and the reduction of the antioxidant defenses induced by D-2-HG and L-2HG. Melatonin, creatine and Vit C + E prevented some of the effects induced by L-2-HG, whereas MK-801 and L-NAME were only able to prevent the D-2-HG-elicited effects and NAC did not prevent D-2-HG and L-2-HG-induced alterations. We also observed that 3-methylglutaconic (3-MGT, structurally similar to D-2-HG) and L-2-hydroxy-3-methylvaleric (L-HMV, structurally similar to L-2-HG) acids were not able to change these parameters, suggesting a selective effect on the pro-oxidant activities induced by D-2-HG- and L-2-HG. Finally, histological studies demonstrated that D-2-HG and L-2-HG were able to cause histopathological alterations in the striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG). D-2-HG provoked vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration in the striatum. Furthermore, L-2-HG induced vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration, necrosis, granular eosinophilic bodies, astrogliosis (glial fibrillary acidic protein (elevated glial fibrillary acidic protein immunostaining) and neuronal loss (decreased neuron-specific nuclear protein (NeuN) immunostaining) in striatum. On the other hand, L-2-HG provoked only vacuolation and lymphocytic and macrophage infiltration in the cerebellum. To the best of our knowledge this is the first report that demonstrates the influence of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on oxidative stress parameters and histopathological alterations in brain of adolescent rats. We presumed that the disturbance of cell redox homeostasis was probably associated with the histopathological abnormalities observed, that possibly contribute at least in part to the neuropathology of the brain injury of patients affected by D-2-HGA and L-2-HGA.

O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é associado ao comprometimento cognitivo, sendo capaz de induzir morte neuronal, de alterar o número e a morfologia das células astrocitárias, de aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BBB) e de promover dano neurovascular. O exercício físico, por outro lado, possui efeitos benéficos sobre o sistema nervoso central (SNC), induzindo plasticidade e melhorando o processo de aprendizagem, de memória e a atividade locomotora. Em nosso primeiro estudo, investigamos os efeitos de cinco semanas de exercício aeróbico sobre a prevenção ou reversão do déficit de memória espacial produzido pelo diabetes, e sobre alterações bioquímicas e imuno-histoquímicas de astrócitos no hipocampo, em ratos machos Wistar com DM1 induzido por estreptozotocina. Foram utilizados quatro grupos: controle não treinado (NTC); controle treinado (TC); diabético não treinado (NTD); e diabético treinado (TD). Neste estudo demonstramos que o exercício reverteu o dano na memória espacial causado pelo DM1, aumentou os níveis de glutationa (GSH) e de glutamina sintetase (GS) nos animais TC, mas não no grupo TD; aumentou a densidade de astrócitos GFAP positivos nos grupos TC e TD, e promoveu ramificação astrocitária no grupo TD. Não observamos nenhuma alteração na captação de glicose e de glutamato entre todos os grupos. No segundo estudo, com os mesmos grupos experimentais, avaliamos os efeitos do exercício sobre a memória de reconhecimento do novo objeto, sobre o comportamento motor no rotarod, e sobre a expressão das proteínas claudina-5 e aquaporina-4 (AQP4), proteínas associadas à integridade da BBB, no hipocampo e no estriado de animais diabéticos. Observamos que o exercício melhorou a memória não espacial e a habilidade motora nos animas TC e TD. O diabetes produziu uma diminuição da expressão da claudina-5 no hipocampo e no estriado, e reduziu os níveis de AQP4 hipocampal. O exercício preservou os níveis de claudina-5 no estriado dos animais TD, mas não no hipocampo, e não alterou os níveis reduzidos de AQP4 hipocampal produzidos pelo diabetes. Nossos resultados indicam que o exercício físico reverte o déficit de memória espacial induzido pelo DM1, melhora a memória de reconhecimento do novo objeto, e a atividade motora, induz importantes alterações morfológicas nas células astrocitárias, e afeta importantes componentes da BBB no estriado. Nossos dados contribuem para a compreensão dos benefícios comportamentais, motores, histofisiológicos e neuroquímicos do exercício físico no DM1. / Type 1 diabetes mellitus (T1DM) affects cognitive domains, induces neuronal death, changes in the number and in morphology of astrocytes, increases blood brain barrier (BBB) permeability and promotes neurovascular impairment. Physical exercise, on the other hand, has beneficial effects on brain functions, inducing brain plasticity and improving learning, memory and locomotor activity. In our first study, we investigated the effects of five weeks of aerobic exercise to prevent or reverse spatial memory deficits produced by diabetes and some biochemical and immunohistochemical changes in hippocampal astrocytes of streptozotocin-induced T1DM in male Wistar rats. The rats were divided in four groups: trained control (TC), non-trained control (NTC), trained diabetic (TD) and non-trained diabetic (NTD). In this study, we demonstrated that exercise reversed spatial memory impairments generated by T1DM, increased glutathione (GSH) and glutamine synthetase (GS) levels in TC animals, but not in TD rats; increased the density of GFAP immunoreactive astrocyte in TC and TD groups, and increased astrocyte ramification in TD group. Glucose and glutamate uptake were not affected. In the second study, using the same experimental groups, we evaluated the effects of exercise on novel object recognition task, on motor behavior in rotarod test, and on the expression of proteins related to BBB integrity, such as claudin-5 and aquaporin-4 (AQP4) in the hippocampus and striatum in diabetic rats. We showed that exercise enhanced the non-spatial memory performance and rotarod ability in the TC and TD animals. Diabetes produced a decrease in claudin-5 expression in the hippocampus and striatum and reduced AQP4 in the hippocampus. Physical exercise preserved the claudin-5 content in the striatum of TD rats, but not in the hippocampus, and the reduction of AQP4 levels produced by diabetes was not reversed by exercise. Our findings indicate that physical exercise reverses the cognitive deficits present in T1DM, improves novel object recognition task retention, enhances motor performance, induces important morphological astrocytic changes, and affects important structural components of the striatal BBB. Our date could enhance the knowledge regarding the behavioral, locomotor, histophysiological and neurochemical benefits of exercise in diabetes.

A hemorragia intracerebral (HIC) é uma das principais causas de mortalidade em todo mundo, desencadeando eventos adversos e déficits neurológicos graves. A partir disso, essa tese teve como objetivo avaliar as respostas celulares e suas interações envolvidas na HIC e investigar os possíveis mecanismos que contribuem para os déficits sensório-motores relacionados, principalmente, à habilidade dos membros anteriores dos animais. Para isso foram realizados dois experimentos. Em ambos os animais de 90 dias foram submetidos à HIC induzida por colagenase no estriado dorsolateral. No primeiro experimento, após 24h, 72h e 7 dias os animais foram avaliados funcionalmente, e histologicamente quanto ao volume da lesão. Ainda, durante 6h, 24h, 72h e 7 dias, o estriado e o córtex foram avaliados quanto ao número de células neuronais, gliais, e em apoptose; a expressão de GFAP e S100B, no estriado e no córtex, a secreção de S100B, no soro e líquido cérebro-espinhal (LCE). A HIC provocou déficits sensório-motores e perda tecidual; induziu morte neuronal e gliose reativa no estriado. O córtex obteve uma resposta astrocitária similar, mas quanto à microglia houve um aumento apenas em 6h. A S100B correlacionou-se positivamente com o número de células gliais; e negativamente com a força e função dos membros anteriores dos animais lesados. No segundo experimento, foram avaliados o estado oxidativo, o nível de TNF-α, a atividade da glutamina sintetase (GS) e a captação de glutamato nos tempos de 6h, 24h, 72h e 7 dias pós-lesão. Após 6h da HIC houve aumento no nível de TNF-α e excitotoxicidade glutamatérgica; entretanto, a função de clearence astrocitário foi restabelecida 7 dias após o dano. A HIC gerou estresse oxidativo e aumento de antioxidantes endógenos, além disso, as espécies reativas de oxigênio (ERO) inibiram a atividade da GS em 24h e 7 dias após a lesão. A partir dos resultados obtidos, podemos concluir que a S100B atua na lesão hemorrágica produzindo respostas distintas, região dependente, contribuindo para o aumento das células gliais no estriado e córtex, correlacionando-se positivamente com os déficits funcionais. Este é o primeiro relato descrevendo a relação da S100B com as alterações celulares e funcionais durante a progressão da HIC experimental. Além disso, os mecanismos envolvidos na HIC demonstraram padrões e respostas envolvendo excitotoxicidade glutamatérgica e inflamação, que colaboraram para o dano oxidativo; em resposta ao estresse houve o aumento de antioxidantes endógenos que podem ter contribuído para o reestabelecimento da função astrocitária. / Intracerebral haemorrhage (ICH) is a major cause of mortality worldwide, triggering adverse events and serious neurological deficits. From this standpoint, this thesis aimed to evaluate the cellular responses and interactions involved in ICH and investigate the possible mechanisms that contribute to sensory-motor deficits, mainly related to the ability of the forelimbs of animals. For this, two experiments were conducted. In both, animals of 90 days of age were subjected to ICH induced by collagenase in dorsolateral striatum. In the first experiment, after 24h, 72h and 7 days, the animals were evaluated functionally, and histologically about the lesion volume. Also, at 6h, 24h, 72h and 7 days, the striatum and the cortex was evaluated as the number of neuronal, glial and apoptotic cells; the expression of GFAP and S100B, the striatum and cortex, S100B secretion in serum and cerebrospinal fluid (CSF). ICH caused sensorimotor deficits and tissue loss; induced neuronal death and reactive gliosis in the striatum. The cortex astrocyte obtained a similar response, but about the microglia there was an increase only at 6h. S100B was positively correlated with the number of glial cells; and negatively correlated with the strength and function of the forelimbs of injured animals. In the second experiment, were evaluated the oxidative state, the level of TNF-α, the activity of glutamine synthetase (GS) and glutamate uptake at 6h, 24h, 72h and 7 days post-injury. After 6h from ICH, there was an increase in TNF-α levels and glutamatergic excitotoxicity; however, the astrocyte clearance function was established 7 days after the damage. HIC generated oxidative stress and increase of endogenous antioxidants, in addition, reactive oxygen species (ROS) inhibited the activity of GS in 24h and 7 days after injury. Based on the results obtained, we can conclude that S100B acts in hemorrhagic lesions producing different responses, region-dependent, contributing to the increase in glial cells in the striatum and cortex, correlating positively with functional deficits. This is the first report describing the relation of S100B with cellular and functional changes during the progression of experimental ICH. Furthermore, the mechanisms involved in ICH displayed patterns and responses involving glutamatergic excitotoxicity and inflammation, that contributed to oxidative damage; in response to stress there was an increase of endogenous antioxidants which may have contributed to the re-establishment of astrocyte function.

Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-13T14:42:13Z No. of bitstreams: 2 Dissertação completa(David).pdf: 16509548 bytes, checksum: 44c6bbf3d82089ebc82817764572ff34 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T14:42:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação completa(David).pdf: 16509548 bytes, checksum: 44c6bbf3d82089ebc82817764572ff34 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação de Amparo a Ciências e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE) / Os ácidos graxos essenciais exercem um papel crucial para o desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso. Estudos recentes do nosso laboratório têm demonstrado que a restrição dietética crônica destes macronutrientes é capaz de induzir sinais de degeneração e perda de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra (SN) de ratos. O presente estudo visa testar a hipótese de que esta restrição dietética é capaz de alterar a distribuição de neurônios GABAérgicos nigrais bem como aumentar a funcionalidade e reatividade de astrócitos na SN e corpo estriado (CE). Ratos Wistar foram divididos em dois grupos de acordo com a dieta materna, a qual foi fornecida a partir do acasalamento e mantida por duas gerações. O grupo controle recebeu dieta balanceada contendo óleo de soja como fonte lipídica; grupo deficiente em ácidos graxos essenciais (DAGEs) recebeu dieta semelhante, mas tendo o óleo de coco como fonte lipídica. A capacidade funcional da glia foi analisada em homogenados do CE e SN a partir da atividade da enzima Glutamina Sintetase (GS). A distribuição dos astrócitos e neurônios GABAérgicos foi analisada a partir de imunohistoquímica utilizando-se anticorpos monoclonais para a Proteína Ácida Fibrilar Glial (GFAP) e parvalbumina, respectivamente. Os níveis protéicos de GFAP foram analisados por Western blot. O perfil de ácidos graxos essenciais em fosfolipídios da SN ou CE foi analisado por cromatografia gasosa. Análise do padrão de complexidade morfológica dos astrócitos foi realizada avaliando-se índices como dimensão fractal, área de arborização e lacunaridade. Os resultados obtidos evidenciaram um aumento significativo (p < 0.01) na atividade da GS no CE de animais jovens (30-40 dias) e adultos (90-110 dias) do grupo DAGES, comparado ao controle. Na SN, um aumento na atividade da GS do grupo DAGES (p<0.001) só foi observado aos 90 dias. Um aumento na dimensão fractal dos astrócitos (p=0.009) foi observado apenas nos animais jovens do grupo DAGES, comparado ao controle. No entanto um aumento da área de arborização dos astrócitos foi detectado no grupo DAGES tanto em animais jovens (p=0.004) como nos adultos (p=0.005). Não houve diferença na lacunaridade tanto nos animais jovens quanto nos animais adultos. Modificações na expressão das isoformas da proteína GFAP foram também induzidas pela dieta experimental nos animais jovens, observando-se um aumento na isoforma de 42 KDa no CE, SN assim como no córtex cerebral. Análise dos astrócitos marcados para GFAP sugere ausência de astrogliose na SN do grupo DAGEs tanto em animais jovens como adultos. Quantificação preliminar realizada em 4 animais adultos do grupo DAGES e 3 animais do grupo controle sugere que o número de neurônios imunorreativos a parvalbumina da SN não difere entre os grupos. Os resultados obtidos sugerem que a restrição dietética em ácidos graxos essenciais por duas gerações induz efeitos adversos sobre a diferenciação e atividade funcional dos astrócitos, evidenciando também uma reatividade diferenciada entre as células da glia da SN e CE. Contudo, a restrição dietética por duas gerações não é capaz de causar astrogliose na SN dos animais jovens e adultos.