Orientador: Delia B. Rodriguez-Amaya / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T23:31:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peres_RenatoGarcia_D.pdf: 1331591 bytes, checksum: dd871bdf16f75c9e9198ba86cdd4a2c1 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Considerando que os artigos de pesquisa desta tese já estão em inglês e na forma para serem enviados aos periódicos internacionais, nos quais os resumos estão restritos a 100 ou 200 palavras, nesta seção, os resumos estão apresentados com maiores detalhes para uma apreciação melhor dos trabalhos e dos seus resultados. Devido à grande abrangência dos trabalhos, e para facilitar a leitura, os resumos estão apresentados em parágrafos separados, em vez de um único parágrafo. Os chás verde e preto (Camellia sinensis) são bebidas muito consumidas mundialmente. Na última década, estas bebidas têm sido alvo de investigação intensa devido a seus possíveis efeitos benéficos à saúde, atribuídos aos compostos fenólicos. Catequinas e teaflavinas são os fenólicos mais importantes em chá verde e chá preto, respectivamente. Têm sido também atribuídas a infusões de chá mate (Ilex paraguariensis), bebidas bastante consumidas no Brasil, atividades biológicas promotoras da saúde, possivelmente devido aos compostos derivados cafeoilquínicos e outros fenólicos. Portanto, o Capítulo 1 é um artigo de revisão que discute os avanços na instrumentação e metodologia analítica aplicadas aos compostos fenólicos em chás. Técnicas analíticas modernas, como cromatografia líquida de alta eficiência, espectrometria de massas e eletroforese capilar têm fornecido dados importantes sobre a composição destes compostos nas bebidas mencionadas. Compostos fenólicos ocorrem abundantemente em vinhos e têm sido alvo de inúmeras pesquisas científicas nos últimos anos devido aos supostos benefícios à saúde. Ácidos orgânicos exercem influência direta na qualidade e propriedades sensoriais de vinhos, bem como na sua estabilidade e controle microbiológico. A determinação de ambos compostos é, portanto, de extrema importância. Uma revisão da literatura (Capítulo 2) mostra que a eletroforese capilar vem substituindo gradativamente a cromatografia líquida de alta eficiência com vantagens de baixo custo operacional, baixo consumo de solventes, rapidez, simplificação no preparo das amostras, etc. Com fenólicos, a eletroforese capilar tem sido utilizada com sucesso para a determinação de isômeros do resveratrol, ácidos fenólicos e flavonóides. Em ácidos orgânicos, sua utilização se dá nos modos de detecção direta e indireta. ¿Chimarrão¿ e ¿tererê¿ são infusões de erva mate (Ilex paraguariensis) largamente consumidas na América do Sul. O artigo do Capítulo 3 descreve a aplicação de HPLCDAD- ESI/MS na identificação e quantificação de ácidos cafeoilquínicos (CQA), glicosídeos de flavonóis e purina alcalóides nestas bebidas. Infusões foram preparadas de amostras comerciais de Ilex paraguarienses do Sul do Brasil. Os ácidos cafeoilquínicos, 4,5-diCQA, 3-CQA, 5-CQA e 4-CQA foram os principais compostos, 238-289, 153-242, 183-263 e 123-188 µg/mL, respectivamente, em chimarrão, e 206-265, 122-218, 164-209, 103-169 µg/mL, respectivamente, em tererê. Cafeína também foi encontrada em altas quantidades. Os glicosídeos de quercetina e kaempferol estavam presentes em níveis baixos. A atividade antioxidante individual foi determinada por um sistema ¿on-line¿ que mede a habilidade da substância sequestrar o radical ABTS.+, revelando que a capacidade antioxidante não foi proporcional às concentrações dos compostos fenólicos. 3-O-CQA, quercetina-3-O-ramnosilglucosídeo e quercetina-3-O-glucosídeo tiveram maior contribuição para a capacidade antioxidante, embora os glicosídeos de quercetina estavam em teores mais de 10 vezes menores que o 3-O-CQA. O Capítulo 4 teve dois objetivos: (1) comparar a quantificação de flavonóis nas formas glicosidicas e agliconas, e (2) comparar a composição de fenólicos e metilxantinas de mates retiradas em dois pontos da produção e entre as infusões chimarrão e tererê. O método quantitativo utilizado para as agliconas obtidas por hidrólise e aquele usado para glicosídeos, outros fenólicos e metilxantinas tiveram bom desempenho, medido em termos de linearidade, limites de detecção e quantificação, recuperação e repetitividade. Para as 13 amostras analisadas, nas duas infusões, resultados equivalentes foram obtidos para quercetina e kaempferol, nas formas glicosídicas e agliconas. Os teores dos analitos foram todos maiores no chimarrão em comparação ao tererê. Em ambas infuses, os níveis de fenólicos e metilxantinas foram significativamente maiores nos mates obtidos diretamente dos produtores que nas amostras comerciais, indicando que perdas ocorreram nas etapas adicionais do processamento e durante a estocagem das amostras obtidas diretamente dos produtores. Um método rápido por RF-MEKC modificado com ß-ciclodextrina sulfatada foi desenvolvido e validado para a determinação de cinco catequinas em chá verde (Capítulo 5). O eletrólito otimizado consistiu de 0.2% trietilamina, 50 mmol/L SDS e 0.8% s-ß-CD (pH=2,9). Os padrões e as amostras foram injetados em 0,6 psi por 5 segundos sob voltagem constante de -30 kV. O preparo da amostra envolveu a extração de 2g de chá com 200mL de água a 95oC sob agitação constante por 5 min. O método demonstrou excelente desempenho com limites de detecção e quantificação de 0,02 a 0,1 µg/L e 0.1 a 0,5 µg/mL, respectivamente, e recuperação de 94 a 101%. O método foi utilizado para analisar infusões de chás verdes comercializados no Brasil. Epigalocatequina galato (23,4-112,4 µg/mL) foi o principal componente, seguido por Epigalocatequina (18,4-78,9 µg/mL), Epicatequina galato (5,6-29,6 µg/mL), Epicatequina (4,6-14,5 µg/mL) e Catequina (3,2-8,2 µg/mL). Foi desenvolvido e avaliado um método para determinação simultânea da estilbeno resveratrol, quatro ácidos fenólicos e cinco flavonóides em vinhos por eletroforese capilar (CE) (Capítulo 6). A composição do eletrólito e as condições instrumentais foram otimizadas, usando um planejamento fatorial 27-3 e análise de superfície de resposta, mostrando TBS (tetraborato de sódio) / metanol como a variável mais influente. As condições eletroforéticas ótimas, minimizando os valores de CRS, consistiram de 17 mmol/L TBS com 20% MeOH como eletrólito, voltagem constante de 25 kV, injeção hidrodinâmica a 50 mBar por 3 segundos e temperatura de 25oC. Os valores de R2 para linearidade foram igual ou maior que 0,99. Os limites de detecção e quantificação foram de 0,01 a 0,03 e de 0,04 a 0,08 mg/L, respectivamente. Os coeficientes de variação para os tempos de migração e áreas dos picos, obtidos por 10 injeções consecutivas, foram menores de 2%. A recuperação variou de 97 a 102%. O método foi aplicado a 23 diferentes tipos e marcas de vinhos brasileiros. Um método por eletroforese capilar para os ácidos orgânicos mais importantes em vinho foi desenvolvido e validado (Capítulo 7). O eletrólito otimizado consistiu de 10 mmol/L de ácido 3,5-dinitrobenzóico (DNB) a pH 3,6, com 0,2 mmol/L de brometo de cetiltrimetilamônio para inversão de fluxo. O DNB foi escolhido porque tem mobilidade efetiva semelhante aos analitos, boa capacidade tamponante a pH 3,6 e características cromofóricas para detecção indireta. O preparo da amostra envolveu apenas diluição e filtração. O método demonstrou bom desempenho: linearidade (R2 > 0,99) na faixa de concentração avaliada (6 a 285 mg/L); limites de detecção e quantificação de 0,64 a 1,55 mg/L e de 2,12 a 5,15 mg/L, respectivamente; tempo de análise de 5,5 minutos. Os coeficientes de variação, em relação aos tempos de migração e as áreas dos picos, foram abaixo de 5%. As porcentagens de recuperação variaram de 95 a 102%. O método foi aplicado a 23 tipos e marcas de vinhos brasileiros, confirmando a boa repetibilidade e demostrando a grande variação nas concentrações dos ácidos orgânicos / Abstract: Green and black teas (Camellia sinensis) are widely consumed beverages in the entire world. In the last decade, these beverages have been the subject of intense investigations in relation to their possible beneficial effects on health. Catechins and theaflavins are the most important phenolics in green and black tea, respectively. Health promoting have also been attributed to the infusions of mate, beverages widely consumed in Brazil, probably due to caffeoylquinic derivatives and other phenolics. Chapter 1 reviews advances in instrumentation and analytical methodology applied to phenolic compounds in teas. Modern analytical techniques, such as high performance liquid chromatography (HPLC), mass spectrometry (MS) and capillary electrophoreses (CE), have provided important data about the composition of these compounds in the above mentioned beverages. Phenolic compounds occur in abundance in wine and have been the object of intense research in recent years because of their potential benefits to health. Organic acids have a direct influence on the quality and sensory properties of wine, as well as in their stability and microbial control. The determination of phenolic compounds and organic acids of wine is, therefore, of paramount importance. A review of the literature (Chapter 2) shows that capillary electrophoresis is gradually substituting high performance liquid chromatography, with the advantages of low operational cost, low solvent consumption, short analysis time, minimal sample preparation, etc. With phenolics, CE has been successfully used for the determination of resveratrol isomers, phenolic acids and flavonoids. With organic acids, this technique has been employed in the direct and indirect mode. ¿Chimarrão¿ and ¿tererê¿ are mate (Ilex paraguariensis) infusions widely consumed in South America. This paper (Chapter 3) describes the application of HPLC-DADESI/ MS in the identification and quantification of caffeoylquinic acids (CQA), flavonol glycosides and purine alkaloids in these beverages. Infusions were prepared from commercial samples of Ilex paraguarienses from Southern Brazil. The cafeoylquinic acids, 4,5-diCQA, 3-CQA, 5-CQA, and 4-CQA were the major compounds, having 238-289, 153- 242, 183-263, and 123-188 µg/mL, respectively, in chimarrão and 206-265, 122-218, 164- 209, 103-169 µg/mL, respectively in tererê. Caffeine also had high amounts while glycosides of quercetin and kaempferol were found at much lower levels. The individual antioxidant activity was determined by an on-line system that measured their ABTS.+ radical scavenging activity, showing that the antioxidant capacity was not proportional to the concentrations of the phenolic compounds. 3-O-CQA, quercetina-3-Oramnosylglucoside, and quercetina-3-O-glucoside were the major contributors to the antioxidant capacity, although the quercetin glycosides had concentrations less than 10 times that of 3-O-CQA. Chapter 4 had a two-fold objective: (1) compare quantification of flavonols in the glycosidic and aglycone forms, and (2) compare the phenolic and purine alkaloid composition of mate samples taken from two stages of industrial production and of hot and cold infusions. The HPLC quantitative method used for the quantification of the flavonol aglycones obtained by hydrolysis and that used for quantifying the glycosides, other phenolics and the purine alkaloids performed well. Both methods showed good linearity, limits of detection and quantification, recovery and repeatability. For all thirteen samples, analyzed as hot or cold infusion, equivalent results were obtained for quercetin and kaempherol, thus these flavonols are amenable to quantification either in the glycoside or aglycone form. The levels of all the analytes in all the samples were lower in the cold infusion. In both infusions the phenolic and purine alkaloid concentrations were significantly higher in the samples obtained from the producers than in the commercial samples, indicating that losses occurred in the additional processing step and during storage of the later samples. A fast RF-MEKC method modified by sulfated-ß-cyclodextrin was developed and validated for the determination of catechins in green tea (Chapter 5). The optimal electrolyte consisted of 0.2% triethylamine, 50 mmol/L SDS and 0.8% s-ß-CD (pH=2.9). The samples and standards were injected at 0.6 psi for 5 s under constant voltage of -30 kV. Sample preparation involved extraction of 2 g of tea with 200 mL water at 95oC under constant stirring for 5 min. The method demonstrated excellent performance, with LOD and LOQ of 0.02 to 0.1 and 0.1 to 0.5 µg/mL, respectively, and recovery percentages of 94 to 101%. The method was applied to six samples of Brazilian green tea infusions. Epigallocatechin gallate (23.4-112.4 µg/mL) was the major component, followed by epigallocatechin (18.4-78.9 µg/mL), epicatechin gallate (5.6-29.6 µg/mL), epicatechin (4.6- 14.5 µg/mL) and catechin (3.2-8.2 µg/mL). In Chapter 6, a method for simultaneously determining the stilbene resveratrol, four phenolic acids and five flavonoids in wine by capillary electrophoresis (CE) was developed and evaluated. The CE electrolyte composition and instrumental conditions were optimized using 27-3 factorial design and response surface analysis, showing TBS (tetraborate)/MeOH as the most influential variables. The optimal electrophoretic conditions, minimizing the chromatographic resolution statistic (CRS) values, consisted of 17 mmol/L TBS with 20% methanol as electrolyte, constant voltage of 25 kV, hydrodynamic injection at 50 mbar for 3s and temperature of 25oC. The R2 values for linearity were equal to or higher than 0.99; limits of detection and quantification were 0.01 to 0.03 and 0.04 to 0.08, respectively. Coefficients of variation for migration time and peak area obtained from ten consecutive injections were less than 2% and recoveries varied from 97 to 102%. The method was applied to 23 different samples of Brazilian wines. A capillary electrophoresis method for six organic acids in wine was developed and validated (Chapter 7). The optimal electrolyte consisted of 10 mmol/L 3,5-dinitrobenzoic acid (DNB) at pH 3.6 with 0.2 mmol/L cetyltrimethylammonium bromide as flow reverser. DNB was chosen because it had effective mobility similar to the organic acids, good buffering capacity at pH 3.6 and good chromophoric characteristics for indirect detection. Sample preparation involved dilution and filtration. The method showed good performance characteristics: linearity at 6 to 285 mg/L (r> 0.99); detection and quantification limits of 0.64 to 1.55 and 2.12 to 5.15 mg/L, respectively; separation time of less than 5.5 min. Coefficients of variation for ten injections was less than 5% and recoveries varied from 95 to 102%. Application to 23 samples of Brazilian wine confirmed good repeatability and demonstrated wide variation in the organic acid concentrations / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

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Operational parameters such as: (i) wave frequency and amplitude applied in C4D system, (ii) electrical potential applied in injection, (iii) injection time, (iv) detection point, (v) effect of capillary conditioning as well as and (vi) recovery percentage were extensively investigated and optimized. Better separations of cationic mixture containing NH4+, K+, Na+, Ca2+ and Mg2+ were achieved using a buffer system composed of 50 mM Lactic Acid, 20 mM Histidine and 3 mM 18-crown-6 on a capillary with effective length of 14.5 cm. . Addition of internal standard was used to ensure analytical reproducibility and allow the recording of merit figures. Linear behaviors were observed in concentration ranges between 10 and 100 M for NH4+, K+, Ca2+ e Mg2+, and 20-200 M for Na+. The limit of detection values calculated were 3.75 μM (NH4+), 3.70 μM (K+), 7.50 μM (Na+), 5.00 μM (Ca2+) and 5.35 μM (Mg2+). The concentration levels achieved for cations in biological samples ranged from 4,1 μM to 200 μM. Besides the hybrid system, this report also describes the development of an alternative methodology for the fabrication of high-relief masters for soft-lithography in poly(dimethylsiloxane) (PDMS) substrate. One of the innovative features makes reference to the use of low cost commercial photoresist from textile industry - poly(vinyl acetate) (PVAc) - which exhibits low toxicity. PVAc films were deposited on printed cirtuitry boards through the use of a homemade spincoater developed by desktop cooler, with rotation time control. This methodology allowed the production of high relief masters and PDMS channels with width and depth of 50 μm and 40 μm, respectively. Channels and masters profiles They were characterized with the following techniques: scan electron microscopy, perfilometry, optical and electrical. PDMS electrophoresis devices were successfully used for the separation of major inorganic cations. / Esta dissertação descreve o desenvolvimento de duas plataformas alternativas para a realização de eletroforese em microssistemas. Inicialmente é descrita um sistema eletroforético híbrido que dispensa etapas de microfabricação utilizando capilares de sílica fundida, conectados por uma interface comercial com formato em cruz. Este sistema capilar híbrido foi acoplado com detecção condutométrica sem contato (C4D) e aplicado na determinação de cátions inorgânicos (NH4+, K+, Na+, Ca2+, Mg2+) em amostras biológicas. A injeção de amostras foi realizada eletrocineticamente no modo gated, sendo o primeiro estudo em capilares utilizando esta modalidade de injeção. Foram avaliados os parâmetros operacionais de funcionamento do sistema incluindo (i) frequência e amplitude da onda senoidal aplicada ao sistema de detecção, (ii) potencial elétrico aplicado na injeção, (iii) tempo de injeção, (iv) composição do tampão, (v) ponto de detecção, (vi) efeito do condicionamento do capilar e (vii) recuperação. As melhores separações para uma mistura contendo os cátions inorgânicos foram obtidas usando-se um sistema tamponante composto de ácido lático 50 mM, histidina 20 mM e éter coroa (18-crown-6) 3 mM em um capilar com comprimento efetivo de 14,5 cm. As figuras de mérito analítico foram obtidas a partir da adição do íon Li+ como padrão interno, o qual assegurou confiabilidade nas análises quantitativas. A partir da otimização dos parâmetros analíticos, as curvas analíticas para os íons NH4+, K+, Ca2+ e Mg2+ exibiram comportamento linear (R2>0,99) na faixa de 10-100 M enquanto a curva analítica para o íon Na+ proporcionou resposta linear na faixa de 20-200 M. Os limites de detecção encontrados para os cinco cátions foram entre 3,75 μM (NH4+), 3,75 μM (K+), 7,50 μM (Na+), 5,00 μM (Ca2+) e 5,35 μM (Mg2+). O sistema desenvolvido foi explorado para a determinação dos cátions inorgânicos em amostras de urina, saliva e lágrimas. As concentrações encontradas nas amostras biológicas variaram de 4,1 μM a 200 μM. Além do sistema híbrido, a dissertação também apresenta uma metodologia de baixo custo para produção de moldes em alto relevo para litografia suave em poli(dimetilsiloxano) (PDMS). A principal inovação é o uso de fotoresiste de baixo custo, que se trata de uma emulsão fotossensível de poli(acetato de vinila) (PVAc) utilizada na indústria têxtil e que apresenta baixa toxicidade. Outra inovação é o controle da altura dos moldes utilizando um spincoater de produção própria, com controle de tempo de rotação. Com esta metodologia foram produzidos moldes em alto relevo, e microchips em PDMS com 50 μm de largura e 40 μm de altura. Foram realizadas separações eletroforéticas dos cátions NH4+,K+,Na+,Ca2+,Mg2+e Li+. As eficiências de separação variaram entre 73.000 e 120.000 pratos/m. O que comprova que a metodologia alternativa apresenta aplicabilidade microfluídica

Em eletroforese capilar, a reprodutibilidade depende essencialmente da manutenção do sinal e no tempo de migração das espécies. A alteração do fluxo eletrosmótico (EOF) entre corridas é um dos principais fatores que afetam esses parâmetros. Nesse trabalho, é proposto um sistema de monitoramento do EOF baseado em marcas térmicas (TMs), que consistem em sinais presentes em um eletroferograma devido a uma perturbação do eletrólito de corrida ocasionada por um breve aquecimento (da ordem de 100 ms) de uma pequena porção do capilar (aproximadamente 1 mm), sob ação do campo elétrico. O dispositivo responsável pelo aquecimento que se mostrou mais eficiente consistiu em um resistor SMD de 15 Ω sobre o qual 5 V eram aplicados para gerar aquecimento. Estudos sobre a origem das TMs sugerem que o fenômeno está relacionado às mudanças do número de transporte das espécies devido à variação de temperatura. Essas conclusões foram baseadas na comparação do perfil dos sinais de TM com valores de número de transporte, além de estudos envolvendo simulação computacional. Diversas aplicações para as marcas térmicas foram propostas: correção de variação de tempo de migração devido a alterações do EOF, medida direta do EOF e para otimização de parâmetros do detector condutométrico sem contato. As TMs revelaram-se, então, um sistema prático e de fácil implementação, que pode ser utilizado como uma espécie de padrão interno. Adicionalmente, o emprego das TMs em um novo sistema de injeção de amostra, chamado de injeção térmica, foi também proposto. A vantagem desse tipo de injeção consiste na minimização de problemas de contínua introdução de amostra no canal de separação em microchip-CE. Para realizar essa injeção, o capilar é preenchido com a amostra diluída em um eletrólito de corrida e a injeção ocorre quando uma TM é gerada. Estudos com soluções de NaCl apresentaram faixa de resposta linear entre 10 µmol L-1 e 1 mmol L-1 para sódio. Entretanto, problemas de interferência sobre a sensibilidade e a mobilidade dos analitos foram obstáculos enfrentados. Também foi alvo de estudo o emprego da injeção térmica em uma técnica de multiplexação para aumento de relação sinal/ruído, baseado em um novo algoritmo. Embora o modelamento matemático tenha sido eficiente para decodificação de sinais, não foi possível obter o aumento na relação sinal/ruído almejado, pois o tempo de análise seria excessivamente longo. No entanto, a utilização da injeção térmica nesse tipo de estratégia mostrou-se bastante adequada, pois ela requer que diversas injeções sejam realizadas sequencialmente sem a interrupção do potencial de corrida, característica que esse sistema de injeção permite. Posteriormente, a implementação de estratégias que gerassem TMs em tempos mais curtos poderiam viabilizar a técnica. Finalmente, a utilização de TMs como ferramenta para obtenção de constantes físico-químicas, como pKa e mobilidade por exemplo, utilizando a eletroforese capilar mostra-se como uma grande perspectiva para a técnica / In capillary electrophoresis, reproducibility depends essentially on the maintenance of the signal and the migration time when the analysis of the same sample is repeated. Variations in the electroosmotic flow (EOF) between runs are one of the major factors affecting these parameters. In this work, a new approach to monitor the EOF based on thermal marks (TMs) is proposed. TM consists in a signal present in the electropherogram caused by heating (typically 100 ms) a small portion of the capillary (approximately 1 mm), while the electric field is applied. The most effective device to promote the heating was a 15-Ω SMD resistor, powered at 5 V. Studies about the origin of TMs suggest that the phenomenon is related to variations in the transport number of the species due to alterations in the temperature. This conclusion was based on comparison between the TM profile and the transport numbers values, as well as results from computer simulation. The proposed applications for TM include: correction in variations of migration times with alterations on EOF, EOF measurement and optimization of the parameters of contactless conductivity detection. Additionally, a new sample injection procedure, called thermal injection, was also proposed. The advantage of this injection consists in minimization of leakage problems related to the continuous introduction of the sample in the separation channel in microchip-CE. To perform the thermal injection, the capillary is completely filled with the sample diluted in a BGE and the injection occurs with the generation of a TM. Studies with NaCl solutions presented extensive linear response range from 10 µmol L-1 to 1 mmol L-1. However, interference problems on sensibility and analytes mobilities appeared. The use of low-concentration solutions diminishes these problems. However, the analytical signal is also diminished, needing a strategy to raise the sensitivity. Thus, a multiplexing technique based on a new algorithm was also introduced in order to improve signal-to-noise ratio. Although the efficiency of the mathematic modeling on the signals decoding, the desired improvement of signal/noise ratio was not obtained, because the analysis time would be excessively high. However, the employment of the thermal injection seems to be very suitable for multiplexing, due to the possibility of performing several sequential injections with no interruption of the electric field. Afterwards, the implementation of fast velocity devices to generate TMs would enable the technique. Finally, the great perspective to applications of TM concerns in the use of TMs to obtain physical chemical constants, such as pKa and ionic mobilities. The present work describes values of ionic mobilities calculated to monopropyl carbonate, monoisopropyl carbonate, and hydronium.

A formação dos monoalquil carbonatos (MACs) em meio aquoso - produzidos pela reação de um álcool e bicarbonato foi investigada por eletroforese capilar (CE) com detecção condutométrica sem contato (C4D). Foram estudadas ao todo 29 substâncias, das quais 25 apresentaram formação de adutos aniônicos monocarregados e 2 delas, adutos aniônicos com dupla carga. A eletroforese capilar proporcionou a obtenção de medidas de propriedades físico-químicas. Através do tempo de migração, foram obtidos mobilidade, coeficiente de difusão e raio iônico hidratado. Para os n-álcoois de 1 a 5 átomos de carbono, os adutos apresentaram raio iônico hidratado entre 216 pm e 310 pm. Os MACs têm raio iônico proporcional ao do álcool gerador, sendo sistematicamente maiores devidos à anexação do grupo carbonato. Quando comparado a ácidos carboxílicos de cadeia carbônica similar, os MACs possuem menor raio iônico hidratado. A obtenção dos valores da cinética de formação e hidrólise foi possível pela utilização de dupla detecção condutométrica, a qual permitia determinar a concentração do MAC em dois momentos diferentes ao longo da coluna. Devido à impossibilidade de uma calibração direta - já que os sais de MACs se decompõem em água - foi introduzida uma nova técnica de calibração que dispensa o uso de uma solução padrão do analito em favor de uma com espécie de mobilidade similar. As constantes cinética e termodinâmica foram comparadas com aquelas disponíveis na literatura, mostrando boa concordância, como no caso dos adutos para o metanol e etanol (a 25 ºC em meio aquoso), cujos valores da constante termodinâmica sugeridos pela literatura são de 3,57 e 1,80, respectivamente, enquanto que os valores calculados em nosso trabalho são de 4,2 e 2,3, a 25ºC. De forma similar ao ácido carbônico, os ácidos alquilcarbônicos (ACAs) se decompõem em meio ácido, o que dificulta a determinação da verdadeira constante de dissociação. Ainda assim, estudos em pH de 3 a 9, permitiram estimar os valores de pKa dos ácidos derivados de metanol, etanol e propanol como estando algo abaixo de 4, o que estaria em acordo com o valor de 3,6 do ácido carbônico. A formação de MACs também foi observada para dióis, como o etileno glicol e polióis, como o glicerol e manitol. Foi também possível observar, por eletroforese capilar, a formação de adutos aniônicos monovalentes para açúcares, tais como a sacarose, glicose e frutose. Por fim, a pesquisa revelou a possibilidade da formação de adutos com dupla carga - os bis(carbonatos) - para alguns dióis: o 1,4-butanodiol e o 1,6-hexanodiol. Esta é a primeira vez que estas espécies foram observadas. Estes resultados sugerem a formação de adutos aniônicos para várias outras classes de compostos, as quais possuam a hidroxila na cadeia carbônica. Embora, em meio predominantemente aquoso, estas espécies não estejam em alta concentração, trata-se de um novo conjunto de espécies a serem consideradas quando se trabalha em condições propícias. / The formation of monoalkyl carbonates (MACs) in aqueous medium - resulting from an alcohol and bicarbonate - was investigated by using capillary electrophoresis with capacitively coupled contactless conductivity detection (C4D). Twenty nine substances were studied. The mono-charged anionic adducts were observed for 25 of them and double-charged species were observed for 2. Capillary electrophoresis allowed us to obtain some physical-chemical properties. The migration time was used to calculate the ionic mobility, coefficient of diffusion, and hydrodynamic radius. The radii ranged from 216 to 310 pm for the adducts formed from the n-alcohols of 1 to 5 carbon atoms, respectively. The MACs have radii proportional to the size of the alcohol, being systematically greater because of the attached carbonate group. When compared to carboxylic acids of similar carbonic chain, the MACs have smaller radii. The calculation of the kinetic constants was possible due to the double C4D detection, which allows quantitation of the MAC at two different moments along the capillary. Due to the decomposition of the MAC salt in water, a direct quantitation was not possible. Thus an indirect calibration approach was introduced, where the analyte is substituted by a stable species of similar mobility. Good agreement was obtained between the kinetic and thermodynamic constants obtained by this method and those ones available in literature. For instance, the methanol and ethanol adducts were 4.2 and 2.3 (at 25 ºC), respectively, while the literature\'s values are 3.57 and 1.80. Similarly to carbonic acid, the alkyl carbonic acids (ACAs) decompose in acid medium, which impairs the determination of the dissociation constant. Even so, studies from pH between 3 and 9 allowed us to estimate that the pKa values of the adducts for methanol, ethanol, and propanol are somewhat below 4, which is in agreement with the value 3.6 for the carbonic acid. MACs were also observed for diols and polyols as well as for sugars. Finally, double-charged species bis(carbonates) were formed with 1,4-butanediol and 1,6-hexanediol. This is the first time that these species are reported. Although the concentrations of these species are not high in an aqueous medium, they form a new set of substance to be considered in aqueous solution when the conditions are favorable.

A monitorização terapêutica tem sido descrita como um recurso clínico valioso, na individualização do regime de dosagem, de acordo com a concentração do fármaco em amostras de plasma ou soro. O objetivo da monitorização terapêutica é assegurar a eficácia clínica e minimizar os efeitos adversos dos fármacos prescritos na clínica. A química analítica moderna tem sido direcionada para a simplificação dos métodos através da miniaturização dos sistemas analíticos, minimização do consumo de solvente orgânico e do volume da amostra. Neste contexto, metodologias analíticas utilizando as técnicas de microextração, extração sortiva em barra de agitação (SBSE) e microextração em sorvente empacotado (MEPS), juntamente com a eletroforese capilar em solução não-aquosa (NACE) foram desenvolvidas para fins monitorização terapêutica de antidepressivos inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRSs: fluoxetina, sertralina, paroxetina e citalopram) em amostras de plasma de pacientes em terapia com ISRSs. Inicialmente foram padronizadas as condições eletroforéticas com detecção espectrofotométrica (UV) para análise simultânea dos ISRSs em amostras de plasma. Dentre as condições avaliadas (diferentes soluções de eletrólitos em meio aquoso e não aquoso, cromatografia eletrocinética micelar e NACE), a técnica NACE-UV foi a única que apresentou resolução dos fármacos adequada. Em seguida, otimizou-se as variáveis inerentes das técnicas de microextração (SBSE e MEPS), visando minimizar o tempo de análise e aumento da sensibilidade analítica. Para o método SBSE/NACE, as variáveis tempo e temperatura de extração, pH da amostra biológica e processo de dessorção foram otimizadas, já para o método MEPS/NACE, as variáveis, pH da amostra biológica, volume da amostra e número dos ciclos aspirar/dispensar foram otimizadas. A validação analítica foi realizada segundo as normas preconizadas pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), com adição de padrão de padrão interno às amostras de plasma enriquecidas com os antidepressivos em diferentes concentrações plasmáticas que contemplam o intervalo terapêutico dos ISRSs. Para avaliar a aplicabilidade das metodologias padronizadas, amostras de plasma de pacientes em terapia com os ISRSs foram analisadas. Os métodos padronizados (SBSE/NACE e MEPS/NACE) foram comparados ao método de referência (LLE/NACE), utilizando a extração líquido-líquido. As técnicas de microextração, quando comparadas à LLE, apresentaram as seguintes vantagens: a reutilização das fases extratoras, procedimentos de extração com reduzido número de etapas, menores volumes de amostras biológicas e de solventes orgânicos. Segundo os parâmetros de validação avaliados, os métodos SBSE/NACE e MEPS/NACE padronizados podem ser empregados nas análises dos antidepressivos (ISRSs) em amostras de plasma, para fins de monitorização terapêutica. / Therapeutic monitoring allows individualization of the dose regimen and has been indicated for the monitoring of well-established therapeutic intervals. In psychiatric disorders, most of the patients require that the plasmatic concentrations to be within a fixed range, so the disorders are kept under control and the adverse effects are acceptable. The aim of the therapeutic monitoring is ensure clinical effectiveness and minimization of adverse effects of drugs prescribed at the clinic. New trends in analytical chemistry have been directed towards simplification and miniaturization of analytical systems, and minimization of organic solvents and sample volume. In this work, analytical methodologies using microextraction techniques, such as stir bar sorptive extraction (SBSE) and microextraction by packed sorbent (MEPS), in conjunction with capillary electrophoresis in a nonaqueous background electrolyte (NACE) were developed for therapeutic drug monitoring of selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs: fluoxetine, sertraline, paroxetine and citalopram) in plasma sample of patients in therapy with SSRIs. First, the optimization of electrophoretic separation of the SSRIs was carried out to obtain simultaneous analysis of all antidepressants. Among the conditions evaluated (different background electrolytes in aqueous and nonaqueous medium, micellar electrokinetic capillary chromatography, and NACE), NACE-UV gave the best results. In the sequence, the optimization of the inherent variables of microextraction techniques (SBSE and MEPS)aiming analyses time minimization and increase of analytical sensibilitywas carried out. For SBSE/NACE methodology development the variables such as time of extraction, temperature of extraction, and matrix pH were optimized. For MEPS/NACE methodology the variables matrix pH and the volume of draw-eject cycles were optimized. Analytical validation was carried out in agreement with the norms of National Health Surveillance Agency (ANVISA) for both of the proposed methods, in different plasmatic concentrations, which completed the therapeutic interval. The developed methods (SBSE/NACE e MEPS/NACE) were compared to the reference method, using liquid-liquid extraction (LLE/NACE). Microextraction techniques, compared to LLE, gave the following advantages: reutilization of the extraction phase, fewer numbers of steps for extraction, reduction of sample volume, and less consumption of organic solvents. According to the evaluated validation parameters, the standardized methods SBSE/NACE and MEPS/NACE can be used in the analyses of antidepressants (SSRIs) in plasma sample for therapeutic drug monitoring purposes.

O uso de pesticidas constitui um importante aspecto na agricultura moderna, com inquestionável beneficio na produção agrícola. Porém a contaminação dos alimentos por pesticidas constitui um sério risco a saúde do consumidor. A determinação de resíduo de pesticidas em alimentos envolve procedimentos laboriosos, com elevado tempo de análise e várias etapas de pré-concentração. Neste trabalho, procedimentos alternativos de extração e pré-concentração para analise multiresíduo de pesticida em água, frutas e tubérculos foram desenvolvidos. A eletroforese capilar em seu modo MEKC em condições de alto e baixo fluxo eletrosmótico foi empregado para a otimização da separação de diferentes classes de pesticidas (triazinas, organofosforado, carbendamidazóis, feniluréia e carbamatos). A composição do eletrólito de separação otimizada para condições de alto EOF foi: 10 mmol L-1 de tetraborato de sódio (pH 9,3),50 mmol L-1 de SDS e 5% etanol e 5% propanol, enquanto que para condições de baixo EOF foi: 10 mmol L-1 de tampão fosfato (pH 2,5), 25 mmol L-1 de SDS e 10% metanol. Estratégias de pré-concetração on-line conhecida como sweeping (SW) e stacking nos modos de migração reversa das micelas (SRMM) e migração reversa com um plug de água (SWR) bem como as suas versões modificadas foram avaliadas, obtendo fatores de pré-concetração de variaram de 2,6 a 19 para o SW, 2,9 a 15 para o SRW e de 5,5 a 15 para o método SRMM modificado. Varias metodologias de extração envolvendo extração em fase sólida (SPE) e extração líquido-líquido (LLE) foram testada. A estratégia de extração por cloud point foi aplicada a uma amostra de abacaxi. O procedimento denominado dispersão da matriz em fase sólida (sigla inglesa MSPD), que minimiza o uso de solventes orgânicos e é de fácil implementação foi aplicado a amostras de cenoura. A combinação do SPE off-line e das estratégias de pré-concentração anteriormente mencionadas permitiram a determinação de alguns pesticidas na concentração de 0,1 &#181;g L-1 em amostras de água potável. O método de extração e clean-up MSPD seguida da análise de MEKC em alto EOF foi otimizado e algumas figuras de mérito foram estabelecidas baseados em protocolos de validação para análise de pesticidas (IAEA-FAO). Boa linearidade (r > 0,99) foi obtido para todos os pesticidas estudados, exceto para linuron e dimetoato. A precisão do método foi estimada através de testes de recuperação. Dois níveis de fortificação foram utilizados para a avaliação, foram obtidos recuperações de 51 a 89 % para o nível mais baixo e 67 a 100% para o maior nível. Foi obtida uma boa precisão intraensaio (CV < 15%). O método otimizado foi aplicado para análise multiresíduo de cenouras. Uma amostra adquirida no comércio local foi quantificada encontrando-se 0,88 mg kg-1 de simazina, 0,13 mg kg-1 de atrazina e 0,08 mg kg-1 de propazina. / The use of pesticides constitutes an important aspect of modem agriculture, with unquestionable impact on crop production. However, food contamination by pesticide residues is a serious risk for the consumer. The determination of pesticide residues in food usually involves laborious procedures, with time consuming sample clean up and preconcentration steps prior to the analysis. In this work, alternative methodologies for extraction, pre-concentration and analysis of pesticide multi-residue in water, fruits and tubers were developed. Capillary electrophoresis in its micellar mode (micellar electrokinetic Chromatography, MEKC) under low and high electroosmotic flow (EOF) conditions was used for the separation of pesticides from different chemical classes (triazines, organophosphorous, carbendamidazols, phenilurea and carbamates). Optimized electrolyte compositions were: high EOF - 10 mmol L-1 tetraborate (pH 9.3), 50 mmol L-1 SDS, 5 % ethanol and 5 % propanol; low EOF - 10 mmol L-1 phosphate buffer (pH 2.5), 25 mmol L-1 SDS and 10 % methanol. On-line preconcentration strategies for MEKC known as sweeping (SW) and stacking with reverse migrating micelles with (SRW) and without (SRMM) a plug of water prior to the sample plug as well as modified versions of SRW and RMM were evaluated and contrasted in terms of signal enhancement factor (peak height ratios) Signal enhancement factors for SW varied from 2,6 to 19 for SRW from 2,9 to 15, whereas for modified-SRMM from 5,5 to 15. Among the extraction methodologies, several procedures involving solid-phase extraction (SPE) and liquid-liquid extraction (LLE) were tested. It is worth mentioning a strategy based upon cloud point extraction, which was applied to pineapple samples and a procedure denominated matrix solid-phase dispersion (MSPD), which combines low cost, saves in solvents and easy implementation, applied to carrots. The combination of off-line SPE and the above mentioned on-line preconcentration strategies allowed the determination of selected pesticides in the 0.1 &#181;/L level (drinking water sample). A complete methodology involving MSPD for extraction and sample clean-up followed by MEKC in high EOF was optimized and a few figures of merit were established based on method validation protocols for pesticide analysis (IAEA-FAO). Good linearity (r>0.99) was obtained for all pesticides under investigation, except for linuron and dimetoate. The method accuracy was estimated by recovery tests. Two level standard spiking were conducted with recoveries of 51 to 89 % for the lowest level and 67 to 100 % for the highest level. Acceptable intra-day precision was obtained (CV < 15 %). The optimized method was applied to the analysis of multi-residue pesticides in carrots. In a sample acquired in a local grocery store an unusual amount of triazines was found: simazine (O,88 mg/kg), atrazine (0,13 mg/kg) and propazine (0,088mg/kg).

A eletroforese capilar (CE) é uma técnica de separação eficiente, que tem merecido grande atenção nas últimas duas décadas, e que oferece soluções analíticas alternativas ou complementares à cromatografia líquida num número crescente campos de aplicação, incluindo análises de fármacos, compostos biológicos e biogênicos, dentre outros. Entre as vantagens comparativas da técnica figuram separações mais rápidas com pequeno dispêndio de amostras, solução tampão (e solvente orgânico, se usado), baixo custo de operação e manutenção. Todavia, a exigüidade de amostra no capilar tem como reflexo, via de regra, limites de detecção menos favoráveis que os da HPLC, uma limitação significativa na análise de traços, suplantável por técnicas e procedimentos de extração/acumulação prévia dos analitos. Nesta tese concebeu-se e implementou-se a combinação inédita entre a CE e a préconcentração eletroquímica de metais. Novos dispositivos para extração líquido/gás/líquido mediada por membranas microporosas também foram propostos e aplicados à analise de aminas voláteis, sempre utilizando detector de condutância medida sem contato direto com a solução (C4D, contactless capacitively coupled conductivity detection). Primeiramente, sem recorrer à preconcentração, definiu-se condições de análise para 16 aminas (metilamina, dimetilamina, trimetilamina, propilamina, n-butilamina, s-butilamina, t-butilamina, hexilamina, DMAE, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, 1,3-diaminopropano, 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano e 1,6-diaminohexano) juntamente com íon amônio, e, para análise de 9 metais (TI++, Cd2+, Pb2+,Cr3+, Zn2+, Ag+, Cu2+, Co2+ e Ni2+). Um método completo para análise de dimetilaminoetanol em formulações cosméticas por CE-C4D foi desenvolvido e validado. Os estudos de extração e pré-concentração líquido/gás/líquido foram realizados utilizando filamento oco de Oxyphan preenchido com solução coletora. Foi construída cela para extração gasosa constituída de recipiente fechado no qual se introduz amostra com analitos voláteis, ou volatilizáveis pela adição de reagente e/ou aquecimento (pervaporação). A bobina coletora de filamento oco preenchido com solução coletora foi montada na parte interna da tampa da cela. Testes realizados com amostras de tecidos de peixe demonstraram o funcionamento do sistema, que poderá ser aperfeiçoado e aplicado, por exemplo, à análise de aminas biogênicas primárias de baixo peso molecular, indicadoras de decomposição de certos alimentos. Criou-se também extrator microvolumétrico em que o filamento de Oxyphan é montado concentricamente no interior de um capilar de sílica fundida, para realização de estudos de extração líquido/gás/líquido em fluxo. Um sistema em fluxo compreendendo válvulas e microbombas foi montado e colocado sob controle de um programa de computador (Labview), que, entre outras funções, controla o deslocamento da solução coletora exposta no filamento oco (13 &#181;L) até o ponto exato da interface em que se dá a injeção no capilar da CE. Pela primeira vez recorreu-se à acumulação eletroquímica (ECPC) de analitos num sistema FIA-CE-C4D - uma configuração baseada inteiramente na eletroquímica -, visando expandir os limites de detecção das determinações e eliminar interferência de matriz por troca de meio. Implementou-se a pré-concentração catódica seguida de redissolução anódica com uma célula eletroquímica especial, em que o capilar da eletroforese é posicionado junto ao eletrodo de trabalho, feito de ouro obtido a partir de CD\'s graváveis. Uma célula microfluídica ECPC-FIA-CE-C4D também foi construída. Tomando íons Cu2+ como sistema modelo, demonstrou-se o aumento do sinal referente aos íons cobre(lI) no eletroferograma para tempos crescentes de acumulação eletroquímica. Para a solução de alto teor salino contendo mistura dos íons Cd(II), Pb(II), Zn(lI) e Cu(II), comprovou-se a eliminação da interferência da matriz por troca de meio antes da redissolução anódica. Os testes iniciais indicam que os novos dispositivos e sistemas propostos nesta tese para uso em conjunto com a CE têm potencialidade para desencadear novas pesquisas, desenvolvimento de métodos e aplicações, sendo passíveis também de miniaturização e automação. / Capillary electrophoresis (CE) is an efficient separation technique that evolved rapidly in the last couple of decades, now offering complementary or alternative analytical solutions to liquid chromatography for an expanding number of application fields including drugs, biological and biogenic compounds. Some comparative advantages of CE are faster separation, very low consumption of buffer solutions and samples (and organic solvents, if any), lower maintenance and operational costs. However, the quantification of a few nanoliters of analyte in a capillary, as a rule, compromises the detection limits attainable by HPLC, a shortcomming in trace analysis, suplantable by extraction/preconcentration of the analytes from the sample. The combination of electrochemical preconcentration (ECPC) with CE is first proposed in this thesis and tested with metal ions. New devices for liquid/gas/liquid extraction based on microporous filaments filled with a collector solution were proposed and applied to the analysis of volatile amines, The detector of choice was the C4D (capacitively coupled contactless conductivity detection) and CE-C4D working conditions were defined for the separation and determination of: i) 16 amines (methylamine, dimethylamine, trimethylamine, propylamine, n-butylamine, s-butylamine, t-butylamine, hexilamine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, DMAE, 1,3-diaminopropane, 1,4- diaminobutane, 1,5-diaminopentane and 1,6-diaminohexane) plus ammonium, ii) nine metallic ions (Tl+, Cd2+, Pb2+, Cr3+ Zn2+, Ag+, Cu2+, Co2+ e Ni2+). A complete method of analysis for Dimethyl-amino-ethanol (DMAE) in cosmetic formulations was established and validated. Liquid/gas/liquid extraction studies were based on the use of a polypropylene microporous filment (Oxyphan® ) filled with the collection solution. A closed cell was devised in which an Oxyphan® coil is installed beneath the cap and volatilization of sample components can be promoted by heating (pervaporation) or addition of a reactant. The device was successfully tested with fish samples by the detection of primary low molecular weight biogenic amines, a procedure of special interest in fast checking of fish or other foods for decomposition. A microvolumetric version of the liquid/gas/liquid extractor was created with an Oxyphan® hollow fiber mounted concentrically inside a silica capillary. A flow system comprising the micropumps, solenoid valves and the microextrator was designed, automatically operated under software control (Labview). This FIA-CE system was tested by the extraction/enrichment of volatile amines in the collecting solution (13 &#181;L) followed by accurate displacement to the interface with the CE capillary by the micropumps. Pioneering work with ECPC-FIA-CE-C4D an all-electrochemical system was conducted in this thesis aiming expanded detection limits and matrix effect reduction. An electrochemical cell for the interface with FIA-CE system was built in acrylic using gold electrodes made from gold-sputtered CD-Rs. A microfluidic version of the cell interfaced with the CE capillary was also conceived. The full system was evaluated by using Cu2+ as a model specie; an increase in analytical signal was observed as a function of the cathodic deposition time before stripping. For a mixture of Cd2+, Cu2+, Zn2+ and Pb2+ in a high saline media, elimination of the matrix interference by medium exchange before stripping was demonstrated. Initial favorable evaluations show that the devices and systems proposed in 12 the thesis have the potential to engender further research of methods and applications as well as miniaturization and automation of procedures.

No presente trabalho foram estudadas as separações de 18 flavonóides (9 agliconas e 9 glicosídeos) pelas técnicas de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em fase reversa (RP-HPLC) e Cromatografia Micelar Eletrocinética em fluxo reverso (RF-Meck). Em ambas as técnicas foram avaliados solventes puros (metanol, acetonitrila e tetrahidrofurano) e suas misturas como formas de promover a variação de seletividade, através da modificação da fase móvel em HPLC, e da natureza do aditivo orgânico em RF-Meck. Nos estudos efetuados em HPLC utilizando-se gradiente, pode-se comprovar a possibilidade da modelagem do fator de retenção em funçã da proporção de solvente utilizados (MeOH, ACN, THF e suas misturas). Pode-se ainda, com base nos dados de retenção e na análise hierárquica de c1usters, diferenciar quatro diferentes grupos de sistemas cromatográficos com diferentes seletividades para flavonóides agliconas, e outros quatro com diferentes seletividades para glicosídeos. Os sistemas cromatográficos mais ortogonais (cada um pertencente a um grupo de seletividade) foram aplicados na separação de uma planta modelo (Azadirachta indica), de onde pode-se escolher a fase móvel mais seletiva para se otimizar a separação dos flavonóides glicosilados presentes nas folhas desta planta. No método final otimizado pode-se identificar e quantificar cinco dos flavonóides majoritários presentes, sendo três glicosídeos de quercetina (rutina, isoquercitrina e quercitrina) e dois glicosídeos de kaempferol (astragalin e nicotiflorin), em amostras de duas diferentes procedências (Piracicaba-SP e Silvânia-GO). Nos estudos envolvendo a separação dos dezoito flavonóides por RFMEKC pode-se comprovar diferenças significativas de seletividade quando se varia a natureza do solvente orgânico utilizado como aditivo, além de se observar tendências na migração em função das propriedades do solvente adicionado e da estrutura molecular do flavonóide. O solvente de menor eficiência para separação dos flavonóides foi o MeOH. Através da análise dos eletroferogramas obtidos através de um planejamento experimental de misturas, e das trocas de pares críticos observadas nos vários eletrólitos utilizados, obteve-se um método de separação com apenas um par crítico em menos de 12 minutos de corrida. O coeficiente de variação obtido para o fator de retenção foi de 1,5% e para área de 3%, considerando-se cinco injeções. O método desenvolvido foi aplicado com sucesso na identificação dos flavonóides majoritários presentes na planta modelo (Neem), obtendo-se o mesmo resultado do estudo anterior. Como forma de avaliar a concentração de flavonóides totais presentes em espécies vegetais é comum a análise de extratos após hidrólise ácida (conversão de todos glicosídeos em agliconas). Desta forma otimizou-se uma metodologia de separação em RP-HPLC de 8 flavonóides agliconas comumente presentes em alimentos e extratos vegetais de uso cosmético. A otimização foi efetuada mediante um planejamento experimental de misturas, para escolha da fase móvel mais seletiva, e de um planejamento fatorial composto central, para otimização das condições de gradiente. O método obtido foi o mais rápido já visto dentro da literatura consultada. A separação em linha de base foi efetuada em menos de 15 minutos, com coeficientes de variação de área entre 0,1 e 1,8%, coeficiente de correlação de 0,9993 a 0,9994 na faixa de 5 a 100 &#181;g/mL, e limites de quantificação estimados na faixa de 0,1 a 0,21&#181;g/mL. O método desenvolvido foi aplicado na otimização das condições de hidrólise de um extrato de Neem. A otimização foi efetuada através de metodologia de superfície de resposta, levando-se em consideração a concentração de ácido adicionada, o tempo de reação, a temperatura, e a concentração de um antioxidante (ácido ascórbico) adicionado. O resultado da otimização foi uma metodologia de hidrólise com tempo de reação igual a 5 minutos, utilizando-se 1,4 mol/L de HCI, 119°C e 500 &#181;g/mL de ácido ascórbico. Através das metodologias de análise e de hidrólise desenvolvidas pode-se constatar a presença e quantificar no extrato de Neem os flavonóides agliconas quercetina, kaempferol e miricetina. Com o objetivo de se avaliar quais os componentes presentes em extratos vegetais são os responsáveis pelo poder antioxidante atribuído a determinadas plantas, foi montado um sistema de avaliação de poder antioxidante \"on-line\" com reação pós-coluna em HPLC (baseado na literatura) utilizando-se como \"radical livre modelo\" o ABTS. A análise da planta modelo (Neem) neste sistema mostrou que os flavonóides glicosilados identificados nas partes anteriores deste trabalho são os responsáveis pelo poder antioxidante atribuído a esta planta. De posse desta informação, e visando a obtenção de extratos para aplicações cosméticas com poder antioxidante, modelou-se a extração dos flavonóide do Neem em função da composição do solvente extrator (água, etanol , propilenoglicol e suas misturas), de acordo com um planejamento simplex centróide ampliado. Além da previsão da concentração dos princípios ativos pode-se ainda prever outras propriedades dos extratos obtidos, tais como, índice de refração e densidade, muitas vezes constituintes de especificações técnicas de acordo com as aplicações a que se destinam (cremes, xampús, etc). / At this work, separation of 18 flavonoids (9 aglycones and 9 glycosides) using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Reduced Flow Micellar Electrokinetic Chromatography (RF-MEKC) were evaluated. For both techniques, pure solvents (methanol, acetonitrile and tetrahydrofuran) e their mixtures were evaluated as an approach of varying selectivity by changing mobile phase in HPLC and organic additive type in RF-MEKC. For HPLC studies using gradient elution, it was possible to guarantee the modeling for retention factor in function of organic solvent used (methanol, acetonitrile and tetrahydrofuran and theirs mixtures). It can be also confirmed, based on retention data and hierarquical clusters analysis, four different chromatographic groups with different selectivity for flavonoid aglycone, and four groups with different selectivity for glycosides. More orthogonal chromatographic systems (each one belonging to a selectivity group) were applied to Neem (Azadirachta Indica) analysis. From this study, it can be chosen the most selective mobile phase composition and optimize flavonoid glycosides separation present at Neem leaves. Applying optimized method, five major flavonoids can be identified and quantified, three quercetin glycosides (rutin, isoquercitrin and quercitrin) and two kaempferol glycosides (astragalin and nicotiflorin), at two samples from different origins (Piracicaba-SP and Silvânia-GO). For studies regarding eighteen flavonoids separation by RF-MEKC can be proved significant selectivity differences when distinct organic solvent are used as additive. Moreover, it can be noted tendencies in migration behaviour depending of solvent used and molecular structure of flavonoids. The solvent with less efficiency to f/avonoid separation is methanol. Analyzing electropherograms obtained by a design of mixtures and by criticai pairs changes observed in diverse electro/ytes, a separation method with only one criticai pair and 12 minutes run was obtained. Coefficient of variation obtained for retention factor was 1.5% and 3% for area (n=5). Developed method was applied to identify major flavonoids at model plant (Neem) and same results observed at previous work were obtained. In order to evaluate total flavonoid concentration present in a plant is a common approach to analyse extracts after acid hydrolyze (convert ali glycosides to aglycones). A method was optimized to separate 8 flavonoid aglicones by RPHPLC usually present in food and vegetal extracts to cosmetic use. Optimization was performed by a mixture factorial design to select the most selective mobile phase composition and one facto ria I design with central point to optimize gradient parameters. Developed methodology is the faster reported in literature until now. Baseline separation was achieved in less than 15 minutes, with coefficients of variation between 0.1 and 1.8%, correlation coefficient from 0,9993 to 0,9994 at 5-100 &#181;g/mL concentration range and quantification limits from 0.1 to 0.21 &#181;g/mL. Developed method was used to optimize hydrolize parameters for a Neem extract. Optimization was realized by a response surface methodology, having concentration of acid added, reaction time, temperature and antioxidant (ascorbic acid) concentration added as parameters. From this study was developed a hydrolyze methodology with 5 minutes of reaction time, using 1.4 mol/L HCI, 119°C and 500 &#181;g/mL of ascorbic acid. Applying method of analysis and hydrolyze developed at Neem extracts it can be identified and quantified aglicones quercetin, kaempferol and miricetin. Aiming to evaluate which compounds in a vegetal extract have antioxidant activity credited to some plants, an on-line system with post-column reaction was built in HPLC (based on literature), using ABTS as free radical mode!. Neem analysis at this system showed that flavonoid glycosides identified before are the responsible for antioxidant activity described for this plant. Based on this information and intending to obtain vegetal extracts with antioxidant activity for cosmetic use, Neem extraction procedure was modeled in function of solvent mixture used (water, ethanol, propylene glycol and their mixtures), following a simplex centroid designo Besides the concentration of active components prediction it can also be predict other properties like refractive index and density, properties that might be included at technical specifications depending of the intended use (creams, shampoos, etc).

A presente dissertação trata da implementação e otimização de um sistema de detecção condutométrica sem contato capacitivamente acoplada (C4D) para Eletroforese Capilar (CE). O sistema é caracterizado pela compactação do sistema de detecção, versatilidade e flexibilidade de instalação em diferentes equipamentos comerciais de eletroforese capilar e home made. Desde a década de 80, a eletroforese capilar vem se consolidando como uma das técnicas de separação mais relevantes. Normalmente, os instrumentos comerciais são disponibilizados com detectores ópticos e detectores eletroquímicos. A C4D é utilizada em eletroforese capilar posicionando-se dois eletrodos tubulares envoltos ao capilar. A aplicação de sinais de alta frequência entre os eletrodos permite monitorar variações de condutividade da solução dentro do capilar. Assim, a resposta do detector depende de diversos fatores como mobilidade do analito, do co-íon do eletrólito, da frequência e amplitude do sinal aplicado entre os eletrodos e da geometria dos mesmos. A ausência de componentes móveis torna o presente detector compacto (6,5 cm3) e robusto. O presente C4D é constituído de um oscilador local funcionando a 1,1 MHz, um circuito capaz de converter corrente em tensão, retificar e filtrar os sinais analógcos, além de apresentar um conversor de sinais analógicos em digitais (Conversor A/D) de alta resolução (21 bits efetivos). Outra vantagem é a possibilidade de determinar o diâmetro interno do capilar através da leitura do conversor A/D quando se faz passar um fluxo de ar e, posteriormente água através do capilar. A diferença de leitura de conversor A/D pode ser convertida em diâmetro interno mediante uma curva de calibração. Em uma aplicação típica, os limites de detecção baseado no critério 3s (sem filtragem inicial) foi de 0,6, 0,4, 0,3, 0,5, 0,6 e 0,8 &#181;mol L-1 para K+, Ba2+, Ca2+, Na+, Mg2+ e Li+, respectivamente, é comparável a outras implementações de alta qualidade de um detector condutométrico sem contato capacitivamente acoplado. / This dissertation deals with the implementation and optimization of a Capacitively Coupled Contactless Conductivity Detector (C4D) applied to capillary electrophoresis (CE). The system is characterized by compaction of the detection system, installation flexibility and versatility in different commercial capillary electrophoresis equipment and home-made. Since the 80s, capillary electrophoresis has been consolidated as one of the most important separation techniques. Typically, commercial instruments are available to optical detectors and electrochemical detectors. The C4D is used in capillary electrophoresis positioning two electrodes encased in tubular capillary. The application of high frequency signals between the electrodes allows monitoring changes in conductivity of the solution within the capillary. Thus, the detector response depends on several factors such as mobility of the analyte, the co-ion electrolyte, the frequency and amplitude of the signal applied between the electrodes and the geometry of the same. The absence of moving parts makes this compact detector (6.5 cm3) and robust. This C4D is composed of a local oscillator, working at 1.1 MHz, a circuit capable of converting current into voltage, rectify and filter the analogs signals, besides presenting a high-resolution analog-to-digital converter (ADC) (21 bits effective). Another advantage is the possibility of determining the internal diameter of the capillary by reading the ADC when it is passed a stream of air and then water through the capillary. A readings different ADC can be converted into inner diameter through a curve a calibration curve. In a typical application, the detection limits based on the 3s criterion (without baseline filtering) was 0.6, 0.4, 0.3, 0.5, 0.6 and 0.8 &#181;mol L-1 for K+, Ba2 +, Ca2 +, Na+, Mg2+ and Li+, respectively, is comparable to other high-quality implementations of a capacitively coupled contactless conductivity detector.

A tese enfatiza o desenvolvimento e aplicação de amostradores difusionais para pré-concentração de traços de poluentes gasosos e sua conjugação com técnicas de separação e determinação, especialmente, a eletroforese capilar. Foram implementadas novas aplicações para um amostrador com múltiplos filamentos microporosos de polipropileno, previamente desenvolvido pelo grupo de pesquisa, e para o novo dispositivo de coleta de dimensões reduzidas, composto por monofilamento microporoso de polipropileno (CMDS) com volume interno de 30 &#181;L. Para o estabelecimento da vazão estável em 1,0 &#181;L min-1 de fase aceptora pelo capilar poroso, recorreu-se à pressurização do reservatório com uma bomba pneumática de aquário e regulagem de vazão por um capilar de sílica fundida e uma válvula de agulha. Outra bomba pneumática foi utilizada para aspirar o fluxo de ar amostrado. As amostras foram coletadas seqüencialmente em frascos de 200 &#181;L, mantidos sob temperatura reduzida em unidade de refrigeração do tipo Peltier acoplado ao amostrador. O CMDS monofilamentar, mais compacto e robusto, apresentou alta eficiência de coleta para a pré-concentração de formaldeído (CH2O), ácidos fórmico e acético e amônia da fase gasosa da atmosfera. Para as espécies com elevada constante de Henry, água deionizada serviu como fase aceptora, enquanto que para amônia, recorreu-se ao deslocamento do equilíbrio por um aceptor ácido, de modo a reter o analito na forma de NH4 +. A concentração das espécies em fase líquida foi determinada posteriormente por eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato (CE-C4D). Os limites de detecção, em fase líquida, para formiato, acetato, formaldeído (determinado na forma do aduto hidroximetanosulfonato HMS) e amônio foram estimados em 1,0, 1,5, 1,2 e 1,2 &#181;mol L-1, respectivamente (equivalentes à 0,9, 3,0, 1,0 e 0,7 &#181;g m-3 dessas espécies na atmosfera, respectivamente). Para a determinação de CH2O por injeção em fluxo (FIA) acoplada à detecção amperométrica em eletrodo de ouro platinizado, fez-se uso do coletor multifilamentar, por atender melhor à necessidade de volume de amostra. A interferência de espécies comumente presentes na atmosfera, como H2O2 e SO2, pôde ser contornada realizando coletas em presença de peróxido de hidrogênio para promover a oxidação do S(IV) à S(VI) e, posteriormente, destruindo o oxidante em reator contendo enzima catalase imobilizada. A determinação de CH2O foi implementada com sucesso por FIA com detecção por amperometria em eletrodo de ouro platinizado. Um CMDS portátil que funciona à pilha, próprio para amostragens em campo, foi desenvolvido utilizando, para o deslocamento do ar amostrado, uma bomba de pistão retirada de aparelho automático para medida de pressão arterial. O amostrador foi empregado na coleta de H2S, SO2 e alquil-mercaptanas em fase gasosa da atmosfera, utilizando fase aceptora alcalina para promover a desprotonação e conseqüente fixação das espécies em meio líquido. Os analitos foram determinados por CE-C4D ou por microextração em fase sólida (SPME) seguida de determinação por GC. O uso conjunto do antioxidante ascorbato para conservação das amostras e de etanol para fixação dos compostos voláteis em meio aquoso permitiu o estabelecimento de um protocolo completo para coleta e detecção dessas espécies reduzidas de enxofre, com sensibilidade suficiente para monitorar emissões de origem biogênica, o que foi exemplificado na prática coletando amostras próximo a um córrego contaminado com esgoto. A perfeita combinação do diminuto volume de fase aceptora do CMDS com a demanda de nanolitros de amostra da CE-C4D culminou com o desenvolvimento de um sistema de análise total (TAS) com gerenciamento de fluidos baseado em propulsão por bombas de aquário (de baixo custo e alta durabilidade) e válvulas solenóide de estrangulamento, controladas por computador. Como exemplo de aplicação inovador e bem sucedido do TAS desenvolveu-se a análise concomitante e em tempo quase real de ácidos fórmico e acético no ar, com freqüência de 10 pares de dados por hora. As vantagens do sistema CMDS-CE-C4D incluem simplicidade, versatilidade, consumo de reagentes e amostra e geração de resíduos minimizada, robustez e rapidez enquanto uma amostra é coletada, o eletroferograma da anterior é adquirido sem necessidade de bombas de alta pressão ou colunas dispendiosas como as requeridas para HPLC / The development and application of porous membrane diffusion samplers for fast and efficient pre-concentration of an array of trace air pollutants was emphasized in this thesis, in conjunction with compatible separation and determination techniques, especially capillary electrophoresis. New applications were found for a formerly developed diffusion scrubber based on a bundle of microporous hollow polypropylene capillary membranes and for a scaled down version with a single core capillary membrane diffusion scrubber (CMDS) comprising an internal volume of 30 &#181;L, were used for sampling of the trace level pollutants to an adequate liquid acceptor. The low-flow of acceptor solution, 1.0 &#181;L min-1, required by the CMDS was satisfied by pressurization of the reservoir with an aquarium pump combined with flow regulation by a silica capillary as hydrodynamic resistor and a needle valve. Another aquarium pump was used for the aspiration of the sampled air through the sampler. The low volumes collected in the CMDS were stored in 200 &#181;L vials inserted in a cooling plate of a Peltier device. The robust and compact system was used for sampling of formaldehyde (CH2O), formic acid, acetic acid and ammonia in the gaseous phase of the atmosphere. For chemical species with high Henry´s constant, deionized water suffices as acceptor phase. Otherwise, equilibria displacement to a non-volatile ion, like NH4 + for NH3 sampling, promoted quantitative retention in the acceptor phase. The concentrations of the analytes in the liquid phase were determined by capillary electrophoresis with capacitively coupled contactless conductometric detection (CEC4D). The detection limits obtained in the liquid phase for formate, acetate, formaldehyde (in the form of the adduct hydroxymethanesulfonate HMS) and ammonium were 1,0, 1,5, 1,2 e 1,2 &#181;mol L-1 respectively (what corresponds to 0,9, 3,0, 1,0 e 0,7 &#181;g m-3 of the respective gaseous species in the air). The higher volume of acceptor phase provided by the sampler with a bundle of microporous membrane capillaries (~600 &#181;L) are in tune with the needs of flow injection analysis (FIA), as demonstrated for amperometric detection of CH2O on a platinized gold electrode. The interferences from SO2 and H2O2 were overcome by adding H2O2 to the acceptor solution to promote the oxidation of S(IV) to S(VI) and destruction of the oxidant afterwards in a column with immobilized catalase enzyme. The aquarium pump used for gas aspiration was substituted to a piston pump, taken from arterial blood pressure meter fed with 8 V D.C., to turn possible field collections with the CMDS device. The system was used for the sampling of H2S, SO2 e alkyl-mercaptans in the gaseous phase of the atmosphere. To succeed on that, the samplings were performed in alkaline media to promote deprotonation of the species (and stabilization in non-volatile forms). The collected analytes were determined by CE-C4D or by solid phase microextraction (SPME) followed by GC analysis. The joint use of the antioxidant ascorbate for sample preservation and ethanol for fixation of the volatile compounds allowed the establishment of a complete protocol for sampling, storage and detection of the sulfur reduced species with enough sensitivity for monitoring biogenic emissions from waste discharge. Perfect matching of the low-volume characteristics of the CMDS device and the CE-C4D equipment led to the conception of a low-cost automatic CMDS-CE-C4D total analysis system (TAS) and its innovative and successful application to near-realtime simultaneous analysis of formic acid and acetic acid in air. During the evaluation of one sample, the TAS collects a new one, with valves, pumps and high voltage delivery under software control. Advantages include rapidity (10 data points per hour for each analyte), high preconcentration efficiency, simplicity and versatility, minimum sample and reagent consumption and residue generation (green analytical method), no need of costly high pressure pumps and separation columns like those used in HPLC