Orientador: Saulo Santesso Garrido / Banca: Marlus Chorilli / Banca: Wilton Rogério Lustri / Resumo: O uso de novas tecnologias como, por exemplo, peptídeos sintéticos para o desenvolvimento de novas drogas é uma estratégia promissora no campo da biotecnologia. Peptídeos com efeito antimicrobiano derivados de toxinas bacterianas intracelulares, produzidas por sistemas de morte pós-segregacional (PKS) tais como CcdB são exemplos dessa estratégia. Resultados promissores têm sido obtidos em relação à inibição da atividade das enzimas bacterianas topoisomerase IV e DNA girase por derivados peptídicos de toxinas antimicrobianas, isto pode ser visto através de ensaios in vitro, como eletroforese em gel de agarose. Porém, drogas com estrutura peptídica derivadas de toxinas bacterianas apresentam sérios problemas na aplicação terapêutica, pois, têm baixa solubilidade e difícil permeabilidade em membranas bacterianas. Portanto, o objetivo desse estudo consiste no desenvolvimento e aprimoramento de sistemas nanoestruturados (lipossomas) que permita a encapsulação de análogos peptídicos da toxina CcdB e sua consequente translocação no citosol bacteriano, permitindo que os mesmos atinjam seus alvos celulares, que são as enzimas bacterianas DNA girase e Topoisomerase IV. Lipossomas do tipo SUV ("Small unilamellar vesicles") de 100 nm de diâmetro, foram preparados pela técnica de extrusão e evaporação variando-se a composição química de suas formulações. Desta forma, foi avaliada a eficiência de encapsulação dos peptídeos através de técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e espectroscopia de UV-Vis e fluorescência. Após testes de eficiência de encapsulação, os lipossomas contendo os análogos peptídicos da toxina CcdB encapsulados, foram submetidos a ensaio de inibição de crescimento em meio líquido para diferentes espécies bacterianas. Os resultados mostraram que os valores de eficiência para o análogo CdBSG-2 ficaram entre 62 e 75% e... / Abstract: The new technologies, like synthetic peptides, for the development new drugs is a promising in biotechnology. Peptides with antibiotic properties, from Intracellular toxins produced by systems of post-segregational killer (PSK) in bacteria such as CcdB are recent examples of this strategy. Promising results have been obtained with respect to inhibition of the activity of the bacterial enzyme DNA gyrase and topoisomerase IV by toxins antimicrobial peptide derivatives that can be seen through in vitro assays such as electrophoresis in agarose gel. However, drugs formed by peptide structures, based on bacterial toxins, have been shown serious problems in therapeutic application due to their poor solubility and low biological membrane permeabilization. The aim of this study is the development and enhancement of nanostructured systems (liposomes) that allows the encapsulation of analogues peptides based on CcdB toxin and its consequent bacterial translocation in the cytosol, allowing them to reach their cellular targets, which are bacterial enzymes DNA gyrase and topoisomerase IV. Liposomes of the SUV type ("Small unilamellar vesicles") of 100 nm diameter were prepared by extrusion and evaporation technique by varying the chemical composition of their formulations.Thus, we evaluated the encapsulation efficiency of the peptides through techniques of high performance liquid chromatography (HPLC) and UV-Vis spectroscopy and fluorescence. After efficiency of encapsulation tests the liposomes containing the peptides have been tested for growth inhibition in a liquid medium to different bacterial species. The results showed that the efficiency values for the analog CdBSG-2 were between 62 and 75% and the CcdBET-2 analogue values were between 52 and 71% Furthermore, the results of bacterial growth inhibition tests showed liposomal system that is effective, to inhibit 82% of gram positive Staphylococcus aureus... / Mestre

Orientador : Maria Luiza Moretti Branchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T17:09:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kuboyama_RogerioHakio_M.pdf: 19362793 bytes, checksum: 6c32c2a3418d317ad2763415c2eb9569 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: o gênero Enterobacter representa de 4% a 12% das sepses causadas pelos microrganismos gram-negativos e a alta mortalidade associada à sepse neonatal tem recebido atenção especial. Enterobacter c/oacae, um microrganismo comensal do trato gastrointestinal, tem emergido, em anos recentes, como um importante patógeno nosocomial, causando infecção sistêmica em recém-nascidos. Os recém-nascidos, especialmente os prematuros e de baixo peso, constituem uma população de alto risco para o desenvolvimento de infecção sistêmica, logo após o nascimento ou durante o período de hospitalização, freqüentemente prolongado, uma vez que possuem o sistema imunológico imaturo, não se encontrando completamente preparados para a vida fora do útero matemo ou apresentam defeitos congênitos associados à prematuridade....Observação: O resumo, na integra, podera ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The gender Enterobacter is found to account for 4% to 12% of sepsis caused by gram-negative microorganisms and the high mortality rate associated with neonatal sepsis has received especial attention. Enterobacter c/oacae, a commensal microorganism of human intestinal tract has emerged, in recent years, as an important nosocomial pathogen causing sistemic infection in newboms. Newborns, especiallyprematures and low birth weight infants constitute a great risk population for developing bloodstream infection, shortly afier birth or during hospitalization period, frequently prolonged, once they have immature immunologic system, not fully prepared for life outside the maternal uterus or they present congenital defects associated with untimely birth....Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Marcos Aurelio Zezzi Arruda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T19:31:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_FabiolaManhasVerbi_M.pdf: 591813 bytes, checksum: c8f7713c1fc6d940a1e9bbb7778fbb5d (MD5) Previous issue date: 2003 / Mestrado

Orientador: Jose Pedrazzoli Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T04:24:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_FernandaDias_M.pdf: 1238730 bytes, checksum: 28d5c999aab93f179f9bdc1c99b7f95c (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: A determinação das isoenzimas da CK (MM, MB e BB) é de fundamental importância em diagnósticos clínicos de diversas patologias, bem como a determinação da relação entre a razão da CK-MB/CK TOTAL, utilizada como marcador específico para o diagnóstico diferencial de lesão do miocárdio. O objetivo do estudo foi avaliar o perfil eletroforéticodas isoformasMM, MBe BB como marcador de lesões do trato gastrointestinal. Para tal, avaliamos um grupo de 95 pacientes, de ambos os sexos, com idade média de 44,63 :I: 1,81 anos, divididos em cinco grupos, dos quais 15 eram normais sendo utilizados como controle, 17 portadores de gastrite, 16 pacientes com úlcera péptica, 16 indivíduos com esofagite péptica, e 31 portadores de neoplasias esofágicas, gástricas ou de cólon/reto. As isoenzimas foram individualizadas e identificadas por eletroforese em gel de agarose. Nos portadores de gastrite, úlcera ou esofagite não foram observadas diferenças significativas da isoforma MM, quando comparada com o grupo controle. No entanto, em pacientes portadores de neoplasias foi observado um decréscimo de 24% desta isoforma. Em alguns destes pacientes verificou-se uma forma anômala de MM, denominada MiMi (mitocondrial). Uma redução dos níveis séricos de CK-MM pôde ser observada em pacientes portadores de neoplasias gastrointestinais, quando comparados com portadores de outras enfermidades digestivas ou controles sadios. O potencial diagnóstico desde achado, bem como as suas causas merecem uma investigação detalhada / Abstract: Not informed. / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Orientador: Raphael Lucio Andreatti Filho / Coorientador: Adriano Sakai Okamoto / Banca: Alessandre Hataka / Banca: Ana Angelita Sampaio / Resumo: A microbiota intestinal das aves exerce papel fundamental no desenvolvimento de seu potencial produtivo por garantir o bom funcionamento do trato gastroentérico e do sistema imunológico a ele intimamente ligado. Por isso diversos aditivos já foram utilizados para favorecer o desenvolvimento de uma microbiota saudável, entretanto, ainda não temos informações sobre o perfil desejável para ela. Sendo assim, nos propusemos a utilizar a Eletroforese em Gel com Gradiente de Temperatura (TGGE), para avaliar a microbiota do ceco de aves alimentadas com dietas acrescidas de halquinol, ácido caprílico e Lactobacillus, e posteriormente desafiadas com Salmonella Enteritidis (SE). Aos 10, 20, 30 e 42 dias de vida foram quantificadas as imunoglobulinas IgA, IgM, IgY e interleucinas 17 e 8, avaliada a colonização cecal de SE (UFC/mL), observação histopatológica de tonsila cecal, e esses resulatados relacionados com a microbiota cecal avaliada pelo método TGGE. O tratamento com ácido caprílico foi igualmente eficaz ao halquinol na diminuição da colonização por SE, seguidos do grupo tratado com Lactobacillus. As concentrações de Il-8 e IgM demonstraram relação com a maturação e desenvolvimento imune local e sistêmico das aves, porém, não identificamos relação com o aumento da complexidade da microbiota, entre os diferentes trtamentos e nos grupos desafiados. No presente estudo também n"ao foi possível reproduzir a técnica de TGGE / Abstract: The intestinal microbiota of birds plays a fundamental role in the development of their production potential to ensure the proper functioning of a gastrointestinal tract and immune system closely linked to it. So many additives have been used to encourage the growth of a healthy microbiota, however, we still have no information about the desired profile for her. So we set out to use the Gel Electrophoresis with Temperature Gradient (TGGE) to assess the cecal microbiota of birds fed diets plus halquinol, caprylic acid and Lactobacillus, and subsequently challenged with Salmonella Enteritidis (SE). At 10, 20, 30 and 42 days old were quantified immunoglobulins IgA, IgM, IgY and interleukins 17:08 assessed cecal colonization IF (CFU / ml), cecal tonsil histopathological observation, and those related to resulatados cecal microbiota evaluated by TGGE method. The treatment with caprylic acid was equally effective in reducing the halquinol colonization by IF, followed by the group treated with Lactobacillus. IL-8 and IgM concentrations shown maturation and compared with the local and systemic immune development of the poultry, however, we do not identify relationship with the increased complexity of the microbiota between different trtamentos and challenged groups. In this study it was also not possible to reproduce the TGGE / Mestre

Orientador : Ladslav Sodek / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T01:18:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Horta_AnaCeciliaGoes_D.pdf: 8864702 bytes, checksum: 86f218c1a0ae8915087764c5e1886df5 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: Nos dois sistemas de cultura utilizados no presente trabalho, cotiledones isolados e explantes, GLN e ASN foram igualmente eficientes em promover acúmulo de proteinas. Entretanto, a eficiencia da ALN, em cotilédones isolados, foi bastante inferior a ASN e GLN. Já em cultura de explantes, a ALN superou as outras fontes de nitrogênio, uma vez que, segundo RAINBIRD et al., 1984), "in situ" os ureideos são degradados dentro do tegumento ou vagem e o nitrogênio resultante é convertido em GLN e translocado para os cotilédones. Em ausência de N, observou-se incremento no teor de proteínas de sementes de explantes, enquanto em cotilédones isolados, apesar do aumento em peso de matéria seca, o teor de proteínas permaneceu o mesmo. Por PAGE-SD8 foi verificado que, em presença de GLN e ASN, as proteinas de reserva dos cotilédones foram sintetizadas com mais eficiencia do que nas sementes crescidas "in vivo". Enquanto em sementes de explantes a ALN promoveu a síntese de todas as subunidades das proteínas de reserva, em cotilédones isolados, sua ineficiencia foi confirmada. Na ausência de N, em cotilédones isolados, foi observado uma metabolização preferencial das subunidades alfa', alfa (78) e cadeias acidas (118), não ocorrendo sintese detectável da subunidade beta (7S). Em todos os tratamentos, mudanças substanciais na composição de aminoacidos livres, foram observadas. Um dos efeitos mais interessantes foi com respeito ao teor de ARG. Enquanto que em sementes de explantes este teor decresceu igualmente em todos os tratamentos, em cotilédones isolados, GLN promoveu um aumento de 26 vezes. No sistema de cultura de explantes, não foi observado acúmulo de ASP e nem foi detectada GLN livre na semente como observado no sistema de cultura de cotilédones isolados, no tratamento com ALN. A adição de metionina ao meio básico estimulou o crescimento e ocasionou variações na composição de aminoácidos livres e modificações qualitativas nas proteínas de reserva de cotilédones de soja. Em cotilédones isolados o aumento em peso de matéria seca e proteínas por cotiledones foi maior do que em sementes de explantes em presença de MET (MB+MET e MB-S+MET). Cotilédones crescidos em meio deficiente em enxofre (MB-S), teve 71,4 do peso de matéria fresca e 72% do peso de matéria seca dos cotilédones crescidos com sulfato <M8). Neste tratamento o teor de proteinas decresceu de 57% em relação ao MB, mas ainda alcançando o teor de proteínas das sementes desenvolvidas na planta pelo mesmo periodo. Em cultura de explantes, o teor de proteínas foi semelhante estatisticamente ao meio básico. Por PAGE-SDS, observou-se que a adição de MET inibiu especificamente a síntese da subunidade beta da fração 7S não ocorrendo modificações detectavels nas outras frações nos dois sistemas de cultura. HOLOWACH et al. (1986) mostraram que esta inibição e reversível, ou seja, com a transferência dos cotiledones crescidos em meia contendo MET para o meia básico, a subunidade acumula a taxas comparaveis ao controle. Quando cotilédones mais velhos (100 mg de peso de matéria fresca) da variedade de soja estudada neste trabalho, que ja continham subunidade beta, foram cultivados em presença de MET, a quantidade desta subunidade permaneceu constante, mostrando que esta é estavel na presença de MET. Cotilédones isolados mantidos em meio deficiente em enxofre (MB-5) acumularam todas as subunidades das conglicininas (7S) em razão similar aos cotilédones crescidos na presença de sulfato. Nesse tratamento as subunidades ácidas das glicininas (11S) foram fracamente detectadas quando comparadas com o meio básico. em sementes de explantes, a síntese das subunidades das proteinas de reserva nao foi afetada pela ausencla de enxofre no mêlo, porem, aparentemente, a concentração da subunidade beta superou aquela de sementes mantidas em meio básico. Metionina exógena afetou Significativamente a concentração de alguns aminoácidos, especialmente SER, ALA, LYS, ARG, ASP e GLU, que aumentaram em malores proporções nos dois sistemas. Entretanto, o teor de VAL aumentou somente em cotiledones isolados, enquanto que em sementes de explantes este aminoacido não foi detectado. Na ausencia de enxofre (MB-S), em cultura de cotilédones isolados, foi observado aparecimento de SER, aumento de LYS e ARG e um decréscimo em ALA, VAL e ASN quando comparados com MB. Ja em cultura de explantes foi observado um decrescimo em SER e ARG nesse tratamento. Em relação a composição de aminoácidos das diferentes subunidades das proteinas de reserva de sementes quiescentes e interessante ressaltar que, na subunidade alfa' o conteúdo de HIS e cerca de 3 vezes maior do que nas outras subunidades e que a subunidade beta se destacou por possuir o nivel mais bailxo de metionina / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

O Brasil é um país de vocação florestal, mantendo atualmente grandes áreas reflorestadas com Eucalyptus, cuja madeira é utilizada como matéria-prima em diversas indústrias de base florestal. A projeção é de uma crescente demanda de madeira e, em função disso, é necessário associar novas estratégias aos programas de melhoramento genético, que resultem não somente no aumento da produtividade, como também na adequação de caracteres da qualidade da madeira para um produto final. A qualidade da madeira depende de diversas propriedades do xilema secundário, tecido que constitui a madeira. O desenvolvimento de tecnologias proteômicas, que permitem analisar os genes diretamente ao nível de seus produtos, pode contribuir para o maior entendimento dos processos relacionados à formação da madeira. O objetivo principal deste trabalho foi identificar as proteínas mais abundantemente expressas na região cambial, envolvidas na formação da madeira de Eucalyptus grandis, aos 6,3 anos de idade. A região cambial foi caracterizada por células do câmbio e por células diferenciadas em floema e xilema secundários. A amostragem foi realizada por meio da abertura de painéis nas árvores, seguido da raspagem de sua casca interna e da superfície do fuste. Foram testados dois métodos de extração de proteínas, que utilizam ácido tricloroacético e fenol, respectivamente, a fim de avaliar qual deles proporciona a obtenção de extratos protéicos concentrados e livres de contaminantes. Ensaios foram realizados para ajustar o tempo e o tampão de focalização isoelétrica das proteínas. Um extrato contendo cerca de 500 &#956;g de proteínas foi utilizado para a preparação dos géis 2D de pH 4-7. Dois tipos de coloração de géis foram avaliados. Os spots foram recortados para proceder a digestão tríptica das proteínas. A solução contendo os peptídeos de uma amostra foi analisada por espectrometria de massa. As seqüências experimentais foram contrastadas com uma base de seqüências peptídicas e um banco de ESTs espécie-específico. As imagens dos géis bidimensionais foram analisadas, com a finalidade de fazer inferências sobre o nível de expressão de cada proteína identificada na região cambial, como também correlacioná-la com a expressão de seu transcrito correspondente. O método com fenol mostrou-se o mais eficiente para extrair proteínas da região cambial. Foi observado que as proteínas foram totalmente focalizadas a 74.000 Vh. A coloração com Coomassie Brilliant Blue G-250 permitiu a revelação de um número maior de spots e mostrou-se compatível com a espectrometria de massa. A análise LC/MS/MS das amostras permitiu a identificação de 69 spots, correspondendo a 41 proteínas distintas da região cambial, sendo 34,15% delas, representadas em múltiplos spots, As proteínas identificadas exercem seu papel biológico na produção de energia (22%), em processos celulares (19,5%), como componentes estruturais (17,1%), nos metabolismos de aminoácidos (14,6%) e macromolecular (19,5%), e no transporte de moléculas (2,4%). Oito spots mostraram similaridade de seqüências em ambas bases de dados, mas nenhuma função foi atribuída a eles. A análise da correlação revelou uma tendência para um grupo restrito de proteínas, de que os transcritos que se mostraram pouco abundantes corresponderam a proteínas altamente expressas na região cambial. / Brasil is a country with forestry inclination, currently keeping large areas planted with Eucalyptus, which wood is used as raw material in several forest-based industries. The projection is an increasing demand of wood and, as a function of it, it is necessary to link new strategies to the programs of genetic improvement that result not only in the increase of the productivity, but also in the adequacy of characters of wood quality for a final product. The wood quality depends on several properties of secondary xylem, a tissue that forms the wood. The development of proteomic technologies, which permit to analyze directly the genes at their products’ level, can contribute to a better comprehension of the processes related to the wood formation. The main objective of this work was to identify the most abundant proteins expressed in the cambial region that are involved in the Eucalyptus grandis wood formation at 6.3 years of age. The cambial region was characterized by cambium cells differentiated into secondary phloem and xylem. The sampling was performed by means of opening panels in the trees, followed by rubbing their internal barks and the stem surface. Two protein extraction methods were tested. These methods use trichloroacetic acid and phenol, respectively, in order to evaluate which one proportionates the acquisition of concentrated proteic extracts and is free from contaminants. Essays were performed to adjust the time and the buffer for isoelectric focus of proteins. Extracts containing around 500 &#956;g of protein were used to prepare 2D gels with pH ranging from 4 to 7. Two types of gel staining were evaluated. The spots were cut out in order to obtain the tripitic digestion of the proteins. The solution containing peptides from each sample was analyzed by mass spectrometry. The experimental sequences were contrasted in a peptidic sequences base and in a speciespecific ESTs. The bidimensional gels images were analyzed in order to make inferences about the level of expression of each protein identified in the cambial region, as well as to correlate them with the expression of its corresponding transcript. The method using phenol showed to be more efficiently to extract proteins from the cambial region. It was observed that the proteins were totally focused at 74,000 Vh. The staining with Coomassie Brilliant Blue G-250 allowed the revealing of a higher number of spots and showed to be compatible with mass spectrometry. The LC/MS/MS sample analyses allowed the identification of 69 spots, corresponding to 41 different proteins from the cambial region, where 34.15% of them were represented in multiple spots. The identified proteins play their biological role in the production of energy (22%), in cellular processes (19.5%), as structural components (17.1%), in metabolism of aminoacids (14.6%) and macromolecular metabolism (19.5%), and in the transportation of molecules (2.4%). Eight spots showed similarity in sequences in both databases, but no function was attributed to them. The correlation analysis revealed a tendency for a restrict group of proteins, whose transcripts showed a little abundant, corresponds to proteins highly expressed in the cambial region.

Orientador: Maria da Gloria Buzinaro / Banca: Samir Issa Samara / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Resumo: Os rotavírus são os principais agentes causadores de diarreias em várias espécies animais e nos seres humanos, causando grandes prejuízos econômicos e de saúde pública. Uma característica marcante desse vírus é a grande diversidade genotípica das estirpes circulantes. Informações sobre genotipagem são imprescindíveis para estabelecer mecanismos de vigilância epidemiológica da infecção por rotavírus. O presente trabalho teve como objetivo discutir a epidemiologia de rotavírus na espécie bovina por meio de estudos desenvolvidos entre os anos 2006 e 2010, no Laboratório de Rotavirose da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" (FCAV/Unesp). Foram obtidas 803 amostras de fezes de bezerros, na faixa etária de 1 a 90 dias, com e sem diarreia, de 48 rebanhos de gado bovino leiteiro e de corte localizados no Estado de São Paulo. As amostras foram caracterizadas com base nos testes de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). O teste de PAGE indicou animais positivos em 33,3% (16/48) dos rebanhos e 6,1% (49/803) das amostras analisadas. Nos rebanhos leiteiros foram detectados animais infectados por rotavírus nas diferentes faixas etárias de até 90 dias de idade, enquanto nos rebanhos de corte alta frequência (22,8%) de amostras positivas foi verificada em bezerros entre 1 e 15 dias (P<0,05). A análise do perfil do genoma no PAGE identificou sete eletroferótipos, característicos de rotavírus do grupo A, indicando grande diversidade genômica do rotavírus nos rebanhos estudados. A caracterização molecular dos genótipos G (VP7) e P (VP4) pela RT-PCR identificou o genótipo G6P[5] como o mais comum. Foram construídos mapas que analisaram a distribuição espacial dos rotavírus detectados. O trabalho de identificação do rotavírus é de grande valia, uma vez que... / Abstract: Rotavirus is the major causative agent of diarrhea in several animal species and humans, causing large economic and public health damage. A striking feature of this virus is the great genotypic diversity of circulating strains. Genotyping information is essential to establish surveillance mechanisms of rotavirus infection. This study aimed to discuss the epidemiology of rotavirus in cattle through studies conducted between 2006 and 2010, the Rotavirus Disease Laboratory of the Faculty of Agriculture and Veterinary Sciences of the Universidade Estadual Paulista "Julio de Mesquita Filho" (FCAV / UNESP), 803 samples of feces of calves were obtained, ranging in age from 1 to 90 days, with and without diarrhea, 48 herds of dairy and beef cattle in the State of São Paulo. The samples were characterized on the basis of electrophoresis tests on polyacrylamide gel (PAGE) and then reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The PAGE test indicated positive animals in 33.3% (16/48) of the herds and 6.1% (49/803) of the samples. In dairy herds infected animals were detected rotavirus in different age groups (P> 0.05), while in the high frequency cut herds (22.8%) of positive samples was observed in calves between 1 to 15 days (P <0,05). The genome profile analysis in PAGE identified seven eletropherotypes characteristic of rotavirus group A, indicating a high genomic diversity of rotavirus in the herds. The molecular characterization of genotype G (VP7) and P (VP4) by RT-PCR identified the genotype G6P [5] as the most common. Maps were constructed to analyze the spatial distribution of detected rotavirus. Rotavirus identification work is of great value, since it is evident that different genotypes agent is spread in São Paulo presenting different forms of production / Mestre

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A adenosina desaminase (ADA â E.C.3.5.4.4.) à uma enzima fundamental no catabolismo das purinas. Ela catalisa a desaminaÃÃo da adenosina ou 2âdeoxi-adenosina produzindo amÃnia e inosina ou 2â-deoxi-inosina, respectivamente. Sua atividade à expressa por 2 isoenzimas presentes em 3 isoformas. A ADA1 (36kDa) ou ADA1 ligada ao CD26 (280kDa) sÃo amplamente distribuÃdas nos tecidos. Sua aÃÃo à particularmente importante porque altos nÃveis de 2âdeoxi-adenosina sÃo tÃxicos para as cÃlulas do sistema imunolÃgico. A ADA2 (100kDa) à normalmente encontrada no soro e sintetizada somente pelo sistema monocÃtico-macrofÃgico. A importÃncia biolÃgica da ADA2 ainda nÃo està totalmente estabelecida, principalmente devido as suas caracterÃsticas cinÃticas. O presente trabalho teve como objetivo discriminar as isoenzimas da adenosina desaminase humana atravÃs de eletroforese em gel de agarose e pelo modelo proposto por Vale e Almeida (1998), bem como realizar um estudo descritivo retrospectivo sobre o perfil dos exames de ADA no Estado do CearÃ. As amostras de lÃquido ascÃtico, pleural e pericÃrdico foram submetidas à eletroforese em agarose a 1% a 80 V por 7 horas. O gel foi fatiado e cada fatia foi incubada em adenosina (22 ou 0,55mM) por 20 horas para a detecÃÃo da amÃnia liberada pela reaÃÃo enzimÃtica. Os resultados encontrados a partir da eletroforese foram comparados com os resultados achados pelo modelo de Vale e Almeida (1998). O lÃquido pleural à o fluido que à mais frequentemente solicitado para a determinaÃÃo da ADA, seguido pelos lÃquidos ascÃtico, cefalorraquidiano, pericÃrdico e soro. Observamos que os valores de atividade enzimÃtica sÃo influenciados pelo tipo de lÃquido corporal onde a enzima se encontra, podendo estar relacionada Ãs barreiras corporais, tais como a barreira hematoencefÃlica. A partir dos resultados obtidos, podemos concluir que o modelo matemÃtico proposto pode ser usado em laboratÃrios clÃnicos para discriminar as isoenzimas da ADA. / Adenosine deaminase (ADA â E.C.3.5.4.4.) is a fundamental enzyme in the catabolism of the purines. It catalyzes the deamination of adenosine or 2âdeoxy-adenosine producing ammonium and inosine or 2â-deoxyinosine, respectively. Its activity is expressed by two isoenzymes presented in three isoforms. ADA1 (36 kDa) and ADA1 bound to CD26 (280kDa) are widely distributed in the body tissues. Their action is particularly important because high levels of 2âdeoxy-adenosine are toxic for the immune system cells. ADA2 (100kDa) is normally found in serum and is synthesized only in monocyte-macrophage system. The biological importance of ADA2 is not yet fully clear, especially for its kinetics characteristics. The objective of the present work was to discriminate the isoenzymes of human adenosine deaminase using agarose electrophoresis and by mathematical model proposed by Vale and Almeida (1998). In addition, we performed a study of the profile of ADA tests in State of Ceara (Brazil). Samples of of ascites, pleural and pericardial effusion were submitted to electrophoresis in 1% agarose at 80V for 7 hours. The gel was sliced and each slice was incubated in adenosine (22 or 0,55mM) for 20 hours to detect the ammonium released by enzymatic reaction. The results found from electrophoresis were compatible with the model proposed by Vale and Almeida (1998). The pleural fluid is the most frequently requested for the determination of ADA, followed by ascitic fluid, cerebrospinal fluid, pericardial fluid and serum. We observed that the value of enzymatic activity is influenced by corporal fluid type where the enzyme is localized. These data can be associated with the corporal barrier, like brain barrier. We concluded that the proposed mathematical model could be used in clinical laboratories to discriminate ADA isoenzymes to improve the diagnostic method.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:05:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivos: (a) Padronizar protocolos rápidos da técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE) para tipagem molecular de amostras clínicas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa; (b) Avaliar a tipabilidade, o poder discriminatório e a reprodutibilidade entre os protocolos rápidos de PFGE versus o protocolo convencional para as amostras de S. aureus, E. coli e P. aeruginosa; (c) Analisar os resultados da tipagem molecular pela técnica do PFGE de acordo com dois critérios distintos de interpretação, os critérios de PFALLER et al. (1992) e os critérios de TENOVER et al. (1995). Métodos: Um total de 60 amostras bacterianas das seguintes espécies bacterianas foi selecionado: S. aureus (n=20), E. coli (n=20) e P. aeruginosa (n=20). Todos amostras foram isoladas da corrente sanguínea de pacientes internados no Hospital São Paulo (HSP) no período de 2000 a 2004. Quinze dos 20 isolados clínicos de cada espécie bacteriana foram selecionados de pacientes previamente caracterizados como não relacionados epidemiologicamente, pela Comissão de Controle de Infecção Hospitalar do HSP. As outras cinco amostras de cada espécie bacteriana foram classificadas como amostras bacterianas possivelmente relacionadas epidemiologicamente, provenientes de uma mesma unidade do HSP em um período de tempo igual ou inferior a três meses. Protocolos convencionais da técnica PFGE foram reproduzidos e protocolos rápidos desta mesma técnica foram padronizados, após digestão destas bactérias com as enzimas de restrição SmaI e SpeI. Os perfis moleculares foram analisados visualmente e interpretados de acordo com os critérios de Pfaller et al (1992) e Tenover et al (1995). Resultados: Os protocolos convencionais e rápidos de PFGE apresentaram resultados idênticos para tipagem das amostras clínicas de S.aureus, E. coli e P. aeruginosa. De acordo com os critérios de Pfaller et al. (1992), foram encontrados nas amostras clínicas de S. aureus, E. coli e P. aeruginosa deste estudo, 17, 13 e 7 padrões diferentes de PFGE, respectivamente. Seguindo os critérios de Tenover et al. (1995) foram encontrados 16, 11 e 6 padrões distintos de PFGE nas amostras de S. aureus, E. coli e P. aeruginosa, respectivamente. As técnicas desenvolvidas tanto pelos protocolos rápidos quanto pelos protocolos convencionais apresentaram percentual de tipabilidade e reprodutibilidade de 100%. O poder discriminatório foi de 95%, 94% e 82% para as amostras clínicas de S. aureus e E.coli e P. aeruginosa, respectivamente. Conclusões: Foram padronizados protocolos rápidos para tipagem molecular de amostras de S. aureus (42hs), E. coli (43hs) e P. aeruginosa (56hs) pela técnica de PFGE. Todos protocolos testados apresentaram excelente tipabilidade e reprodutibilidade. O poder discriminatório foi excelente para as amostras clínicas de S. aureus e E. coli, e satisfatório para as amostras de P. aeruginosa, devido a pouca diversidade clonal. Os critérios de Pfaller et al. (1992) diferenciaram melhor a presença de novos clones quando comparados aos critérios de Tenover et al. (1995). / Objectives: (a) To develop rapid protocols of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) technique for molecular typing of clinical samples of Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa; (b) To evaluate the typeability, the discriminatory power, and the reproducibility between rapid and conventional PFGE protocols for clinical isolates of S. aureus, E. coli and P. aeruginosa, (c) To analyze PFGE results according to two different interpretation criteria, one from Pfaller et al. (1992) and the other from Tenover et al. (1995). Methods: A total of 60 bacteria samples were selected from the following species: S. aureus (n=20), E. coli (n=20), and P. aeruginosa (n=20), isolated from bloodstream infections from patients from Hospital São Paulo (HSP). Among the 20 clinical isolates from each specie, 15 were selected from patients previously characterized by the hospital’s Infection Control Department of HSP as epidemiologically non-related. The other five isolates were characterized as possible epidemiologically related. These samples were collected from the same medical ward of HSP, in a period of time equal to or less than 3 months. The conventional PFGE protocols were reproduced, and the rapid protocols were developed, after DNA digestion with SmaI and SpeI enzymes. The molecular patterns were examined visually and interpreted according to Pfaller et al. (1992) and Tenover et al.(1995) criteria. Results: The rapid and conventional PFGE protocols presented similar results for S. aureus, E. coli, and P. aeruginosa isolates. According to Pfaller et al. (1992), a total of 17, 13, and 7 distinct PFGE patterns were identified for S. aureus, E. coli, and P. aeruginosa, respectively. On the other hand, by Tenover criteria, a total of 16, 11 and 6 distinct PFGE patterns were found for S. aureus, E. coli and P. aeruginosa, respectively. All protocols tested presented 100% of reproducibility and typeability. The discriminatory power was 95%, 94%, and 82% for S. aureus, E. coli, and P. aeruginosa, respectively. Conclusions: Rapid PFGE protocols were developed for S. aureus (42hs), E. coli (43hs) and P. aeruginosa (56hs), and all of them presented excellent reproducibility and typeability. The discriminatory power was excellent for clinical isolates of S. aureus and E. coli, and satisfactory for P. aeruginosa; probably because of the low clonal diversity of this specie identified in this study. Compared to Tenover et al. (1995) criteria, Pfaller et al. (1992) could better differentiate the presence of new bacterial clones. / FAPESP: 2006/57700-0 / BV UNIFESP: Teses e dissertações