Tese (doutorado) - Universidade de São Paulo. Instituto de Biociencias / Não possui conteúdo digital / Made available in DSpace on 2013-12-05T20:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 1989

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T11:05:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289231.pdf: 1620951 bytes, checksum: a62aeadc4a1209d35b1bcc351a80279f (MD5) / A Acca sellowiana (O. Berg.) Burret é uma espécie pertencente à família Myrtaceae, conhecida popularmente como goiabeira serrana. Uma série de trabalhos multidisciplinares envolvendo a domesticação da goiabeira serrana, com ênfase na área de melhoramento genético e da aplicação das técnicas de cultura vegetal para a micropropagação desta espécie têm sido realizados por diferentes grupos de pesquisa. Estudos morfofisiológicos com o auxilio das técnicas de cultura vegetais, notadamente a embriogênese somática, permitem a propagação massal clonal de genótipos superiores, além de servir como modelo de estudos fisiológicos, genéticos e bioquímicos do desenvolvimento embrionário. A embriogênese somática é uma dos principais sistemas de regeneração de plântulas in vitro, pois permite a redução de custos associados a um maior rendimento biológico em comparação aos demais sistemas de micropropagação. A técnica da embriogênese somática em Acca sellowiana tem sido estudada desde 1997 no Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal do CCA/UFSC e vários pontos de controle do protocolo foram otimizados, sendo possível alcançar um rendimento de mais de mil embriões somáticos por explante. Entretanto, a técnica ainda precisa ser aprimorada, podendo ser associada a outras técnicas como a imersão temporária para a conversão dos embriões somáticos. Desta forma, o presente estudo busca elucidar pontos de controle durante a indução e conversão de embriões somáticos de Acca sellowiana. Este trabalho foi redigido em forma de capítulos visando a melhor compreensão dos dados. O primeiro capítulo esta relacionado a uma revisão bibliográfica sobre os aspectos da embriogênese somática com ênfase em Acca sellowiana. O segundo capítulo aborda a influência do 2,4-D na embriogênese somática desta espécie e como este fitorregulador afeta a conversão dos embriões somáticos. Aspectos bioquímicos relacionados com os teores de ABA, AIA, poliaminas e aminoácidos também foram analisados para uma maior elucidação do processo. O terceiro capítulo aborda a conversão dos embriões somáticos em plântulas em resposta ao uso de biorreatores de imersão temporária e do Fluridone, um inibidor da síntese de ABA.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-graduação em Recursos Genéticos Vegetais / Made available in DSpace on 2012-10-24T18:52:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 266463.pdf: 1340728 bytes, checksum: e843f8959b1ec2611e3a974c8e6381bf (MD5) / A pupunha (Bactris gasipaes Kunth - Arecacea) é uma palmeira domesticada, nativa do trópico úmido americano. Nos últimos anos, o cultivo da pupunheira para a produção de palmito vem despertando o interesse de agricultores de todo o País. Esse interesse é devido, principalmente, à busca de novas opções de cultivo em substituição aos tradicionais, já que para atender a alta demanda comercial, a exploração predatória provocou uma grande devastação das palmeiras nativas da Mata Atlântica. A embriogênese dessa espécie foi alvo do presente estudo no qual foram estudados eventos moleculares, celulares, fisiológicos e do desenvolvimento ao longo deste processo morfogenético tanto in vitro quanto in vivo. A embriogênese somática pode ser empregada para a propagação massal clonal de genótipos de interesse e para o avanço na compreensão de fatores fisiológicos, genéticos e bioquímicos envolvidos no desenvolvimento do embrião. Ferramentas biotecnológicas podem ser empregadas nesta espécie para a sua conservação e propagação massal. No presente trabalho eventos e processos bioquímicos e fisiológicos em calos embriogênicos e não embriogenicos foram estudados para fundamentar o estabelecimento de protocolos regenerativos baseados na embriogênese somática. Teores endógenos de acido indolacético (AIA), ácido abscísico (ABA), poliaminas (PAs), aminoácidos e fenóis totais foram analisados. Aminoácidos, PAs, AIA e ABA foram determinados por cromatografia líquida de alta eficiência e fenóis totais a partir da leitura das absorbâncias em espectrofotômetro. Outro foco do estudo foi investigar e caracterizar mudanças no perfil das proteínas expressas durante o desenvolvimento da embriogênese somática, endosperma e embriões zigóticos de pupunha. Para isto, estágios da embriogênese somática, calos embriogênicos e não embriogênicos, bem como embriões zigóticos e endosperma foram caracterizados por eletroforese bidimensional (2-DE). Nas análises bioquímicas foram detectadas diferenças entre calos embriogênicos e não embriogênicos para AIA, ABA, PAs, aminoácidos e fenóis totais. Para AIA e ABA calos embriogênicos apresentaram níveis mais altos, estando estes associados à indução e aumento da competência embriogênica. Já para PAs e fenóis totais, calos não embriogenicos apresentaram níveis mais elevados, especialmente para poliamina putrecina. Alguns aminoácidos tiveram suas expressões envolvidas com a competência ou não dos calos. Os altos níveis de triptofano observados em calos embriogênicos podem estar associados a uma maior síntese de AIA nos mesmos. Para proteômica, durante a embriogênese somática (0, 15, 30 e 60 dias) observou-se um aumento tanto na concentração de proteínas totais quanto no número de spots entre 0 dias (15,68µg/g de MF) e 15 dias (38,5 µg/g de MF), ficando constante entre 15 e 30 dias com uma subseqüente diminuição entre 30 e 60 dias (22,36 µg/g de MF). Algumas proteínas foram exclusivas dos estádios de 15 e 30 dias podendo ser biomarcadoras da embriogenese somática. Em calos embriogênicos e não embriogênicos houve uma maior expressão de proteínas em calos embriogênicos, observando-se 71 spots exclusivos desses calos, 11 de calos não embriogênicos e 128 spots constantes, sendo que alguns deles apresentaram diferença na sua expressão. Perfis protéicos de embrião zigótico e endosperma também revelaram um maior número de proteínas expressas em embriões zigóticos, verificando-se 118 spots exclusivos de embriões zigoticos, 58 spots constantes e 10 spots exclusivos do endosperma.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-graduação em Recursos Genéticos Vegetais / Made available in DSpace on 2012-10-23T09:02:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 241316.pdf: 2873828 bytes, checksum: 2dea42b66b87bd60b407f3348ca09682 (MD5) / Nesta seção, estudaram-se as proteínas expressas em embriões somáticos de A. sellowiana em diferentes estádios de desenvolvimento. O objetivo foi detectar e identificar proteínas diferencialmente expressas durante os diferentes estádios de desenvolvimento do embrião somático. Usando a alta resolução do gel bidimensional de poliacrilamida (2-DE) observaram-se diferenças entre as proteínas expressas nos estádios iniciais e similaridade entre as proteínas expressas nos últimos estádios. Foram detectadas 29, 32, 51, 61 e 57 proteínas para o estádio globular, cordiforme, torpedo, pré-cotiledonar e cotiledonar, respectivamente. Das 230 proteínas visualizadas por 2-DE, 62 foram identificadas por MALDI TOF/MS. Quatro proteínas foram expressas unicamente no estádio globular, uma no estádio cordiforme, duas no estádio torpedo e quatro no estádio pré-cotiledonar. As proteínas identificadas nos diferentes estádios da embriogênese somática foram agrupadas nas seguintes categorias: metabolismo de carboidratos, biossíntese de purinas, divisão celular, metabolismo secundário, reserva, chaperonas, formação e transporte celular. Os estudos de proteoma com esta espécie são inéditos e permitem avançar no conhecimento do metabolismo embrionário desta espécie, bem como possibilitam uma adequação dos protocolos de embriogênese somática visando sua propagação massal e conservação.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2008 / Made available in DSpace on 2012-10-24T01:43:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 275619.pdf: 2872302 bytes, checksum: 2509de280a79a30f2f17c2a38e4e869e (MD5) / The Acca sellowiana somatic embryogenesis model system has been extensively studied in the last years. Although somatic embryos are obtained in high frequency and show to be morphologically normal, their conversion rates are still low. The ABA is a plant hormone known to induce a cascade of important events that result in a normal germination The Fluridone (1-metil-3-fenil-5-[3-(trifluormetil)-fenil]-4(1H)-piridinona), is a inhibitor of carotenogenesis, ABA synthesis and derivatives, being compared to GA3 in its physiological effects. Thus, in the present work we attempted to study the role of Fluridone in the conversion of Acca sellowiana somatic embryos. Somatic embryos were from mature zygotic embryos inoculated in LPm culture medium supplemented with maltose (3%); Morel vitamins, phytagel (0.2%), and 2,4 - D (20ìM). Somatic embryos in torpedo, precotyledonary and cotyledonary stages were placed in Petri dishes containing 30 mL of growing medium LPm medium plus sucrose (3%), active charcoal (1.5%), Morel vitamins, and supplemented with BAP (0.5 ìM), GA3 (1 ìM) and Fluridone (0, 1. 5 and 10 ìM). Complementarily to the same basal culture medium with BAP (0.5 ìM), GA3 (1 ìM), 0.25; 0.5; 1; 1.5 and 2ìM of Fluridone was added. The cultures were incubated in culture room at a temperature of 25 ± 2 °C temperature, under photoperiod of 16 h;, and 50 ìmol m-2s-1 light intensity The rate conversion to plantlets was evaluated to 15, 30 and 45 days. The largest rate of embryo conversion resulted from the treatment with 1ìM of Fluridone. The embryo conversion was suppressed in response to Fluridone at 2 and 10 ìM. Acca sellowiana somatic embryos show of sensitivity to Fluridone, thus confirming its antagonism with ABA.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais / Made available in DSpace on 2013-07-16T00:57:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 228757.pdf: 3458437 bytes, checksum: ef6893274b72b1a5958a3b3032c7ee7b (MD5)

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:43:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317842.pdf: 1874621 bytes, checksum: 1625556e3bf30951e00ec4f3cd4b2d07 (MD5) Previous issue date: 2013 / O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é uma espécie tropical com tem um elevado valor económico, é o principal elemento na produção de chocolate o alto conteúdo de polifenóis o há posicionado como um produto antioxidante. O cacaueiro a além de ser um dos principais componentes econômicos nas regiões onde é cultivado exerce também um importante papel na preservação ambiental. No entanto, às características botânicas que esta espécie apresenta, associadas a um alto grau de auto-incompatibilidade, os plantios comerciais apresentam alta heterozigosidade genética, afetando diretamente a produtividade do seu cultivo, gerando assim a necessidade dos melhores genótipos serem propagados assexuadamente. Por estão razão, a embriogênese somática se configura como alternativa eficiente para a propagação de genótipos elite, permitindo a captura e fixação de ganhos genéticos. A técnica de cultura de tecidos, como a embriogênese somática tem sido rotineiramente usada tanto como uma técnica de propagação clonal de plantas, bem como um modelo válido para investigar eventos estruturais, fisiológicos e moleculares que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário. No presente trabalho buscou-se avaliar a resposta embriogênica e capacidade de formar embriões somáticos dos genótipos do grupo genético Nacional, visando estabelecer um protocolo de propagação baseado na embriogênese somática. Assim, também integraram-se duas técnicas como a quantificação do padrão de metilação do DNA de embriões e das plântulas obtidas durante a embriogênese somática, assim como também a elaboração de um perfil proteômico dos embriões somáticos formados durante a embriogênese somática de Theobroma cacao L. Propondo-se identificar a relação da metilação DNA e a capacidade conversão dos embriões somáticos, visto que a metilação do DNA é um dos mediadores chave no mecanismo epigenético associado ao desenvolvimento embrionário. Neste contexto, o presente trabalho foi estruturado em capítulos, para facilitar a compreensão dos resultados obtidos. O primeiro capítulo consiste no estado da arte e situação do problema, no qual a traves de uma revisão bibliográfica se trata de mostrar aspectos relevantes de Theobroma cacao L., da embriogênese somática, da metilação do DNA e da proteômica em plantas. O segundo capítulo consiste na avaliação da resposta dos genótipos de grupo Nacional à embriogênese somática. O terceiro capítulo relaciona aos níveis de metilação do DNA global em embriões somáticos formados durante a embriogênese somática secundaria e as plântulas obtidas durante a conversão e o quarto aborda a proteômica comparativa como uma ferramenta para identificar proteínas relacionadas com a capacidade de conversão dos embriões somáticos de Theobroma cacao L.<br>

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:51:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 321523.pdf: 4932600 bytes, checksum: 1ae132ba78a22b9e3beb07d2926f7885 (MD5) Previous issue date: 2013 / A Araucaria angustifolia é uma conífera da família Araucariaceae, com ocorrência na floresta ombrófila mista, tipologia do bioma Mata Atlântica do Brasil que atualmente, encontra-se ameaçada de extinção, Esta condição reforça a necessidade de aplicação de medidas para a conservação desta espécie. Para que isto ocorra de forma eficaz é necessário o emprego conjunto de manejos convencionais para conservação dos remanescentes florestais e ferramentas biotecnológicas. Sendo assim, o presente trabalho propõe avanços na área de fisiologia, bioquímica e morfogenética que podem ser aplicados em técnicas de conservação de sementes e a propagação in vitro via embriogênese somática desta espécie. Anaálises de western blot em sementes de araucária detectaram a presença de dehidrinas nos extratos termoestáveis e termosensíves de eixos e cotiolédones de embriões zigóticos dessa espécie, e um possível mecanismos de defosforilação dessas proteínas. Além disso, imunolocalizações in situ por microscopia de luz (ML) e microscopia eletrônica de transmissão (MET) mostraram que estas proteínas estão presentes em todos os tecidos dos eixo embrionário e cotilédones, e a nível subcelular elas foram associadas aos corpos proteicos, microcorpos e a cromatina no núcleo. Os padrões desenvolvimento de embriões somáticos desta espécie foram acompanhados por ML, microscopia confocal (MC), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e MET. Os resultados mostraram que culturas embrionárias de A. angustifólia proliferam através de massas pró-embrionároas (MPE) em três estágios de desenvolvimento, I, II e III, e que somente o estágio III é capaz de dar origem aos embriões somáticos (ES) iniciais. ES iniciais foram caracterizados pela presença de massa embrionária (ME) composta pelas células embriogênicas (CE), a qual é ligada a região do suspensor. O suspensor foi composto inicialmente pelas células do embrionárias do tubo (CT), seguidas pelas células de suspensor (SC), sendo que estes dois tipos celulares se diferem pelo diferente grau de vacualização e desorganizaçãoo celular. Além disso, por análise de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi possível verificar que o desenvolvimento inicia dos embriões somáticos de A. angustifolia foram relacionados com uma redução do ABA endógeno e da poliamina putrescina na etapa de proliferação das MPE, seguido de aumento de ABA endógeno e das poliaminas spermidina e espermina, durante a embriogênese inicial. <br> / Abstract : Araucaria angustifolia is an endangered conifer of the South of Brazil. This condition reinforces the need to implement measures for the conservation of this species. For this to happen effectively requires the combined use of conventional managements for conservation of forest remnants and biotechnological tools. Therefore, this work proposes advances in physiology, biochemistry and morphogenetic that can be applied in seed conservation techniques and in vitro propagation via somatic embryogenesis of this species. Western blot analysis of Brazilian pine seeds detected the presence of dehydrins in the total proteins and heat-stable extracts from axis and cotyledons from zygotic embryos, and a possible mechanisms for dephosphorylation of these proteins. Furthermore, immunolocalization in situ of dehydrins by light microscopy (LM) and transmission electron microscopy (TEM) showed the presence of these proteins in all tissues of the embryonic axis and cotyledons. At the subcellular level they were associated with protein bodies, microbodies and chromatin in the nucleus. The standards development of somatic embryos of this species were followed by LM, confocal microscopy (CM), scanning electron microscopy (SEM) and TEM. The results showed that embryogenci cultures of A. angustifolia proliferate by proembryogenic masses (PEM) in three developmental stages I, II and III and, only the PEM III are able to give rise to early somatic embryos (ES). Early ES were characterized by the presence of embryonal mass (EM) composed of embryogenic cells (EC), which is connected to the region of the suspensor. The suspensor was composed by embryonal tube cells (CT) followed by suspensor-like cells (SC), and these two cell types differ by degree of vacuolation and dismantling cell. Furthermore, by analysis of high performance liquid chromatography (HPLC) was verified that the development of early somatic embryos of A. angustifolia were associated with a decrease in endogenous contentes of ABA and polyamine putrescine in the proliferation step of MPE, followed by an increase of endogenous contentes of ABA and polyamines spermine and spermidina during the early embryogenesis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais. / Made available in DSpace on 2012-10-26T08:56:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 302849.pdf: 2018286 bytes, checksum: 84fbd336e926fd2c147b1ae76bd9ada8 (MD5) / O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito do inibidor da metilação do DNA 5-Azacitidina (AzaC) na embriogênese somática em Acca sellowiana por meio de análises morfológicas e microscopia óptica, além de estudar os padrões de metilação do DNA global por meio da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Embriões zigóticos de dois acessos de A. sellowiana (101X458 e 85) foram submetidos a quatro diferentes pulsos de 1h (200 µM de 2,4-D; 200 µM de 2,4-D e 10 µM de 5-AzaC; 10 µM de AzaC; e 100 µM de AzaC), seguidos da inoculação em meio de cultura LPm suplementado com maltose (30 g.L-1), vitamina de Morel, ácido glutâmico (8 mM) e Phytagel® (2 g.L-1), com diferentes concentrações de AzaC (0, 10 e 50 µM). Os embriões somáticos obtidos foram, após 50 dias de cultivo, inoculados em meio de conversão LPm suplementado com vitaminas de Morel, sacarose (30 g.L-1), BAP (0,5 µM), AG3 (1,0 µM) e carvão ativado (1,5 g.L-1). Paras as análises por HPLC amostras obtidas aos 10, 20 e 30 dias de cultivo foram submetidas à extração de DNA e posterior digestão de ácidos nucleicos, sendo detectados por meio de dois tipos de detecção diferentes: detector UV e espectrometria de massas (MS/MS). Os tratamentos isentos de 2,4-D apresentaram inibição da formação de embriões somáticos em ambos os acessos testados. O tratamento com suplementação de 10 µM de AzaC no meio de cultura e pulso de 2,4-D resultou na maior formação de embriões para o acesso 101X458, indicando médias de 19.6, 60 e 110.4 embriões somáticos, aos 20, 30 e 45 dias, respectivamente. Para o acesso 85, o tratamento com 50 µM de AzaC com pulso de 2,4-D resultou no maior número de embriões somáticos formados, indicando médias de 14.4, 364.4 e 484 embriões somáticos, aos 20, 30 e 45 dias, respectivamente. Para a conversão, foram obtidas taxas médias de conversão para plântulas de 35% para o acesso 101X458 e 30,2% para o acesso 85, e para o tratamento com pulso 200 uM 2,4-D/50 uM AzaC 16,6% e 8,9%, respectivamente. As análises dos nucleosídeos por HPLC/MS/MS se mostraram mais precisas e mais rápidas, realizando a separação dos compostos em 8 min, comparado a 25 min por HPLC/UV. Os dados obtidos por HPLC/MS/MS indicaram para as amostras do acesso 101X458 no tratamento com pulso 200 µM 2,4-D/0 uM AzaC um aumento crescente na metilação dos 10 aos 30 dias (34,7%, 40,9% e 44,3%, respectivamente). No tratamento com pulso 200 µM 2,4-D/50 µM AzaC observou-se uma queda nos níveis de metilação entre os 10 e 20 dias, seguido de uma alta (39,5%, 36,2% e 41,6%, respectivamente). Para o tratamento com pulso 100 µM AzaC/50 µM AzaC, observou-se uma queda nos três períodos de avaliação (36,8%, 28,8% e 20,8%, respectivamente). Para o acesso 85 o tratamento controle apresentou valores de 22,6%, 35,2% e 41% e o que continha AzaC e 2,4-D valores de 29,9%, 38,9% e 42,6%, sendo estes os tratamentos que estiveram associados à indução da ES. Por outro lado, o tratamento com AzaC, que não resultou na indução da ES, apresentou um padrão bastante distinto, com queda gradual nos níveis de metilação dos 10 aos 30 dias (37,6%, 24,7% e 21,5%). Os resultados obtidos indicam que o AzaC influencia positivamente a indução de embriões somáticos nesta espécie, contudo, o pulso de 2,4-D se mostrou essencial para este processo. Além disso, foi observado que a presença do AzaC no meio de cultura de indução parece prejudicar as taxas de conversão dos embriões somáticos a plântulas. Já os níveis de metilação parecem exercer um papel preponderante no processo de indução da ES em A. sellowiana.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:19:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317844.pdf: 2129065 bytes, checksum: 5016a5fec1b8983b865c3111ff0005e3 (MD5) Previous issue date: 2013 / A pupunha (Bactris gasipaes Kunth) é uma palmeira nativa da Amazônia, pertencente à família Arecaceae, sendo considerada uma árvore multi-propósito e desempenha um papel importante como um componente de agrossistemas. A produção de frutos e palmito para o mercado nacional são um dos seus usos mais importantes. Ela se tornou uma alternativa para a produção de palmito cultivado, apresentando diversas vantagens comparativamente a outras espécies de palmeiras (ex.: Euterpe edulis e E. oleracea) usadas para produção deste produto, tais como um curto ciclo de vida, presença de ramificações, níveis mais elevados de açúcares. Além disso, esta palmeira apresenta baixas concentrações das enzimas peroxidases e polifenoloxidase, permitindo o comércio in natura sem que haja oxidação do produto. O desenvolvimento de protocolos de regeneração in vitro se configura como uma eficiente ferramenta de apoio à conservação e programas de melhoramento genético da espécie. Entre as várias técnicas disponíveis, a embriogênese somática oferece vantagens como a produção automatizada em grande escala, com culturas cíclicas, e estabilidade genética das plântulas regeneradas. O Sistema de Imersão Temporária (SIT) é relevante para a ampliação ou melhoria de protocolos de regeneração in vitro e também abre possibilidades para automatizar algumas fases da cultura. Além disso, a embriogênese somática pode ser acoplada a programas de conservação por meio, por exemplo, da criopreservação de embriões somáticos. Sabe-se que o pool de genes da pupunha cultivada e selvagem é rico em diversidade, porém, esta sujeito à erosão genética, necessitando de urgente desenvolvimento de estratégias eficientes de conservação de germoplasma à longo prazo, sendo a criopreservação a estratégia mais adequada para este fim. A criopreservação é definida como a conservação de material biológico em temperaturas ultrabaixas (-196°C ou -150°C) e duas técnicas, vitrificação e vitrificação-droplet, estão sendo amplamente utilizadas para diversas espécies, sendo que as duas objetivam a obtenção de um estado vítreo de líquidos celulares, obtida por concentrações suficientemente altas de solutos (crioprotetores) e resfriamento rápido. Entretanto, a capacidade de recrescimento e estabilidade genética em plantas criopreservadas estão associadas a mudanças no DNA global celular, pricipalmente em nível epigenético, alterando o padrão de metilação global do DNA celular. Além disso, um aspecto crítico para se obter um protocolo de criopreservação de uma determinada espécie é diminuir a injuria na ultraestrutura da célula, que normalmente é causada pela técnica, e análises ultraestruturais e epigenéticas durante as etapas do protocolo de criopreservação se tornam importantes para aprimoramento destas técnicas. Considerando os aspectos supramencionados, o objetivo geral deste trabalho foi o de otimizar o protocolo de embriogênese somática para pupunha utilizando SIT nas diferentes fases deste, bem como desenvolver um protocolo para a criopreservação de embriões somáticos desta espécie, elucidando aspectos ultraestruturais e epigenéticos dos embriões somáticos submetidos a estas técnicas. A primeira parte do trabalho teve como objetivo específico identificar o melhor sistema de cultivo para cada etapa do protocolo de embriogênese somática de pupunha, aliado à análise bioquímica e epigenética, bem como avaliar os efeitos do ABA no processo de maturação dos embriões somáticos. Embriões somáticos multiplicados em aparatos RITA® apresentaram os melhores parâmetros analisados, ou seja, uma multiplicação elevada com o incremento significativo de proteínas totais (4,07 mg g-1), amido (1,34 mg g-1) e atividade enzimática da álcool desidrogenase (ADH)(3,65 OD min-1 mg-1 de proteína), ligado a um baixa taxa de metilação de DNA global (27,52%), indicando um possível avanço no desenvolvimento de embriões somáticos. O ABA juntamente com o meio de cultura semi-sólido, foi importante para a maturação de embriões somáticos, ligado a uma queda na metilação global do DNA (27,28%), o que provavelmente permitiu que a expressão de proteínas essenciais para a maturação dos embriões somáticos. No passo inicial da conversão, o cultivo em placas de Petri com meio de cultura isento de fitoreguladores proporcionou o desenvolvimento de um grande número de embriões verdes (105,25) que, em seguida, quando transferidos para os aparatos RITA® resultaram em um grande número de plântulas (315,7) em um tempo curto se comparado com os outros sistemas. Na aclimatização, a sobrevivência (83,3%) e enraizamento (94,4%) foram melhores para plântulas inicialmente com 7 cm, indicando a importância do tamanho da planta nesta etapa final. A segunda parte do trabalho avaliou a dinâmica da metilação global do DNA associada com as taxas de recrescimento de embriões somáticos durante as etapas do protocolo de criopreservação pela técnica de vitrificação-droplet. Clusters de embriões somáticos (SEC), submetidos a solução de vitrificação PVS3 (Plant Vitrification Solution 3) por diferentes períodos (0, 60, 120, 180 e 240 min) apresentaram diferentes taxas de recrescimento. A maior taxa (52,4%) foi obtida em resposta à técnica de vitrificação-droplet, combinado com um tempo de incubação de 120 minutos. A dinâmica de metilação do DNA global foi afetada tanto pela solução crioprotetora quanto pela submissão ao protocolo de criopreservação. Por exemplo, a incubação de SEC em PVS3, independente do tempo, não só reduz as taxas de recrescimento, como imediatamente aumenta os níveis de metilação global do DNA em relação aos SEC multiplicados no sistema de imersão temporária (controle). Porém, SEC que foram submetidos a criopreservação e posteriormente recuperados tiveram uma maior variação nas taxas de metilação global do DNA, e a exposição de SEC em PVS3 durante 120 min foi a única que conseguiu restabelecer o padrão inicial de metilação global após 24 semanas de recrescimento. Assim, durante a criopreservação de embriões somáticos, mudanças epigenéticas causadas pela alteração do estado de metilação global do DNA podem apresentar consequências fisiológicas implicando na conservação do germoplasma dessa importante espécie de palmeira. Para estabelecer um protocolo de criopreservação adequado, a terceira parte do trabalho objetivou avaliar as características ultraestruturais de SEC de B. gasipaes submetidos a criopreservação pela técnica de vitrificação. Assim, SEC foram incubados em diferentes tempos (0, 60, 120, 180 e 240 min) na solução PVS3. Em geral, as células submetidas a esta solução apresentaram características de células viáveis associadas a um núcleo proeminente, numerosas mitocôndrias e as paredes celulares bem preservadas. Células não incubadas em PVS3 não sobreviveram após o processo criogênico, apresentando células ultraestruturalmente colapsadas. O melhor tempo de incubação para a técnica de vitrificação foi de 240 minutos, resultando numa taxa de recrescimento de 37%. Nestes casos, várias características foram indicativas de um metabolismo celular ativo, incluindo núcleos intactos e paredes de células preservadas, um grande número de mitocôndrias e corpos lipídicos, bem como a presença de muitos grânulos de amido e cromatina condensada. Assim, a análise ultraestrutural revelou que as estruturas celulares totais foram conservadas depois do tratamento criogênico aliado a solução PVS3, validando o uso da técnica de vitrificação para a criopreservação de genótipos elite de pupunha, bem como os genótipos selvagens, que possuem uma ampla base genética muito rica e que devem ser conservados. Em conclusão, o protocolo de embriogênese somática desenvolvido neste trabalho mostra uma alta eficiência para a multiplicação, maturação dos embriões somáticos e produção de plântulas de pupunha e enfatiza a importância de modificar sistemas de cultivo nas diferentes etapas do protocolo resultando em alta qualidade de embriões somáticos, encurtando o tempo e aumentando o número de plântulas no final do processo. Com relação à criopreservação dos embriões somáticos, os acréscimos nas taxas de metilação global do DNA podem explicar as altas taxas de recrescimento desses embriões somáticos e estudos adicionais podem elucidar se estas variações epigenéticas podem ser herdadas pela geração seguinte e se as mudanças de metilação global do DNA causados durante criopreservação podem influenciar nas plântulas regeneradas a partir destes embriões somáticos criopreservados. Quanto às análises estruturais associadas à criopreservação, as mesmas revelaram estruturas celulares conservadas depois do tratamento criogênico e assim validando a técnica de vitrificação para a criopreservação de genótipos de pupunha.