A técnica de inseminação artificial (IA) por laparoscopia em ovinos foi utilizada pela primeira vez em 1982, o que tornou viável a utilização econômica do sêmen congelado nesta espécie. Os experimentos foram realizados com o objetivo de determinar as taxas de prenhez de ovelhas inseminadas por laparoscopia, utilizando 50 x 106 espermatozóides descongelados e capacitados in vitro. No experimento 1, foi utilizado sêmen de um reprodutor e 67 ovelhas com estros sincronizados, divididas aleatoriamente entre os grupos: sêmen congelado (SC1) e sêmen congelado capacitado in vitro (SCC1). As ovelhas foram submetidas à IA, com 50x106 espermatozóides, 56 e 60 horas, respectivamente, após a retirada das esponjas impregnadas com progesterona. No grupo SCC1, a taxa de prenhez foi de 48,39% (15/31) significativamente superior a do grupo SC1 de 25% (9/36). No experimento 2, utilizou-se um reprodutor e 100 ovelhas com os estros sincronizados, distribuídas aleatoriamente entre três grupos: sêmen fresco (SF2), SC2 e SCC2. Nos grupos SF2 e SC2 as fêmeas foram inseminadas com 100x106 espermatozóides e 56 horas após a retirada da progesterona. No grupo das fêmeas inseminadas com espermatozóides capacitados in vitro, utilizou-se 50x106 espermatozóides e um intervalo de 60 horas após retirada da progesterona. As taxas de prenhez diagnosticadas nos diferentes grupos experimentais foram: SF2 60,9% (25/41), SC2 56,70% (17/30) e SCC2 44,90% (13/29), não existindo diferença estatística entre os grupos. Os experimentos realizados mostraram a viabilidade doemprego, na espécie ovina, da IA por laparoscopia utilizando 50x106 espermatozóides descongelados e capacitados in vitro. / The ovine artificial insemination (AI) by laparoscopy was described the first time in 1982, since this time frozen semen became a tool for use under field conditions. Today one research goal is to achieve high preganancies rates after AI using a reduced number of frozen/thawed spermatozoa per dosis. The experiments were carried out with the objective to determine the pregnancy rate of ewes inseminated by laparoscopy, using 50 x 106 thawed and in vitro capacited spermatozoa. In the experiment 1 was used semen of one fertily ram and 67 ewes with synchronized estrus. The females were randomly distributed among two experimental groups: inseminated with frozen semen (SC1) or frozen and in vitro capacitated semen (SCC1). The ewes were submitted to the AI with 50x106 spermatozoa, 56 (SC1) or 60 (SCC1) hours, respectively, after retreat of the intra vaginal device impregnated with progesterona. In the group SCC1 the pregnancy rate was 48,39% (15/31) significantly different from the 25% (9/36) observed in the group SC1. In the experiment 2 was used one fertily ram and 100 ewes with synchronized estrus, distributed randomly among three groups: inseminated with fresh semen (SF2), 100 x 106 spermatozoa, SC2, 100 x 106 frozen spermatozoa and SCC2, 50 x 106 frozen and in vitro capacited spermatozoa. The moment of the laparoscopic AI was the same as used in the experiment 1: 56 (SF2 and SC2) or 60 (SCC2) hours, respectively, after retreat of the intra vaginal device impregnated with progesterona. The observed pregnancy rates were similar among the experimental groups: SF2 60,9% (25/41), SC2 56,70% (17/30) and SCC2 44,90% (13/29). Our experiments showed the ability of frozen/thawed and in vitro capacitated ovine spermatozoa to in vivo fertilize and promote the development of pregancies. In conclusion, itis possible to use 50x106 frozen/thawed and in vitro capacited spermatozoa for ovine laparoscopic AI.

Os materiais de origem animal utilizados na produção in vitro (PIV) de bovinos podem apresentar-se contaminados pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) quando provenientes de animais infectados. Tendo isso em vista é importante realizar estudos aplicados para minimizar a transmissão de patógenos via biotécnicas de reprodução. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a capacidade dos métodos de processamento seminal, Swim up, gradiente de Percoll e a combinação Swim up/Percoll em reduzir ou eliminar o BVDV de amostras de sêmen experimentalmente infectadas (Experimento 1), e também, avaliar o efeito do BVDV durante a maturação in vitro (MIV) de complexos cumuli-oophorus bovinos (CCOs), assim como, no seu posterior desenvolvimento embrionário. Foi avaliada também a produção de antígenos nas células do cumulus (CC) em cultivo em comparação com as células MDBK (Experimento2). No Experimento 1 foram obtidas as seguintes faixas de títulos virais após processamento, 100.87 – 102.3 TCID/50/mL no Percoll, 101.87 – 103.3 TCID/50/mL no Swim up e no grupo combinado Swim up/Percoll não foi possível detectar vírus nas amostras. E a PIV produziu taxas de blastulação semelhantes nos grupos de diferentes processamentos seminais avaliados. Os dados mostraram que a combinação Swim up/Percoll reduziu/eliminou significativamente o número de partículas virais nas amostras de sêmen, sem causar danos aos espermatozóides, e também, possibilitou a PIV. No Experimento 2 nossos dados mostraram que os grupos controle (C) e infectado (V) apresentaram padrões diferentes de expansão das CC. A taxa de MIV do grupo C foi significativamente maior do que no grupo V, assim como as taxas de blastulação. Títulos virais mais altos foram obtidos nas CC em comparação com as células MDBK. Os resultados mostraram que a presença do BVDV na MIV infecta as CC, afeta o padrão de expansão das CC e reduz as taxas de maturação e blastulação. Dessa forma conclui-se que os dados obtidos nesse trabalho são extremamente importantes para auxiliar no desenvolvimento de protocolos de lavagem de sêmen a fim de eliminar os microorganismos presentes e possibilitar a produção de embriões livres de patógenos. / The materials of animal origin used in cattle to produce in vitro embryos (IVP) have been shown to contain BVDV when originate from infected animals. Considering that it is important to perform applicable studies to minimize transmission of pathogens via these assisted reproductive techniques. The aim of the study were evaluate the capacity of sperm separation procedures Percoll gradient, Swim-up, and a combination of Swim-up/Percoll, to reduce/eliminate BVDV from experimentally infected semen samples (Experiment 1), and to evaluate BVDV experimentally infection during in vitro maturation (IVM) of bovine cumuli oophorus complexes (COCs) and also BVDV effect on the COCs posterior embryo development. It was also evaluated the production of BVDV antigens through cumulus cells (CC) culture in comparison to MDBK cell culture (Experiment 2). At experiment 1 the virus titration presented a titer range among 100.87 - 102.3 TCID50/mL in Percoll; 101.87 - 103.3 TCID50/mL in Swim up; and undetected for all samples in the Swim up/Percoll. And the PIV produced similar blastocyst rates among the groups. The data showed that the combination of Swim up/Percoll promoted a significant reduction/elimination in the number of viral particles in the semen, without promotion of damage in spermatozoa cells and allow IVP with similar blastocyst rates among the different groups. From experiment 2 our data showed that control (C) and infected (V) groups presented different CC expansion patterns. The IVM rate for C group was higher than V group. Embryo development rate to blastocyst stage was significantly higher in C group than in V group. The highest virus titers were obtained in CC in comparison with MDBK cells. Our findings showed that BVDV presence during IVM infected CC and this affects their expansion pattern, which may be related to the observed reduced nuclear maturation and blastocyst development rates. Therefore it is possible to conclude that our data are extremely important as a help to develop semen washing protocols to eliminate microorganisms and allow the embryo production free of pathogens.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-03-31T17:01:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 832328 bytes, checksum: 949148bf83eadb0a808e78e1ad85509d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-31T17:01:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 832328 bytes, checksum: 949148bf83eadb0a808e78e1ad85509d (MD5) Previous issue date: 2004-02-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O tubo digestivo dos insetos pode ser dividido em intestino anterior, intestino médio ou ventrículo e intestino posterior, sendo o ventrículo de origem endodérmica e os intestinos anterior e posterior de origem ectodérmica. No ventrículo ocorre a secreção de enzimas digestivas e a absorção dos nutrientes. Os principais tipos celulares encontrados no ventrículo são as células digestivas, que secretam enzimas e absorvem nutrientes e as células regenerativas, que se diferenciam e originam os demais tipos celulares do epitélio do ventrículo. Durante a metamorfose das abelhas, o epitélio do ventrículo é substituído, e esta substituição ocorre às custas da diferenciação das células regenerativas larvais. O presente trabalho busca investigar as modificações ocorridas no epitélio do ventrículo da abelha Melipona quadrifasciata anthidioides durante o desenvolvimento pós-embrionário e se existe proliferação das células regenerativas durante a metamorfose do ventrículo, utilizando-se técnicas anatômicas, de imunofluorescência e imunoperoxidase com anticorpo anti BrdU. Foram analisadas larvas de diferentes idades, pré-pupas, pupas de operárias em diferentes fases de desenvolvimento: pupas de olhos brancos, olhos marrons, olhos pretos e operárias adultas. Os resultados revelaram que na larva ocorre proliferação de células regenerativas, o que pode ser comprovado pela observação de metáfases, culminando com o aumento do número de células regenerativas por ninho. Com o envelhecimento da larva o número e o tamanho dos ninhos de células regenerativas aumentam. A substituição do epitélio larval pelo epitélio do adulto ocorre a partir do segundo dia após o inicio da defecação. Neste período os ninhos de células regenerativas estão em contato, formando uma espécie de rede, lembrando um sincício pelo fato de não ter sido observado o limite celular. Concomintante à degeneração das células digestivas larvais ocorre a diferenciação das células regenerativas, formando as células digestivas do adulto. Células regenerativas BrdU positivas são observadas somente na fase de pré-pupa, 12 h após a injeção de BrdU, indicando que é durante esta fase que a população de células regenerativas aumenta. Pode-se entender a proliferação das células regenerativas como um processo compensatório, que repõe as células regenerativas que se diferenciam durante a metamorfose do ventrículo. Parece que a existência de proliferação de células regenerativas culmina no aumento da população de células regenerativas e não na formação de novas células digestivas. A hipótese de que células digestivas dos adultos se originam através da proliferação e posterior diferenciação das células regenerativas durante a metamorfose do ventrículo de M. quadrifasciata anthidioides pode ser rejeitada porque a proliferação das células regenerativas durante a pupação não seria suficiente para restabelecer os ninhos de células regenerativas e ao mesmo tempo formar novas células digestivas e pelo fato de que a população de células regenerativas existente durante o processo de defecação parece ser suficiente para promover a renovação do epitélio do ventrículo durante a metamorfose. / The digestive tract of insects can be divided into foregut, midgut and hindgut. Fore and hindgut have an ectodermic origin, while midgut is endodermic. Midgut is responsible for the enzyme secretion and nutrient absorption. The midgut epithelium is formed basically by the digestive cells, responsible for the enzyme secretion and nutrient absorption and for the small regenerative cells that are placed in nests scattered among the digestive cells. During midgut metamorphosis, the epithelium is substituted to attend adult's nutritional needs, and this substitution occurs due to larval regenerative cells differentiation. The present work focused on the midgut epithelial modifications during the post- embryonic development of the stingless bee Melipona quadrifasciata anthidioides. The presence of regenerative cells proliferation during midgut metamorphosis was also investigated, using anatomical and imunofluorescence techniques with antibody against BrdU. Were analyzed specimens at the following developmental stage: larvae of different ages, prepupae, White eyed, brown eyed and black eyed pupae and adult workers. Regenerative cell proliferation is easily detected during larval period by the presence of metaphase, which results in the regenerative cell number increasing. During larval aging the number and the size of the nests of regenerative cells also increases. Larval epithelium degeneration starts in the second day after defecation process had initiated. In this period the nests of regenerative cells are in contact and cell limit were not visualized, resembling a sincicium. The degeneration of the larval digestive cells and the regenerative cells differentiation into adult's digestive cells occurs at the same time. The BrdU positive regenerative cells are only observed in the prepupae period, 12 h after BrdU injection indicating that regenerative cell population increase during this period. Regenerative cell proliferation can be understood as a compensatory process, responsible for the regenerative cell replacing that are consumed during midgut epithelial renewing during metamorphosis. It probably assures the maintenance of the adult midgut epithelium. It seems that the regenerative cell proliferation culminates in the increase of the regenerative cells population and not in the formation of new digestive cells because the proliferation of regenerative cells would not be enough to reestablish the nests of regenerative cells and at the same time form new adult digestive cells. In this sense the hypothesis that digestive adult cells are originated through the regenerative cell proliferation and posterior differentiation during metamorphosis can be rejected. M. quadrifasciata anthidioides midgut

The inherent complexity of development of a new human being, especially when related to a lack of teaching-learning resources, makes the process of teaching-learning in the area of Human Embryology often difficult and abstract. The possibility of using and/or producing three-dimensional concrete models is recognized as an alternative capable of promoting the understanding of the different stages of human embryogenesis. Trying to evaluate, qualitatively and quantitatively, the educational potential of such macroscopic tools, three-dimensional models were used as intervention in Human Embryology lessons concerning the discipline taught to the second semester of undergraduate Biological Sciences, at Federal University of Santa Maria (UFSM), RS. To collect data, a knowledge test with illustrated and, in most of cases, closed questions was applied three times, what consisted in a pre-test, a post-theory test and a post-intervention test. The knowledge test and the models used were referring to the first four weeks of human embryogenesis. The pre-test helped in the first moment to survey the prior knowledge of the sample on the topic and, in a second moment, as a reference for comparison with the results of subsequent applications. Qualitative analysis of the tests resulted in categories of responses and quantitative analysis, in frequencies of each category and average score. Such analysis showed that the performance of the sample in the post-intervention test was considerably higher than in previous applications, what means that intervention models contributed significantly to the process of teaching and learning of the sample, what resulted in a better acquisition of knowledge about human embryonic development. The evaluation made by the sample also contributed to this statement. In this sense, it s highlighted the importance of using such pedagogical alternatives in initial and continuing teacher training, so such tools may be effectively used at different levels of science teaching. / A complexidade inerente ao desenvolvimento de um novo ser, principalmente quando aliada à falta de recursos didático-pedagógicos, torna, muitas vezes, o processo de ensino-aprendizagem, na área de Embriologia Humana, árduo e abstrato. A possibilidade de utilizar e/ou produzir modelos concretos tridimensionais é, reconhecidamente, uma alternativa capaz de favorecer o entendimento das diferentes fases da embriogênese humana. Buscando avaliar, qualitativa e quantitativamente, o potencial pedagógico de tais ferramentas macroscópicas, modelos didáticos tridimensionais foram utilizados, de forma interventiva, em aulas de Embriologia Humana referentes à disciplina ministrada ao segundo semestre da graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), RS. Para a coleta de dados, um teste de conhecimentos com questões ilustradas e, em sua maioria fechadas, foi aplicado em três momentos distintos, constituindo um pré-teste, um teste pós-teoria e um teste pós-intervenção. O teste de conhecimentos e os modelos utilizados foram referentes às quatro primeiras semanas da embriogênese humana. O pré-teste serviu, inicialmente, para o levantamento dos saberes prévios da amostra acerca do tema em questão e, em um segundo momento, de referência para comparação com os resultados das aplicações posteriores. A análise qualitativa dos testes resultou em categorias de respostas, e a análise quantitativa nas frequências de cada categoria e na média geral de acertos. Tais análises demonstraram que o desempenho da amostra no teste pós-intervenção foi consideravelmente maior do que nas aplicações anteriores, o que permite considerar que a intervenção com os modelos contribuiu, de forma significativa, para o processo de ensino e aprendizagem da amostra, resultando, assim, em uma maior apropriação dos conhecimentos referentes ao desenvolvimento embrionário humano. A avaliação da metodologia realizada pela própria amostra também levou a esta constatação. Nesse sentido, destaca-se a importância da utilização de tais alternativas didáticas na formação inicial e continuada de professores da área, para que tais ferramentas venham a ser, efetivamente, utilizadas nos diferentes níveis do Ensino de Ciências.

A técnica de inseminação artificial (IA) por laparoscopia em ovinos foi utilizada pela primeira vez em 1982, o que tornou viável a utilização econômica do sêmen congelado nesta espécie. Os experimentos foram realizados com o objetivo de determinar as taxas de prenhez de ovelhas inseminadas por laparoscopia, utilizando 50 x 106 espermatozóides descongelados e capacitados in vitro. No experimento 1, foi utilizado sêmen de um reprodutor e 67 ovelhas com estros sincronizados, divididas aleatoriamente entre os grupos: sêmen congelado (SC1) e sêmen congelado capacitado in vitro (SCC1). As ovelhas foram submetidas à IA, com 50x106 espermatozóides, 56 e 60 horas, respectivamente, após a retirada das esponjas impregnadas com progesterona. No grupo SCC1, a taxa de prenhez foi de 48,39% (15/31) significativamente superior a do grupo SC1 de 25% (9/36). No experimento 2, utilizou-se um reprodutor e 100 ovelhas com os estros sincronizados, distribuídas aleatoriamente entre três grupos: sêmen fresco (SF2), SC2 e SCC2. Nos grupos SF2 e SC2 as fêmeas foram inseminadas com 100x106 espermatozóides e 56 horas após a retirada da progesterona. No grupo das fêmeas inseminadas com espermatozóides capacitados in vitro, utilizou-se 50x106 espermatozóides e um intervalo de 60 horas após retirada da progesterona. As taxas de prenhez diagnosticadas nos diferentes grupos experimentais foram: SF2 60,9% (25/41), SC2 56,70% (17/30) e SCC2 44,90% (13/29), não existindo diferença estatística entre os grupos. Os experimentos realizados mostraram a viabilidade doemprego, na espécie ovina, da IA por laparoscopia utilizando 50x106 espermatozóides descongelados e capacitados in vitro. / The ovine artificial insemination (AI) by laparoscopy was described the first time in 1982, since this time frozen semen became a tool for use under field conditions. Today one research goal is to achieve high preganancies rates after AI using a reduced number of frozen/thawed spermatozoa per dosis. The experiments were carried out with the objective to determine the pregnancy rate of ewes inseminated by laparoscopy, using 50 x 106 thawed and in vitro capacited spermatozoa. In the experiment 1 was used semen of one fertily ram and 67 ewes with synchronized estrus. The females were randomly distributed among two experimental groups: inseminated with frozen semen (SC1) or frozen and in vitro capacitated semen (SCC1). The ewes were submitted to the AI with 50x106 spermatozoa, 56 (SC1) or 60 (SCC1) hours, respectively, after retreat of the intra vaginal device impregnated with progesterona. In the group SCC1 the pregnancy rate was 48,39% (15/31) significantly different from the 25% (9/36) observed in the group SC1. In the experiment 2 was used one fertily ram and 100 ewes with synchronized estrus, distributed randomly among three groups: inseminated with fresh semen (SF2), 100 x 106 spermatozoa, SC2, 100 x 106 frozen spermatozoa and SCC2, 50 x 106 frozen and in vitro capacited spermatozoa. The moment of the laparoscopic AI was the same as used in the experiment 1: 56 (SF2 and SC2) or 60 (SCC2) hours, respectively, after retreat of the intra vaginal device impregnated with progesterona. The observed pregnancy rates were similar among the experimental groups: SF2 60,9% (25/41), SC2 56,70% (17/30) and SCC2 44,90% (13/29). Our experiments showed the ability of frozen/thawed and in vitro capacitated ovine spermatozoa to in vivo fertilize and promote the development of pregancies. In conclusion, itis possible to use 50x106 frozen/thawed and in vitro capacited spermatozoa for ovine laparoscopic AI.

Os materiais de origem animal utilizados na produção in vitro (PIV) de bovinos podem apresentar-se contaminados pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) quando provenientes de animais infectados. Tendo isso em vista é importante realizar estudos aplicados para minimizar a transmissão de patógenos via biotécnicas de reprodução. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a capacidade dos métodos de processamento seminal, Swim up, gradiente de Percoll e a combinação Swim up/Percoll em reduzir ou eliminar o BVDV de amostras de sêmen experimentalmente infectadas (Experimento 1), e também, avaliar o efeito do BVDV durante a maturação in vitro (MIV) de complexos cumuli-oophorus bovinos (CCOs), assim como, no seu posterior desenvolvimento embrionário. Foi avaliada também a produção de antígenos nas células do cumulus (CC) em cultivo em comparação com as células MDBK (Experimento2). No Experimento 1 foram obtidas as seguintes faixas de títulos virais após processamento, 100.87 – 102.3 TCID/50/mL no Percoll, 101.87 – 103.3 TCID/50/mL no Swim up e no grupo combinado Swim up/Percoll não foi possível detectar vírus nas amostras. E a PIV produziu taxas de blastulação semelhantes nos grupos de diferentes processamentos seminais avaliados. Os dados mostraram que a combinação Swim up/Percoll reduziu/eliminou significativamente o número de partículas virais nas amostras de sêmen, sem causar danos aos espermatozóides, e também, possibilitou a PIV. No Experimento 2 nossos dados mostraram que os grupos controle (C) e infectado (V) apresentaram padrões diferentes de expansão das CC. A taxa de MIV do grupo C foi significativamente maior do que no grupo V, assim como as taxas de blastulação. Títulos virais mais altos foram obtidos nas CC em comparação com as células MDBK. Os resultados mostraram que a presença do BVDV na MIV infecta as CC, afeta o padrão de expansão das CC e reduz as taxas de maturação e blastulação. Dessa forma conclui-se que os dados obtidos nesse trabalho são extremamente importantes para auxiliar no desenvolvimento de protocolos de lavagem de sêmen a fim de eliminar os microorganismos presentes e possibilitar a produção de embriões livres de patógenos. / The materials of animal origin used in cattle to produce in vitro embryos (IVP) have been shown to contain BVDV when originate from infected animals. Considering that it is important to perform applicable studies to minimize transmission of pathogens via these assisted reproductive techniques. The aim of the study were evaluate the capacity of sperm separation procedures Percoll gradient, Swim-up, and a combination of Swim-up/Percoll, to reduce/eliminate BVDV from experimentally infected semen samples (Experiment 1), and to evaluate BVDV experimentally infection during in vitro maturation (IVM) of bovine cumuli oophorus complexes (COCs) and also BVDV effect on the COCs posterior embryo development. It was also evaluated the production of BVDV antigens through cumulus cells (CC) culture in comparison to MDBK cell culture (Experiment 2). At experiment 1 the virus titration presented a titer range among 100.87 - 102.3 TCID50/mL in Percoll; 101.87 - 103.3 TCID50/mL in Swim up; and undetected for all samples in the Swim up/Percoll. And the PIV produced similar blastocyst rates among the groups. The data showed that the combination of Swim up/Percoll promoted a significant reduction/elimination in the number of viral particles in the semen, without promotion of damage in spermatozoa cells and allow IVP with similar blastocyst rates among the different groups. From experiment 2 our data showed that control (C) and infected (V) groups presented different CC expansion patterns. The IVM rate for C group was higher than V group. Embryo development rate to blastocyst stage was significantly higher in C group than in V group. The highest virus titers were obtained in CC in comparison with MDBK cells. Our findings showed that BVDV presence during IVM infected CC and this affects their expansion pattern, which may be related to the observed reduced nuclear maturation and blastocyst development rates. Therefore it is possible to conclude that our data are extremely important as a help to develop semen washing protocols to eliminate microorganisms and allow the embryo production free of pathogens.

Para elucidar as vias genéticas controlando a formação das câmaras cardíacas, foi analisada a regulação do promotor atrial-específico do gene de codorna que codifica a isoforma lenta da cadeia pesada de miosina (slow myosin heavy chain 3 -SMyHC3). Em camundongos transgênicos, a expressão atrial-específica dos 840 pb do promotor SMyHC3 fundido ao gene repórter da fosfatase alcalina (HAP), SMyHC3-HAP, é controlada pelos 72 pb mais distais deste promotor. Este fragmento contém sítios putativos para ligação a receptores nucleares os quais foram denominados ECRRN (elemento complexo de resposta a receptores nucleares), definidos por modelagem molecular. Tratamento de embriões SMyHC3-HAP com ácido retinoico (AR) expande o domínio atrial de expressão do transgene, enquanto que a inibição da via de sinalização por AR reduz o domínio de expressão do transgene. Ensaios de gel shift revelam que os receptores de AR, RAR/RXR se ligam fracamente a esse promotor. Também, esses receptores não ativam o promotor SMyHC3 em experimentos de transfecção transiente, mesmo na presença de coativadores, tais como p300, CBP e GRIP1. Isso sugere a participação indireta de AR na regulação deste marcador atrial. Ensaios de transfecção celular demonstram que COUPTF2 é capaz de ativar o promotor SMyHC3 e, siRNA contra COUPTF2 inibe esta transativação. Embriões tratados com AR apresentam um aumento geral da expressão de COUPTF2, reforçando a idéia de que AR age indiretamente ativando este gene. Estudos de bioinformática revelam que o ECRRN está presente na região 3 do gene AMHC1 de galinha e alinhamentos indicam que pode se tratar de um elemento móvel que pode ter sido adquirido por um evento de exaptação. Em resumo, COUPTF2 e AR controlam a expressão do promotor SMyHC3, porém a natureza da relação entre os 2 elementos necessita ser elucidada. / To elucidate the genetic pathways controlling cardiac chamber formation, the atrial specific gene promoter SMyHC3 was analyzed. In transgenic mice, the atrial specific expression an 840 bp of the SMyHC3 promoter was linked to reporter gene human alkaline phosphatase (HAP), SMyHC3-HAP. By directed mutagenesis and deletion analysis we identified the more distal 72 bp of the promoter as responsible of the atrial expression. This fragment contains putative binding sites to nuclear receptors, the CNRRE (complex nuclear receptor response element), defined by molecular modeling. RA (retinoic acid) treatment in SMyHC3-HAP embryos expands the atrial domain. However, the RA effectors, RXR/RAR bind with low affinity to the SMyHC3 promoter. These receptors are not able to activate the promoter even in the presence of coactivators such as p300, CBP and GRIP1. These results suggest that RA acts indirectly to regulate this atrial marker. Cell transient transfection shows that COUPTF2 activate the SMyHC3 promoter, and COUPTF2 siRNA inhibits the transactivation of the SMyHC3 promoter. Treatment of embryos with RA increases the COUPTF2 expression reinforcing the idea that this receptor could be regulatedindirectly by RA. Bioinformatic studies revealed that CNRRE is present in the 3 region of the ortholog chicken AMHC1 gene. Alignments indicate that this CNRRE could have been acquired by an exaptation event. In conclusion, the SMyHC3 promoter seems to be controlled by RA and COUPTF2 governing atrial expression. However the nature of relationships between RA and COUPTF2 need to be elucidated.

A técnica de inseminação artificial (IA) por laparoscopia em ovinos foi utilizada pela primeira vez em 1982, o que tornou viável a utilização econômica do sêmen congelado nesta espécie. Os experimentos foram realizados com o objetivo de determinar as taxas de prenhez de ovelhas inseminadas por laparoscopia, utilizando 50 x 106 espermatozóides descongelados e capacitados in vitro. No experimento 1, foi utilizado sêmen de um reprodutor e 67 ovelhas com estros sincronizados, divididas aleatoriamente entre os grupos: sêmen congelado (SC1) e sêmen congelado capacitado in vitro (SCC1). As ovelhas foram submetidas à IA, com 50x106 espermatozóides, 56 e 60 horas, respectivamente, após a retirada das esponjas impregnadas com progesterona. No grupo SCC1, a taxa de prenhez foi de 48,39% (15/31) significativamente superior a do grupo SC1 de 25% (9/36). No experimento 2, utilizou-se um reprodutor e 100 ovelhas com os estros sincronizados, distribuídas aleatoriamente entre três grupos: sêmen fresco (SF2), SC2 e SCC2. Nos grupos SF2 e SC2 as fêmeas foram inseminadas com 100x106 espermatozóides e 56 horas após a retirada da progesterona. No grupo das fêmeas inseminadas com espermatozóides capacitados in vitro, utilizou-se 50x106 espermatozóides e um intervalo de 60 horas após retirada da progesterona. As taxas de prenhez diagnosticadas nos diferentes grupos experimentais foram: SF2 60,9% (25/41), SC2 56,70% (17/30) e SCC2 44,90% (13/29), não existindo diferença estatística entre os grupos. Os experimentos realizados mostraram a viabilidade doemprego, na espécie ovina, da IA por laparoscopia utilizando 50x106 espermatozóides descongelados e capacitados in vitro. / The ovine artificial insemination (AI) by laparoscopy was described the first time in 1982, since this time frozen semen became a tool for use under field conditions. Today one research goal is to achieve high preganancies rates after AI using a reduced number of frozen/thawed spermatozoa per dosis. The experiments were carried out with the objective to determine the pregnancy rate of ewes inseminated by laparoscopy, using 50 x 106 thawed and in vitro capacited spermatozoa. In the experiment 1 was used semen of one fertily ram and 67 ewes with synchronized estrus. The females were randomly distributed among two experimental groups: inseminated with frozen semen (SC1) or frozen and in vitro capacitated semen (SCC1). The ewes were submitted to the AI with 50x106 spermatozoa, 56 (SC1) or 60 (SCC1) hours, respectively, after retreat of the intra vaginal device impregnated with progesterona. In the group SCC1 the pregnancy rate was 48,39% (15/31) significantly different from the 25% (9/36) observed in the group SC1. In the experiment 2 was used one fertily ram and 100 ewes with synchronized estrus, distributed randomly among three groups: inseminated with fresh semen (SF2), 100 x 106 spermatozoa, SC2, 100 x 106 frozen spermatozoa and SCC2, 50 x 106 frozen and in vitro capacited spermatozoa. The moment of the laparoscopic AI was the same as used in the experiment 1: 56 (SF2 and SC2) or 60 (SCC2) hours, respectively, after retreat of the intra vaginal device impregnated with progesterona. The observed pregnancy rates were similar among the experimental groups: SF2 60,9% (25/41), SC2 56,70% (17/30) and SCC2 44,90% (13/29). Our experiments showed the ability of frozen/thawed and in vitro capacitated ovine spermatozoa to in vivo fertilize and promote the development of pregancies. In conclusion, itis possible to use 50x106 frozen/thawed and in vitro capacited spermatozoa for ovine laparoscopic AI.

Os materiais de origem animal utilizados na produção in vitro (PIV) de bovinos podem apresentar-se contaminados pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) quando provenientes de animais infectados. Tendo isso em vista é importante realizar estudos aplicados para minimizar a transmissão de patógenos via biotécnicas de reprodução. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a capacidade dos métodos de processamento seminal, Swim up, gradiente de Percoll e a combinação Swim up/Percoll em reduzir ou eliminar o BVDV de amostras de sêmen experimentalmente infectadas (Experimento 1), e também, avaliar o efeito do BVDV durante a maturação in vitro (MIV) de complexos cumuli-oophorus bovinos (CCOs), assim como, no seu posterior desenvolvimento embrionário. Foi avaliada também a produção de antígenos nas células do cumulus (CC) em cultivo em comparação com as células MDBK (Experimento2). No Experimento 1 foram obtidas as seguintes faixas de títulos virais após processamento, 100.87 – 102.3 TCID/50/mL no Percoll, 101.87 – 103.3 TCID/50/mL no Swim up e no grupo combinado Swim up/Percoll não foi possível detectar vírus nas amostras. E a PIV produziu taxas de blastulação semelhantes nos grupos de diferentes processamentos seminais avaliados. Os dados mostraram que a combinação Swim up/Percoll reduziu/eliminou significativamente o número de partículas virais nas amostras de sêmen, sem causar danos aos espermatozóides, e também, possibilitou a PIV. No Experimento 2 nossos dados mostraram que os grupos controle (C) e infectado (V) apresentaram padrões diferentes de expansão das CC. A taxa de MIV do grupo C foi significativamente maior do que no grupo V, assim como as taxas de blastulação. Títulos virais mais altos foram obtidos nas CC em comparação com as células MDBK. Os resultados mostraram que a presença do BVDV na MIV infecta as CC, afeta o padrão de expansão das CC e reduz as taxas de maturação e blastulação. Dessa forma conclui-se que os dados obtidos nesse trabalho são extremamente importantes para auxiliar no desenvolvimento de protocolos de lavagem de sêmen a fim de eliminar os microorganismos presentes e possibilitar a produção de embriões livres de patógenos. / The materials of animal origin used in cattle to produce in vitro embryos (IVP) have been shown to contain BVDV when originate from infected animals. Considering that it is important to perform applicable studies to minimize transmission of pathogens via these assisted reproductive techniques. The aim of the study were evaluate the capacity of sperm separation procedures Percoll gradient, Swim-up, and a combination of Swim-up/Percoll, to reduce/eliminate BVDV from experimentally infected semen samples (Experiment 1), and to evaluate BVDV experimentally infection during in vitro maturation (IVM) of bovine cumuli oophorus complexes (COCs) and also BVDV effect on the COCs posterior embryo development. It was also evaluated the production of BVDV antigens through cumulus cells (CC) culture in comparison to MDBK cell culture (Experiment 2). At experiment 1 the virus titration presented a titer range among 100.87 - 102.3 TCID50/mL in Percoll; 101.87 - 103.3 TCID50/mL in Swim up; and undetected for all samples in the Swim up/Percoll. And the PIV produced similar blastocyst rates among the groups. The data showed that the combination of Swim up/Percoll promoted a significant reduction/elimination in the number of viral particles in the semen, without promotion of damage in spermatozoa cells and allow IVP with similar blastocyst rates among the different groups. From experiment 2 our data showed that control (C) and infected (V) groups presented different CC expansion patterns. The IVM rate for C group was higher than V group. Embryo development rate to blastocyst stage was significantly higher in C group than in V group. The highest virus titers were obtained in CC in comparison with MDBK cells. Our findings showed that BVDV presence during IVM infected CC and this affects their expansion pattern, which may be related to the observed reduced nuclear maturation and blastocyst development rates. Therefore it is possible to conclude that our data are extremely important as a help to develop semen washing protocols to eliminate microorganisms and allow the embryo production free of pathogens.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The jenipapeiro (Genipa americana L.) has great economic importance both for its forest essence, as the production of food. Obtaining protocols is important for conservation of genetic resources conservation. The objectives of this study was to establish protocols for in vitro conservation jenipapeiro, and studies of the effect of different culture media on in vitro germination of seeds of this species and the effects of different culture media on the induction of somatic embryogenesis from explants of this culture. The experiments were conducted in the laboratory of Plant Tissue Culture Embrapa Coastal Tablelands, SE. To study the in vitro conservation of plant seeds were used arrays jenipapeiro from Cruz das Almas, Bahia; access Oiteiros, Sergipe and access Siriri, Sergipe. In the experiment of conservation tested different concentrations of mannitol - Test 1; ABA- Test 2, and variations of the MS and sucrose- test 3. After 150 days, the seedlings from the means of conservation, targeted and were inoculated on regeneration medium (MS gelled supplemented with 30 g L-1 sucrose, BAP (0 and 1 mg L-1) and 4,5 g L-1 Phytagel ®). For the germination experiment tested distilled water and different variations of MS salts and sucrose. For the experiment of somatic embryogenesis, seedling 90 days in vitro culture were segmented and transferred to a new MS medium supplemented with 30 g L-1 sucrose and different concentrations of 2,4 - 2,4-D-Dichlorofenoxyacetic (0 , 4 and 8 mg L-1) combined with concentrations of four-benzylaminopurine (BAP 0, 1, 2 and 3 mg L-1). In the stage of conservation, mannitol concentrations studied did not promote growth slowdown seedlings jenipapeiro, while, abscisic acid caused a reduction in the number of leaves. The means MS and ½ MS salt concentration in the presence of 30 g L-1 sucrose promoted slowing the growth of seedlings jenipapeiro can be recommended protocols for conservation by slow growth. The explants from the storage medium containing mannitol and maintained abscisic acid in the presence of 1,0 mg L-1 BAP phase of resumption showed higher morphogenetic response. Explants kept in storage phase in the presence of MS medium + 30 g L-1 sucrose and ½ MS 15 or 30 g L-1 sucrose, had lower morphogenetic response in the absence of BAP compared with the other treatments. In the stage of germination in vitro, it was observed that in the absence of salts and sucrose was highest percentage of normal seedlings and lowest shoot length. In the stage of somatic embryogenesis, the presence of 2,4-D, promoted greater percentage of explants with morphogenetic response. The shoot segments promoted greater response than the foliar concentration in the absence and 4 mg L-1 2,4-D. Furthermore, the presence of BAP induced reduced response to this variable stem explants and greater response to foliar explants. / O jenipapeiro tem grande importância econômica tanto pela sua essência florestal, quanto pela produção de alimentos. A obtenção de protocolos de conservação é importante para a preservação de recursos genéticos. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer protocolos de conservação in vitro de jenipapeiro, além de estudos do efeito de diferentes meios de cultura na germinação in vitro de sementes dessa espécie e do efeito de diferentes meios de cultura na indução da embriogênese somática. Os experimentos foram conduzidos no laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da Embrapa Tabuleiros Costeiros, SE e foram utilizadas sementes de plantas matrizes de jenipapeiro provenientes de Cruz das Almas- BA; Povoado Oiteiros- SE e Povoado Siriri- SE. No experimento de conservação foram testadas diferentes concentrações de manitol- ensaio 1; de ABA- ensaio 2; e variações do meio MS e sacarose- ensaio 3. Após 150 dias, as plântulas provenientes do meio de conservação, foram segmentadas e inoculados em meio de regeneração (MS gelificado suplementado com 30 g L-1 de sacarose, BAP (0 e 1 mg L-1) e 4,5 g L-1 de Phytagel®). Para o experimento de germinação foram testadas água destilada e diferentes variações de sais MS e sacarose. Para o experimento da embriogênese somática, plântulas com 90 dias de cultivo in vitro foram segmentadas e transferidas para um novo meio MS suplementado com 30 g L-1 de sacarose e diferentes concentrações de 2,4- Diclorofenoxiacético- 2,4-D (0; 4 e 8 mg L-1) combinadas com quatro concentrações de benzilaminopurina-BAP (0; 1; 2 e 3 mg L-1). Na etapa de conservação, o manitol nas concentrações estudadas não promoveu desaceleração do crescimento das plântulas de jenipapeiro, enquanto, o ácido abscísico promoveu a redução do número de folhas. Os meios MS e ½ da concentração de sais MS na presença de 30 g L-1 de sacarose promoveram a desaceleração do crescimento das plântulas de jenipapeiro, podendo ser recomendados para protocolos de conservação por crescimento lento. Os explantes provenientes do meio de conservação contendo manitol e ácido abscísico mantidos na presença de 1,0 mg L-1 de BAP na fase de retomada, apresentaram maior resposta morfogenética. Os explantes mantidos na fase de conservação na presença de meio MS + 30 g L-1 de sacarose e ½ MS com 15 ou 30 g L-1 de sacarose, apresentaram menor resposta morfogenética na ausência de BAP quando comparado com os demais tratamentos. Na etapa de germinação in vitro, observou-se que na ausência de sais e de sacarose houve maior porcentagem de plântulas normais e menor comprimento da parte aérea. Na etapa da embriogênese somática, a presença de 2,4-D, promoveu maior porcentagem de explantes com resposta morfogenética. O segmento caulinar promoveu maior resposta que o segmento foliar na ausência e na concentração 4 mg L-1 de 2,4-D. Além disso, a presença de BAP induziu menor resposta dessa variável para o explante caulinar e maior resposta para o explante foliar.