Abstract The main goal of in vitro fertilization (IVF) and intracytoplasmic sperm injection (ICSI) treatment is a healthy mother and a healthy child. The most important complication following IVF/ICSI arises from the increased risk of multiple pregnancies. An elective single embryo transfer (eSET) with the freezing of spare embryos and subsequent treatment with frozen embryo transfer (FET) is the only way to avoid this complication. For this reason, the number of children born after FET is steadily rising. The aim of this study was to provide more detailed evidence on the safety of FET, particularly focusing on serum hormone profiles during the first trimester weeks of singleton pregnancies after IVF/ICSI fresh embryo transfer (ET), after FET during a natural menstrual cycle, and after spontaneous conception. Another part of this study compared the perinatal outcomes, congenital anomalies (CAs), and morbidity of singletons born after FET and IVF/ICSI fresh ET. The reference group was those born after spontaneously conceived (SC) pregnancies. In the clinical prospective study, the maternal serum estradiol and progesterone levels in pregnancies after fresh ET (n=39) were higher during early pregnancy weeks than in FET (n=30) and SC pregnancies (n=41), while the hormonal profiles after FET did not differ from SC pregnancies. In the large register study, FET children (n=1830) were found to have a reduced risk for adverse perinatal outcomes, such as preterm birth, a low birthweight, and being small for their gestational age compared with children born after fresh ET (n=2942). However, FET children have an increased risk for being large for their gestational age. The major CAs and morbidity until three years of age did not differ between groups. When compared with SC children (n =31 243), the perinatal outcome was worse and the rates of CAs and morbidity were higher in FET children. The FET cycle seemed to provide a better physiological environment for early fetal development than fresh ET. Further, FET protects against some of the adverse perinatal outcomes of children when compared with fresh ET, but not when it comes to the major CAs and early somatic health. This study provides further evidence of the safety of FET in comparison with fresh ET. This information should further encourage clinicians to implement eSET combined with cryopreservation in their IVF/ICSI program. / Tiivistelmä Koeputkihedelmöityshoidon (in vitro fertilization, IVF ja intracytoplasmic sperm injection, ICSI) tavoitteena on terve äiti ja terve lapsi. Monisikiöraskaus on hoidon komplikaatio, koska siihen liittyy selkeästi kohonnut riski äidille ja lapselle. Yhden alkion siirto, jäljelle jääneiden alkioiden pakastus ja myöhemmin tehtävä pakastetun alkion siirto (PAS) ovat lisänneet IVF/ICSI-hoitojen turvallisuutta ja tehokkuutta. Täten PAS:sta syntyneiden lasten määrä kasvaa. Tutkimuksen tavoitteena on lisätä PAS-hoitojen turvallisuutta tarkastelemalla veren steroidihormonien muutoksia alkuraskaudessa naisilta, jotka olivat tulleet raskaiksi IVF/ICSI-tuorealkion siirroista, luonnollisen kuukautiskierron aikana tehdystä PAS:sta ja luonnollisesti. Lisäksi tutkimuksessa verrattiin PAS- ja IVF/ICSI-tuorealkion siirrosta alkunsa saaneiden lasten terveyttä kolmeen ikävuoteen asti. Viiteryhmän muodostivat luonnollisesti alkunsa saaneet lapset. Kliinisessä prospektiivisessa tutkimuksessa havaittiin naisilla, joilla oli tuorealkion siirrosta alkanut raskaus (n=39), merkittävästi koholla olevat seerumin estradioli- ja progesteronipitoisuudet 7-8 raskausviikolle asti verrattuna naisiin, joilla raskaudet olivat alkaneet PAS:sta (n=30) tai luonnollisesti (n=41). Vastaavasti PAS-raskauksissa hormonipitoisuudet eivät eronneet merkittävästi luonnolliseen raskauteen verrattuna. Laajassa rekisteritutkimuksessa havaittiin PAS-lapsilla (n=1830) olevan pienempi riski ennenaikaisuuteen ja pienipainoisuuteen kuin tuorealkiolapsilla (n=2942). Kuitenkin PAS-lapsilla oli lisääntynyt riski syntyä isokokoisina raskausviikkoihin nähden. Synnynnäisten epämuodostumien ja eri sairauksien esiintyvyyksissä ei ollut eroja. Luonnollisesti alkunsa saaneisiin lapsiin (n= 31 243) verrattaessa, PAS-lapsilla oli vastasyntyneisyyskaudelta lähtien enemmän terveyteen liittyviä ongelmia. Tutkimus osoitti PAS-raskaudessa sikiön kehittyvän alkuviikkoina luonnollisemmassa ympäristössä kuin tuorealkion siirtoraskaudessa. Vaikka suurin osa PAS- ja tuorealkiolapsista oli terveitä, tuorealkiolapsilla oli vastasyntyneisyyskaudella enemmän ongelmia kuin PAS-lapsilla. Muita terveyseroja lasten välillä ei todettu. Tutkimus antaa lisänäyttöä PAS hoidon turvallisuudesta. Alkion pakastamisella voidaan välttää koeputkihedelmöityshoidon riskejä pyrkimällä mahdollisimman usein yhden alkion siirtoon.

La conservation de la biodiversité génétique du cochon d’Inde (Cavia porcellus) est importante en tant qu’animal de consommation endémique de la région andine ainsi qu’en tant qu’animal modèle précieux pour la recherche biomédicale.L’objectif de ce travail était de mettre en place les protocoles qui permettront une conservation ex situ des ressources génétiques de cette espèce par la voie femelle. Les étapes nécessaires à la concrétisation d’un projet de cryobanque sont :- la maîtrise de la production d’embryons grâce à des traitements hormonaux de synchronisation du cycle œstral et de superovulation des femelles,- la cryoconservation dans l’azote liquide des embryons obtenus et leur transfert dans des femelles receveuses.Une méthode standardisée de synchronisation des chaleurs basée sur l’administration d’altrenogest per os pendant 15 jours a été définie. Les chaleurs des femelles donneuses et receveuses d’embryons apparaissent dans les 4 à 5 jours qui suivent l’arrêt du traitement de ce progestagène.Des traitements de superovulation basés sur 3 injections à 24 heures d’intervalle d’hMG, ou 6 injections à 12 heures d’intervalle de FSH-recombinante humaine, permettent une augmentation du taux d’ovulation de l’ordre de fois 3 à fois 4 par rapport à des femelles non-traitées. Toutefois les réponses au traitement restent variables et il faudra réitérer l’expérience sur de plus grands lots d’animaux afin d’ajuster les doses et les moments d’application.La méthode de congélation lente, utilisant l’éthylène glycol comme cryoprotecteur, a permis d’obtenir des taux de survie embryonnaire satisfaisants (70,3%). La méthode de vitrification a également donné de bons résultats, avec un taux de survie embryonnaire de 41,7%.Le premier transfert au monde d’embryons frais réalisé avec succès dans une femelle receveuse préalablement synchronisée a été obtenu lors de ce travail. Les transferts d’embryons décongelés n’ont pas encore donné lieu à des gestations. / The preservation of the guinea pig (Cavia porcellus) genetic biodiversity is important as a native source of protein for many highlanders in the Andean region and as a precious laboratory animal for biomedical research.The aim of this work was to establish the protocols that will enable an ex situ preservation of the genetic resources of this species by the female way.The necessary steps for the achievement of a cryobank project are:- the control of the embryo production thanks to hormonal treatments to synchronize the estrous cycles and to superovulate the females,- the cryopreservation in liquid nitrogen of the obtained embryos and their transfer into recipient females.A standard method for synchronization of heat periods based on the per os administration of altrenogest during 15 days has been defined. The heat periods of the females, donors and recipients of embryos, appears 4 to 5 days after the end of the progestagen treatment. Superovulation treatments, based on 3 injections at 24-hour intervals of hMG or 6 injections at 12-hour intervals of human recombinant-FSH, lead to an increase of the ovulation rate of about 3 to 4 times when compared to untreated females. However, the responses to the treatments remain variable and further studies involving a larger number of animals should be carried out in order to adjust the dose and the moment of application of the treatment.The slow-freezing method, using ethylene glycol as cryoprotectant, enables the attainment of a satisfactory in vitro embryo survival rate (70,3%). The vitrification method also gives good results, with a 41,7% in vitro embryo survival rate.The first successful transfer of fresh embryos into a synchronized recipient female has been achieved in this study. The transfers of frozen-thawed embryos did not yet lead to gestation.

This study has determined the cellular site of adenosine deaminase (ADA) expression in the mouse during development from Days 5 through 13 (day vaginal plug was found = Day 0) of gestation. Developmental expression of ADA progressed in two overlapping phases defined genetically (maternal vs. embryonal) and according to region (decidual vs. placental). In the first phase, ADA enzyme activity increased almost 200-fold in the antimesometrial region (decidua capsularis + giant trophoblast cells) from Days 6 through 9 of gestation but remained low in the mesometrial region. Immunohistochemical staining revealed a major localization of ADA to the secondary decidua. In the second phase, ADA activity increased several-fold in the placenta (labyrinth + basal zones) from Days 9 through 13 of gestation but remained low in the embryo proper. Immunohistochemical staining revealed a major localization of ADA to secondary giant cells, spongiotrophoblast, and labyrinthine trophoblast. Regression of decidua capsularis and growth of the spongiotrophoblast population accounted for an antimesometrial to placental shift in both ADA enzyme activity and a 40-kDa immunoreactive protein band. To verify a shift from maternal to fetal expression, studies were performed with two strains of mice (ICR, Eday) homozygous for a different ADA isozyme (ADA-A, ADA-B). Blastocysts homozygous for Adab were transferred to the uterus of pseudopregnant female recipients homozygous for Adaa. The isozymic pattern in chimeric embryo-decidual units analyzed at Days 7, 9, 11, and 13 revealed a predominance of maternal-encoded enzyme at Days 7 through 11 of gestation and a shift to fetal-encoded enzyme by Day 13. Thus, maternal expression of ADA in the antimesometrial decidua may play a role during establishment of the embryo in the uterine environment, whereas fetal expression of ADA in the trophoblast might be important to placentation.

Um Projeto Temático de Pesquisa foi desenvolvido no Laboratório de Poluição Ambiental do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo com o objetivo de avaliar os efeitos da exposição aguda/crônica ao ar ambiente de um grande centro urbano sobre a saúde. Dentro deste projeto, uma linha de pesquisa foi dedicada ao estudo dos efeitos dessa exposição sobre a saúde reprodutiva feminina. Evidências de estudos epidemiológicos e experimentais implicam os fatores ambientais na infertilidade humana e resultado obstétrico adverso. Contudo, poucos estudos foram conduzidos até o presente para avaliar um possível efeito da exposição à poluição ambiental particulada sobre a saúde reprodutiva feminina. Portanto, o objetivo dos projetos da minha linha de pesquisa é fornecer dados que possam demonstrar os possíveis efeitos da exposição pré-concepcional de curta duração às partículas de exaustão do diesel (PED) e à poluição ambiental particulada sobre a função ovariana, o desenvolvimento embrionário inicial e resultado gestacional utilizando um modelo experimental e um epidemiológico. O objetivo do primeiro projeto desta tese foi avaliar os efeitos de dois meios de cultura comerciais no desenvolvimento de oócitos de camundongo fertilizados in vitro até o estágio de blastocisto. Zigotos obtidos de fêmeas de camundongo de 8 semanas de idade submetidas à indução da ovulação foram cultivados in vitro até o estágio de blastocisto em meio simples otimizado enriquecido com potássio (KSOM) ou meio G1/G2. A porcentagem de zigotos que se desenvolveu até o estágio de blastocisto 96 e 120 horas após a inseminação e que sofreu eclosão parcial ou completa no quinto dia de cultivo foi significativamente maior no grupo KSOM. O número médio de células da massa celular interna (MCI) foi 11,7 ± 4,0 e 9,2 ± 5,2 para os zigotos cultivados nos grupos KSOM e G1/G2, respectivamente, mostrando um número significativamente maior de células MCI em blastocistos derivados da cultura no meio KSOM. Concluímos que o meio KSOM comercialmente disponível é superior ao meio seqüencial G1/G2 para o cultivo de zigotos até o estágio de blastocisto no modelo de fertilização in vitro (FIV) em camundongos. No segundo projeto que compõe esta tese, o objetivo foi avaliar os efeitos da exposição de curta duração às PED sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais utilizando o modelo de FIV em camundongo. A instilação intranasal de água destilada (grupo controle), de PED nativas (grupo PED-N) ou de PED ácidoextraídas (grupo PED-AE), realizada uma vez ao dia por três dias, iniciada no primeiro dia de administração de gonadotrofinas, foi realizada em fêmeas de camundongo com oito semanas de idade. Os pontos de avaliação reprodutivos analisados incluíram a resposta ovariana a estimulação, taxa de fertilização, desenvolvimento embrionário, taxas de formação e de eclosão dos blastocistos, contagem celular total e proporção da alocação celular à MCI e trofoectoderma (TE), e a morfologia da MCI. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariado para a exposição às PED-N e PED-AE na coloração diferencial de blastocistos e na morfologia da MCI, mas não para a FIV ou desenvolvimento embrionário, foi observado. A contagem celular da MCI e a razão MCI/TE em blastocistos produzidos no grupo controle foram significativamente maiores do que em blastocistos produzidos nos grupos PED-N e PED-AE. O número total de células dos blastocistos foi similar entre os grupos. O escore que representa a morfologia da massa celular interna foi significativamente maior no grupo controle quando comparado àquele encontrado nos grupos PED-N e PEDAE. Baseando-se nesses resultados, nosso estudo sugere que a exposição de curta duração às PED pode afetar negativamente o processo reprodutivo através do distúrbio da especificação das linhagens celulares do embrião em estágio de blastocisto. Finalmente, a exposição a toxinas ambientais pode ser inevitável durante o período pré-concepcional em grandes centros urbanos e seus efeitos são desconhecidos. Portanto, o propósito do terceiro projeto que compõe esta tese foi avaliar os potenciais efeitos da exposição de curta duração à poluição ambiental particulada durante a fase folicular sobre os resultados clínicos, laboratoriais e gestacionais de casais submetidos à fertilização in vitro e transferência de embriões (FIVETE). Trezentos e quarenta e oito mulheres submetidas ao seu primeiro ciclo de FIVETE foram avaliadas retrospectivamente neste estudo coorte, casocontrole casado. A exposição ao material particulado ambiental (MP) durante a fase folicular de cada paciente foi estimada baseando-se em dados da poluição ambiental (1997-2006) categorizados em período Q1-3 ( 56,72 g/m3) e Q4 (>56,72 g/m3). Desse grupo, 177 pacientes que engravidaram (casos) foram comparadas com 354 mulheres que conceberam espontaneamente (controles). Os principais pontos de avaliação incluíram a resposta ovariana às gonadotrofinas, o número de oócitos recuperados e as taxas de fertilização, de clivagem, de qualidade embrionária, de implantação, de gestação, de abortamento e de nascidos vivos. Nenhum efeito da exposição a níveis elevados de MP durante a fase folicular foi observado nos resultados clínico e laboratorial, na transferência embrionária ou no sucesso dos ciclos de tratamento das pacientes submetidas à FIVETE. Mulheres expostas ao período Q4 durante a fase folicular do ciclo de concepção apresentaram um risco significativamente maior de abortamento, independentemente do método de concepção (razão de chance: 2,58; intervalo de confiança de 95%: 1,63 4,07), quando comparado àquele de mulheres expostas ao período Q1-3. O risco de perda da gestação aumentou 3% por unidade de aumento do valor médio do MP na fase folicular (p= 0,000). Os resultados apresentados aqui fornecem evidências para uma relação causal entre a breve exposição a níveis elevados de MP ambiente durante o período pré-concepcional e a perda gestacional inicial, independentemente do método de concepção e está associada a um aumento de 2,6 vezes no risco de abortamento. Apesar da ausência de efeitos dessa exposição sobre os resultados clínicos e laboratoriais e sobre o sucesso do tratamento, a FIVETE foi incapaz de reduzir esse risco / A thematic research project to evaluate the health effects of acute/chronic exposure to ambient air in a large urban center was developed at the Air Pollution Laboratory in the Department of Pathology at the University of São Paulo School of Medicine. Within this project a specific research line was committed to the study of the effects of this exposure on female reproductive health. Evidence from epidemiological and experimental studies implied environmental factors as possible contributors to human infertility and poor obstetric outcome. However, very few studies evaluating a possible effect of exposure to particulate air pollution on female reproductive health have been conducted so far. Thus, the aim of the projects in my research line was to provide data that could show the possible effects of short-term preconceptional exposure to diesel exhaust particles and particulate air pollution on ovarian function, early embryo development and pregnancy outcome using experimental and epidemiological models. The objective of the first project was to examine the effects of two commercial media on the development of mouse ova fertilized in vitro to the blastocyst stage. One-cell embryos obtained from eight-week old superovulated mice were cultured in vitro up to the blastocyst stage in potassium-enriched simplex optimized medium (KSOM) or G1/G2 media. The percentage of zygotes that developed to the blastocyst stage 96 and 120 hours after insemination and that partially or completely hatched by day five of culture was significantly higher in the KSOM group. The mean number of inner cell mass (ICM) cells was 11.7 ± 4.0 and 9.2 ± 5.2 for zygotes cultured in KSOM and G1/G2 groups respectively, revealing a significantly higher cell number in the ICM of blastocysts derived from culture in KSOM medium. I concluded that commercially available KSOM medium is superior to sequential G1/G2 media for culturing one-cell embryos up to the blastocyst stage in the mouse IVF model. In the second project the objective was to evaluate the effects of short-term exposure to diesel exhaust particles on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts using the mouse IVF model. Intranasal instillation of distilled water (control group), native diesel exhaust particles (N-DEP group) or acid-extracted diesel exhaust particles (AE-DEP) once a day, for three days starting on the first day of gonadotrophin administration was performed on eight-week old female mice. Reproductive endpoints evaluated included ovarian response to superovulation, fertilization rate, embryo development, blastocyst and hatching rates, total cell count, and proportion of cell allocation to ICM and trophectoderm (TE), and ICM morphology. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for exposure to NDEP and AE-DEP on blastocyst differential staining and ICM morphology but not on IVF or embryo development was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the control group were significantly higher than in blastocysts produced in N-DEP and AE-DEP groups. The total cell count was similar among groups. The score that represents ICM morphology was significantly higher in the control group when compared to that found in N-DEP and AE-DEP groups. Based on these results this study suggests that short-term exposure to DEP may negatively affect the reproductive process by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage. Finally, exposure to environmental toxins may be unavoidable during the preconceptional period in large urban centers and its effects are unknown. Thus, the purpose of the third project was to assess the potential effects of short-term exposure to particulate air pollution during the follicular phase on clinical, laboratory, and pregnancy outcomes for couples undergoing IVF/ET. Three hundred forty-eight patients undergoing their first IVF/ET cycle were evaluated in this retrospective cohort-matched casecontrolled single-center study. Exposure to ambient particulate matter (PM) during the follicular phase for each patient was estimated based on air pollution data (1997-2006) categorized in Q1-3 ( 56.72 g/m3) and Q4 (>56.72 g/m3) periods. From this group 177 women who became pregnant (cases) were compared with 354 who had conceived spontaneously (controls). Main outcome measures included response to gonadotrophins, number of oocytes retrieved, fertilization, cleavage, embryo quality, implantation, pregnancy, miscarriage, and live birth rates. No effects of follicular phase exposure to high levels of PM on clinical, laboratory, embryo transfer or treatment outcome were found in women undergoing IVF/ET. Women exposed to Q4 level PM during the follicular phase of the conception cycle had significantly higher risk of miscarriage, regardless of the method of conception (odds ratio, 2.58; 95% confidence interval: 1.63-4.07) when compared to women exposed to Q1-3 level PM. The risk of miscarriage increased 3% per unit increase in follicular phase PM average level (p=0.000). The results presented here provide evidence of a causal role for brief exposure to high levels of ambient PM during the preconceptional period in early pregnancy loss, regardless of the method of conception, with a 2.6-fold increase in risk of miscarriage. Despite the absence of effects of this exposure on clinical, laboratory, and treatment outcome, IVF/ET was unable to reduce this risk

Os perfis longitudinais dos metabólitos dos esteróides sexuais, progesterona e estrógenos, e dos glicocorticóides foram analisados para 22 eventos (gestação, parto e lactação) de 8 jaguatiricas mantidas em cativeiro. Três eventos foram oriundos da Transferência de Embrião (TE) e foram comparados àquelas que gestaram por fertilização natural. As análises estatísticas demonstraram haver diferenças altamente significativas para metabólitos de progesterona na fase inicial (P<0001) e média (P< 0,007) da gestação, bem como, no período da lactação (P<0,0015). As análises descritivas sugeriram uma atividade ovariana para a espécie no período de lactação, uma vez detectado picos de metabólitos de estrógenos para alguns eventos. Foi realizado ainda, um estudo do comportamento materno de 3 fêmeas através do sistema de vídeo-monitoramento dos primeiros meses da lactação (n=3989,5 horas observadas). A espécie em cativeiro despendeu mais tempo cuidando do seu filhote e descansando durante o dia, entrando na caixa de abrigo entre 5:00h e 8:00h (61,3%) e nela permanecendo por um tempo médio de 8 horas seguidas. Outras análises comportamentais sugerem que o estresse é um fator preponderante na determinação do sucesso da criação do filhote. A variável comportamental executada pela fêmea de entrar e sair da caixa por repetidas vezes foi associada ao estresse, sendo possível avaliar a resposta da adrenal pela secreção dos glicocorticóides e realizar sua validação fisiologicamente. Espera-se desta forma, contribuir para uma mudança no quadro bastante crítico da população em cativeiro, considerando a baixa taxa de natalidade e a alta taxa de mortalidade dos filhotes, principalmente, no seu primeiro mês de vida. / The longitudinal profiles of the sexual steroid\'s metabolites, progesterone and estrogen, and glucocorticoids were analyzed for 22 events (pregnancy, birth and breastfeeding) of 8 ocelots kept in captivity. Three events came from the Embryo Transfer (TE) and were compared against the ones that were gestated by natural fertilization. The statistical analysis demonstrated that the differences were highly significative during the initial (P<0001) and middle stages (P< 0,007) of pregnancy and lactation (P<0,0015) periods for the progesterone metabolites. The descriptive analysis suggests a ovarian activity for the species during the lactation period, once detected the estrogen metabolites peaks during some events. A study was also performed, concerning the maternal behavior of 3 female through video-monitoring of the first months of lactation (n=3989,5 hours observed). The species that were kept in captivity spent more time resting and caring the puppy, entering it\'s shelter between 5:00h and 8:00h (61,3%) and there staying during 8 hours average. Other behavior analysis suggests that the stress level is a predominant fact in the success of the establishment of the puppy. A behavior variable performed by the female, by entering the shelter for a repeated number of times was linked to the stress level, being possible to assess the adrenal response by the secretion of glucorticoids and perform it\'s phisiological validation. It is expected by this means, a contribution for a change in the critical scene of the population that is kept in captivity, considering the puppies\' low birth rate and high mortality rate, specially during it\'s first months.

Um Projeto Temático de Pesquisa foi desenvolvido no Laboratório de Poluição Ambiental do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo com o objetivo de avaliar os efeitos da exposição aguda/crônica ao ar ambiente de um grande centro urbano sobre a saúde. Dentro deste projeto, uma linha de pesquisa foi dedicada ao estudo dos efeitos dessa exposição sobre a saúde reprodutiva feminina. Evidências de estudos epidemiológicos e experimentais implicam os fatores ambientais na infertilidade humana e resultado obstétrico adverso. Contudo, poucos estudos foram conduzidos até o presente para avaliar um possível efeito da exposição à poluição ambiental particulada sobre a saúde reprodutiva feminina. Portanto, o objetivo dos projetos da minha linha de pesquisa é fornecer dados que possam demonstrar os possíveis efeitos da exposição pré-concepcional de curta duração às partículas de exaustão do diesel (PED) e à poluição ambiental particulada sobre a função ovariana, o desenvolvimento embrionário inicial e resultado gestacional utilizando um modelo experimental e um epidemiológico. O objetivo do primeiro projeto desta tese foi avaliar os efeitos de dois meios de cultura comerciais no desenvolvimento de oócitos de camundongo fertilizados in vitro até o estágio de blastocisto. Zigotos obtidos de fêmeas de camundongo de 8 semanas de idade submetidas à indução da ovulação foram cultivados in vitro até o estágio de blastocisto em meio simples otimizado enriquecido com potássio (KSOM) ou meio G1/G2. A porcentagem de zigotos que se desenvolveu até o estágio de blastocisto 96 e 120 horas após a inseminação e que sofreu eclosão parcial ou completa no quinto dia de cultivo foi significativamente maior no grupo KSOM. O número médio de células da massa celular interna (MCI) foi 11,7 ± 4,0 e 9,2 ± 5,2 para os zigotos cultivados nos grupos KSOM e G1/G2, respectivamente, mostrando um número significativamente maior de células MCI em blastocistos derivados da cultura no meio KSOM. Concluímos que o meio KSOM comercialmente disponível é superior ao meio seqüencial G1/G2 para o cultivo de zigotos até o estágio de blastocisto no modelo de fertilização in vitro (FIV) em camundongos. No segundo projeto que compõe esta tese, o objetivo foi avaliar os efeitos da exposição de curta duração às PED sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais utilizando o modelo de FIV em camundongo. A instilação intranasal de água destilada (grupo controle), de PED nativas (grupo PED-N) ou de PED ácidoextraídas (grupo PED-AE), realizada uma vez ao dia por três dias, iniciada no primeiro dia de administração de gonadotrofinas, foi realizada em fêmeas de camundongo com oito semanas de idade. Os pontos de avaliação reprodutivos analisados incluíram a resposta ovariana a estimulação, taxa de fertilização, desenvolvimento embrionário, taxas de formação e de eclosão dos blastocistos, contagem celular total e proporção da alocação celular à MCI e trofoectoderma (TE), e a morfologia da MCI. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariado para a exposição às PED-N e PED-AE na coloração diferencial de blastocistos e na morfologia da MCI, mas não para a FIV ou desenvolvimento embrionário, foi observado. A contagem celular da MCI e a razão MCI/TE em blastocistos produzidos no grupo controle foram significativamente maiores do que em blastocistos produzidos nos grupos PED-N e PED-AE. O número total de células dos blastocistos foi similar entre os grupos. O escore que representa a morfologia da massa celular interna foi significativamente maior no grupo controle quando comparado àquele encontrado nos grupos PED-N e PEDAE. Baseando-se nesses resultados, nosso estudo sugere que a exposição de curta duração às PED pode afetar negativamente o processo reprodutivo através do distúrbio da especificação das linhagens celulares do embrião em estágio de blastocisto. Finalmente, a exposição a toxinas ambientais pode ser inevitável durante o período pré-concepcional em grandes centros urbanos e seus efeitos são desconhecidos. Portanto, o propósito do terceiro projeto que compõe esta tese foi avaliar os potenciais efeitos da exposição de curta duração à poluição ambiental particulada durante a fase folicular sobre os resultados clínicos, laboratoriais e gestacionais de casais submetidos à fertilização in vitro e transferência de embriões (FIVETE). Trezentos e quarenta e oito mulheres submetidas ao seu primeiro ciclo de FIVETE foram avaliadas retrospectivamente neste estudo coorte, casocontrole casado. A exposição ao material particulado ambiental (MP) durante a fase folicular de cada paciente foi estimada baseando-se em dados da poluição ambiental (1997-2006) categorizados em período Q1-3 ( 56,72 g/m3) e Q4 (>56,72 g/m3). Desse grupo, 177 pacientes que engravidaram (casos) foram comparadas com 354 mulheres que conceberam espontaneamente (controles). Os principais pontos de avaliação incluíram a resposta ovariana às gonadotrofinas, o número de oócitos recuperados e as taxas de fertilização, de clivagem, de qualidade embrionária, de implantação, de gestação, de abortamento e de nascidos vivos. Nenhum efeito da exposição a níveis elevados de MP durante a fase folicular foi observado nos resultados clínico e laboratorial, na transferência embrionária ou no sucesso dos ciclos de tratamento das pacientes submetidas à FIVETE. Mulheres expostas ao período Q4 durante a fase folicular do ciclo de concepção apresentaram um risco significativamente maior de abortamento, independentemente do método de concepção (razão de chance: 2,58; intervalo de confiança de 95%: 1,63 4,07), quando comparado àquele de mulheres expostas ao período Q1-3. O risco de perda da gestação aumentou 3% por unidade de aumento do valor médio do MP na fase folicular (p= 0,000). Os resultados apresentados aqui fornecem evidências para uma relação causal entre a breve exposição a níveis elevados de MP ambiente durante o período pré-concepcional e a perda gestacional inicial, independentemente do método de concepção e está associada a um aumento de 2,6 vezes no risco de abortamento. Apesar da ausência de efeitos dessa exposição sobre os resultados clínicos e laboratoriais e sobre o sucesso do tratamento, a FIVETE foi incapaz de reduzir esse risco / A thematic research project to evaluate the health effects of acute/chronic exposure to ambient air in a large urban center was developed at the Air Pollution Laboratory in the Department of Pathology at the University of São Paulo School of Medicine. Within this project a specific research line was committed to the study of the effects of this exposure on female reproductive health. Evidence from epidemiological and experimental studies implied environmental factors as possible contributors to human infertility and poor obstetric outcome. However, very few studies evaluating a possible effect of exposure to particulate air pollution on female reproductive health have been conducted so far. Thus, the aim of the projects in my research line was to provide data that could show the possible effects of short-term preconceptional exposure to diesel exhaust particles and particulate air pollution on ovarian function, early embryo development and pregnancy outcome using experimental and epidemiological models. The objective of the first project was to examine the effects of two commercial media on the development of mouse ova fertilized in vitro to the blastocyst stage. One-cell embryos obtained from eight-week old superovulated mice were cultured in vitro up to the blastocyst stage in potassium-enriched simplex optimized medium (KSOM) or G1/G2 media. The percentage of zygotes that developed to the blastocyst stage 96 and 120 hours after insemination and that partially or completely hatched by day five of culture was significantly higher in the KSOM group. The mean number of inner cell mass (ICM) cells was 11.7 ± 4.0 and 9.2 ± 5.2 for zygotes cultured in KSOM and G1/G2 groups respectively, revealing a significantly higher cell number in the ICM of blastocysts derived from culture in KSOM medium. I concluded that commercially available KSOM medium is superior to sequential G1/G2 media for culturing one-cell embryos up to the blastocyst stage in the mouse IVF model. In the second project the objective was to evaluate the effects of short-term exposure to diesel exhaust particles on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts using the mouse IVF model. Intranasal instillation of distilled water (control group), native diesel exhaust particles (N-DEP group) or acid-extracted diesel exhaust particles (AE-DEP) once a day, for three days starting on the first day of gonadotrophin administration was performed on eight-week old female mice. Reproductive endpoints evaluated included ovarian response to superovulation, fertilization rate, embryo development, blastocyst and hatching rates, total cell count, and proportion of cell allocation to ICM and trophectoderm (TE), and ICM morphology. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for exposure to NDEP and AE-DEP on blastocyst differential staining and ICM morphology but not on IVF or embryo development was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the control group were significantly higher than in blastocysts produced in N-DEP and AE-DEP groups. The total cell count was similar among groups. The score that represents ICM morphology was significantly higher in the control group when compared to that found in N-DEP and AE-DEP groups. Based on these results this study suggests that short-term exposure to DEP may negatively affect the reproductive process by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage. Finally, exposure to environmental toxins may be unavoidable during the preconceptional period in large urban centers and its effects are unknown. Thus, the purpose of the third project was to assess the potential effects of short-term exposure to particulate air pollution during the follicular phase on clinical, laboratory, and pregnancy outcomes for couples undergoing IVF/ET. Three hundred forty-eight patients undergoing their first IVF/ET cycle were evaluated in this retrospective cohort-matched casecontrolled single-center study. Exposure to ambient particulate matter (PM) during the follicular phase for each patient was estimated based on air pollution data (1997-2006) categorized in Q1-3 ( 56.72 g/m3) and Q4 (>56.72 g/m3) periods. From this group 177 women who became pregnant (cases) were compared with 354 who had conceived spontaneously (controls). Main outcome measures included response to gonadotrophins, number of oocytes retrieved, fertilization, cleavage, embryo quality, implantation, pregnancy, miscarriage, and live birth rates. No effects of follicular phase exposure to high levels of PM on clinical, laboratory, embryo transfer or treatment outcome were found in women undergoing IVF/ET. Women exposed to Q4 level PM during the follicular phase of the conception cycle had significantly higher risk of miscarriage, regardless of the method of conception (odds ratio, 2.58; 95% confidence interval: 1.63-4.07) when compared to women exposed to Q1-3 level PM. The risk of miscarriage increased 3% per unit increase in follicular phase PM average level (p=0.000). The results presented here provide evidence of a causal role for brief exposure to high levels of ambient PM during the preconceptional period in early pregnancy loss, regardless of the method of conception, with a 2.6-fold increase in risk of miscarriage. Despite the absence of effects of this exposure on clinical, laboratory, and treatment outcome, IVF/ET was unable to reduce this risk

Os perfis longitudinais dos metabólitos dos esteróides sexuais, progesterona e estrógenos, e dos glicocorticóides foram analisados para 22 eventos (gestação, parto e lactação) de 8 jaguatiricas mantidas em cativeiro. Três eventos foram oriundos da Transferência de Embrião (TE) e foram comparados àquelas que gestaram por fertilização natural. As análises estatísticas demonstraram haver diferenças altamente significativas para metabólitos de progesterona na fase inicial (P<0001) e média (P< 0,007) da gestação, bem como, no período da lactação (P<0,0015). As análises descritivas sugeriram uma atividade ovariana para a espécie no período de lactação, uma vez detectado picos de metabólitos de estrógenos para alguns eventos. Foi realizado ainda, um estudo do comportamento materno de 3 fêmeas através do sistema de vídeo-monitoramento dos primeiros meses da lactação (n=3989,5 horas observadas). A espécie em cativeiro despendeu mais tempo cuidando do seu filhote e descansando durante o dia, entrando na caixa de abrigo entre 5:00h e 8:00h (61,3%) e nela permanecendo por um tempo médio de 8 horas seguidas. Outras análises comportamentais sugerem que o estresse é um fator preponderante na determinação do sucesso da criação do filhote. A variável comportamental executada pela fêmea de entrar e sair da caixa por repetidas vezes foi associada ao estresse, sendo possível avaliar a resposta da adrenal pela secreção dos glicocorticóides e realizar sua validação fisiologicamente. Espera-se desta forma, contribuir para uma mudança no quadro bastante crítico da população em cativeiro, considerando a baixa taxa de natalidade e a alta taxa de mortalidade dos filhotes, principalmente, no seu primeiro mês de vida. / The longitudinal profiles of the sexual steroid\'s metabolites, progesterone and estrogen, and glucocorticoids were analyzed for 22 events (pregnancy, birth and breastfeeding) of 8 ocelots kept in captivity. Three events came from the Embryo Transfer (TE) and were compared against the ones that were gestated by natural fertilization. The statistical analysis demonstrated that the differences were highly significative during the initial (P<0001) and middle stages (P< 0,007) of pregnancy and lactation (P<0,0015) periods for the progesterone metabolites. The descriptive analysis suggests a ovarian activity for the species during the lactation period, once detected the estrogen metabolites peaks during some events. A study was also performed, concerning the maternal behavior of 3 female through video-monitoring of the first months of lactation (n=3989,5 hours observed). The species that were kept in captivity spent more time resting and caring the puppy, entering it\'s shelter between 5:00h and 8:00h (61,3%) and there staying during 8 hours average. Other behavior analysis suggests that the stress level is a predominant fact in the success of the establishment of the puppy. A behavior variable performed by the female, by entering the shelter for a repeated number of times was linked to the stress level, being possible to assess the adrenal response by the secretion of glucorticoids and perform it\'s phisiological validation. It is expected by this means, a contribution for a change in the critical scene of the population that is kept in captivity, considering the puppies\' low birth rate and high mortality rate, specially during it\'s first months.

The subject of the following dissertation, as the title states, is to explore legal and ethical aspects of the protection of human life and its dignity. Its aim is not merely to attempt to map the present legal situation regarding the protection of human life in the legal system of the Czech Republic, but also to outline some philosophical and anthropological implications which could have considerable influence on the practical consequences of some legal measures, including general aspects of the protection of human life and the legal regulation of two areas of study chosen by the author, namely assisted reproduction and euthanasia. In this sense the following work does not simply describe the various philosophical- anthropological conceptions in a neutral way, but offers to the reader a possible model which, in the view of the author, best corresponds to the degree of protection that human life and dignity can claim in early and terminal phases, taking a neoscholastic and personalistic view of man and his ontological status, in order to try to deduce from this model ethical implications both in a general sense and in relation to the two above-mentioned areas of application. The aim of the work is thus not only to describe the degree of protection of human life de lege lata, but also by making comparisons...