La sclérose en plaques (SEP) est caractérisée par des infiltrations périvasculaires de cellules immunitaires et par de la démyélinisation au sein du système nerveux central (SNC). Ces deux paramètres de la maladie sont associés à la fragilisation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). En ce sens, le recrutement des cellules présentatrices d’antigène (CPA) myéloïdes, telles que les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques, dans le SNC à travers la BHE, est une étape cruciale dans l’initiation et la persistance de l’inflammation cérébrale. Nerve injury-induced protein (Ninjurin)-1 est une nouvelle molécule d’adhérence qui médie une interaction de type homophilique et dont l’expression sur l’endothélium vasculaire de la BHE humaine fut identifiée grâce à une analyse protéomique des protéines associées à la BHE. Les résultats présentés dans ce mémoire montrent que l’expression de Ninjurin-1 augmente dans un contexte inflammatoire dans les cultures primaires de cellules endothéliales de la BHE (CE-BHE) et sur les CPA myéloïdes humaines ex vivo et générées in vitro. De plus, les CPA infiltrantes retrouvées dans les lésions cérébrales de patients atteints de SEP et dans le SNC des souris atteintes d’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE), le modèle murin de la SEP, expriment de hauts niveaux de Ninjurin-1. À l’aide du modèle in vitro de la BHE, la neutralisation de Ninjurin-1 restreint spécifiquement la migration des monocytes à travers les CE-BHE sans affecter le recrutement des lymphocytes, ni la perméabilité des CE-BHE. Enfin, les souris atteintes d’EAE et traitées avec un peptide bloquant dirigé contre Ninjurin-1 présentent une maladie moins sévère ainsi qu’une diminution des CPA infiltrant le SNC et ce comparé au groupe contrôle. Ces résultats suggèrent que Ninjurin-1 est une molécule d’adhérence de la BHE impliquée dans le recrutement de CPA myéloïdes au sein du SNC et qu’elle peut être considérée comme une cible thérapeutique potentielle en SEP. / Multiple Sclerosis (MS) is characterized by perivascular infiltrations of immune cells and by demyelination in the central nervous system (CNS). These two hallmarks of the disease are associated with the disruption of the blood-brain barrier (BBB). The recruitment of monocytes, macrophages and dendritic cells, the so-called myeloid antigen-presenting cells (APCs), in the CNS through the BBB is thought to play a crucial role in the initiation and the persistence of the disease. Therefore the identification of the molecular mechanisms involved in the migration of myeloid APCs into the CNS is considered a valid therapeutic option in MS. Nerve injury-induced protein (Ninjurin)-1, a novel adhesion molecule that mediates homophilic binding, was found to be expressed in the vascular endothelium of the BBB following a proteomic screen of human BBB-associated proteins. Ninjurin-1’s expression increases during an inflammatory context in primary cultures of endothelial cells of the BBB (BBB-ECs) and on ex vivo and in vitro generated myeloid APCs. In addition, infiltrating APCs in human MS lesions and in the CNS of the murine model of MS, the mice affected with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), express high levels of Ninjurin-1. Using an experimental model of the BBB, the neutralization of Ninjurin-1 specifically restricts the migration of monocytes across the BBB-ECs without affecting the recruitment of lymphocytes or the permeability of the BBB-ECs. Finally, EAE mice treated with a Ninjurin-1 blocking peptide have reduced disease severity and a reduced infiltration of myeloid APCs in the CNS, as compared to the control group. Our results show that Ninjurin-1 is an adhesion molecule of the BBB involved in the recruitment of myeloid APCs to the CNS and is also a potential therapeutic target to dampen CNS inflammatory processes, as occurs in MS.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire du système nerveux central (SNC) caractérisée par une infiltration périvasculaire de cellules mononucléaires, telles que les lymphocytes T CD4+ et CD8+, les lymphocytes B ainsi que les cellules myéloïdes qui comprend les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs). Ce phénomène d’infiltration est dû à une fragilisation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’entrée des cellules immunitaires au SNC va mener à la destruction de la gaine de myéline et donc à l’apparition de plaques de démyélinisation. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que la migration des divers sous-types de cellules immunitaires du sang périphérique à travers la BHE est contrôlée par des mécanismes moléculaires distincts et spécifiques à chaque type cellulaire. Afin de répondre à cette hypothèse, quatre différentes études ont été mises sur pieds. En premier lieu, nous démontrons un effet bénéfique des statines sur la BHE en SEP, en diminuant la migration des lymphocytes T et des monocytes, et en diminuant la diffusion de marqueurs moléculaire soluble. Ce phénomène s’opère via la suppression du processus d’isoprenylation, et en empêchant probablement la contraction des cellules endothéliales de la BHE. De plus, nous démontrons que les monocytes qui migrent au SNC en condition inflammé sont en mesures de se différencier en DCs et d’induire une réponse inflammatoire de la part des lymphocytes T CD4+. La migration des monocytes à travers la BHE est contrôlée par une nouvelle molécule d’adhérence nommée Ninjurin-1. Le blocage de Ninjurin-1 conduit à une inhibition spécifique de la migration des monocytes in vitro, ainsi qu’à une amélioration des signes cliniques du modèle animal de la SEP, soit l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Finalement, nous démontrons que la migration des lymphocytes T CD8+ au SNC s’effectue via l’intégrine alpha-4. De plus, la majorité des lymphocytes T CD8+ que l’on retrouve dans le liquide céphalo-rachidien de patients SEP, dans le SNC de souris EAE ainsi que dans le SNC de souris infectée au virus de l’hépatite murine portent un phénotype effecteur mémoire. Ces données pourraient expliquer l’émergence de leucoencéphalopathie multifocale progressive observée chez certains patients SEP traités au natalizumab, un anticorps dirigé contre l’intégrine alpha-4. En conclusion, notre étude a permis de démontrer l’importance des monocytes provenant de la périphérie dans le processus inflammatoire prenant part au SNC en SEP. L’inhibition d’entrée de ces cellules pourrait s’avérer bénéfique en SEP tout en permettant l’immuno-surveillance du cerveau, ce que l’anti-alpha-4 intégrine ne permet pas. Les statines pourraient s’avérer une autre option intéressante puisqu’elles agissent sur les processus inflammatoires impliqués dans la SEP. / Multiple sclerosis (MS) is an immune-mediated disorder of the central nervous system (CNS) characterized by multifocal areas of leukocyte infiltration and demyelination associated with a breakdown of the blood-brain barrier (BBB). Typically, demyelination is centered around perivascular accumulation of CD4+ and CD8+ T lymphocytes, monocytes, macrophages and dendritic cells (DCs) that arise from migration of peripheral blood immune cells across the CNS microvascular endothelium. We have thus suggested that the migration across the BBB of immune cells subsets from the blood is controlled by molecular mechanism specific for each cell type. To answer this hypothesize, we have performed four different studies. We first show a beneficial effect of statins on the BBB, restricting the migration of lymphocytes and monocytes as well as the diffusion of soluble molecular tracers. This phenomenon is mediated through abrogation of isoprenylation processes that is probably inhibiting the ability of endothelial cells of the BBB to contract. We also show that CD14+ monocytes migrate across the inflamed human blood BBB and differentiate into DCs in response to BBB-secreted TGF-beta and GM-CSF. These DCs then promote the proliferation and expansion of inflammatory CD4+ T lymphocytes. We demonstrate that the migration of monocytes is controlled by a new adhesion molecule called Ninjurin-1. Ninjurin-1 neutralization specifically abrogated the adhesion and migration of human monocytes across endothelial cells of the BBB, without affecting lymphocyte recruitment. Moreover, Ninjurin-1 blockade reduced clinical disease activity and histopathological indices of experimental allergic encephalomyelitis (EAE). Finally we show that migration of CD8+ T lymphocytes across BBB is dependent on alpha-4 integrin. Also, the majority of CD8+ T lymphocytes found in the cerebrospinal fluid of MS patients, and in the CNS of EAE mice as well as the CNS of mouse infected with hepatitis virus are showing an effector memory phenotype. These data could explain the numerous cases of progressive multifocal leukoencephalopathy seen in natalizumab treated MS patients. In conclusion, our study unveils an important role of peripheral monocytes in MS. The inhibition of migration of these cells to the CNS could be a beneficial therapy since it would allow immune surveillance of the brain. The statins could also be a very interesting option since these molecules would reduce the inflammatory processes involved in MS.

La sclérose en plaques est une maladie neuroinflammatoire idiopathique caractérisée par la formation de lésions focales de démyélinisation, qui apparaissent suite à l’infiltration périvasculaire de cellules immunitaires et à l’augmentation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle animal de cette maladie. Cependant, ce modèle présente des différences importantes avec la sclérose en plaques. L’objectif de ce projet de maîtrise était d’approfondir la caractérisation d’un nouveau modèle transgénique d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale spontanée, le modèle TCR1640, afin de valider celui-ci pour l’étude des phénomènes physiopathologiques qui surviennent à différents stades de la sclérose en plaques, ainsi que pour le développement de nouveaux traitements de la maladie. La souris TCR1640 porte un récepteur des cellules T (TCR) transgénique autoréactif, qui reconnaît un peptide de la myéline et déclenche une réaction auto-immune contre la myéline endogène au sein du système nerveux central (SNC). Des observations faites in situ et in vitro ont permis d’identifier des changements qui surviennent de façon très précoce dans l’unité neurovasculaire chez les animaux TCR1640 présymptomatiques, et qui sont liés à la présence d’un profil immunitaire périphérique proinflammatoire. Lors des phases actives de l’EAE spontanée, les animaux TCR1640 au stade chronique présentent une inflammation accrue du système nerveux central associée à une infiltration leucocytaire massive, par rapport aux animaux au stade aigu de la maladie. Une étude in vivo a également permis de moduler la maladie développée par des animaux ayant subi une immunisation passive avec des cellules T auxiliaires en provenance de souris TCR1640. Enfin, l’implication de nouvelles molécules d’adhésion cellulaire dans le développement et le maintien de l’EAE spontanée a été suggérée par des observations in vitro. L’ensemble de ces résultats suggère que le modèle TCR1640 présente plusieurs avantages pour l’étude de la physiopathologie de maladies neuroinflammatoires telles que la sclérose en plaques, et servira d’outil afin de valider de nouvelles stratégies thérapeutiques. / Multiple sclerosis is an idiopathic inflammatory disease of the central nervous system. It is characterized by the formation of focal perivascular lesions and demyelination of the surrounding area, which appear concomitantly to a massive immune cell infiltration and disruption of the blood brain barrier. Experimental autoimmune encephalomyelitis is the animal model most extensively used for the study of multiple sclerosis. Unfortunately, this model does not mimic many aspects of the human disease. The goal of this project is to further the characterization of a new transgenic model of spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis, the TCR1640 model, and to validate it as a relevant tool for the study of multiple sclerosis physiopathology and treatment. The TCR1640 mouse possesses a transgenic T cell receptor which recognizes a myelin peptide and triggers an autoimmune response against endogenous myelin in the central nervous system. In situ and in vitro observations have led to the identification of early changes which appear at the neurovascular unit in presymptomatic TCR1640 animals. This early disruption of blood brain barrier homeostasis is linked to the establishment of a proinflammatory immune profile in the periphery. Animals at the chronic stage show sustained inflammation of the central nervous system parenchyma and massive leukocyte infiltration, compared to animals in acute phase of disease. An in vivo experiment has allowed modulating the disease by treatment with a multiple sclerosis-approved therapy, in wild type mice which had received reactivated CD4+ T cells from TCR1640 animals. Finally, the implication of new cell adhesion molecules in the development and maintenance of spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis has been suggested by in vitro study of melanoma cell adhesion molecule (CD146) and activated leucocyte cell adhesion molecule (CD166). The results obtained in this study suggest that the TCR1640 model is a valuable asset in the study of neuroimmune diseases such as multiple sclerosis. It could also be used to validate new therapeutic strategies for the treatment of this disease.

Made available in DSpace on 2015-06-26T13:08:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 stella_aparecida_iff_mest_2013.pdf: 2260165 bytes, checksum: eb12d331363220960351de6e8f16c16d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Saúde da Mulher, da Criança e do Adolescente Fernandes Figueira. Departamento de Ensino. Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e da Mulher. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As lesões tumefativas desmielinizantes (LTD) do SNC apresentam extrema dificuldade diagnóstica em virtude da similaridade clínica e radiológica com outras entidades nosológicas, incluindo doenças neoplásicas, inflamatórias e infecciosas. Frequentemente, o caráter indefinido das lesões aponta para a necessidade de biópsia cerebral com alto risco de morbidade. Portanto, o reconhecimento das características neurorradiológicas da LTD é fundamental para evitar a utilização de procedimentos invasivos. Na prática clínica, os exemplos das formas tumefativas não tumorais são os seguintes: esclerose múltipla (EM), neuromielite óptica (NMO), doença de Schilder e encefalomielite agudadisseminada (ADEM).Objetivo e Métodos: Analisar, através de revisão sistemática da literatura, quais ferramentas diagnósticas clínicas, radiológicas e laboratoriais são utilizadas pelos autores na investigação da etiologia das LTDs do SNC na infância.Resultados: As doenças desmielinizantes encontradas foram as seguintes: EM em 36% dos casos; LTD, sem classificação específica, em 27%; ADEM 17%;doença de Schilder 13 % e NMO 7%. De todos os casos estudados, em 45% houve recorrência de eventos desmielinizantes. Não há protocolo definido em relação aos tipos de exame solicitados nem a sequência apropriada ou oportunidade de indicá-los. Os exames mais realizados pelos autores foram os seguintes: RM de crânio, exame histopatológico, pesquisa de bandas oligoclonais e índice de IgG no líquor, RM de coluna e pesquisa de anticorpo antiaquaporina 4. Conclusão: A análise da literatura mostra que os dados mais relevantes para se definir o diagnóstico das LTDs são obtidos através da história e evolução clínica dos pacientes, e exames de neuroimagem; é fundamental que pacientes portadores de LTD sejam acompanhados a médio/longo prazo na tentativa de aumentar as possibilidades diagnósticas; não existe protocolo universal de abordagem das LTDs; há necessidade incondicional de implementação de fluxo de procedimentos capazes de orientar o diagnóstico das LTDs na infância e adolescência. / Introduction: The tumefactive demyelinating lesions (TDL) of the CNS have extremely difficult diagnosis due to the clinical and radiological similarity with other nosological entities, including neoplastic, inflammatory and infectious diseases. Commonly, the undefined character of the lesions points to the need of brain biopsy with high risk of morbidity. Thus, the recognition of neuroradiological characteristics of the TDL is critical to avoid the use of invasive procedures. In the clinical practice, the examples of the non tumorous forms of tumefactive lesions are the following: multiple sclerosis (MS), optic neuromyelitis (ONM), Schilder`s disease and acute disseminated encephalomyelitis (ADEM). Objective and Methods: Analysis, through the systematic review of the literature, which clinic, radiological and laboratorial diagnostic tools are used by the authors in the investigation of the etiology of the TDL`s of the CNS in the childhood. Results: The following demyelinating diseases have been found: MS in 36% of the cases; TDL without a specific classification in 27%; ADEM 17%;Schilder`s disease 13 % and ONM 7%. Considering all the cases studied, in 45% had recurrence of demyelinating events. There is no defined protocol with respect to the types with medical exams requested neither the appropriate sequence or the opportunity of indicate them. The medical exams more conducted by the authors were the following: MRI of skull,histopathological exam, research of oligoclonal bands and IgGindex in the liquor, MRI of spine and research of anti-aquaporin-4 antibody. Conclusion: The analysis of the literature shows that the most relevant data to define the diagnosis of the TDLs are obtained through the history and clinical evolution of the patients and neuroimaging tests.It is critical that the patients with TDL be accompanied over the medium/long term in an attempt of increase the diagnostic possibilities; there is not an universal protocol of approach of the TDL; there is unconditional necessity of implementation of flow of procedures able to guide the diagnosis of the TDLs in the childhood and adolescence.

Chez les patients atteints de la sclérose en plaques (SEP), les lymphocytes T autoréactifs utilisent des molécules d'adhérence (CAM) pour traverser la barrière hémo-encéphalique (BHE), pénétrer dans le système nerveux central (SNC) et médier la détérioration de la myéline. Les lymphocytes T régulateurs (Treg) constituent l’un des éléments clés de la tolérance immunitaire, protégeant contre les réactions auto-immunes. Cependant, l'entrée et la fonction des Treg dans le SNC restent largement inconnues. Notre laboratoire a démontré la contribution de plusieurs CAM, dont la molécule melanoma cell adhesion molecule (MCAM), dans la migration des lymphocytes pathogéniques à travers la BHE. L'objectif de cette étude est de déterminer si les Treg migrent dans le SNC en utilisant MCAM et s’ils exercent des fonctions anti-inflammatoires qui pourraient atténuer l'inflammation du SNC. L'expression de MCAM, des marqueurs fonctionnels de Treg (CTLA-4, CCR6, CCR5), ainsi que leur sécrétion de cytokines (IL-10, GrzmB, TGF-ß, IFN-γ, TNF α, GM-CSF, IL-17a), ont été étudiées sur des Treg du sang périphérique, du liquide céphalo-rachidien (LCR) et de la culture in vitro, provenant de patients atteints de SEP et d’individus sains (HC), par cytométrie de flux, en corroboration avec qPCR et ELISA. De plus, la présence de MCAM+ Treg dans le SNC a été évaluée par immunohistofluorescence (CD4, CD25, Foxp3, MCAM, noyaux) sur des souris atteintes d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Nos données ont montré une augmentation de l'expression de MCAM sur les Treg de patients atteints de la forme cyclique de SEP (RRMS) par rapport aux HC. Nous avons observé une tendance vers une fréquence plus élevée de MCAM+ Treg dans le LCR par rapport au sang périphérique des patients atteints de SEP, ce qui suggère que MCAM pourrait jouer un rôle important dans la migration des Treg. Ces cellules MCAM+ Treg semblent avoir un phénotype plus fonctionnel et anti-inflammatoire que leurs contreparties MCAM-. De plus, nous avons trouvé des niveaux plus élevés de MCAM+ Treg dans les périodes de rémission de l'EAE, ce qui souligne leur implication durant cette phase de la maladie. Dans l'ensemble, nos données montrent que MCAM est une CAM essentielle pour la migration des Treg vers le SNC. / In multiple sclerosis (MS), autoreactive T cells upregulate cellular adhesion molecules (CAMs) to cross the blood brain barrier (BBB), enter the central nervous system (CNS) and mediate damage to myelin. Regulatory T cells (Treg) are one of the key components of immune tolerance, protecting against autoimmune reactions. However, Treg's entry and function in the CNS remains largely unknown. Our lab has demonstrated the contribution of several CAMs, including melanoma cell adhesion molecule (MCAM), in the migration of pathogenic lymphocytes across the BBB. The goal of this study is to determine whether Treg migrate into the inflamed CNS using MCAM and exert anti-inflammatory functions, possibly dampening CNS inflammation. The expression of MCAM and Treg functional markers and chemokine receptors (CTLA-4, CCR6, CCR5,), as well as cytokine secretion (IL-10, GrzmB, TGF-ß, IFN-γ, TNF α, GM-CSF, IL-17a), were studied on MS patients and healthy individuals (HC) Treg from the peripheral blood, cerebrospinal fluid (CSF), and in vitro culture, by flow cytometry, in corroboration with qPCR and ELISA. Moreover, the presence of MCAM+ Treg in the CNS was assessed by immunohistofluorescence (CD4, CD25, Foxp3, MCAM, nuclei) on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) affected mice. Our data showed an increase in the expression of MCAM on Treg during relapse-remitting MS patients (RRMS) compared to HC. We observed a trend for a higher frequency of MCAM+ Treg cells in the CSF versus the peripheral blood of MS patients, suggesting that MCAM might play an important role in the migration of Treg. These MCAM+ Treg seem to have a more functional and anti-inflammatory phenotype than their MCAM- counterparts. Moreover, we found higher levels of MCAM+ Treg in periods of EAE remission, underlining their involvement during this disease phase. Overall, our data depicts MCAM as an essential CAM for Treg homing to the CNS.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) caractérisée par de l’infiltration leucocytaire et de la démyélinisation axonale. Les cellules présentatrices d’antigènes (APC) jouent un rôle primordial dans ce processus en activant dans la périphérie les lymphocytes T réactifs contre la myéline. Les lymphocytes activés peuvent traverser la barrière hémo-encéphalique (BHE) et infiltrer le SNC. Les lymphocytes sont ensuite réactivés dans l’espace périvasculaire par les APC, suite à quoi ils contribuent à la démyélinisation et aux dommages axonaux. Nétrine-1 (N1) est une protéine de guidance axonale possédant d’importantes propriétés anti-inflammatoires. L’importance de N1 dans le maintien de la BHE et l’inhibition de l’infiltration leucocytaire dans le SNC a été bien démontrée, mais son implication dans la présentation antigénique et la régulation de l’activation lymphocytaire n’a jamais été étudiée. Le présent ouvrage propose l’hypothèse que N1 est produite par les APC afin de réguler la neuro-inflammation. Il cherche à caractériser l’expression de N1 par les APC, déterminer l’influence de N1 sur l’activation lymphocytaire et explorer le rôle de la production de N1 par les APC dans la neuro-inflammation. Les expériences menées à terme dans le cadre de ce projet démontrent que N1 est exprimée par les cellules dendritiques matures et les macrophages de type M1. De plus, N1 a pour effet de stimuler la prolifération des lymphocytes TH1, TH17 et CD8+. N1 inhibe également la production de cytokines par les lymphocytes TH17 et diminue l’expression de perforine par les lymphocytes T CD8+. N1 n’a toutefois pas d’influence sur l’expression des molécules d’adhérence par les lymphocytes T. Enfin, les cellules dendritiques, macrophages et cellules microgliales n’expriment pas N1 dans le SNC des souris dans le cadre de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de SEP. En somme, les résultats ici présentés suggèrent que N1 est produite par les APC afin d’influencer le fonctionnement des lymphocytes T. / Multiple Sclerosis (MS) is an autoimmune disorder of the central nervous system (CNS) characterized by leukocytic infiltration and axonal demyelination. Antigen presenting cells (APCs) play a crucial role in this process by activating myelin-reactive lymphocytes in the periphery. Activated lymphocytes subsequently cross the blood-brain barrier (BBB) and infiltrate the CNS. These lymphocytes are reactivated in the perivascular space by APCs, following which they contribute to demyelination and axonal damage. Netrin-1 (N1) is an axonal guidance protein with considerable anti-inflammatory properties. The relevance of N1 in maintaining BBB function has been thoroughly established, but its involvement in antigen presentation and T cell activation has yet to be studied. This project investigates the hypothesis that N1 is produced by APCs to regulate neuroinflammation and aims to characterize N1 production by APCs, delineate the impact of N1 on T cell activation and clarify the role of APC-derived N1 in neuroinflammation. The results presented in this thesis demonstrate that N1 is produced by mature dendritic cells and M1 macrophages. Furthermore, N1 is shown to increase T cell proliferation, decrease TH17 cell cytokine production and decrease CD8+ T cell perforin expression. N1 does not alter T cell expression of adhesion molecules. Finally, N1 is not expressed by the CNS dendritic cells, macrophages or microglial cells of mice undergoing experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model for MS. In summary, these results suggest that N1 is produced by APCs to modulate T cell function.

La Sindrome da Affaticamento Cronico/Encefalomielite Mialgica (CFS/ME), è una grave malattia multisistemica caratterizzata da anomalie immunologiche e disfunzioni del metabolismo energetico. Recenti evidenze suggeriscono l’esistenza di una forte correlazione tra disbiosi e condizione patologica. La presente ricerca ha analizzato la composizione del microbiota intestinale ed orale in pazienti con CFS/ME rispetto a controlli sani e ha determinato se eventuali differenze osservate potrebbero essere utili in futuro per l'identificazione di biomarcatori diagnostici. La composizione batterica fecale e salivare dei pazienti con CFS/ME è stata studiata mediante sequenziamento Illumina degli ampliconi del gene 16S rRNA. Il microbiota fecale dei pazienti con CFS/ME ha mostrato una significativa riduzione di Lachnospiraceae, in particolare di Anaerostipes, rispetto ai gruppi di soggetti senza CFS/ME e un incremento di Phascolarctobacterium faecium e unclassified Ruminococcus. Bacteroides vulgatus, unclassified Bacteroides, Bacteroides uniformis e unclassified Barnesiella sono risultati significativamente più abbondanti nei pazienti con CFS/ME. Il microbiota orale dei pazienti con CFS/ME ha mostrato un aumento significativo di Rothia dentocariosa. Il profilo metabolico fecale di un sottogruppo di pazienti con CFS/ME ha mostrato un aumento complessivo di SCFA e di derivati dell'indolo rispetto ai gruppi non CFS/ME, suggerendo un aumento dei processi di fermentazione. I nostri risultati supportano l'ipotesi autoimmune per la CFS/ME e se saranno confermati da studi più ampi, le differenze rilevate nei profili microbici dei pazienti CFS/ME potrebbero essere utilizzate come markers per una diagnosi più accurata e per lo sviluppo di strategie terapeutiche specifiche. / The Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME), is a severe multisystemic disease characterized by immunological abnormalities and dysfunction of energy metabolism. Recent evidence suggest that there is a strong correlation between dysbiosis and pathological condition. The present research investigated the composition of the intestinal and oral microbiota in CFS/ME patients in comparison to healthy controls and determined whether any observed differences could be useful for the identification of diagnostic biomarkers. The fecal and salivary bacterial composition in CFS/ME patients was investigated by Illumina sequencing of 16S rRNA gene amplicons. The fecal microbiota of CFS/ME patients showed a significant reduction of Lachnospiraceae, particularly Anaerostipes, compared to the non-CFS/ME groups, and an increase of Phascolarctobacterium faecium and unclassified Ruminococcus. Bacteroides vulgatus, unclassified Bacteroides, Bacteroides uniformis and unclassified Barnesiella resulted significantly more abundant in CFS/ME patients. The oral microbiota of CFS/ME patients showed a significant increase of Rothia dentocariosa. The fecal metabolic profile of a subgroup of CFS/ME patients revealed an overall increase of SCFAs and indole derivatives compared to the non-CFS/ME groups, suggesting an increase in the fermentation processes. Our results support the autoimmune hypothesis for CFS/ME condition and if confirmed by larger studies, the differences detected in the microbial profiles of CFS/ME patients may be used as markers for a more accurate diagnosis and for the development of specific therapeutic strategies.

L’encéphalomyélite myalgique (EM) est une maladie complexe, multi-systémique et débilitante, dont l’étiologie est inconnue. D’une personne atteinte d’encéphalomyélite myalgique (PAEM) à l’autre, les symptômes varient en fréquence et en sévérité créant ainsi une grande hétérogénéité clinique entre les individus. Un sous-groupe de PAEM vivent des épisodes d’intolérance orthostatique (IO) ou vivent avec une comorbidité de syndrome de tachycardie orthostatique posturale (POTS), deux conditions qui sont mal comprises. Le malaise après-effort (PEM), un des symptômes phare de l’EM, survient après une activité physique ou mentale minimale. Le malaise après-effort entraîne une dégradation générale de l’état de l’individu, peut entraîner une exacerbation des autres symptômes et va durer de plusieurs heures à plusieurs jours. Chez les individus souffrant de POTS ou d’IO, le malaise après-effort peut déclencher des épisodes d’intolérance orthostatique. Le gène SLC6A2 codant pour le transporteur de norépinephrine NET a été identifié comme potentiel mécanisme dans pathophysiologie du POTS, tout comme les protéines impliquées dans la vasodilatation, comme la thrombospondine-1 (TSP-1). Notre laboratoire a identifié un panel de onze microARN (miARN) exprimés différentiellement chez les PAEM. Parmi ceux-ci, le miR-150-5p a comme cible prédite SLC6A2. Notre hypothèse était qu’une plus grande expression du miR-150-5p après un effort ou qu’une chute de thrombospondine-1 pourrait induire une vasodilatation soudaine contribuant aux symptômes d’IO ou de POTS. Nous avons mesuré les niveaux plasmatiques du miR-150-5p et de TSP-1 avant (T0) et après (T90) l’induction du malaise après-effort chez des PAEM avec POTS/IO (n = 20), chez des PAEM sans POTS/IO (n = 117) et chez des témoins sédentaires associés pour le sexe et l’âge (n = 48). Nous avons démontré que les sujets atteints de POTS/IO avaient des niveau plus importants du miR-150-5p et des symptômes plus sévères. Finalement, nous avons également utilisé la veste intelligente Hexoskin (Carré Technologies Inc., Montreal, Qué., Canada) pour suivre un sous-groupe d’individus (n = 10) sur une plus longue période après l’induction du malaise après-effort. Avec cet outil, nous avons pu monitorer les symptômes au quotidien, permettant un meilleur suivi clinique de ces patients. Ce projet de maîtrise a permis une meilleure compréhension de la pathophysiologie de l’EM et de celle du POTS. / Myalgic encephalomyelitis (ME) is a complex chronic disease with debilitating smyptoms and unknown etiology. Symptoms vary in frequency and severity from a person with ME (PwME) to another, thus creating a highly clinically heterogeneous patient population. Some PwME also experience orthostatic intolerance (OI) episodes or live with a comorbidity of postural orthostatic tachycardia syndrome (POTS), two conditions that are not well understood. Post-exertional malaise (PEM) causes patients to experience a worsening of their symptoms following an effort, whether it be physical or mental. PEM can last from a few hours to several days. In PwME with POTS/OI, PEM can trigger orthostatic intolerance episodes. SLC6A2 is a gene coding for the norepinephrine transporter NET. Its contribution to the POTS pathophysiology has been mentioned several times in literature. A biochemical milieu prone to vasodilation was also reported as a contributing element to POTS pathophysiology. Recently, our laboratory published an article identifying a panel of eleven microRNAs (miRNAs) differentially expressed in PwME. Among these miRNAs, miR-150-5p has been predicted to target SLC6A2. Our hypothesis was that higher expression of miR-150-5p following an effort or a decrease in circulating thrombospondin-1 (TSP-1) inducing vasodilation could contribute to POTS/OI symptoms. We measured circulating levels of miR-150-5p and TSP-1 before (T0) and after (T90) PEM induction in PwME (n = 117), PwME with POTS/OI (n = 20) and age and sex matched sedentary controls (n = 48). We demonstrated that PwME with POTS/OI have higher levels of miR-150-5p at both T0 and T90, while also having more severe symptoms. Furthermore, we used the connected vest Hexoskin (Carré Technologies Inc., Montreal, Qué., Canada) to follow a subgroup (n = 10) of patients for a longer period following PEM induction. With this tool, we were able to monitor symptoms on a daily basis, allowing better clinical follow-up. Overall, this project allowed better understanding of ME and POTS’ pathophysiology.

L'encéphalomyélite myalgique (EM) aussi connue sous le nom de syndrome de fatigue chronique est une maladie multi-systémique caractérisée par une fatigue extrême et un malaise post-effort, associés à d’autres symptômes débilitants comme l’intolérance orthostatique et des troubles du sommeil. L’EM se caractérise également par des altérations au niveau du système immunitaire et des perturbations du métabolisme énergétique affectant également le métabolisme des lipides. Dans ce contexte, nous avons exploré la contribution possible de la sphingomyéline phosphodiesterase acide 3b (SMPDL3B), produite par le gène SMPDL3B, dans la pathogénèse de l’EM. Celle-ci est une protéine multifonctionnelle ancrée par un groupement glycophosphatidylinositol (GPI) au niveau de la membrane des cellules. Cette enzyme a suscité notre intérêt compte tenu de son rôle dans la régulation de l'immunité innée et dans la conversion métabolique des sphingolipides en céramides. En effet, des études métabolomiques antérieures ont rapporté une réduction drastique des taux plasmatiques de céramides de 50% chez les hommes et de 86% chez les femmes souffrant d'EM. Nous proposons que l’élévation des niveaux circulants en SMPDL3B contribue à la sévérité de plusieurs symptômes chez les personnes atteintes d’EM (PAEM) via différents mécanismes. Les niveaux plasmatiques en SMPDL3B ont été mesurés par ELISA au niveau d’une cohorte prospective québécoise composée de PAEM (n=147) et de témoins sédentaires appariés pour le sexe et l’âge (n=62) n’ayant aucun antécédent familial d’EM. Nous avons également testé, par la même approche, des échantillons de plasma d’une cohorte norvégienne composée de PAEM (n=141). L’analyse de ces deux cohortes indépendantes a permis de mettre en évidence une corrélation positive entre les taux circulants en SMPDL3B et la sévérité des symptômes des PAEM. Nous avons également observé des niveaux plasmatiques plus élevés chez les PAEM atteints d’intolérance orthostatique lorsque comparés aux PAEM ne présentant pas ce symptôme. Finalement, nous avons confirmé à l’aide de la spectrométrie cellulaire diélectrique que la forme soluble de la protéine SMPDL3B peut se lier avec une haute affinité au récepteur de chimiokines CCR3 présent chez les cellules Jurkat et mis en évidence que l’occupation de ce récepteur par la chimiokine CCL11 ou un antagoniste pharmacologique pouvait augmenter la liaison de la forme soluble de la protéine SMPDL3B vers un autre récepteur membranaire qui demeure pour l’instant inconnu. Ce projet de maîtrise a permis une meilleure compréhension de la pathophysiologie de l’EM et de la contribution de la protéine SMPDL3B (forme ancrée et soluble) dans sa pathogénèse. / Myalgic encephalomyelitis (ME) also known as chronic fatigue syndrome is a multi-systemic disease characterized by extreme fatigue, post-exercise malaise, orthostatic intolerance, and sleep disturbances. ME is also characterized by alterations in the immune system and disturbances in energy metabolism that also affect lipid metabolism. In this context, we explored the possible contribution of sphingomyelin acid phosphodiesterase 3b, produced by the SMPDL3B gene, in the pathogenesis of ME. This is a multifunctional protein anchored by a glycophosphatidylinositol (GPI) group at the cell membrane. This enzyme has intrigued our interest given its role in the regulation of innate immunity and in the metabolic conversion of sphingolipids into ceramides. Indeed, previous metabolomics studies have reported a drastic reduction in plasma ceramide levels by 50% in men and 86% in women with ME. We propose that elevation of circulating levels of SMPDL3B increases the severity of several symptoms in persons with ME (PwME) via different mechanisms. Plasma levels of SMPDL3B were measured by ELISA in a Quebec cohort composed of PwME (n=147) and sedentary controls matched for sex and age (n=62) with no family history of ME. We also tested, by the same method, plasma samples from a Norwegian cohort composed of PwME (n=141). The analysis of these two independent cohorts revealed a positive correlation between SMPDL3B and the severity of PwME symptoms. We also observed higher plasma levels in PwMEs with orthostatic instability when compared to PwMEs without this symptom. Finally, we confirmed using dielectric cell spectrometry that the soluble form of the SMPDL3B protein can bind with high affinity to the CCR3 chemokine receptor present in Jurkat cells and demonstrated that the occupation of this receptor by the chemokine CCL11 or a pharmacological antagonist could increase the binding to another membrane receptor which remains unknown for the moment. This master's project allowed a better understanding of the pathophysiology of ME and the contribution of the SMPDL3B protein in its pathogenesis.

L'encéphalomyélite myalgique (EM) est une maladie chronique complexe et hétérogène dont l'étiologie et la physiopathologie restent mal comprises. Cette maladie comporte une multitude de symptômes et se caractérise par une fatigue constante inexpliquée, non soulagée par le repos et un malaise post-effort (MPE), qui se traduit par une aggravation des symptômes à la suite d’une activité physique ou cognitive minimale. Bien que le MPE soit le symptôme caractéristique de l'EM, plusieurs symptômes peuvent varier au fil du temps selon les personnes affectées en termes de fréquence et d'intensité. Environ 60 % des personnes atteintes d'EM souffrent d’une dysautonomie, plus fréquemment d’une intolérance orthostatique (IO) et, souvent, d’un syndrome de tachycardie orthostatique posturale (STOP). L’IO et le STOP sont déclenchés par un changement de position de couché à debout et sont aggravés par le MPE. Les patients gravement atteints par l’EM sont confinés à la maison et souvent cloués au lit. L'EM est une maladie qui affecte globalement des millions de personnes, incluant plus de 500,000 Canadiens. Cependant, le nombre de personnes souffrant de cette maladie pourrait en fait être une sous-représentation de la réalité car environ 84 à 91 % d’entre elles ne sont toujours pas diagnostiquées. Le diagnostic de l’EM est difficile en raison du manque de biomarqueurs validés et du chevauchement dans les symptômes avec d'autres maladies telles que la fibromyalgie (FM). La FM est une autre maladie chronique dont l'étiologie demeure inconnue avec une prévalence d'environ 2 à 3 % de la population et présente plusieurs symptômes en commun avec l'EM, tels que la fatigue, les problèmes de sommeil et les troubles cognitifs. Alors que l'EM est davantage caractérisée par la MPE, la FM est associée aux douleurs chroniques, à un faible seuil de douleur et à une sensibilité musculaire. Avec des preuves à l’appui et compte tenu de la nature hétérogène de l’EM, il est reconnu que la pathogénèse de cette maladie est le résultat d’une combinaison de facteurs. D’abord, il y a les prédispositions génétiques, car souvent plusieurs membres de la famille sont atteints. Ensuite, il y a les expositions environnementales telles que les toxines, les moisissures, l’exposition aux métaux lourds (mercure, arsenic, etc.). De plus, les infections par des agents pathogènes viraux (H1N1, EBV, etc.) ou bactériens (Borrelia burgdorferi), ainsi que des stress majeurs peuvent jouer un rôle comme agent déclencheur dans la maladie. Les microARN (miARN) sont une classe de petits ARN non codants qui possèdent la capacité de réguler l'expression de plusieurs gènes et ont donc un impact considérable sur les fonctions physiologiques. Il est important de noter que l’expression de nombreux miARN est modulée par les facteurs génétiques, épigénétiques et environnementaux. Nous proposons que les miARN jouent un rôle dans la pathogenèse de l'EM en modulant plusieurs voies physiologiques dont la réponse au stress. L'objectif général de cette thèse était d'examiner le rôle des miARN dans la physiopathologie de l'EM et leur contribution dans la variabilité et à la gravité des symptômes. Dans le premier article, nous avions pour objectif d’identifier les miARN impliqués dans l’EM. Ceci nous a conduit à découvrir 11 miARN circulants qui sont dérégulés et associés au MPE déclenché par l'application d'une provocation standardisée. Basé sur les changements d’expression de ces miARN après un stress appliqué provoquant un MPE chez les participants EM, nous avons pu créer un algorithme capable de différentier avec succès les individus EM des témoins sains. De plus, en utilisant le regroupement k-means, nous avons identifié quatre sous-groupes distincts de patients atteints d'EM présentant des profils de miARN et une gravité de la maladie différents. Parmi les 11 miARN identifiés, l'expression dérégulé de hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-150-5p et hsa-miR-374b-5p avait été précédemment associée à la FM dans la population norvégienne. L'objectif du deuxième article était d'évaluer les niveaux d'expression des 11 miARN associés à l'EM chez les patients atteints de FM ainsi que chez ceux présentant un diagnostic comorbide d'EM et de FM (EM+FM). Nous avons observé des signatures d'expression différentielles des 11 miARN entre les individus EM, FM et EM+FM. Ces résultats nous ont permis de développer un modèle de prédiction basé sur une approche d’apprentissage automatique, capable de différentier les maladies EM et FM. L'un des miARN identifiés dans notre panel diagnostic d’EM, hsa-miR-150-5p, est prédit de réguler l'expression du gène SLC6A2 codant pour le transporteur de norépinephrine (NET). L’inactivation du transporteur NET a été mise en évidence par la découverte de mutations inactivatrices associées à une forme familiale rare de STOP ce qui n’est pas le cas pour la majorité des personnes atteintes de STOP. Néanmoins, chez ces personnes le niveau de la protéine NET et son expression sont souvent réduites. L'objectif du troisième manuscrit était d'étudier l'implication de miR-150-5p dans le STOP et IO survenant chez les personnes souffrant d'EM, EM+FM et STOP sans EM ni FM. Dans cette étude, nous avons confirmé une élévation du taux plasmatique de norépinephrine chez les participants atteints de STOP (avec et sans EM), suggérant une réduction de la protéine NET. Parmi les patients atteints d'EM avec STOP/IO et les patients STOP uniquement (sans EM), nous avons déterminé un mécanisme double par lequel le STOP est déclenché, centré sur deux profils distincts impliquant des taux plasmatiques faibles et élevés de miR-150-5p. Nous avons réalisé des expériences in vitro permettant de moduler les niveaux d’expression du miR-150-5p dans la lignée cellulaire SH-SY5Y, et mis en évidence une augmentation de l'expression du gène SLC6A2 suggérant un mécanisme indirect impliquant une réduction significative dans les niveaux de protéine EZH2, un puissant répresseur transcriptionnel de SLC6A2 et une autre cible confirmée de miR-150-5p. Dans cette thèse, nous avons identifié un panel diagnostic constitué de 11 miARN circulants qui, grâce à une combinaison d'un test d'effort, peuvent aider au diagnostic des individus atteints d'EM et révéler de nouvelles informations sur la physiopathologie de l'EM. De plus, ce panel de miARN peut être utilisé pour différentier les conditions de EM, FM et EM+FM, ce qui est vital pour la compréhension de la physiopathologie de chaque maladie. Finalement, nous proposons un nouveau mécanisme par lequel l'altération de miR-150-5p peut déclencher le STOP/IO chez les individus atteints d'EM, EM+FM ainsi que chez ceux souffrant de STOP sans EM. Le diagnostic précis des individus à l'aide des miARNs en tant que biomarqueurs aidera à déterminer des mesures préventives, à établir des traitements efficaces et à identifier des cibles thérapeutiques pour la maladie EM par une manipulation directe ou indirecte de l'expression des miARN. / Myalgic encephalomyelitis (ME) is a complex chronic heterogeneous illness whose etiology and pathophysiology remain poorly understood. This disease has a multitude of symptoms, and it is characterised by unexplained constant fatigue unrelieved by rest and post-exertional malaise (PEM), which is reported as a worsening of symptoms following a minimal physical or cognitive activity. While PEM is the hallmark symptom of ME, some symptoms can vary overtime among affected individuals in frequency and intensity. About 60% of people with ME experience autonomic dysfunctions often refereed as dysautonomia and can result in orthostatic intolerance (OI) and in some cases in Postural Orthostatic Tachycardia Syndrome (POTS). Both OI and POTS are triggered by a change of position from supine to standing and are worsened by PEM. Severely affected patients are housebound and often bedridden. ME is common in all populations and it is known to affect over 500,000 Canadians. However, the number of people suffering from this disease may be in fact an underrepresentation of the reality because about 84-91% remain undiagnosed. Diagnosis is challenging due to a lack of validated biomarkers and overlap in symptoms with other diseases such as Fibromyalgia (FM). FM is another chronic illness with unknown etiology with a prevalence of about 2-3% of the population and has several common symptoms with ME such as fatigue, sleep problems and cognitive impairment. While ME is more characterised by PEM, FM is associated with more chronic pain, low pain threshold and muscle tenderness. With supporting evidence and the heterogeneous nature of ME, it is evident that the pathophysiology of this disease includes a combination of factors. First of all, there are predisposing genetic factors since it is common to observe several affected family members. Then, there are environmental exposures such as toxins, mold, exposure to heavy metals (mercury, arsenic, etc.). In addition, viral pathogen infections (H1N1, EBV, etc.) or bacterial infections (Borrelia burgdorferi) as well as major stress can play a role as a triggering agent in the disease. MicroRNAs (miRNAs) are a class small non-coding RNAs that possess the ability to regulate the expression of several genes and therefore greatly impact physiological functions. Of note, the expression of many miRNAs is modulated by genetic, epigenetic, and environmental factors. We propose that miRNAs play a role in the pathogenesis of ME by modulating several physiological pathways particularly in response to stress. The general objective of this thesis was to examine the role of miRNAs in the pathophysiology of ME and their contribution to symptom variability, and severity. In firstly paper, we aimed to determine the miRNAs involved in ME disease. We have identified using microarray technology and confirmed by qPCR a panel of 11 circulating miRNAs that are deregulated and associated with PEM in response triggered by the application of a standardized provocation maneuver. Based on the changes of those miRNAs due to the applied stress test that provokes PEM in ME participants, we were able to create an algorithm capable of successfully differentiate ME individuals from healthy controls (HC). In addition, using k-means clustering, we have identified four distinct subgroups of ME patients with different miRNA profiles and severity of the disease. Among the selected 11 miRNAs, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-150-5p and hsa-miR-374b-5p downregulated expression was previously associated with FM in the Norwegian population. The objective of the second paper was to investigate the expression levels of the 11 associated miRNAs with ME in FM patients as well as those with a comorbid diagnosis of ME and FM (ME+FM). We observed differential expression signatures of the 11 miRNAs between ME, FM and ME+FM individuals. These results prompted us to develop a prediction model based on machine learning approach, which can differentiate ME and FM illnesses. One of the miRNAs identified in our ME diagnostic panel, hsa-miR-150-5p is predicted to regulate the expression of SLC6A2 gene encoding norepinephrine transporter (NET). Inactivation of NET transporter by mutations was discovered in rare familial form of POTS which is not the case for most people with POTS. Nevertheless, in these people the level of the NET protein and its expression are often reduced. The objective of the third manuscript was to investigate the implication of miR-150-5p in POTS and OI occurring in people suffering of ME, ME+FM and POTS without ME or FM. In this study, we confirmed an elevation of plasma norepinephrine in participants with POTS (with and without ME), suggesting a reduction in NET protein. Among ME patients with POTS/OI, and POTS-only patients (without ME), we determined a dual mechanism by which POTS is triggered centered on two distinct profiles involving low and high plasma miR-150-5p levels. We performed in vitro experiments and with modulation of miR-150-5p expression levels in SH-SY5Y cells line, we observe an increase in SLC6A2 expression, suggesting an indirect mechanism involving a significant reduction in levels of EZH2 protein, a powerful transcriptional repressor of SLC6A2 and another confirmed target of miR-150-5p. In this thesis, we have identified a panel of circulating miRNAs, which in combination to a stress test, can aid in the accurate diagnosis of ME individuals and reveal new insights into the ME pathophysiology. In addition, this panel of miRNAs at baseline can be used to differentiate ME from FM or when it co-exists with the ME (ME+FM), which is crucial for understanding the pathophysiology of each illness. And finally, we propose a first mechanism by which alteration of miR-150-5p can trigger POTS/OI in individuals with ME, ME+FM as well as in those suffering of POTS without ME. The accurate diagnosis of individuals with the help of miRNAs as biomarkers will help to establish preventive measures, effective treatments, and therapeutic targets for ME disease by a direct or indirect manipulation of miRNA expression.