Introdução: A disfunção erétil (DE) é definida como a incapacidade de alcançar ou manter a ereção do pênis para um desempenho sexual satisfatório, contribuindo significativamente para a baixa qualidade de vida e morbidade psicossocial masculina. A endotelina-1 (ET-1), um potente peptídeo vasoconstritor que promove contração lenta e sustentada em células de músculo liso vascular, possui grande importância na fisiopatologia da DE. Diversos estudos mostram que o aumento da expressão de mediadores inflamatórios está intimamente ligado ao desenvolvimento da DE. O inflamassoma é um complexo multiprotéico do sistema imune inato que atua através da ativação da caspase-1 e resulta na maturação de citocinas pró- inflamatórias, tais como interleucina- IL (IL-l?). O receptor NLRP3 faz parte do inflamassoma e sua ativação leva a clivagem de caspase-1 e consequente secreção de IL-1?. A ET-1, também possui papel importante na inflamação crônica vascular, mediando a liberação de citocinas pró-inflamatórias. No entanto, ainda é desconhecido se a ação pró- inflamatória da ET-1 em células de músculo liso é mediada pela ativação da via do inflamassoma. Hipótese: A ET-1 ativa o NLRP3 em células do músculo liso do corpo cavernoso (CMLCC), promovendo alterações na reatividade do corpo cavernoso (CC). Objetivo: Avaliar o papel da endotelina-1 na ativação do NLRP3 em CMLCC de camundongos. Métodos: CMLCC de camundongos C578BL/6 (WT) e NLRP3-/- foram cultivadas em meio de cultura DMEM acrescido de soro fetal bovino (SFB), 10%, foram pré- incubadas com endotelina-1 nas concentrações de 10-9, 10-8 e 10-7 M, em presença de LPS ou veículo. Avaliamos o efeito da deleção do NLRP3 sobre a reatividade do CC (contratilidade e relaxamento mediante estímulos por campo elétrico e/ou farmacológico). Após, avaliamos o efeito da ET-1 na ativação do NLRP3, nas alterações sobre a reatividade do CC de camundongos WT, e se estas persistiriam nos camundongos NLRP3-/- e caspase1/11-/- . Resultados: As células apresentaram-se fluorescentes para marcação para ?-actina e não para Von Willebrand, caracterizando assim que não houve contaminação com células endoteliais. A incubação com a ET-1 10-7 M por 24 h na presença de LPS ou veículo aumentou a atividade da caspase-1 em CMLCC de camundongos WT e este efeito não ocorreu nas CMLCC de camundongos NLRP3-/-. Não se observou diferença com relação à massa corporal ou massa dos órgãos entre os animais WT e NLRP3-/-. O CC de animais NLRP3-/- apresenta prejuízo para o relaxamento mediado por nitroprussiato de sódio (NPS) quando comparado com as tiras de CC de camundongos WT. A incubação com ET-1 10-7 M por 4 horas promove aumento na contração para fenilefrina (PE) e prejuízo no relaxamento induzido por nitroprussiato de sódio (NPS), e o mesmo efeito não é observado nas tiras de CC de camundongos NLRP3-/- e caspase1/11-/-. Conclusão: O NLRP3 contribui para o aumento na contração e prejuízo no relaxamento produzido pela ET-1 em CC de camundongos, possivelmente através da ativação da caspase-1 / Introduction: Erectile dysfunction (ED) is defined as the inability to achieve or maintain penile erection to perform sexual intercourse, it contributes significantly to the low quality of life and male psychosocial morbidity. Endothelin-1 (ET-1), a potent vasoconstrictor peptide that promotes slow and sustained contraction of vascular smooth muscle cells, has great importance in the pathophysiology of ED. Several studies show that increased expression of inflammatory mediators is closely linked to the development of ED. The inflammasome is a multiproteic complex of the innate immune system that acts through activation of caspase-1, which leads to maturation of pro-inflammatory cytokines such as interleukin-1 beta (IL-l?). The activation of NLRP3 receptor, part of the inflammasome, leads to caspase-1 cleavage and subsequent secretion of IL-1?. ET-1 also plays an important role in chronic vascular inflammation by mediating the release of pro-inflammatory cytokines. However, it is still unknown whether pro-inflammatory actions of ET-1 on smooth muscle cells is mediated by the activation of the inflammasome. Hypothesis: ET-1 activates NLRP3 in smooth muscle cells of the corpora cavernosa (SMCCC), promoting changes in corpus cavernosum (CC) reactivity. Objective: To evaluate the role of endothelin-1 in the activation of the NLRP3 in SMCCC of mice. Methods: SMCCC of C57BL/6 (WT) and NLRP3-/- mice were grown in DMEM culture medium supplemented with bovine fetal serum (FBS) 10%, pre-incubated with endothelin-1 at concentrations of 10-9, 10- 8 and 10-7M, in the presence of LPS or vehicle. We evaluated the effect of the NLRP3 deletion on the reactivity of the CC (contractility and relaxation by electric field and/or pharmacological stimulation). After that, we evaluated the ET-1 effect on activation NLRP3, changes on the reactivity of the CC of WT, and if these alterations would persist NLRP3-/- and caspase1/11-/- mice. Results: The cells presented fluorescent labeling to ?-actin, but not for Von Willebrand factor, characterizing absence of endothelial cells contamination. The incubation with 10-7 M ET-1 for 24 h in the presence of LPS or vehicle increased caspase-1 activity in SMCCC from WT, but not from NLRP3-/- mice. No difference was observed in body mass or weight of the organs between WT and NLRP3-/- animals. The CC from NLRP3-/- animals displayed impaired relaxation mediated by sodium nitroprusside (SNP) when compared to WT CC. The incubation with ET-1 10-7 M for 4 hours promoted an increase in the contraction to phenylephrine (PE) and reduced relaxation induced by sodium nitroprusside (SNP). The same effect was not observed in CC strips from NLRP3-/- and caspase1/11-/- mice. Conclusion: NLRP3 contributes to the increase in contraction and impaired relaxation produced by ET-1 in mice CC, possibly by activation of caspase-1

El propósito general del presente trabajo de Tesis Doctoral fue estudiar la participación de la ET-1 endógena en el desarrollo de HC inducida por Ang II así como las vías de señalización intracelular involucradas. En virtud de los antecedentes expuestos se elaboró la siguiente hipótesis: la HC patológica se produciría como resultado de la activación de un mecanismo autocrino/paracrino desencadenado por el estiramiento del miocardio y que involucra la liberación de Ang II y ET-1, el aumento de las ERO y la activación del NHE-1. La figura 8 muestra la secuencia propuesta de los eventos que se desencadenarían en los miocitos cardíacos adultos cuando son expuestos a Ang II y/o ET-1.

INTRODUÇÃO: Queimaduras estão associadas a uma intensa atividade imunoinflamatória; contudo, um perfil seqüencial precoce dos níveis de TNF-α, seus receptores solúveis e endotelina (ET)-1 (um potente vasoconstritor) em pacientes queimados ainda não está claro. MÉTODOS: Foram estudados vinte pacientes com uma superfície corporal queimada (SCQ) ≥ 30% e com menos de 6h desde o acidente. Amostras de sangue foram retiradas no momento zero, 6, 12, 24h para seqüencialmente medir os níveis do TNF-α, seus receptores solúveis 1 e 2 (sTNFR1 e sTNFR2) e ET-1 usando ensaios ELISA. RESULTADOS: Idade, SCQ e lesão inalatória não foram significativamente diferentes entre sobreviventes (n=10; 30±13 anos, SCQ 40±12%) e não sobreviventes (n=11; 38±15 anos, SCQ 56±20%). Níveis do sTNFR1 estavam aumentados em não sobreviventes (2937±1676 pg/ml; 4548±1436 pg/ml) comparado aos sobreviventes (1313±561 pg/ml; 2561±804 pg/ml) nas 6 e 24h, respectivamente (P=0,01 e 0,002), enquanto níveis de sTNFR2 estavam significativamente aumentados em não sobreviventes (4617±1876 pg/ml vs 2611±1325 pg/ml) somente nas 6h (P=0,015). Níveis elevados de sTNFR1 nas 6h e TNF-α nas 12h mostraram valor preditivo positivo de 100% (para ambos marcadores) e valor preditivo negativo para mortalidade de 70 e 52%, respectivamente; risco relativo de 3,25 e 1.2, respectivamente; com intervalos de confiança de 1,4-7,3 e 1,28-3,52, respectivamente. CONCLUSÕES: Níveis aumentados de sTNFR1 e sTNFR2 foram maiores nas 6h em pacientes queimados não sobreviventes. Níveis de TNF-α e ET-1 foram similares em não sobreviventes e sobreviventes. Determinação muito precoce de sTNFR1 e sTNFR2 poderiam ajudar a identificar o risco de prognóstico adverso em pacientes grandes queimados.

INTRODUÇÃO: Queimaduras estão associadas a uma intensa atividade imunoinflamatória; contudo, um perfil seqüencial precoce dos níveis de TNF-α, seus receptores solúveis e endotelina (ET)-1 (um potente vasoconstritor) em pacientes queimados ainda não está claro. MÉTODOS: Foram estudados vinte pacientes com uma superfície corporal queimada (SCQ) ≥ 30% e com menos de 6h desde o acidente. Amostras de sangue foram retiradas no momento zero, 6, 12, 24h para seqüencialmente medir os níveis do TNF-α, seus receptores solúveis 1 e 2 (sTNFR1 e sTNFR2) e ET-1 usando ensaios ELISA. RESULTADOS: Idade, SCQ e lesão inalatória não foram significativamente diferentes entre sobreviventes (n=10; 30±13 anos, SCQ 40±12%) e não sobreviventes (n=11; 38±15 anos, SCQ 56±20%). Níveis do sTNFR1 estavam aumentados em não sobreviventes (2937±1676 pg/ml; 4548±1436 pg/ml) comparado aos sobreviventes (1313±561 pg/ml; 2561±804 pg/ml) nas 6 e 24h, respectivamente (P=0,01 e 0,002), enquanto níveis de sTNFR2 estavam significativamente aumentados em não sobreviventes (4617±1876 pg/ml vs 2611±1325 pg/ml) somente nas 6h (P=0,015). Níveis elevados de sTNFR1 nas 6h e TNF-α nas 12h mostraram valor preditivo positivo de 100% (para ambos marcadores) e valor preditivo negativo para mortalidade de 70 e 52%, respectivamente; risco relativo de 3,25 e 1.2, respectivamente; com intervalos de confiança de 1,4-7,3 e 1,28-3,52, respectivamente. CONCLUSÕES: Níveis aumentados de sTNFR1 e sTNFR2 foram maiores nas 6h em pacientes queimados não sobreviventes. Níveis de TNF-α e ET-1 foram similares em não sobreviventes e sobreviventes. Determinação muito precoce de sTNFR1 e sTNFR2 poderiam ajudar a identificar o risco de prognóstico adverso em pacientes grandes queimados.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Objetivos: 1- Estudar a ativação endotelial em pacientes com artrite reumatóide, correlacionando os marcadores molécula de adesão intercelular-1(ICAM-1), endotelina- 1 (ET-1), fator de vonWillebrand (vWF) e fator de crescimento endotelial (VEGF) com a atividade clínica e laboratorial da doença. 2- Avaliar possíveis correlações entre os níveis destes marcadores com auto-anticorpos Fator reumatóide (FR) e anticorpo antipeptideo citrulinado cíclico (anti-CCP) e a gravidade da doença. Casuística e Métodos: Em 38 pacientes e 24 indivíduos não reumatóides foram dosados FR, antiCCP, vWF, ICAM-1, ET-1 e VEGF no soro (Nefelometria, Imunoturbidimetria e EIA). A atividade da doença foi definida pelo escore do DAS28. O HAQ (Health Assessment Questionnaire) definiu a capacidade funcional e os critérios revisados do American College of Rheumatology (ACR) a classe funcional. Radiografias de mãos e punhos quantificaram o índice de Sharp modificado. Na análise estatística foram empregados os testes qui-quadrado, teste T, teste de Kolmogorov-Smirnov, Mann-Whitney e o coeficiente de correlação de Spearman. Resultados: A idade dos pacientes foi de 52 ± 12,5 anos e dos indivíduos normais de 49 ± 9,4 anos. O tempo de doença foi de 68 ± 66,6 meses. O vWF apresentou correlação significativa com o tempo de evolução da doença, (r= 0,340; p= 0,037 ), os auto-anticorpos com o índice de Sharp, FR (r= 0,529; p= 0,001) anti-CCP (r= 0,415; p= 0,10). A correlação do vWF e da ICAM-1 foi significativa com o DAS-28 (r= 0,374*; p=0,021) e (r= 0,338; p= 0,038) respectivamente, o vWF se correlacionou com o HAQ (r= 0,355; p= 0,029) e com o Sharp (r= 0,564; p= <0,001). A ET-1 não teve correlação significante com nenhuma variável. O VEGF não se correlacionou significativamente com nenhuma variável. Conclusões: Os auto-anticorpos e os marcadores endoteliais, exceto o vWF não se correlacionaram com o tempo de doença. O FR e o anti-CCP se correlacionaram com o Índice de Sharp. O vWF apresentou correlação significativa com atividade e gravidade da doença, através da correlação com o DAS28 e com o Sharp. O ICAM-1 teve correlação significativa com o FR, mas não com o anti-CCP. No presente estudo a ET- 1 não mostrou ser um bom marcador endotelial para AR. / Objectives: 1 – To study endothelial activation in patients with rheumatoid arthritis, by establishing correlations among specific markers (intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), endotheline-1 (ET-1), von Willebrand factor (vWF) and vascular endothelial growth factor (VEGF)) with clinical and laboratorial activities of the disease; 2 – To evaluate possible correlations among the levels of those markers and rheumatoid factor (anti-RF), anti-cyclic citrullinated peptide autoantibody (anti-CCP) and the severity of the disease. Casuistic and Methods: In 38 patients and 24 non-rheumatoid individuals the following elements were dosed: RF, anti-CCP, vWF, ICAM-1, ET-1 and serum VEGF (nefelometry, imunoturbidimetry and EIA). Disease activity was determined by using the DAS28 score. HAQ (Health Assessment Questionnaire) defined the functional ability and the revised criteria of the American College of Rheumatology (ACR) defined the functional class. Hand and fist radiographs quantified the modified Sharp index. On statistical analysis tests employed were: qui-square test, T test, Kolmogorov-Smirnov test, Mann-Whitney test and Spearman’s correlation coefficient. Results: Patient age range was 52 ± 12,5 years and in normal individuals age variation was 49 ± 9,4. Disease time was 68 ± 66,6 months. Significant correlations were found between vWF and disease evolution time and also between autoantibodies and the Sharp index. Correlation of vWF and ICAM-1 were significant with DAS-28 and vWF was correlated with HAQ and with the Sharp index. ET-1 did not show significant correlations with any variable. VEGF was not found in significant correlation with any variable. Conclusions: Autoantibodies and endothelial markers, with the exception of vWF did not show correlations with disease time. RF and anti-CCP were correlated with the Sharp index. A significant correlation was found between vWF and disease activity and severity, through a correlation with DAS28 and Sharp. ICAM-1 had a significant correlation with RF but not with anti-CCP. In the present study ET-1 did not prove itself as an efficient marker for rheumatoid arthritis. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-31 / Objetivo: caracterizar farmacológicamente as respostas à bradicinina e outros agonistas no músculo liso não vascular (fundo do estômago) e vascular (aorta abdominal) isolados de animais nocaute B1 e B2 de cininas. Métodos: Foram isolados fundus de estômago e aorta abdominal de animais normais, nocaute B1 e animais nocaute B2; registros de contrações isométricas foram obtidos para determinação da potência e eficácia dos agonistas. Foram aplicadas doses crescentes cumulativas e não-cumulativas dos agonistas peptídicos bradicinina (BK), Des-Arg9 bradicinina, angiotensina II (AII) e endotelina-1 (ET-1). Resultados: O estudo da potência em fundus de estômago isolado de animais nocautes revelou que a afinidade dos agonistas testados, não foi alterada. Quanto ao efeito máximo, verificou-se que a ausência do receptor B1 diminuiu a eficácia da BK, porém não da ET-1 e AII. No tecido vascular, a BK mostrou-se menos eficaz em animais nocaute B1 assim como a ET-1, enquanto a AII teve sua eficácia diminuída, tanto em animais nocaute B1 como B2. As respostas à ET-1 e AII apresentaram o Emax alterado nos animais nocautes o qual foi revertido em nocaute duplo B1 e B2. Conclusão: A verificação de que a afinidade relativa dos agonistas testados, no estômago isolado de camundongos nocautes B1 e B2 não foi alterada significativamente em relação à determinada em animais WT, sugeriu que neste tecido não ocorrem interações entre os receptores que afetariam a ligação dos agonistas ao seu receptor. Entretanto a redução na contração máxima induzida pela BK no animal nocaute B1 poderia estar relacionada com o elevado nível de óxido nítrico (NO) endógeno encontrado no fundus de estômago desse animal. Porém, L-NAME (inibidor da NO sintase) não afetou o Emax da BK, descartando essa hipótese. Considerando-se que heterodimerização entre os receptores B1 e B2 ocorre nas células do estômago, a falta de B1 teria favorecido a homodimerização do B2, que leva à ativação e dessensibilização, induzindo a taquifilaxia mais acentuada para a BK, e a redução do Emax. Para o caso da AII, que mostrou ter a afinidade e a eficácia mantidas nos nocautes, mas a taquifilaxia atenuada no KOB1 e no KOB2 poderia ser atribuída ou a heterodimerização entre os receptores B2 e AT1 no KOB1 ou a homodimerização entre os receptores AT1 no KOB2. Quanto à aorta abdominal, esta se mostrou sensível à BK, mas não a DBK que não induziu resposta no WT e nos nocautes, sugerindo que este receptor não seria expresso. Entretanto aorta isolada de KOB1 teve a sensibilidade drasticamente reduzida à BK que é mediada pelo receptor B2 indicando expressão funcional importante do receptor B1 nesta preparação. Quanto a ET-1, a eficácia diminuída somente no animal KOB1 poderia ser devida à interação cruzada do receptor da ET-1 com o B2, que deixaria de dimerizar com o B1. A AII teve sua eficácia diminuída nos animais KOB1 e KOB2, sugerindo que heterodimerização entre estes receptores e também destes com o AT1 da AII poderia ocorrer, favorecendo a ação da AII. Os resultados obtidos no fundus do estômago e na aorta abdominal sugerem importância na expressão funcional simultânea dos receptores B1 e B2 em ambas as preparações, e interferência nos mecanismos de transdução de sinais, afetando a contração e relaxamento de músculos lisos vascular e não-vascular. / Purpose: to pharmacologically characterize the responses to bradykinin (BK) and other agonists in non-vascular (stomach fundus) and vascular (aorta) smooth muscles isolated from kinin B1 and B2 receptor knockout mice. Methods: stomach fundus and aorta were isolated from normal , B1 knockout and B2 knockout animals; isometric contraction recordings were obtained for potency and efficacy determinations of agonists; cumulatively and non-cumulatively increasing doses of agonists such as BK, desArg9BK (DABK), angiotensin II (AII) and endothelin (ET-1) were applyied. Results: Potency (pD2) values determined in stomach fundus of WT and KO animals revealed that the affinity of agonists was maintained. Concerning the maximal effect induced by agonists, the efficacy of BK, but not AII and ET-1 was reduced in KOB1 animals. In the vascular tissue, BK was shown to be less efficient in KOB1 and KOB2 than in WT. The responses to AII and to ET-1 were reduced in KOB1 animals but it was reverted in KOB2 animals. In addition, stomach from KOB1 was found to be impaired to relax to sodium nitroprusside whereas the relaxant response was inaltered in KOB2, indicating that the deletion of B1 receptor led to important changes in the Ca regulation mechanism. Conclusions: The finding that the relative affinity of the agonists was not affected in stomach from knockout animals suggested that in this tissue there is no cross talking between kinin receptors and other agonist receptors. However the reduction in the maximal response to BK1 receptor might favoured the homodimerization of B2, which lead to activation and dessensitization, inducing an accentuated tachyphylaxis to BK and also the reduced maximal effect. In the case of AII, which showed a high affinity and efficacy, but the tachyphylaxis was attenuated in knockout animals, it can be suggested that there was formation of homodimers of B2 receptors rather than heterodimers between kinin B2 and AII AT1 receptors due to the absence of B1 receptors. Concerning BK- but not DABK induced effect in abdominal aorta in normal and knockout animals, indicated that B1 receptors would not express in this tissue. But the drastic reduction in change in sensitivity of the aorta towards BK-induced contraction suggested that B1 receptor should be mediating kinin mediated effect. The finding that the efficacy of ET-1 was reduced in KOB1 whereas that of AII was affected in aorta of the two knockout animals suggest that there must be cross talk between kinin receptors and of ET-1 and AII or between signal transduction activateed by these agonists. It is concluded that B1 and B2 receptors in stomach fundus and in abdominal aorta both receptors play important role for functional expression of kinins and that they are involved in the mechanisms of cell signaling, affecting the vascular and non-vascular smooth muscle contraction and relaxation. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

INTRODUÇÃO: Queimaduras estão associadas a uma intensa atividade imunoinflamatória; contudo, um perfil seqüencial precoce dos níveis de TNF-α, seus receptores solúveis e endotelina (ET)-1 (um potente vasoconstritor) em pacientes queimados ainda não está claro. MÉTODOS: Foram estudados vinte pacientes com uma superfície corporal queimada (SCQ) ≥ 30% e com menos de 6h desde o acidente. Amostras de sangue foram retiradas no momento zero, 6, 12, 24h para seqüencialmente medir os níveis do TNF-α, seus receptores solúveis 1 e 2 (sTNFR1 e sTNFR2) e ET-1 usando ensaios ELISA. RESULTADOS: Idade, SCQ e lesão inalatória não foram significativamente diferentes entre sobreviventes (n=10; 30±13 anos, SCQ 40±12%) e não sobreviventes (n=11; 38±15 anos, SCQ 56±20%). Níveis do sTNFR1 estavam aumentados em não sobreviventes (2937±1676 pg/ml; 4548±1436 pg/ml) comparado aos sobreviventes (1313±561 pg/ml; 2561±804 pg/ml) nas 6 e 24h, respectivamente (P=0,01 e 0,002), enquanto níveis de sTNFR2 estavam significativamente aumentados em não sobreviventes (4617±1876 pg/ml vs 2611±1325 pg/ml) somente nas 6h (P=0,015). Níveis elevados de sTNFR1 nas 6h e TNF-α nas 12h mostraram valor preditivo positivo de 100% (para ambos marcadores) e valor preditivo negativo para mortalidade de 70 e 52%, respectivamente; risco relativo de 3,25 e 1.2, respectivamente; com intervalos de confiança de 1,4-7,3 e 1,28-3,52, respectivamente. CONCLUSÕES: Níveis aumentados de sTNFR1 e sTNFR2 foram maiores nas 6h em pacientes queimados não sobreviventes. Níveis de TNF-α e ET-1 foram similares em não sobreviventes e sobreviventes. Determinação muito precoce de sTNFR1 e sTNFR2 poderiam ajudar a identificar o risco de prognóstico adverso em pacientes grandes queimados.

Introdução: Os fitoesteróis são indicados no tratamento da hipercolesterolemia. Embora sua ação sobre a redução do colesterol já tenha sido exaustivamente estudada, não se encontra bem elucidada na literatura, a forma como atua sobre biomarcadores inflamatórios e endoteliais em indivíduos hipercolesterolêmicos. Objetivo: Avaliar o efeito do fitoesterol adicionado ao leite de soja sobre as concentrações plasmáticas de lípides e biomarcadores, além de alterações em vias transcricionais envolvidos na patogênese da aterosclerose em células linfomononucleares em indivíduos moderadamente hipercolesterolêmicos. Metodologia: Foram estudados 38 pacientes, recrutados no Ambulatório do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Inicialmente, os pacientes foram submetidos a um período basal de três semanas para avaliar a aderência e tolerabilidade ao leite de soja padrão (Placebo). Foram orientados a manter os hábitos alimentares e a atividade física. Receberam 400 mL/dia de leite de soja padrão ou enriquecido com fitoesteróis (1,6 g/dia) por dois períodos de quatro semanas em que o estudo foi randomizado, cego e cruzado. Resultados: O peso corporal foi mantido durante o estudo. O tratamento com fitoesterol reduziu o colesterol total em 5,5 % (P<0,001), a lipoproteína de baixa densidade (LDL) em 6,4 % e os triglicérides em 8,3 % (P<0,05) e aumentaram as concentrações de campesterol e sitosterol no plasma em 18,9% e 21,6%, respectivamente. Não houve alteração nos valores de lipoproteína de alta densidade (HDL). Com relação aos biomarcadores de aterosclerose, os fitoesteróis provocaram redução apenas na endotelina-1 em 11 % (P<0,05). Esta ação foi independente da redução do LDL-C. Não houve alteração no RNAm para 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A redutase e receptor de LDL. Conclusão: Os fitoesteróis são eficientes na redução da concentração plasmática do colesterol total, triglicérides, LDL-C e da endotelina-1, sendo esta última independente da redução do colesterol / Background: Phytosterols are recommended in the treatment of moderate hypercholesterolemia. Although their mechanisms of action on cholesterol reduction has been exhaustively studied, other activities, such as their effects on inflammatory arterial markers and on endothelial function, have not yet been fully investigated. Objective: To evaluate the efficacy of phytosterols added to soy milk on the reduction of plasma lipids, on biomarkers involved in the pathogenesis of atherosclerosis and on transcriptional changes in 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMGCoA) reductase and low density lipoprotein receptor in moderately hypercholesterolemic individuals. Design: Moderately hypercholesterolemic patients (n=38, mean age 58 y) were initially followed over a 3-wk baseline period to evaluate their adherence to the program and their tolerance to the added milk. Patients received soy milk (400 mL/d) or soy milk + phytosterol (1.6 g/d) for 2 periods of 4-wk each. The study was randomized, blinded and crossed. Results: Body weight was maintained during the study. Phytosterol treatment reduced the total cholesterol concentration 5.5 % (P < 0.001), low density lipoprotein (LDL) 6.4 % and triglycerides 8.3 % (P<0.05), without modifying high density lipoprotein (HDL). Phytosterol reduced plasma endothelin-1 by 11 % (P<0.05), independently of LDL-C lowering activity. No effects on LDL receptor or on HMGCoA reductase mRNA expression in mononuclear blood cells were found. Sitosterol and campesterol plasma concentrations increased with phytosterol consumption by 18.9% and 21.6%, respectively. Conclusions: Phytosterol effectively lowered plasma total cholesterol, LDL-C, triglycerides and endothelin-1 concentration. The reduction in endothelin-1 concentration was independent of the decrease in the LDL-C concentration

Relógios biológicos são marcapassos endógenos presentes tanto em eucariotos quanto em procariotos. Relógios diferentes possuem períodos distintos, e aqueles que se aproximam de 24h de oscilação são chamados circadianos. Em mamíferos, o primeiro relógio circadiano identificado situa-se no núcleo supraquiasmático, localizado no hipotálamo. O funcionamento do relógio circadiano envolve mecanismos de retroalimentação positiva e negativa, em geral tendo início com a ativação dos genes Per e Cry por CLOCK e BMAL1. Atualmente sabe-se que os relógios estão presentes em áreas do cérebro fora do núcleo supraquiasmático e em muitos tecidos periféricos. Em Drosophila e Danio rerio, os osciladores periféricos podem ser sincronizados diretamente por luz, enquanto em mamíferos o reinício de fase dos mesmos parece ser controlado por sinais regulados pelo marcapasso do núcleo supraquiasmático. Uma nova opsina, denominada melanopsina, foi recentemente descoberta na retina de todos os vertebrados estudados, em uma subpopulação de células ganglionares intrinsecamente fotossensíveis. Ela é responsável pela captura de luz e envio dessa informação para o núcleo supraquiasmático. A endotelina (ET) é um peptídeo vasoconstritor composto por 21 resíduos de aminoácidos. Existem três isoformas endógenas de ETs, designadas ET-1, ET-2 e ET-3. Três tipos de receptores para endotelinas já foram clonados, sendo eles designados ETA, ETB e ETC. Todos pertencem à família dos receptores acoplados à proteína G. Órgãos, tecidos e células de Danio rerio constituem um excelente modelo para o estudo dos genes de relógio e de ritmos in vitro. Em células embrionárias ZEM 2S deste teleósteo, constatamos a presença de melanopsina, do receptor ETA para endotelina, e dos seis genes Cry através de PCR. A presença de melanopsina também foi confirmada por imunocitoquímica. Foram realizadas curvas de crescimento em células ZEM 2S previamente mantidas por cinco dias em regime de 14C:10E (luz acesa às 9:00h). No 6º. dia, as células foram transferidas para as seguintes condições: escuro constante; 14C:10E; 10C:14E e luz constante. Houve inibição da proliferação celular por luz. O padrão de expressão temporal dos genes Per1, Cry1b, Clock e da melanopsina foi estudado, assim como sua modulação por ET-1. Células ZEM 2S foram mantidas em fotoperíodo 12C:12E (luz acesa às 9:00h) durante cinco dias, após o que foram tratadas com ET-1 nas concentrações 10-11M, 10-10M, 10-9M e 10-8M, durante 24h. O RNA extraído a cada 3h foi submetido a RT-PCR para posterior análise por PCR quantitativo. RNA ribossômico 18S foi utilizado como normalizador do experimento. Melanopsina não apresentou ritmicidade de expressão em fotoperíodo 12C:12E. ET-1 exerceu efeito bifásico, aumentando a expressão nas menores concentrações de hormônio utilizadas e diminuindo nas maiores. Na concentração 10-10M, ET-1 aparentemente estabeleceu uma oscilação ao longo das 24 horas, com crescente expressão na fase de escuro, atingindo um pico em ZT21 e decrescente durante o período de luz, com o mínimo em ZTs 6 e 9. A expressão do gene Clock é rítmica em regime fotoperíodo 12C:12E, com valores significativamente maiores em ZT12 a ZT21 do que em ZT0, ZT3 e ZT9, indicando um aumento de expressão coincidente com o período de escuro. Foi observado um pico de expressão em ZT6, durante a fase de luz. ET-1 nas concentrações de 10-11 e 10-10M aboliu o ritmo de expressão de Clock, e inibiu o pico de expressão em ZT6. Expressão de Clock permaneceu elevada somente em ZT18. Nas maiores concentrações (10-9M e 10-8M), a inibição ocorreu em todos os ZTs, abolindo completamente o ritmo e atenuando qualquer variação previamente observada entre os ZTs. A expressão do gene Per1 é rítmica em regime fotoperíodo 12C:12E, com valores significativamente maiores nos ZTs 21, 0, 3, 6 e 9 do que nos ZTs 12, 15 e 18, indicando um aumento de expressão na fase de claro. Vale mencionar que já em ZT21, há um aumento significativo antecipatório da fase de luz. Nas concentrações de 10-11 e 10-10M, ET-1 não alterou o período ou a amplitude desse ritmo. A ação evidente de ET-1 foi a inibição da expressão de Per1 na fase de luz (ZT0, ZT3, ZT6 e ZT9), e também em ZT21 (fase de escuro) nas maiores concentrações (10-9M e 10-8M) não afetando o período da oscilação, mas diminuindo marcadamente sua amplitude. A expressão de Cry1b foi rítmica durante o ciclo claro:escuro, com aumento na fase de claro e diminuição na fase de escuro. Novamente a ET-1 apresentou um efeito bifásico sobre a expressão deste gene, aumentando a mesma durante a fase de luz na concentração de 10-11M, e em ZT6 e ZT9 na concentração 10-10M. No entanto, não alterou o período ou a amplitude do ritmo. Por outro lado, durante toda a fase de luz houve inibição deste gene na presença de ET-1 10-9 e 10-8M, diminuindo a amplitude observada nas células controle. / Biological clocks are endogenous timekeepers that are present both in eukaryotic as in prokaryotic organisms. Different clocks have different periods, and those that have about 24h of oscillation are called circadian clocks. In mammals, the first identified circadian clock is located in the suprachiasmatic nucleus, in the hipothalamus. It is now well known that clocks are present in brain regions other than the suprachiasmatic nucleus and in many peripheral tissues. In Drosophila and Danio rerio, peripheral oscillators can be synchronized directly by light, while in mammals the reset of the phase seems to be controlled by signals regulated by the suprachiasmatic timekeepers. The maintenance of the circadian clock is governed by positive and negative feedback loops, in general starting with the activation of Per and Cry genes by CLOCK and BMAL1. A new opsin called melanopsin, was recently discovered in the retina of all studied vertebrates, in a subset of intrinsically photosensitive ganglion cells. This photopigment is responsible for capturing light and sending this information to the suprachiasmatic nucleus. Endothelin (ET) is a 21-amino acid residue vasoconstrictor peptide. There are three endogenous isoforms of ETs, ET1, ET2 and ET3. Three subtypes of endothelin receptors have already been cloned: ETA, ETB and ETC, all members of the family of G protein -coupled receptors. Organs, tissues and cells of Danio rerio constitute an excellent model for the study of clock genes and rhythms in vitro. In ZEM 2S embryonic cells of this teleost, we demonstrated the presence of melanopsin, the endothelin receptor ETA, and the six Cry genes by PCR. The presence of melanopsin was also confirmed by immunohistochemistry. ZEM 2S cells previously kept for five days in 14L:10D (lights on 9:00am) were transferred in the sixth day to the following conditions: constant darkness, 14L:10D, 10L:14D and constant light, and growth curves were determined. ZEM 2S showed inhibition of proliferation by light. The temporal expression pattern of the genes Per1, Cry1b, Clock and of melanopsin and their modulation by ET-1 were studied. ZEM 2S cells were kept in 12D:12L photoperiod (lights on 9:00am) for five days, and then treated with 10-11M, 10-10M, 10-9M and 10-8M ET-1, for 24h. RNA extracted every 3 hours was submitted to RT-PCR for subsequent analysis by Real Time-PCR. 18S ribosomal RNA was used to normalize the results. Melanopsin did not show rhythmicity of expression in 12D:12L photoperiod. ET-1 exhibited a biphasic effect, increasing the expression in the lower concentrations, and reducing at the higher concentrations. At 10-10M, ET-1 apparently established an oscillation along the 24h-period, with increasing expression in the dark phase, reaching a peak at ZT2, and decreasing during the light phase, with the minimum at ZT6 and 9. The expression of Clock gene was rhythmic in 12D:12L photoperiod, with significant higher values in ZT12 to ZT21 than ZT0, ZT3 e ZT9, indicating an increase of expression coincident with the dark period. A peak of expression was observed at ZT6, during the light phase. At 10-11 and 10-10M, ET-1 abolished the rhythm of expression of Clock, and inhibited the peak of expression at ZT6. Expression of Clock remained high only at ZT18. At the higher concentrations (10-9M e 10-8M), the inhibition occurred at all ZTs, completely abolishing the rhythm and attenuating any variation previously observed among ZTs. The expression of Per1 gene was rhythmic in 12D:12L photoperiod, with significant higher values at ZTs 21, 0, 3, 6 and 9 than at ZTs 12, 15 and 18, indicating an increase of expression in the light phase. It is important to mention that at ZT21 there was already a significant increase, anticipatory of the light phase. At 10-11 e 10-10M, ET-1 did not alter neither the period nor the amplitude of this rhythm. The evident action of ET-1 was the inhibition of Per1 expression in the light phase (ZT0, ZT3, ZT6 e ZT9), and also at ZT21 (dark phase), at the higher concentrations (10-9M e 10-8M), with no change in the oscillation period, but markedly reducing its amplitude. The expression of Cry1b was rhythimic during the light:dark cycle, with increase in the light phase and reduction in the dark phase. Again, ET-1 showed a biphasic effect on this gene expression, increasing it during the light phase at the concentration of 10-11M, and at ZT6 and 9 at 10-10M. However, the hormone did not affect either the period or the amplitude of the rhythm. On the other hand, along the light phase, there was inhibition of Cry1b in the presence of ET-1 10-9 and 10-8M, reducing the amplitude observed in the control cells.

Introdução: O Alcoolismo e o Diabetes são doenças bastante prevalentes em todos os continentes e seriam fatores de risco relacionados com a Disfunção Erétil. Dentre os muitos mecanismos relacionados com a ereção temos a Endotelina e seus receptores, causando intensa e sustentada contração da musculatura lisa dos corpos cavernosos penianos (CC). Acredita-se que poderia haver regulação das vias dos receptores de endotelina pelos microRNAs, que são RNAs não codificantes, regulam a expressão gênica e poderiam sofrer alteração pelos efeitos do álcool e / ou diabetes. Objetivos: Avaliar, experimentalmente com utilização de ratos, se há alteração nas vias dos receptores da endotelina devido ao efeito crônico do alcoolismo, do diabetes ou de sua associação e se existiria correlação com os microRNAs miR-155 e miR-199. Materiais e Métodos: Utilizaram-se 48 Ratos Wistar machos divididos em 4 grupos: Controle (GC), Alcoolizado (GA), Diabético (GD) e Diabético+Alcoolizado (GD+A). Foi utilizado PCR em tempo real e imunoistoquímica para estudar a expressão gênica e proteica dos receptores da endotelina ETA e ETB em corpos cavernosos e PCR em tempo real para avaliar a expressão gênica dos miR-155 e miR-199 no sangue e CC. Resultados: Análise imunohistoquímica encontrou baixa expressão dos receptores de endotelina no GC e elevada nos grupos experimentais, sendo que os receptores ETA estavam distribuídos de forma difusa e em maior concentração, enquanto os receptores de ETB localizavam-se na periferia dos CC. Análise por PCR em tempo real dos CC verificou: aumento não significativo de ETA no GD e de ETB no GD+A; hipoexpressão significativa do miR-199 no GD+A e hipoexpressão não significativa do miR-199 e miR-155 nos demais grupos experimentais em relação ao GC. Análise no sangue: hipoexpressão significativa do miR-155 no GA+D e não significativa nos demais grupos em relação ao GC, hipoexpressão significativa do miR-199 no GD e GD+A e não significativa no GA, todos em relação ao GC. Conclusões: Foi encontrado aumento dos receptores de endotelina como efeito do álcool, do diabetes e de sua associação, também identificou-se diminuição, principalmente, da expressão gênica do miR-199 nos corpos cavernosos dos grupos experimentais o que sugere a hipótese de que o aumento da endotelina poderia ser determinado pela diminuição da ação supressora do miR-199 que se encontra hipoexpresso em decorrência dos efeitos deletérios do álcool e diabetes. A descoberta de alterações em microRNAs associada ao desenvolvimento continuado da genômica pode propiciar novos diagnósticos e marcadores para inúmeras doenças, além de ajudar a identificar possíveis terapêuticas alvo moleculares. / Introduction: Alcoholism and Diabetes are very prevalent diseases in all the continents and are considered risk factors related to erectile dysfunction. Endothelin and its receptor are some of the mechanism related to erection, causing intense and sustained contracture of the penile corpus cavernosum (CC) smooth muscle. It\'s thought that micro-RNAs could regulate endothelin receptors pathways. Micro-RNAs are not coding RNAs that regulate gene expression and could be affected by alcohol and/or diabetes. Objectives: To experimentally evaluate, using rats, alterations in receptors pathways due to chronic effects of alcoholism, diabetes, alone or in association, and to correlate this alterations with miR-155 and miR-199 microRNAs. Materials and Methods: 48 male Wistar rats were used. They were divided in four groups: Control group (GC), Alcoholic group (GA), Diabetic group (GD) and Diabetic+Alcoholic group (GD+A). We used real time PCR and immunohistochemical study to evaluate gene and protein expression of endothelin ETA and ETB in corpus cavernosum tissue and real time PCR to evaluate gene expression of miR-155 and miR-199 in blood and CC. Results: Immunohistochemical analysis showed low expression of endothelin receptors in GC and high expression in experimental groups; ETA receptors were distributed in diffuse pattern and higher concentration although ETB receptors had a peripheral pattern in CC. Real time PCR analysis in CC showed: not significant ETA increase in DG and ETB increase in GD+A; significant miR-199 hypoexpression in GD+A and not significant miR-199 and miR-155 hypoexpression in other experimental groups compared to GC. Blood analysis showed significant miR-155 hypoexpression in GD+A and not significant in other experimental groups compared to CG, significant miR-199 hypoexpression in GD and GD+A and not significant in GA, compared to GC. Conclusions: We found endothelin receptors increase as an effect of alcohol abuse, diabetes and its association; we also found decrease, mainly in gene expression, of miR-199 in corpus cavernosum tissue of experimental groups, what suggests the hypothesis that endothelin increase could be determined by a decrease of suppress action of miR-199, that is hypo expressed because of deleterious effect of alcohol and diabetes. Finding microRNAs changes, associated to continuous development in genomics, could propitiates new diagnostic tools and markers to innumerous diseases and even help to identify possible new molecular target therapies.