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Esta memoria de título se inscribe en el marco del proyecto del desarrollo de la estrategia terapéutica basada en conjugados entre péptidos y nanopartículas metálicas como herramientas de diagnóstico y tratamiento para la enfermedad de Alzheimer. La estructura que adoptan estos péptidos una vez anclados a las nanopartículas es importante para el reconocimiento molecular de agregados tóxicos de la proteína amiloide beta involucrados en la enfermedad de Alzheimer. En el presente trabajo se realizaron análisis mediante diversas técnicas altamente especializadas como espectroscopia de fuerza a través de microscopía de fuerza atómica y dispersión Raman aumentada por superficie, para arrojar luces sobre la estructura del péptido adsorbido a la superficie de la nanopartícula de oro. En este sentido, uno de los detalles más significativos es el residuo de ácido aspártico; por esto, se emplearon péptidos isómeros: CLPFFD, CDLPFF y CLPDFF, estudiando el efecto de la secuencia en la carga y dispersión Raman. Se obtuvieron resultados consistentes con los reportados en estudios previos de nuestro grupo, observando mayor carga en el péptido CLPFFD, semejanteen el péptido CLPDFF, y menor en el péptido CDLPFF. Asimismo, se observó mayor aumento de la señal Raman en CDLPFF e CLPDFF. Esto hace probable que el péptido CLPFFD se disponga con su esqueleto peptídico de forma vertical con respecto a la superficie de la nanopartícula, en tanto que los isómeros se disponen en ángulos más cerrados. Estos resultados permiten explicar la mayor interacción del conjugado CLPFFD con agregados tóxicos de la proteína amiloide beta.

La proteína beta amiloide (Aβ), involucrada en la enfermedad de Alzheimer, cambia su conformación en condiciones patológicas formando agregados tóxicos (AT) que tienen un efecto neurodegenerativo. La estructura molecular de los AT todavía no se ha dilucidado debido a que Aβ no cristaliza. Su conocimiento contribuirá al diseño de fármacos capaces de interferir eficientemente en el proceso de agregación. En este, Aβ1_42 puede formar estructuras como protofibrillas, amiloesferoides o fibras amiloides (FAs). Para obtener información estructural y sondear si existe exposición de grupos hidrofóbicos en los AT de Ab1¡42, se emplearon diferentes técnicas como AFM, TEM, FV, y sondas de nanopartículas (NP) metálicas. Se estudió la interacción de los AT con sustratos hidrofílicos e hidrofóbicos y también se usaron NP de oro conjugadas al péptido CLPFFD, que reconocen selectivamente los AT. A través de espectroscopia de fuerza (FV), se estudió la interacción de los AT adsorbidos a HOPG (grafito pirrolítico altamente ordenado) con una sonda de oro funcionalizada con CLPFFD. Una de las interacciones observadas fue la adhesión, atribuible a la interacción entre residuos hidrofóbicos de los AT y CLPFFD. Además, se estudió la interacción entre LPFFD y FAs in volumen observándose la desagregación de FAs. Paralelamente, se realizaron experimentos in situ observándose que LPFFD no produce desagregación de FAs sobre HOPG, debido a que los sitios de interacción con LPFFD se encuentran bloqueados por la interacción con el HOPG. Los resultados obtenidos revelaron interesantes propiedades fisicoquímicas de los agregados, que concuerdan con algunos de los modelos actuales para la agregación de la proteína Aβ1_42. / Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / The amyloid beta peptide (Ab ), involved in Alzheimer´s disease, can change its conformation in pathologic conditions forming toxic aggregates (TA) with a neurodegenerative effect. Structure of Ab at a molecular level is unknown yet due to this protein has not been crystalized. The knowledge of the structure will contribute to the design of new drugs that can efficiently halt the aggregation process. In the aggregation process, is possible to recognize clear structures of Ab1¡42, like protofibrils, globular aggregates or amyloid fibrils (AF). To obtain information about the structure of amyloid aggregates and to probe wether exist exposition of hydrophilic or hydrophobic groups in different regions, AFM, TEM, FV and metal nanoparticles probes will be used. The interaction between the TA and hydrophobic and hydrophyilc substrates has been studied. In addition, gold nanoparticles (AuNP) were linked to the peptide CLPFFD that selectively attaches to the AF of Ab1¡42. We study with force spectroscopy (FV) mode, the interaction of the TA of Ab1¡42 adsorbed in a HOPG surface, with a gold-CLPFFD linked probe. The force curves gave information of the interaction between the AF of Ab1¡42 and the peptide sequence CLPFFD. One of the interactions observed was the adhesion, attributable to the interaction between hydrophobic residues. Therefore, we study the interaction between LPFFD and AF of Ab1¡42 in volumen observing the disaggregation. In contrast, in experiments done in situ, disaggregation was not observed due to the blocking of the AF by HOPG to LPFFD that avoid the interaction. The obtained results reveals interesting physicochemical properties of the TA which are in agreement with some of the recently proposed models for the Ab1¡42 aggregation

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Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo caracterizado por la pérdida progresiva de memoria. Los oligómeros solubles sinaptotóxicos del péptido β-amiloide (AβOs) son reconocidos como los agentes causantes de la EA. Los AβOs se unen a las neuronas hipocampales e inducen la generación de señales de Ca2+intracelulares persistentes, que se deben a su entrada por el receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) y la subsecuente amplificación a través dela activación de los receptores de ryanodina (RyR). Los RyR residen en el retículo endoplasmático (RE) y son activados por Ca2+, liberando Ca2+ desde el lumen de este compartimiento al citoplasma. Las señales de Ca2+ persistentes y de baja intensidad generadas por los AβOs y mediadas por los RyR inducen la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares por un mecanismo no del todo dilucidado. Por su parte, los ROS disminuyen el umbral de activación de los RyR por Ca2+, debido a que la actividad de estos receptores está estrechamente regulada por su estado redox. Antecedentes del laboratorio muestran que los AβOs, adicionados en concentraciones subletales a cultivos primarios de neuronas de hipocampo, causan la fragmentación de la red mitocondrial y la disminución de los niveles transcripcionales de la isoforma 2 del RyR (RyR2). Adicionalmente, la incubación previa de las neuronas con el antioxidante general N-acetil-cisteína (NAC) previene la generación de señales de Ca2+ aberrantes y la fragmentación de la red mitocondrial inducida por los AβOs. En la presente tesis, se estudiaron los efectos delos antioxidantes NAC y EUK-134 sobre la disfunción mitocondrial y la disminución de la expresión de RyR2 inducidos por los AβOs. Para cumplir con este objetivo, se trataron cultivos hipocampales de ratas con 0,5 μM AβOs y se evaluó: 1) la generación de ROS en la mitocondria utilizando la sonda MitoSox (que detecta superóxido - O2−·) o la transfección de las neuronas con HyPerMito (que detecta peróxido de hidrógeno -H2O2) por microscopia confocal; 2) la morfología de la red mitocondrial en neuronas cargadas con el marcador mitocondrial MitoTracker, por microscopía confocal; y 3) los niveles transcripcionales de RyR2, por PCR en tiempo real. Los resultados muestran que la incubación de las neuronas con 0,5 μM AβOs generó un aumento lento pero progresivo de la concentración de O2−· y deH2O2mitocondrial. El tratamiento previo con NAC o con EUK-134 previno tanto el aumento de los niveles de O2−· como deH2O2 inducidos por los AβOs. De forma interesante, el tratamiento con ryanodina, un inhibidor de los RyR, también previno el aumento en los niveles de O2−· yH2O2 inducidos por los AβOs, sugiriendo que este efecto es mediado por los RyR. Además, la incubación previa de las neuronas con EUK-134 previno la fragmentación de la red mitocondrial inducida por los AβOs, tal como se demostró con NAC. Por último, la incubación con NAC también previno de forma significativa la disminución de la expresión de RyR2 inducida por los AβOs, sugiriendo que los ROS podrían modular la transcripción de RyR2. Como conclusión, los datos obtenidos en esta tesis apoyan la idea de que los efectos deletéreos de los AβOs sobre la mitocondria y sobre los niveles transcripcionales de RyR2 son mediados por el RyR, cuya actividad es, a su vez, modulada por los ROS. Estos efectos deletéreos de los AβOs son prevenidos farmacológicamente por el uso de antioxidantes como el NAC y el EUK-134 / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by progressive memory loss. Synaptotoxic soluble oligomers of the β-amyloid peptide (AβOs) are recognized as the causative agents of the disease. AβOs bind to hippocampal neurons and elicit persistent intracellular Ca2+ signals, which are due to its entry by the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor and subsequent amplification by the activation of ryanodine receptors (RyR). RyRare resident in endoplasmic reticulum (ER) and are activated by Ca2+, releasing Ca2+ from the lumen of this organelle to the cytoplasm. The persisted RyR-mediated Ca2+ signals generated in neurons in response to AβOs induce the production of reactive oxygen species (ROS), by a mechanism not yet fully elucidated. In turn, ROS decrease the threshold of RyR activation by Ca2+, since RyR activity is tightly regulated by its redox state. Previous works from the laboratory showed that AβOs, added at sublethal concentration to primary cultures of hippocampal neurons, induces mitochondrial network fragmentation, increases the concentration of reactive oxygen species (ROS) and causes deregulation of transcriptional levels of RyR2.Interestingly, previous incubation of neurons with the general antioxidant NAC prevented the generation of aberrant Ca2+ signals and mitochondrial fragmentation induced by AβOs. In this thesis, we studied the protective effects of the antioxidants N-acetyl-cysteine (NAC) and EUK-134 on the mitochondrial dysfunction and the decrease in RyR2 expression induced by AβOs. To this, rat hipocampal neurons were treated with 0,5 μM AβOs to evaluate: 1) Mitochondrial ROS generation, using the MitoSox dye (detects superoxide - O2−·) or the transfection of the neurons with HyPerMito (detects hydrogen peroxide -H2O2) by confocal microscopy; 2) Mitochondrial morphology in neurons loaded with the dye MitoTracker, by confocal microscopy; and 3) RyR2 trascriptional levels, by real time PCR. The results showed that the incubation of neurons with 0.5 μM AβOs generated a slow but progressive increase in the mitochondrial concentration of both O2−· and H2O2. Pretreatment with NAC or EUK-134 prevented this effect. Interestingly, treatment with ryanodine, a RyR inhibitor, also prevented the increase in H2O2 andO2−·in response to AβOs, indicating that RyR mediates this effect. Moreover, preincubation of the neurons with EUK-134 prevented mitochondrial network fragmentation induced AβOs, as previously shown with NAC. Finally, the incubation with NAC also significantly prevented the decrease in RyR2 expression induced by AβOs, indicating that ROS might modulate RyR2 transcription. In conclusion, the data obtained in this study support the idea that the deleterious effects of AβOs on mitochondrial morphology and function and on RyR2expression are mediated by RyR, whose activity is modulated by ROS. These deleterious effects of AβOs are prevented pharmacologically by using antioxidants like NAC and EUK-134

El desafío que plantea el tratamiento de patologías producidas por el plegamiento incorrecto y la agregación de proteínas que dan origen a especies tóxicas, ha llevado a nuestro grupo de investigación al desarrollo de una nueva estrategia terapéutica basada en el empleo de nuevos nanobiomateriales. Nanopartículas de oro (AuNP) conjugadas a péptidos con afinidad por los agregados proteicos tóxicos que desencadenan estas enfermedades, podrían ser dirigidas específicamente a éstos y efectuar localmente una suerte de “cirugía molecular” al ceder la energía que se les puede entregar a través de campos magnéticos oscilantes, convirtiéndolos de esta manera en especies menos tóxicas. Así, esta tesis se enmarca dentro de la primera etapa de este proyecto y pretende obtener conjugados AuNP-Péptidos estables y capaces de unirse selectivamente a los agregados tóxicos de la proteína -amiloide (A) involucrada en la enfermedad de Alzheimer. En consecuencia, se sintetizaron AuNP a través de la reducción de ácido tetracloroáurico (HAuCl4) con citrato de sodio dihidratado en presencia y ausencia de -ciclodextrinas,se conjugaron al péptido CLPFFDNH2 (INH), péptido modificado a partir del péptido disruptor de láminas  LPFFDNH2 que posee afinidad por los agregados tóxicos de A, y a dos de los isómeros de INH para evaluar si el grado de interacción con los agregados de A es secuencia dependiente. Finalmente, se evaluó la estabilidad de los conjugados obtenidos en diferentes condiciones de pH, temperatura, y fuerza iónica, teniendo en cuenta realidades cercanas a las fisiológicas. Se obtuvieron AuNP con tamaños promedio de 6 y 10 nm, y conjugados AuNP-Péptido que mostraron afinidad por A y ser estables a pHs que se aproximan a los fisiológicos y concentraciones cercanas a 100 mM de NaCl, lo que traza un camino prometedor hacia el desarrollo de esta nueva estrategia terapéutica para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades conformacionales.

Doctor en Ciencias Mención Biología Molecular, Celular y Neurociencias. / El estrés oxidativo y la desregulación de la señalización de calcio son señales importantes en una variedad de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (EA). El factor de transcripción STAT3 tiene un rol crucial en el desarrollo y mantención del sistema nervioso. Recientemente, la pérdida de la actividad transcripcional de STAT3 ha sido ligada a la EA. En este trabajo, tratamos astrocitos primarios con los oligómeros del péptido β-amiloide (AβOs), los cuales muestran una potente actividad sinaptotóxica, y estudiamos los efectos de los mediadores presentes en el medio condicionado de astrocitos tratados con AβOs (MCA+AβOs) en la depleción nuclear de STAT3 fosforilado en el residuo 727 (pSer-STAT3) en las neuronas. El tratamiento de los cultivos neuronales ricos en astrocitos con 0,5 μM de AβOs indujo en las neuronas una disminución significativa de pSer-STAT3, pero no de fosfotirosina 705-STAT3, la otra forma fosforilada de STAT3. Esta disminución no ocurrió en cultivos neuronales pobres en astrocitos revelando un rol fundamental de los astrocitos en esta respuesta. Para probar si los mediadores, liberados por los astrocitos en respuesta a los AβOs, induce la depleción nuclear de pSer-STAT3, cultivos neuronales pobres en astrocitos fueron tratados con MCA+AβOs, lo que causó depleción nuclear de pSer-STAT3 pero no modificó los niveles totales de STAT3. El uso de catalasa y hemoglobina extracelular previno la depleción nuclear de pSer-STAT3 causada por el MCA+AβOs, indicando que posiblemente el peróxido de hidrógeno y el óxido nítrico son los mediadores liberados por los astrocitos involucrados en esta respuesta. Además, el MCA+AβOs indujo un aumento significativo de la espresión y la secreción de la citoquina pro-inflamamtoria IL-6. El MCA+AβOs aumentó el tono oxidativo neuronal y generó en las neuronas señales de calcio mediadas por el receptor de ryanodina, que son esenciales para la depleción nuclear de pSer-STAT3. Usando adenovirus, se demostró que la inhibición de calcineurina abolió la depleción nuclear de pSer-STAT3 inducida por el MCA+AβOs: También se demostró que la activación de calcineurina produjo un leve aumento de la depleción nuclear y mayor defosforilación de pSer-STAT3 en las neuronas, revelando que si bien calcineurina participa en la depleción nuclear de pSer-STAT3, no es el único componente involucrado en el proceso. En suma, el MCA+AβOs generó una disminución significativa de los niveles de ARNm de genes de sobrevivencia Bcl-2 y survivina y un aumento de la razón pro-apoptótica Bax/Bcl-2. No obstante, el MCA+AβOs no promovió la apoptosis por si solo. El MCA+AβOs sensibilizó a la neuronas hacia la muerte apoptótica pero solo en presencia de NMDA a concentraciones excitotóxicas. Esta es la primera descripción que el MCA+AβOs promueve señales de calcio neuronales que regulan la distribución nuclear de pSer-STAT3 en las neuronas. En esta tesis se propone que los AβOs inducen la producción de peróxido de hidrógeno, óxido nitric e IL-6, lo cual aumenta el tono oxidativo neuronal, generando una señal de calcio que activa la fosfatasa calcineurina, la cual causa (en parte) la depleción nuclear de pSer-STAT3 y la pérdida de la actividad transcripcional protectora de STAT3. / Oxidative stress and dysregulation of calcium signaling are pivotal signs in a variety of neurodegenerative diseases, including Alzheimer´s disease (AD). The transcription factor STAT3 has a crucial role in the development and maintenance of the central nervous system. Recently, the loss of transcriptional activity of STAT3 has been linked to AD. In this work, we treated astrocytes with amyloid beta peptide oligomers (AβOs), which display potent synaptotoxic activity, and studied the nature and effects of astrocyte-conditioned medium treated with AβOs on the nuclear depletion of neuronal serine-727-phosphorylated STAT3 (pSer-STAT3). Treatment of mixed neuron-astrocyte cultures with 0.5 μM AβOs induced in neurons a significant decrease of nuclear pSer-STAT3, but not of phosphotyrosine-705 STAT3, the other form of STAT3 phosphorylation. This decrease did not occur in astrocyte-poor neuronal cultures revealing a pivotal role for astrocytes in this response. To test if mediators released by astrocytes in response to AβOs induce pSer-STAT3 nuclear depletion, we used conditioned medium derived from AβOs-treated astrocyte cultures (ACM+AβOs). Treatment of astrocyte-poor neuronal cultures with ACM+AβOs caused pSer-STAT3 nuclear depletion but did not modify overall STAT3 levels. Extracellular catalase and haemoglobin prevented the pSerSTAT3 nuclear depletion caused by AβOs, indicating that reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide could mediate this response. Besides, ACM+AβOs produced an increase of production and secretion of the pro-inflamamtory cytokine IL-6. Also, ACM+AβOs increased the neuronal oxidative tone and calcium signals in neurons, leading to a ryanodine-sensitive intracellular calcium signal that proved to be essential for pSer-STAT3 nuclear depletion. Using adenoviruses we showed that calcineurin inhibition abolished the nuclear depletion of pSer-STAT3 induced by ACM+AβOs and that calcineurin activation produced just a mild increase of the nuclear depletion of pSer-STAT3 in neurons, revealing that calcineurin participate in nuclear depletion of pSer-STAT3, however, it is not the only component involved in the process. In addition, ACM+AβOs generated decreased Bcl-2 and Survivin transcription and significantly increased Bax/Bcl-2 ratio but ACM+AβOs did not execute apoptosis itself. ACM+AβOs sensibilized neurons to apoptotic death when it was incubated in presence of NMDA at an excitotoxic concentration. This is the first description that ACM+AβOs and neuronal calcium signals jointly regulate pSer-STAT3 nuclear distribution in neurons. We propose that AβOs induce hydrogen peroxide, nitric oxide and IL-6 production, which by increasing the neuronal oxidative tone, generate a calcium signal that activates the phosphatase calcineurin, which cause (in part) pSer-STAT3 nuclear depletion and loss of STAT3 protective transcriptional activity. / -Beca CONICYT doctorado nacional N°21130445 y extensión de beca doctoral. -Proyecto Anillo ACT-1114 del Programa de investigación asociativa de CONICYT (PIA, adjudicado por el Dr. Marco Tulio Núñez) -Proyecto FONDECYT 1150736 (adjudicado por la Dra. Andrea Paula-Lima) -Proyecto FONDECYT 1130068 (adjudicado por el Dr. Marco Tulio Núñez) -Becas CONICYT de asistencia a congresos N°81140457 (2014) y N°81150376 (2015) También quiero agradecer a las siguientes instituciones internacionales que gracias a sus becas me permitieron asistir a diferentes cursos de neurociencia y a congresos internacionales de alto nivel: -International Society for Neurochemistry (ISN) por el financiamiento completo para asistir al curso “3rd ISN Latin American School of Advanced Neurochemistry” (Montevideo, Uruguay, 2014) y la beca para asistir al congreso “26th ISN-ESN biennal meeting” en Paris, Francia (2017). -International Brain Research Organization (IBRO) por el financiamiento completo para asistir al curso “IBRO-USCRC 10th Canadian School of Neuroscience” (Montreal, Canadá, 2016) y al congreso “10th Annual Canadian Neuroscience Meeting” en Toronto (2016) y por la beca para asistir al congreso “13th Conference Alzheimer and Parkinson Disease” en Viena, Austria (2017). -Francais Société des Neurosciences-IBRO quienes financiaron mi viaje a Bordeaux, Francia para asistir al congreso “NeuroFrance 2017” y buscar postdoc. -Grass Foundation, IBRO LATP y USCRC y a Society for Neuroscience quienes financiaron mi beca completa para participar en el curso: “Latinoamerican Training program 2018” en Valparaíso, Chile y quienes financiarán mi participación en el congreso Society for Neuroscience 2019 en Chicago, EEUU. / Diciembre 2019

Este trabajo de tesis se basó en el diseño y síntesis de compuestos bioactivos, a partir de estructuras inspiradas en productos naturales, con el propósito de contribuir al descubrimiento de nuevos inhibidores de colinesterasas de carácter multifuncional, con potencial aplicación para la terapia de la enfermedad de Alzheimer. En primer lugar, en el capítulo III de esta tesis se llevó a cabo la optimización mediante calentamiento con equipo de microondas, de la síntesis de derivados de azaestilbeno mediante la incorporación de un espaciador y una amina terciaria a una estructura análoga al azaresveratrol, de conocida actividad biológica. Se obtuvieron 19 compuestos, todos resultaron inhibidores de acetilcolinesterasa (ACE) y butirilcolinesterasa (BuCE). El derivado con un anillo de piperidina unido al azaestilbeno por un espaciador de siete carbonos (12b) fue el inhibidor más potente para ACE. Asimismo mostró inhibición significativa de ACE en células de neuroblastoma humanas SH-SY5Y, sin efecto citotóxico. A su vez, el estudio cinético enzimático mostró una inhibición no competitiva y el modelado molecular reveló interacciones con el sitio activo catalítico así como también con el sitio aniónico periférico de ACE. El estudio de dinámica molecular de los derivados con piperidina y linker de seis (11b), siete (12b) y ocho carbonos (13b) mostró que la conformación que adopta 12b permite interacciones más efectivas que los otros análogos, justificando así su mayor potencia de inhibición observada experimentalmente. Por otro lado, el derivado con pirrolidina y un espaciador de siete carbonos (12a) fue el inhibidor más potente para BuCE. Continuando con la misma estrategia de diseño, en el capítulo IV se obtuvieron 14 análogos de azobenceno mediante la síntesis asistida por microondas comprendida en dos etapas, en un tiempo total no superior a 40 minutos. Todos los compuestos resultaron potentes inhibidores de ACE. El derivado de azobenceno disustituído con dos linkers de cinco carbonos unidos a un anillo de piperidina, 21b, fue el inhibidor más potente. Mediante exposición con luz UV, se logró la fotoisomerización E→Z de los derivados 18b y 20b evaluada por espectroscopia UV-Vis y RMN de 1H. Ambos, mostraron una mayor potencia de inhibición enzimática en su configuración Z comparada con la E. De esta manera, el mejor resultado de IC50 de toda la serie (E y Z) se obtuvo para el isómero Z del compuesto 20b. En el capítulo V, mediante síntesis asistida por microondas se obtuvieron 6 nuevos compuestos híbridos de teofilina y pirrolidina, con una cadena hidrocarbonada de 3 a 8 carbonos. El derivado 27a con un linker de siete carbonos fue el inhibidor más potente de la serie. Por otro lado, 25a, que presenta un espaciador de cinco carbonos, activó el receptor muscular de acetilcolina (nAChR) a concentraciones muy bajas (de 0,01 pM) y a la concentración más alta probada (30 μM) se observó una disminución en la duración media de apertura, lo que sugiere que este compuesto actúa como un agonista del receptor y también un bloqueador de canal abierto. Por último, la síntesis one pot de nuevas bislofinas es abordada en el capítulo VI, la cual se optimizó mediante calentamiento por microondas logrando una importante disminución de los tiempo de reacción y evitando el uso del ácido de Lewis como catalizador. Tres de los seis compuestos sintetizados resultaron inhibidores selectivos de BuCE. Por otro lado, de la serie completa de los derivados de bislofina evaluados como inhibidores enzimáticos, el compuesto IIIB fue el inhibidor selectivo más potente de BuCE, a escala nanomolar. El estudio cinético enzimático de este mostró una inhibición no competitiva. / This work was based on the design and synthesis of bioactive compounds, inspired by natural products structures, with the aim of contributing to the discovery of new multifunctional cholinesterase inhibitors, with potential application in the Alzheimer’s disease therapy. Initially, in chapter III this thesis describes the optimization of the synthesis of azaestilbene derivatives, by microwave-assisted reactions. A spacer and a tertiary amine were incorporated into a structure analogous to azaresveratrol, a compound of known biological activity. Nineteen new compounds were obtained, all of them were able to inhibit both acetyl- and butyrylcholinesterase. For acetylcholinesterase, the best inhibition was achieved with the derivative 12b with a seven-carbon spacer connecting the amine with the azastilbene portion. In addition, compound 12b elicited significant inhibition of acetylcholinesterase activity in SH-SY5Y human neuroblastoma cells, with no cytotoxicity. In turn, the enzymatic kinetic study showed non-competitive inhibition and the molecular modeling revealed interactions with the catalytic active site as well as with the peripheral anionic site of the enzyme. The molecular dynamic study of the derivatives with piperidine and linker of six (11b), seven (12b) and eight carbons (13b) was carried out. This study showed that the conformation that 12b adopts allows more effective interactions than the other analogues. In this way, the greater inhibition efficiency observed experimentally for 12b, is justified. On the other hand, the pyrrolidine derivative with a seven-carbon spacer (12a) was the most potent inhibitor for butyrylcholinesterase. Continuing with the same design strategy, in Chapter IV, fourteen new azobenzene analogs were obtained by microwave-assisted synthesis. This synthesis was based on two steps, with a total reaction time no longer than 40 minutes. All the derivatives were potent acetylcholinesterase inhibitors. The azobenzene derivative disubstituted with two five-carbon linkers attached to a piperidine ring, 21b, was the most potent inhibitor. Upon UV-light irradiation, isomerization from the E-form to the Z-form of derivatives 18b and 20b was achieved. The E-Z isomerization was corroborated by UV−Vis spectroscopy and 1H NMR spectra. Both compounds showed a higher potency of enzyme inhibition in their Z configuration compared to E. Thus, the best IC50 value of the entire series (E and Z) corresponds to the Z isomer of compound 20b. Chapter V details the microwave-assisted synthesis of five new hybrid compounds of theophylline and pyrrolidine, with a hydrocarbon chain of three to seven carbons. Derivative 27a with a seven-carbon linker was the most powerful inhibitor in the series. On the other hand, 25a, which has a five-carbon spacer, activated muscle nAChR at an extremely low concentrations (from 0.01 pM). At the highest tested concentration (30 μM) a decrease in the mean open duration was observed, which suggest that 25a also acts as an open channel blocker. Finally, the one-pot synthesis of new bislofinas is addressed in chapter VI. This synthesis was optimized by microwave heating, getting a significant reduction in reaction time and avoiding the use of Lewis acid as a catalyst. Three of the six synthesized compounds were selective butyrylcholinesterase inhibitors. On the other hand, compound IIIB was the most potent selective butyrylcholinesterase inhibitor in the whole series evaluated, with an IC50 value in the nanomolar scale. Its enzymatic kinetic study showed non-competitive inhibition