El presente trabajo de investigación parte de la gran preocupación en las entidades encargadas de la salud pública y bienestar de las personas. La denominada organización “Stop TB”, donde participan países con elevados índices de morbilidad de tuberculosis, expresaron la necesidad de tomar cartas en el asunto contra la TBC denominada como una de las principales enfermedades que causa fallecimientos en el mundo e implica impedimentos para el surgimiento y desarrollo de naciones; pese a que la Organización de las Naciones Unidas (ONU) ha planteado estrategias de afrontamiento y cura en todo el mundo, las cifras de nuevos casos se vienen incrementando, a pesar de contar con medicamentos y tratamientos adecuados para combatir la enfermedad. Las medidas “preventivas promocionales” que se han implementado, han podido sumar para un cierto sector de ciudadanos en un gran porcentaje, pero nos encontramos con secuelas y factores causados durante y posterior al haber recibido tratamiento y diagnosticado con Tuberculosis Pulmonar, que probablemente no hayan sido estudiados. Una de ellas ha sido la importancia y el valor del “Soporte Social” que recibe y percibe el paciente, junto a los síntomas depresivos que podrían ir presentándose durante o después del tratamiento. Al tener estos dos aspectos, se puede generar una posible relación negativa inversa que fomente el menor número de casos.

La Neumonía Aguda de la Comunidad (NAC) es una infección del parénquima pulmonar que se manifiesta por síntomas (fiebre, tos nueva o exacerbación de la tos y secreciones muco purulentas) y signos de infección respiratoria baja asociados a un infiltrado nuevo en la radiografía de tórax y se presenta en pacientes no hospitalizados durante los catorce días previos a la hospitalización.

Al momento de iniciar los estudios que dieron lugar a la presente Tesis Doctoral, la identificación de organismos del cBc en nuestro país presentaba serias limitaciones. Los métodos utilizados a nivel hospitalario eran las técnicas bioquímicas de rutina y los estudios de resistencia a antimicrobianos se hacían empleando los métodos de determinación de CIM convencionales. La epidemiología del cBc en Argentina era muy poco conocida y las metodologías de identificación basadas en técnicas de PCR (PCR-recA primers EE) se encontraban limitadas a un solo nosocomio. Asimismo, en los principales centros de atención de FQ del país se registraba en el año 2004 un aumento considerable de aislamientos de bacterias cuya tipificación era compatible con miembros de cBc. Esta situación fue motivo de gran preocupación en los centros de salud debido a que la identificación del cBc, a nivel de género, solía demorar entre 3–7 días debido a la naturaleza de las técnicas fenotípicas disponibles y en consecuencia esto implicaba una retraso en el inicio del tratamiento antimicrobiano y de las prácticas de aislamiento de los pacientes. En este contexto era de suma necesidad contar con un método rápido, económico y confiable que permitiera la identificación de los principales patógenos respiratorios recuperados de muestras de pacientes FQ y en especial de organismos del cBc. Esta situación motivó a Servicios de Bacteriología de hospitales locales (Hospital de Niños y Rossi de La Plata) a requerir de nuestro Instituto la posibilidad de desarrollar nuevas estrategias de identificación de estos organismos. Ese año 2004 se registró un importante aumento en el número de aislados del cBc en una sala de pacientes FQ del Hospital de Niños de La Plata. Los aislados no pudieron ser discriminados a nivel de especie por el servicio de bacteriología local. A partir de esta situación de base los objetivos generales de este trabajo fueron desarrollar métodos rápidos, sencillos y precisos que permitieran la discriminación e identificación de especies estrechamente relacionadas del cBc y de BNF presentes en infecciones pulmonares de pacientes FQ. Para este objetivo se decidió estudiar la aplicación de nuevas tecnologías fisicoquímicas basadas en la espectroscopía FT-IR y la espectrometría de masa MALDI-ToF. Asimismo se consideró evaluar la acción de antimicrobianos comúnmente empleados en el tratamiento de infecciones pulmonares causadas por el cBc empleando la metodología convencional y el modelo de crecimiento en biofilm. En particular se propuso estudiar en detalle los siguientes ítems: 1.- Desarrollar el empleo de la espectroscopía FT-IR y métodos de análisis multivariantes (análisis de cluster y redes neuronales artificiales) como herramienta para la discriminación e identificación de especies pertenecientes al cBc y BNF relevantes en infecciones pulmonares de pacientes con FQ. 2.- Evaluar el uso de la espectrometría de masa MALDI-ToF mediante detección de biomarcadores específicos y análisis multivariante que conduzcan a la discriminación e identificación de especies pertenecientes al cBc y BNF relevantes en FQ. 3.- Determinar el perfil de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos de especies del cBc procedentes de centros nosocomiales y del ambiente por test convencionales. 4.- Evaluar el efecto de los agentes antimicrobianos en cultivos en biofilms de aislados clínicos y ambientales del cBc.

A pesar del continuo progreso en quimioterapia, radioterapia y cirugía, las tasas de sobrevida para pacientes con tumores sólidos son aun insatisfactorias. Investigaciones recientes han mostrado áreas moleculares más específicas que son potenciales blancos para la intervención terapéutica: en particular, las señales intracelulares de los factores de crecimiento que regulan la proliferación celular. Un desequilibrio en esas vías intracelulares puede resultar en proliferación celular descontrolada llevando al desarrollo de tumores. EGFR es un excelente “target” para la terapia del cáncer debido a que es el receptor mas frecuentemente expresado en una variedad de canceres. De manera importante, en ciertos tumores, la expresión de EGFR esta asociada con enfermedad avanzada y pobre pronostico clínico. Esta asociación ha llevado al desarrollo de un número de terapias innovadoras que hacen blanco en este factor de crecimiento y sus vías intracelulares activadas.

El síndrome de distrés respiratorio del adulto (SDRA) se caracteriza por una disminución de la compilancia pulmonar, un aumento del shunt derecha-izquierda e hipertensión pulmonar aguda por vasoconstricción pulmonar, dando lugar a una alteración de la relación ventilación-perfusión (V./O) y profunda hipoxemia. El SDRA se puede inducir experimentalmente mediante lavados pulmonares repetidos. El descubrimiento del factor de relajación derivado del endotelio (EDRF), sU identificación como óxido nítrico (NO) o un compuesto donador de NO y el desarrollo de inhibidores de la enzima óxido nítrico sintetasa (NOS), ha puesto en evidencia un nuevo e importante mecanismo regulador de la circulación sistémica y pulmonar. Además, la reciente observación de que la inhalación del gas NO produce vasodilatación pulmonar sin vasodilatación sistémica, puede proporcionar una nueva estrategia terapéutica en la insuficiencia respiratoria aguda. El propósito de este estudio fue investigar los efectos del gas NO inhalado y la infusión de N°-nitro L-arginina metil ester (L-NAME), un inhibidor de la NOS, ambos independientemente y combinados en la hemodinámica sistémica y pulmonar e intercambie de gases en un modelo experimental de SORA. Las hipótesis fueron que la inhalación de NO gas produciría vasodilatación selectiva de las regiones pulmonares ventiladas, reduciendo la hipertensión pulmonar y disminuyendo el shunt al mejorar las relaciones V(A)/Q, independientemente del flujo pulmonar: la infusión de L-NAME aumentaría la vasoconstricción pulmonar hipóxica (VPH) mejorando también las relaciones V(A).Q y potenciaría los efectos del NO sobre el intercambio de gases, ya que al aumentar la VPH aumentaría el flujo hacia las zonas ventiladas y vasodilatadas por la inhalación de NO; y dado que el NO activa al enzima guanil ciclasa y produce un aumento de GMPc, responsable de la vasodilatación, los niveles plasmáticos de GMPc deberían aumentar con la inhalación de NO. Tras aprobación por el Subcomité de Protección de Animales para la Investigación del Hospital General de Massachusetts, se estudiaron 21 ovejas de la raza Suffolk de 30-35 kg., anestesiadas con pentobarbital, intubadas y ventiladas mecánicamente con FlO(2) entre 0,85-0,90. Fueron Instrumentadas para medir: presión arterial sistémica (PAS), presión de arteria pulmonar (PAP), presión venosa central (PVC) y presión de aurícula izquierda (PAI). El gasto cardíaco se medió por termodilución. Se realizaron análisis de gases en sangre arterial y venosa mixta. Las resistencias vasculares sistémicas (RVS), resistencias vasculares pulmonares (RVP) y shunt intrapulmonar o mezcla venosa (Q(VA)/Q(I)) se calcularon mediante fórmulas estándar. Los niveles plasmáticos de GMPc se midieron en sangre arterial y venosa mixta mediante radloinmunoensayo. Se efectuó lavado pulmonar bilateral con una solución de Tween 80 en suero fisiológico a 37°C. Los animales se estudiaron en dos fases: 1) Estudio preliminar: Se estudió la estabilidad del modelo de lavado, se hizo una curva de dosis-respuesta a diferentes concentraciones de NO y se estudiaron los efectos hemodinámicos y gasométricos de la infusión de L-NAME. 2) Estudio experimental: Se estudiaron en los siguientes tiempos: Basal (BASl), después del lavado pulmonar bilateral (LPB), tras 10 min. de la inhalación de 60 ppm de NO (NO), 10 min. después de interrumpir la inhalación de NO (BAS2), después de la infusión de 30 mg/kg de L-NAME (L-NAME), de nuevo durante 10 min. de la InhalacIón de 60 ppm de NO (L-NAME+NO), 10 min. tras cesar la inhalación de NO (BASJ) y tras la infusión de 1 g/kg de L-Arginina (L-ARG). Todas las mediciones se realizaron a tres niveles de GC excepto en los tiempos BL2, BLJ, L-ARG. La medición del GMPc se realizó también sin manipular el GC. Todos los valores se expresaron como media±error estándar. Se ha aplicado el test de la T de Student para datos apareados con corrección de Bonferroni, regresión lineal y análisis de la variancia según era conveniente. Los resultados del estudio preliminar demostraron que tras el lavado pulmonar bilateral se produce una lesión pulmonar caracterizada por hipoxemia severa, aumento del shunt o mezcla venosa, hipertensión pulmonar moderada y aumento de la presión inspiratoria máxima. Todos los cambios permanecieron estables a lo largo del período estudiado de 4 horas. La máxima reducción en la PAP se consiguió respirando entre 30 y 60 ppm de NO, mientras que la inhalación entre 60-120 ppm causó la máxima reducción en la Q(VA)/Q(I). La infusión de L-NAME provocó un aumento en la PAP, las RVS y RVP, y una marcada reducción del GC, así como de la (Q(VA)/Q(I)) En el estudio experimental, la inhalación de NO por un breve periodo de tiempo produjo una rápida disminución de la PAP y de las RVP: no produjo ningún efecto sobre la FAS ni sobre el GC y mejoró la eficacia del intercambio de gases, al aumentar la PAP y reducir el shunt intrapulmonar. La infusión de L-NAME, inhibidor de la síntesis endógena de óxido nítrico, provocó vasoconstricción pulmonar y sistémica y una marcada reducción del GC, sin modificar el intercambio de gases. La inhalación de NO después de la infusión de L-NAME produjo de nuevo una vasodilatación pulmonar selectiva sin vasodilatación sistémica y una mejoría del intercambio de gases al reducir el shunt intrapulmonar, pero su efecto sobre la oxigenación no se potenció por la infusión previa de L-NAME, por lo que la infusión de L-NAME no aumentó la vasoconstricción pulmonar de manera selectiva en las zonas hipóxicas del pulmón. Los efectos hemodinámicos y gasométricos durante la inhalación de NO, tanto antes como después de la infusión de L-NAME, fueron independientes del flujo pulmonar o GC. Mientras que los efectos de la infusión de L-NAME sobre la (Q(VA)/Q(I)) fueron dependientes del flujo pulmonar o GC. Finalmente, solo durante la inhalación de NO hubo liberación de GMPc por el pulmón a la circulación sistémica. En el presente modelo experimental podemos concluir que la inhalación de NO produce una vasodilatación pulmonar selectiva y una mejoría del intercambio de gases, independientemente del flujo pulmonar o GC y que sus efectos son mediados por el GMPC. / In the present study we examined the effects of inhaling nitric oxide (NO) on pulmonary hemodynamics and gas exchange in an ovine model of adult respiratory distress syndrome (AROS), induced by repeated lung lavages. In addition we investigated in this modal the effects of inhibition endogenous NO synthesis by NG-nitro-Larginine metyl ester (L-NAKE) and the combination with inhaled NO. Because NO activates guanylate cyclase, increasing guanosine 3’-5'- cyclic monophosphate (cGMP) we also we measured cGMP plasma levels. In anesthetized and mechanically ventilated sheep inhaling 60 ppm of NO after lung lavage decreased pulmonary artery pressure and resistance without any systemic hemodynamic effects, increased arterial PaO(2) and decreased venous admixture (Q(VA)/Q(I)). A L-NAME infusion produced pulmonary and systemic vasoconstriction without changes on PaO(2) or (Q(VA)/Q(I)) inhaling NO after L-NAME produced the same hemodynamics and gas exchange effects than inhaling NO alone. The effects on inhaled NO were independent of pulmonary blood flow or cardiac output. During NO inhalation plasma cGMP levels were increased significantly. We concluded that in this experimental model of AROS inhaled NO produced selective pulmonary vasodilatation and improved gas exchange by incressing cGMP concentration in ventilated lung regions and these effects were not potentiated with the inhibition of endogenous NO synthesis.

Las diferentes técnicas de exploración de la función pulmonar aportan información, a menudo esencial, para el diagnóstico y evaluación del grado de disfunción pulmonar. Existe un conjunto de pruebas básicas que se emplean de forma convencional en la clínica para establecer el perfil de la función pulmonar en el paciente objeto de estudio. Entre ellas se encuentra la espirometría forzada con prueba broncodilatadora. Un método rápido, económico y de fácil realización para evaluar a un enfermo con alteraciones respiratorias, es la realización del pico flujo con un neumotacómetro (Pick-Flow). El mismo mide el volumen espirado durante el primer segundo de la maniobra. Este método que es rápido, de bajo costo y fácil de transportar en cualquier maletín médico, es una prueba básica que debe estar al alcance del médico general para la valoración correcta del paciente.

La tos convulsa es una enfermedad aguda, respiratoria y altamente contagiosa que a pesar de ser inmunoprevenible, hoy en día es considerada una enfermedad resurgente. Surge entonces la necesidad de aplicar refuerzos de inmunización de forma de prolongar la duración de la inmunidad contra la enfermedad, así como también de mejorar las vacunas actuales de manera tal que no solo ofrezcan una protección duradera en el tiempo sino que también protejan contra cepas circulantes antigénicamente distintas. Es por esto que la inclusión de antígenos expresados por cepas circulantes en las formulaciones vacunales podría ofrecer una mejora en el control de esta enfermedad Por otra parte, ante las vacunas parenterales convencionales, una vacuna mucosal podría ser una alternativa válida para mejorar las vacunas existentes, ya que imita a la infección natural y puede prevenir la colonización de B. pertussis mediante la generación de anticuerpos en la mucosa. Sin embargo, la inducción de una respuesta inmune protectora es difícil de lograr mediante inmunización por vía mucosal con antígenos recombinantes solubles. Es por ésto que el uso correcto de adyuvantes es fundamental a la hora de diseñar vacunas recombinantes administradas por vía de mucosas. En este sentido, se ha demostrado que la subunidad B de la toxina colérica es un potente inmunoestimulador que puede actuar como adyuvante estimulando la respuesta inmune sistémica y de mucosas contra antígenos administrados por vía mucosal, además de ser seguro para su uso en humanos. Con el objetivo de contribuir al desarrollo de una vacuna recombinante acelular para la mejora de la prevención de la infección por B. pertussis, el objetivo general de este trabajo fue generar herramientas moleculares que resulten útiles en el control de la infección causada por B. pertussis. Nuestro trabajo contempló la identificación, caracterización, y la validación de proteínas de B. pertussis como candidatos vacunales así como el estudio de la respuesta del huésped a dichas proteínas. Nuestra hipótesis es que proteínas recombinantes de B. pertussis fusionadas con CTB son buenos candidatos vacunales para ser utilizados por vía mucosal.