Memoria para optar al título Profesional de Médico Veterinario / Mepraia spinolai es una especie silvestre de triatomineo, el cual es vector de la enfermedad de Chagas. Estudios recientes demuestran que este insecto es epidemiológicamente importante en la transmisión de dicha enfermedad, debido a su capacidad potencial para reemplazar a los vectores domiciliarios ocupando el nicho ecológico dejado por éstos después de su eliminación. Se ha observado que el roedor Octodon degus puede llegar a jugar un rol significativo en la trasmisión de esta enfermedad, ya que, por su alta tasa de infección, es considerado un reservorio de la misma. La evaluación de la respuesta inmune del roedor O. degus a la picada de M. spinolai puede ser una útil herramienta inmuno epidemiológica para evaluar la exposición de estos animales a la enfermedad de Chagas. Las proteínas provenientes de las glándulas salivales de insectos triatomineos pueden inducir reacciones de hipersensibilidad, tanto locales como sistémicas en sus hospederos. En este estudio, se evaluó la respuesta de anticuerpos isotipo IgG contra la saliva de M. spinolai en O. degus. Para ello se establecieron dos grupos de estudio: uno de ellos sólo fue picado de manera reiterada por especímenes de M. spinolai (grupo A) y el otro, además de ser picado reiteradamente, se inoculó de manera previa con extracto toráxico que contenía glándula salival de M. spinolai (grupo B). Se realizó test ELISA al suero preinmune y postinmune para detectar la presencia de anticuerpos IgG contra proteínas de la glándula salival de M. spinolai. Sólo se detectaron anticuerpos IgG en el suero postinmune de animales del grupo B. En este estudio se concluye que O. degus puede generar respuesta inmune humoral contra los antígenos contenidos en el extracto toráxico y eventualmente esta respuesta podría incluir anticuerpos IgG contra las proteínas de la saliva de M. spinolai. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt no. 1040711

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Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / El quitosano es un polímero natural muy estudiado actualmente, este material deriva de la quitina, que es el biopolímero más abundante en la naturaleza después de la celulosa y el componente principal del exoesqueleto de crustáceos e insectos, y paredes celulares de algunas bacterias y hongos. El quitosano es también un polisacárido cuya principal fuente de producción es la hidrólisis de la quitina en medio alcalino. Este polímero parcialmente desacetilado, está constituido por copolímeros de β-(1-4)-D-glucosamina (unidades desacetiladas) y N-acetil-D-glucosamina (unidades acetiladas). El quitosano es biodegradable, carece de toxicidad, posee actividad inmunogénica y alta viscosidad, lo que lo hace un excelente candidato como un adyuvante de depósito. El objetivo de la presente memoria de título fue evaluar la capacidad adyuvante del quitosano por medio de la vacunación de ratas con una vacuna peptídica anti GnRH inoculada parenteralmente. Si bien esto ya se ha realizado en otros estudios, no se habían evaluado anteriormente otras soluciones de quitosano como el quitosano de bajo peso molecular, o el quitosano fosforilado. Para determinar la inmunogenicidad del quitosano como adyuvante, se inoculó un grupo de ratas macho con la proteína GnRX G/Q (capaz de neutralizar el GnRH, desarrollada en el Laboratorio Biovetec de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile) junto con las soluciones de quitosano a evaluar, otro grupo de ratas con Adyuvante completo de Freund (ACF) como adyuvante y otras con la proteína suspendida en PBS como grupo control. Estas ratas fueron inoculadas 2 veces, el día 0 y 30 días después y se les extrajo sangre cada 15 días por 75 días, para medir los niveles de testosterona sérica y estimar la cantidad de inmunoglobulinas por medio de ELISA. Los resultados revelaron que las tres soluciones de quitosano en estudio fueron superiores en la generación de IgG1 al ACF, y al grupo control. Y quedó en evidencia que la proteína GnRX G/Q no es inmunogénica por si sola. También fue posible demostrar que la vacuna con quitosano como adyuvante disminuye los niveles de testosterona sérica llegando a ser más efectiva que la vacuna con ACF como adyuvante. De esta manera fue posible dar aprobada la hipótesis planteada de que el quitosano mejora la respuesta inmune en un modelo de vacuna peptídica.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Mepraia spinolai es el vector silvestre de la enfermedad de Chagas en Chile. Estudios recientes demuestran que este insecto es epidemiológicamente importante en la transmisión de dicha enfermedad. El conejo europeo forma parte importante en la dieta de estos insectos por lo cual puede llegar a jugar un rol significativo en la trasmisión del Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad. Por otra parte, se ha demostrado que los triatominos introducen a través de la picada proteínas presentes en su saliva que pueden inducir respuestas inmunes de tipo local y sistémico en sus hospederos, lo cual podría modular la adaptación de diferentes reservorios a la picada del insecto, y así modificar la incorporación del parásito a los mismos. Dado lo anterior, se consideró de importancia evaluar la respuesta inmune del conejo europeo frente a la picada e inoculación de proteínas de la saliva de M. spinolai, como herramienta útil para evaluar la exposición a la enfermedad de Chagas. En el estudio se evaluó la respuesta del conejo europeo, en la producción de anticuerpos IgG frente a las proteínas presentes en la saliva de M. spinolai, en dos grupos de tratamiento. El primer grupo fue sometido a tres sesiones de picaduras de insecto, mientras que el segundo fue sometido previamente a la inoculación de un extracto torácico del triatomino (que contenía las glándulas salivales) antes de seguir la misma serie de picaduras. Sólo en el segundo grupo se evidenció una respuesta significativa de anticuerpos IgG. En conclusión, el conejo europeo genera una respuesta inmune humoral frente al extracto torácico y eventualmente esta respuesta podría incluir anticuerpos IgG contra las proteínas de la saliva de M. spinolai. / FONDECYT Nº 1040711

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La tos convulsa es una enfermedad aguda, respiratoria y altamente contagiosa que a pesar de ser inmunoprevenible, hoy en día es considerada una enfermedad resurgente. Surge entonces la necesidad de aplicar refuerzos de inmunización de forma de prolongar la duración de la inmunidad contra la enfermedad, así como también de mejorar las vacunas actuales de manera tal que no solo ofrezcan una protección duradera en el tiempo sino que también protejan contra cepas circulantes antigénicamente distintas. Es por esto que la inclusión de antígenos expresados por cepas circulantes en las formulaciones vacunales podría ofrecer una mejora en el control de esta enfermedad Por otra parte, ante las vacunas parenterales convencionales, una vacuna mucosal podría ser una alternativa válida para mejorar las vacunas existentes, ya que imita a la infección natural y puede prevenir la colonización de B. pertussis mediante la generación de anticuerpos en la mucosa. Sin embargo, la inducción de una respuesta inmune protectora es difícil de lograr mediante inmunización por vía mucosal con antígenos recombinantes solubles. Es por ésto que el uso correcto de adyuvantes es fundamental a la hora de diseñar vacunas recombinantes administradas por vía de mucosas. En este sentido, se ha demostrado que la subunidad B de la toxina colérica es un potente inmunoestimulador que puede actuar como adyuvante estimulando la respuesta inmune sistémica y de mucosas contra antígenos administrados por vía mucosal, además de ser seguro para su uso en humanos. Con el objetivo de contribuir al desarrollo de una vacuna recombinante acelular para la mejora de la prevención de la infección por B. pertussis, el objetivo general de este trabajo fue generar herramientas moleculares que resulten útiles en el control de la infección causada por B. pertussis. Nuestro trabajo contempló la identificación, caracterización, y la validación de proteínas de B. pertussis como candidatos vacunales así como el estudio de la respuesta del huésped a dichas proteínas. Nuestra hipótesis es que proteínas recombinantes de B. pertussis fusionadas con CTB son buenos candidatos vacunales para ser utilizados por vía mucosal.

Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular / Las Gap Junctions (GJs) son clústers de canales intercelulares localizados en la membrana plasmática que permiten la comunicación directa entre células adyacentes. Cada canal GJ está compuesto por 2 hemicanales hexaméricos conocidos como conexones, los cuales a su vez están compuestos por seis proteínas de transmembrana llamadas conexinas (Cxs), siendo Cx43 la más representada en el sistema inmune. Se ha vinculado la variación de los niveles normales de expresión de las Cxs con la patogénesis de distintas enfermedades, incluyendo sordera congénita, arritmias cardiacas y cáncer. Dentro de esta última nuestro laboratorio ha desarrollado proyectos de investigación que permitan determinar el papel de las GJs en la respuesta inmune antitumoral. Por ejemplo, publicaciones previas de nuestro laboratorio han demostrado que Cx43 participa en la transferencia directa de antígenos tumorales entre células dendríticas (DCs). Así mismo, Cx43 polariza hacia la sinapsis entre DC y linfocitos T (LT) CD4+, formando canales funcionales que permiten una comunicación bidireccional requerida para la activación de LT mediada por APC. Además, se ha encontrado que Cx43 juega un rol en la activación de células natural killer (NK) por parte de DCs y en la regulación de la citotoxicidad de las células NK contra células tumorales. Así mismo, resultados no publicados indican que Cx43 polariza hacia el sitio de contacto entre LT CD8+ citotóxicos (CTLs) y células de melanoma, sugiriendo que Cx43 participaría en la citotoxicidad de CTLs en contra de éstas. Estos antecedentes sugieren que las GJs podría participar en el transporte de moléculas o señales que se encuentren involucradas en el proceso de activación de LT CD8+ mediada por DCs, tema que aún no ha sido estudiado por las investigaciones actuales. En estudios 2 anteriores nuestro laboratorio ha trabajado con modelos celulares humanos, sin embargo, dado que la obtención de LT vírgenes específicos contra el tumor a partir de donantes sanos es improbable y engorroso, en este trabajo decidimos utilizar el modelo murino específico para melanoma pMEL-1 y validar y optimizar su utilización para estudios de la participación de las GJs en la activación de LT CD8+ por parte de DCs. Nuestros resultados indican que el modelo pMEL-1 no representa alteraciones en la expresión de Cx43 respecto a su contraparte silvestre (wild type (WT)), y que es un modelo muy sensible, encontrando expresión del marcador de activación CD69 incluso desde 1 hora post co-cultivo. Además, se determinó que existe transferencia de calceína entre moDC y LT CD8+ pMEL-1 en un contexto estrictamente antígeno específico. Sin embargo, no pudimos dilucidar si las GJs participan del proceso de activación ya que el método de inhibición utilizado, el cual es un péptido mimético de Cx43, presentó problemas técnicos de funcionamiento, fenómeno que fue comprobado en modelos donde anteriormente se había determinado la comunicación mediada por GJs. Proponemos en el futuro utilizar otros métodos de inhibición, como el uso de siRNA contra Cx43, para determinar si estos canales juegan un rol en este proceso. / Gap Junctions are clusters of intercellular channels located in the plasma membrane that allow direct communication between adjacent cells. Each GJ channel is composed of 2 hexameric hemichannels known as connexions, which are composed by six transmembrane proteins called conexins (Cxs), being Cx43 the most represented one in the inmmune system. Variation in normal expression levels on Cxs have been linked to the development of different diseases, including congenital deafness, cardiac arrhythmias and cancer, being the last the one where our laboratory has developed investigation lines that allow to determine the role of GJs in the antitumoral response. In example, previous publications of our group have demonstrated that Cx43 participates in the direct transfer of tumoral antigens between dendritic cells (DCs) and that polarizes to the synapsis between DCs and CD4+ T lymphocytes, forming functional channels that allow bidirectional communication required for the DCs mediated activation of LT. Besides this, we have found that Cx43 plays a role in the activation of natural killer (NK) cells mediated by DCs, and in the regulation of the cytotoxicity of NK cells against tumor cells. Likewise, unpublished data indicate that Cx43 polarizes to the contact site between cytotoxic CD8+ T cells (CTLs) and melanoma cells, suggesting that Cx43 participates in the cytotoxicity of these cells. These backgrounds suggest that GJs may participate in the transport of molecules or signals that may be involved in the process of DC mediated activation of CD8+ T cells, subject that hasn’t been studied by the actual investigations. In previous studies our group has worked with human cellular models, however, given that obtaining naïve T cells from healthy donors is unlikely and difficult, in this work we decided to use the melanoma specific murine model pMEL-1 and valid and optimize it’s use for studies of the participation of GJs in the DCs 4 activation of T cells. Our results indicate that the pMEL-1 model doesn’t have alterations in the Cx43 expression levels compared with the wild type background and that it is a very sensible model, in which we can evaluate the activation of T cells even an hour after co-culture. Besides, it was determined the existence of calcein transfer between moDCs and CD8+ pMEL-1 T cells in a strictly antigen specific context. However, we could not elucidate if the GJs participate or not in the CD8+ T cell activation process, as our inhibition method, which is a Cx43 mimetic peptide, presented technical problems, phenomenon that was proven in models where GJ mediated communication has previously been determinate. We propose in the future to use a different inhibition method, as the use of anti-Cx43 siRNA, in order to determine if these channels play a role in this process.

Tesis por compendio / [ES] La producción en acuicultura se ha visto menguada por aparición de enfermedades en los sistemas de cría de peces. En concreto, en la dorada (Sparus aurata), hay dos parásitos destacados: Enteromyxum leei (Myxozoa) y Enterospora nucleophila (Microsporidia). Hasta la fecha, para ninguno de los dos se ha establecido un cultivo in vitro, y solo para E. leei se ha conseguido establecer un modelo de mantenimiento de la infección in vivo. La presente tesis pretende incrementar el conocimiento sobre estos parásitos y sus relaciones con el hospedador, sentando las bases para generar soluciones que puedan ser aplicadas en la acuicultura. El objetivo con E. leei fue estudiar la inmunidad adquirida inducida en la dorada y la posibilidad de generar herramientas de diagnóstico y vacunas frente a esta enfermedad. Para ello, primero se demostró la resistencia del pez al parásito tras una segunda exposición, la cual duró hasta 16 meses. Además, la resistencia parece estar correlacionada con altos niveles de inmunoglobulina (Ig) M específica en sangre, y una alta expresión de Igs, incluso antes de la re-exposición al parásito. El siguiente paso fue afinar el protocolo de infección con E. leei. Los resultados mostraron que una semana es suficiente para transmitir la infección de E. leei por efluente, independientemente de la temperatura. Tras la demostración de la respuesta adaptativa eficaz frente a E. leei, y al disponer de un modelo de infección refinado, se realizó un ensayo de inmunización pasiva. Aquí, los resultados mostraron que los anticuerpos especi'ficos efectivamente consigue ralentizar la invasión del intestino por el parásito y disminuir los síntomas de la enfermedad. Paralelamente, el resultado del análisis del repertorio de las regiones variables de la IgM e IgT del intestino peces resistentes mostró la inducción de una respuesta policlonal en las ce'lulas B. En base a estos resultados, se realizó una búsqueda de antígenos de E. leei que pudieran ser utilizados como candidatos para la producción de vacunas (análisis proteómico) o herramientas de diagnóstico (análisis in silico). Para ello, se ensambló un transcriptoma de novo utilizando una muestra mixta de intestino de dorada y parásito. Los resultados dieron lugar a 7 y 12 candidatos en la búsqueda in silico y proteómica, respectivamente. En los estudios de E. nucleophila, debido a que fue descrita muy recientemente, el punto de partida fue más básico. Las muestras de este parásito solo se pueden obtener de brotes naturales en piscifactorias. Por ello, primero se realizó un estudio de caracterización de la patología de la infección a partir de peces infectados naturalmente. En etapas tempranas de la infección, el parásito se localiza principalmente en el intestino, pero meses después, la prevalencia en intestino baja e incrementa en los órganos hematopoyéticos y el esto'mago. Los signos clínicos de la infección consistieron en una reducción significativa del crecimiento, emaciación, y palidez de las paredes intestinales. A nivel celular, en los casos ma's graves se observó hipercelularidad en el epitelio intestinal y proliferación de ce'lulas rodlet, un elevado número de linfocitos en la base del epitelio e infiltración de granulocitos acidófilos en el epitelio intestinal. Finalmente se probaron varias formas de transmisión horizontal de E. nucleophila (cohabitación, efluente, intubación oral y anal) con para desarrollar un modelo de mantenimiento in vivo. Se consiguió la transmisión el parásito por todas las vías, pero con una disminución de prevalencia a lo largo del tiempo. Variables como la temperatura, la dosis, y el estado de los peces donantes parecen ser más determinantes que la ruta seleccionada para la transmisión. Entre las rutas probadas, la intubación anal parece ser la más prometedora, pero ninguna de ellas fue capaz de reproducir los signos clínicos observados en las infecciones naturales. / [CA] La producció en aqüicultura s'ha vist minvada per aparició de malalties en els sistemes de cria de peixos. En concret, en l'orada (Sparus aurata), hi ha dos paràsits destacats: Enteromyxum leei (Myxozoa) i Enterospora nucleophila (Microsporidia). Fins avui, per a cap dels dos s'ha establert un cultiu in vitro, i només per a E. leei s'ha aconseguit establir un model de manteniment de la infecció in vivo. La present tesi pretén incrementar el coneixement sobre aquests paràsits i les seves relacions amb l'hoste, establint les bases per a generar solucions que puguin ser aplicades en l'aqüicultura. L'objectiu amb E. leei va ser estudiar la immunitat adquirida induïda en l'orada i la possibilitat de generar eines de diagnòstic i vacunes enfront d'aquesta malaltia. Per a això, primer es va demostrar la resistència del peix al paràsit després d'una segona exposició, la qual va durar fins a 16 mesos. A més, la resistència sembla estar correlacionada amb alts nivells d'immunoglobulina (Ig) M específica en sang, i una alta expressió de Igs, fins i tot abans de la re-exposició al paràsit. El següent pas va ser afinar el protocol d'infecció amb E. leei. Els resultats van mostrar que una setmana és suficient per a transmetre la infecció de E. leei per efluent, independentment de la temperatura. Després de la demostració de la resposta adaptativa eficaç enfront de E. leei, i en disposar d'un model d'infecció refinat, es va realitzar un assaig d'immunització passiva. Aquí, els resultats van mostrar que els anticossos específics efectivament aconsegueix alentir la invasió de l'intestí pel paràsit i disminuir els símptomes de la malaltia. Paral·lelament, el resultat de l'anàlisi del repertori de les regions variables de la IgM i IgT de l'intestí peixos resistents va mostrar la inducció d'una resposta policlonal en les cèl·lules B. Sobre la base d'aquests resultats, es va realitzar una cerca d'antígens de E. leei que poguessin ser utilitzats com a candidats per a la producció de vacunes (anàlisis proteómico) o eines de diagnòstic (anàlisi in silico). Per a això, es va assemblar un transcriptoma de novo utilitzant una mostra mixta d'intestí d'orada i paràsit. Els resultats van donar lloc a 7 i 12 candidats en la cerca in silico i proteòmica, respectivament. En els estudis de E. nucleophila, pel fet que va ser descrita molt recentment, el punt de partida va ser més bàsic. Les mostres d'aquest paràsit només es poden obtenir de brots naturals en piscifactorias. Per això, primer es va realitzar un estudi de caracterització de la patologia de la infecció a partir de peixos infectats naturalment. En etapes primerenques de la infecció, el paràsit es localitza principalment en l'intestí, però mesos després, la prevalença en intestí baixa i incrementa en els òrgans hematopoètics i l'estómac. Els signes clínics de la infecció van consistir en una reducció significativa del creixement, emaciació, i pal·lidesa de les parets intestinals. A nivell cel·lular, en els casos més greus es va observar hipercelularidad en l'epiteli intestinal i proliferació de cèl·lules rodlet, un elevat nombre de limfòcits en la base de l'epiteli i infiltració de granulòcits acidòfils en l'epiteli intestinal. Finalment es van provar diverses formes de transmissió horitzontal de E. nucleophila (cohabitació, efluent, intubació oral i anal) amb per a desenvolupar un model de manteniment in vivo. Es va aconseguir la transmissió el paràsit per totes les vies, però amb una disminució de prevalença al llarg del temps. Variables com la temperatura, la dosi, i l'estat dels peixos donants semblen ser més determinants que la ruta seleccionada per a la transmissió. Entre les rutes provades, la intubació anal sembla ser la més prometedora, però cap d'elles va ser capaç de reproduir els signes clínics observats en les infeccions naturals. / [EN] Aquaculture production is hampered by the emergence of parasite diseases in fish farming systems. Among them, in Sparus aurata, there are two important enteric parasites described: Enteromyxum leei (Myxozoa) Enterospora nucleophila (Microsporidia). To date, no in vitro culture has been established for either parasite, and only for E. leei was it possible to establish a model for maintaining the infection in vivo. The aim of this thesis is to gain new knowledge about these parasites and their relationship with the host, also the basic foundations for generating solutions that can be applied in aquaculture. The general objective for E. leei was to study the acquired immunity induced in gilthead bream and the possibility of generating diagnostic tools and vaccines against this disease. To this end, resistance against the parasite was assessed with a second exposure against the parasite, which showed a resistance for at least 16 months. Besides resistance seemed to be correlated with high levels of specific immunoglobulin (Ig) M in blood, and a high expression of Igs, in particular, the soluble forms, even before re-exposure to the parasite. The next step was refining the protocol for effluent infection with E. leei by studying infection at different exposure time points, temperatures and population densities. The results showed that one week of exposure is sufficient to spread E. leei infection by effluent, regardless of temperature. After demonstrating the resistance against E. leei, and with a refined infection model, a passive immunization assay was performed. The results showed that the serum with specific antibodies effectively slows down the invasion of the gut by the parasite and reduces the symptoms of the disease. At the same time, the analysis of the repertoire of the variable regions of intestinal IgM and IgT showed an induction of a polyclonal response in B cells. On the basis of these results, a research was carried out for E. leei antigens that could have use as candidates for the production of vaccines (proteomic study) or diagnostic tools (in silico study) using the parasite transcriptomic data. To do this, a de novo transcriptome was assembled using a mixed sample of gilthead sea bream and parasite, with a posterior filtrate of the sequences. The In silico and proteomic analysis search resulted in 7 and 12 transcripts, respectively, which are being used for diagnostic and vaccine production. The starting point was more basic in E. nucleophila studies, since this is a recently described disease. The samples of this parasite can only be obtained from natural outbreaks in fish farms. Therefore, first study was carried out to characterize the pathology of the infection of naturally infected fish. In the early stages of the infection, the parasite is mainly located in the intestine, but months later, the prevalence is lower in the intestine and increases in the hematopoietic organs and the stomach. Clinical signs of infection were significant reduction in growth, wasting, and intestinal walls paleness. At the cellular level, in the most severe cases hypercellularity in the intestinal epithelium, proliferation of rodlet cells, high number of lymphocytes at the base of the epithelium and infiltration of acidophilic granulocytes in the intestinal epithelium were observed. Finally, horizontal transmission of E. nucleophila was tried using different transmission methods: cohabitation, effluent, and oral and anal intubation. Transmission of the parasite was achieved with all routes, but there was a decrease in prevalence over time in all cases except for the anal route. Variables such as temperature, dose, and the status of the donor fish appear to be more important than the selected route. Among the routes tested, anal intubation seemed to be the most promising, as it was sustained over a longer period of time, but none of them was able to reproduce the same clinical signs of infection observed in natural infections. / The authors kindly acknowledge the collaboration of anonymous fish farming companies allowing access to the animals during the disease outbreaks. We thank J. Monfort and L. Rodríguez (IATS-CSIC) for the technical assistance on histological processing.This work has been carried out with financial support from the European Union and the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO) under grant projects ParaFishControl (H2020-634429) and AGL2013-R-48560-C2-2-R, respectively. APS was contracted under ParaFishControl project. Primer sequences and access to the gilthead sea bream transcriptomic database were kindly provided by Prof. J. Pérez-Sánchez of the IATS- Nutrigenomics group. The authors thank I. Vicente for fish maintenance and technical assistance during samplings. The authors thank P. Boudinot (INRAE) for his help in designing and interpreting the immunoglobulin repertoire study and results, J. Pérez-Sánchez (IATS-CSIC) for providing access to the gilthead sea bream genome sequences to perform the repertoire analysis.This work was funded by the European Research Council (ERC Consolidator Grant 2016 725061 TEMUBLYM). / Picard Sánchez, MA. (2021). Control of enteric parasitic diseases of farmed gilthead sea bream: New insights into Enteromyxum leei (Myxozoa) and Enterospora nucleophila (Microsporidia) infections [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/167035 / Compendio