Uma doença, denominada de enfezamento, de etiologia desconhecida, tem sido observada nos campos de cultivo de repolho da região do cinturão verde de São Paulo. A doença tem causado sérios danos à cultura nos últimos anos. A sintomatologia apresentada pelas plantas afetadas tem sido caracterizada por clorose foliar, avermelhamento das nervuras e do limbo, enfezamento generalizado, proliferação de brotos e má formação da cabeça, de folhas e órgãos florais. A presença destes sintomas levou à suspeita da ocorrência de fitoplasma associado à doença. Com o objetivo de investigar o possível agente etiológico, plantas de repolho naturalmente infectadas foram coletadas em São Paulo e também nos Estados do Paraná e Rio Grande do Sul, onde a doença, recentemente, tem ocorrido com alta intensidade. Cigarrinhas que ocorrem em cultivos comerciais também foram amostradas em campos de Ibiúna/SP. Após a extração, o DNA total foi submetido ao teste de duplo PCR empregando-se os pares de primers universais P1/Tint e R16F2n/R2 e os pares específicos para identificação de fitoplasmas. Análises de PCR mostraram a amplificação consistente de fragmentos de DNA de 1,2 kb, evidenciando a associação constante de fitoplasma com tecidos das plantas sintomáticas e de insetos. O uso de primers específicos para identificação demonstrou a ocorrência de fitoplasmas afiliados ao grupos 16SrI e 16SrIII, tanto em repolho como nas cigarrinhas. Análises de RFLP, usando as enzimas de restrição AluI, Bsh 12361, HhaI HpaII, KpnI, MboI, MseI e RsaI confirmaram a ocorrência de fitoplasmas pertencentes aos referidos grupos no material vegetal e nos insetos. O padrão espacial de plantas sintomáticas no campo foi do tipo agregado e não houve evidência da disseminação planta a planta, indicando um papel mais importante do comportamento do vetor no arranjo espacial da doença do que de influências do patógeno ou do hospedeiro. / A disease called stunt, of unknown etiology, has occurred in cabbage crops located in the green belt region of the São Paulo State (Brazil). The disease has caused serious yield losses in the last years. The symptomatology exhibited by the affected plants has been characterized by foliar chlorosis, intense red coloration of leafs, general stunt, shoot proliferation and malformation of heads, leaves and floral parts. The presence of those symptoms suggested the occurrence of phytoplasma associated with the disease. In order to investigate the possible agent of the disease, naturally infected cabbage plants were collected from the States of São Paulo, and also from Paraná and Rio Grande do Sul, where the disease has occurred recently with level of intensity. Leafhoppers present in cabbage fields were sampled from Ibiúna, in São Paulo State. Total DNA was extracted and submitted to nested PCR with the universal primer pairs P1/Tint and R16 F2n/R2 and specific primers for phytoplasmas identification. PCR assays revealed the amplification of DNA fragments of 1.2kb, demonstrating consistently the presence of phytoplasma in the tissues from symptomatic plants and insects. Specific primers revealed the occurrence of phytoplasmas affiliated with the groups 16SrI and 16SrIII, both cabbage plants and leafhoppers. RFLP analyses using the restriction enzymes AluI, Bsh 12361, HhaI, HpaII, KpnI, MboI, MseI and RsaI confirmed the occurrence of phytoplasmas belonging to the same groups in plants and insects. Spatial pattern of symptomatic plants in the field was aggregated and there was no evidence of the spread plant-to-plant. This indicates a more important role of the vector behavior on spatial pattern than influences of the pathogen or host.

As brássicas compreendem diversas espécies de grande relevância comercial dentre as demais espécies olerícolas cultivadas no Brasil. A região localizada próxima à cidade de São Paulo (SP) tem se destacado no cultivo de brássicas, especialmente do repolho, da couve-flor e do brócolis. Em campos de cultivo destas espécies, tem sido observadas plantas exibindo redução de tamanho, inflorescências mal formadas, avermelhamento de folhas e necrose dos vasos condutores. Investigações tem mostrado que estas anormalidades estão associadas aos fitoplasmas e a doença tem sido denominada enfezamento. Ainda, estudos anteriores têm sugerido a ocorrência de algumas espécies de cigarrinhas potencialmente vetoras destes fitoplasmas. Considerando estas informações, o presente trabalho teve por objetivo identificar espécies transmissoras de fitoplasmas para plantas de brócolis, buscando aumentar os conhecimentos sobre os vetores de fitoplasmas envolvidos com o enfezamento desta cultura. Para isto, foram coletados insetos no interior e áreas marginais de campos cultivados. Estes insetos foram separados em grupos, identificados taxonomicamente e confinados em plantas sadias de brócolis. A avaliação da transmissão foi feita com base na detecção de fitoplasmas nos tecidos dos insetos e das plantas, usando-se a técnica de PCR duplo, com primers específicos para identificação de fitoplasmas do grupo 16SrIII. A sobrevivência dos insetos nas plantas de brócolis foi pouco duradoura, não excedendo 48 horas. A transmissão experimental foi constatada em 30% das plantas inoculadas. Dentre as 8 potenciais espécies de vetores que foram testadas, as espécies Atanus nitidus, Balclutha hebe, Agalliana sticticollis e Agallia albidula transmitiram fitoplasma para plantas de brócolis. Os resultados deste estudo confirmaram aqueles obtidos nas investigações anteriores, as quais sugeriam a ocorrência de potenciais espécies vetoras de fitoplasmas dentre aquelas presentes nos campos de cultivo. No entanto, o conhecimento de detalhes sobre a transmissão necessita de estudos com populações sadias e infectivas das espécies vetoras, sob condições controladas. Apesar desta necessidade, uma etapa importante foi cumprida no presente trabalho, o qual se constitui numa contribuição relevante tanto para o conhecimento de aspectos epidemiológicos relacionados à disseminação do agente causal do enfezamento do brócolis como para a área de conhecimento relacionada à transmissão de patógenos por insetos vetores, nas condições brasileiras. / Cole crops include several species of commercial importance among the vegetable crops cultivated in Brazil. The region located near the city of São Paulo (SP) has excelled in the cultivation of brassica, especially cabbage, cauliflower and broccoli. In cultivated fields with these species have been observed plants showing reduction of size, malformed inflorescences, reddening of leaves and necrosis of region of vessels. Previous investigations have shown that these abnormalities are associated with phytoplasmas and the disease has been called stunt. In addition, previous studies have suggested the occurrence of some species of leafhoppers potentially vectors of phytoplasmas. Considering this information, the present study aimed to identify species that transmit phytoplasmas to plants of broccoli, seeking to increase knowledge about vectors of phytoplasmas involved with this culture. Thus, insects were collected within and in marginal areas of cultivated fields. These insects were separated into groups, taxonomically identified and confined in healthy plants of broccoli. The evaluation of transmission was based on detection of phytoplasmas in the tissues of plants and insects using the technique of nested PCR with specific primers for identification of phytoplasmas group 16SrIII. The survival of insects on plants of broccoli was short-lived, not exceeding 48 hours. The experimental transmission was observed in 30% of inoculated plants. Among the 8 potential vector species that were tested, the species Atanus nitidus, Balclutha hebe, Agalliana sticticollis and Agallia albidula transmitted phytoplasma to plants of broccoli. The results of the present study confirmed those obtained in previous research, which suggested the occurrence of potential vector species of phytoplasmas among those present in crop fields. However, details about these species as vectors require the creation of healthy populations of these species and infective for broadcast demonstration in controlled conditions. Despite this need, an important step has been accomplished in this work, which constitutes a significant contribution both to the knowledge of epidemiological aspects related to the spread of causal agent of broccoli stunt and the area of knowledge related to the transmission of pathogens by insects vectors, the Brazilian conditions.

Phytoplasmas are bacteria with a persistent propagative transmission by insect vectors that generates direct and indirect interactions among them. In order to understand these interactions for maize bushy stunt phytoplasma (MBSP) and the leafhopper vector Dalbulus maidis (Hemiptera: Cicadellidae), two research lines were addressed. The first one aimed to determine the indirect effects of maize infection by MBSP on some biological and behavioral parameters of the vector, whereas a second line investigated direct interactions of the phytoplasma with D. maidis during its movement through the vector body following acquisition from plants, and associated microbiota. Indirect effects were investigated in choice experiments in which alighting and oviposition preferences by D. maidis were compared on healthy vs. MBSP-infected plants with variable incubation time (diseased plants with early and advanced symptoms, or still asymptomatic). Likewise, indirect effect of MBSP on the D. maidis biology was determined in two life table experiments in which the vector was reared on healthy vs. MBSP-infected plants expressing advanced disease symptoms or still asymptomatic. Choice experiments showed that alighting and oviposition preferences of D. maidis on MBSP-infected plants compared to healthy plants depend on the pathogen incubation period in the plant. The leafhopper preferred MBSP-infected plants over healthy ones during the asymptomatic phase of the disease, but rejected infected plants with advanced symptoms. The vector was able to acquire MBSP from asymptomatic infected plants shortly (3 days) after inoculation, but transmission efficiency increased when acquisition occurred at later stages of the pathogen incubation period (≥14 days) in the source plants and the test plants showed disease symptoms faster. These results suggest that MBSP modulates D. maidis preference for asymptomatic infected plants in the early stages of the crop, allowing rapid spread of this pathogen. Maize infection by the phytoplasma had a neutral effect on most life table parameters of D. maidis; a lower net reproductivity rate (Ro) was observed in the cohort reared on MBSP-infected plants with advanced symptoms, which was compensated to some extent by a higher sexual ratio. MBSP acquisition by all vector nymphal stadia was confirmed by PCR, and the pathogen as detected in both male and female reproductive organs. Concerning direct MBSP-vector interactions, transmission electron microscopy analyses showed phytoplasma-like cells in the midgut lumen, microvilli and epithelial cells, suggesting that MBSP enters the epithelium midgut through the microvilli wall. Within the epithelial cells, mitochondria and bacteria-like cells (possibly endosymbionts) were observed together with masses of phythoplasma-like cells. In the hemocoel, phytoplasma-like cells grouped into a matrix were also observed in association with bacteria-like cells similar to those observed in the midgut epithelium. Similar associations were found in the salivary gland. Interestingly, in-situ hybridization (FISH) technique revealed a variation in diversity and abundance of the microbiota in intestine and salivary glands of D. maidis adults over time after MBSP acquisition from plants. Sulcia sp., Cardinium sp. and eubacteria increased their abundance over time, whereas Rickettsia sp. decreased. The frequent association of the vector microbiota with the phytoplasma in some tissues of D. maidis suggests that endosymbiotic bacteria may play some role in MBSP-vector interactions. / Fitoplasmas são bactérias transmitidas de forma persistente propagativa por insetos vetores, havendo interações diretas e indiretas envolvendo tais organismos. Para entender algumas dessas interações no caso do enfezamento vermelho do milho, associado ao \'maize bushy stunt phytoplasma\' (MBPS) e à cigarrinha vetora Dalbulus maidis (Hemiptera: Cicadellidae), foram desenvolvidas duas linhas de trabalho. Na primeira determinou-se o efeito indireto de MBSP no comportamento e biologia do vetor, enquanto que na segunda estudaram-se as interações diretas do fitoplasma com o vetor durante sua movimentação através de órgãos internos e associação com a microbiota do inseto. O efeito indireto no comportamento foi demostrado em testes de escolha nos quais se variou o período de incubação de MBSP na planta (plantas com sintomas iniciais ou avançados da doença, e plantas infectadas assintomáticas) sobre a preferência para pouso e oviposição pelo vetor. O efeito indireto na biologia do D. maidis foi estabelecido em dois experimentos de tabela de vida, alimentando o inseto durante seu ciclo de vida em plantas de milho sadias ou plantas infectadas com o fitoplasma em dois tempos de incubação (plantas com sintomas avançados da doença e plantas infectadas assintomáticas). Os testes de escolha mostraram que a preferência de D. maidis para pouso e oviposição em plantas infectadas por MBSP em relação a plantas sadias depende do período de incubação do patógeno na planta. A cigarrinha preferiu plantas infectadas por MBSP na fase assintomática da doença, mas rejeitou plantas com sintomas avançados. Ocorreu aquisição do fitoplasma pelo vetor em plantas assintomáticas a partir de 3 dias após a inoculação, mas a eficiência de transmissão aumentou após 14 dias de incubação do patógeno na planta-fonte, e diminuiu o tempo para expressão de sintomas nas plantas-teste inoculadas. Os resultados sugerem que MBSP modula a preferência do vetor para plantas infectadas no estágio inicial da cultura de modo a permitir sua rápida disseminação. O efeito da infecção de plantas por MBSP na biologia de D. maidis mostrou ser neutro para a maioria dos parâmetros biológicos estimados; houve menor taxa líquida de reprodução (Ro), que foi compensada por maior razão sexual, para insetos criados em plantas com sintomas avançados. Verificou-se, por PCR, aquisição do fitoplasma por todos os estádios ninfais do vetor e sua presença em órgãos reprodutivos dos adultos. Por microscopia eletrônica de transmissão, observaram-se células do tipo fitoplasma no lúmen, microvilosidades e células epiteliais do mesêntero de D. maidis, sugerindo que o MBSP penetra no epitélio através das microvilosidades. No epitélio intestinal, foram observadas massas de células do tipo fitoplasma próximas a mitocôndrias e células bacterianas, possíveis endossimbiontes. Na hemocele, também foram observadas células do tipo fitoplasma agrupadas numa matriz, em associação com bactérias similares às observadas no intestino. Associações semelhantes foram observadas na glândula salivar. A técnica de FISH revelou uma variação na riqueza e abundância das espécies na da microbiota no mesêntero e glândula salivar de D. maidis em função do tempo após a aquisição de MBSP. A abundância de Sulcia sp., Cardinium sp. e eubacteria aumentou, enquanto que a de Rickettsia sp. decresceu. A associação frequente dessas bactérias com fitoplasma em alguns tecidos de D. maidis sugere que endossimbiontes possam ter um papel nas interações fitoplasma-vetor.

Phytoplasmas are bacteria with a persistent propagative transmission by insect vectors that generates direct and indirect interactions among them. In order to understand these interactions for maize bushy stunt phytoplasma (MBSP) and the leafhopper vector Dalbulus maidis (Hemiptera: Cicadellidae), two research lines were addressed. The first one aimed to determine the indirect effects of maize infection by MBSP on some biological and behavioral parameters of the vector, whereas a second line investigated direct interactions of the phytoplasma with D. maidis during its movement through the vector body following acquisition from plants, and associated microbiota. Indirect effects were investigated in choice experiments in which alighting and oviposition preferences by D. maidis were compared on healthy vs. MBSP-infected plants with variable incubation time (diseased plants with early and advanced symptoms, or still asymptomatic). Likewise, indirect effect of MBSP on the D. maidis biology was determined in two life table experiments in which the vector was reared on healthy vs. MBSP-infected plants expressing advanced disease symptoms or still asymptomatic. Choice experiments showed that alighting and oviposition preferences of D. maidis on MBSP-infected plants compared to healthy plants depend on the pathogen incubation period in the plant. The leafhopper preferred MBSP-infected plants over healthy ones during the asymptomatic phase of the disease, but rejected infected plants with advanced symptoms. The vector was able to acquire MBSP from asymptomatic infected plants shortly (3 days) after inoculation, but transmission efficiency increased when acquisition occurred at later stages of the pathogen incubation period (≥14 days) in the source plants and the test plants showed disease symptoms faster. These results suggest that MBSP modulates D. maidis preference for asymptomatic infected plants in the early stages of the crop, allowing rapid spread of this pathogen. Maize infection by the phytoplasma had a neutral effect on most life table parameters of D. maidis; a lower net reproductivity rate (Ro) was observed in the cohort reared on MBSP-infected plants with advanced symptoms, which was compensated to some extent by a higher sexual ratio. MBSP acquisition by all vector nymphal stadia was confirmed by PCR, and the pathogen as detected in both male and female reproductive organs. Concerning direct MBSP-vector interactions, transmission electron microscopy analyses showed phytoplasma-like cells in the midgut lumen, microvilli and epithelial cells, suggesting that MBSP enters the epithelium midgut through the microvilli wall. Within the epithelial cells, mitochondria and bacteria-like cells (possibly endosymbionts) were observed together with masses of phythoplasma-like cells. In the hemocoel, phytoplasma-like cells grouped into a matrix were also observed in association with bacteria-like cells similar to those observed in the midgut epithelium. Similar associations were found in the salivary gland. Interestingly, in-situ hybridization (FISH) technique revealed a variation in diversity and abundance of the microbiota in intestine and salivary glands of D. maidis adults over time after MBSP acquisition from plants. Sulcia sp., Cardinium sp. and eubacteria increased their abundance over time, whereas Rickettsia sp. decreased. The frequent association of the vector microbiota with the phytoplasma in some tissues of D. maidis suggests that endosymbiotic bacteria may play some role in MBSP-vector interactions. / Fitoplasmas são bactérias transmitidas de forma persistente propagativa por insetos vetores, havendo interações diretas e indiretas envolvendo tais organismos. Para entender algumas dessas interações no caso do enfezamento vermelho do milho, associado ao \'maize bushy stunt phytoplasma\' (MBPS) e à cigarrinha vetora Dalbulus maidis (Hemiptera: Cicadellidae), foram desenvolvidas duas linhas de trabalho. Na primeira determinou-se o efeito indireto de MBSP no comportamento e biologia do vetor, enquanto que na segunda estudaram-se as interações diretas do fitoplasma com o vetor durante sua movimentação através de órgãos internos e associação com a microbiota do inseto. O efeito indireto no comportamento foi demostrado em testes de escolha nos quais se variou o período de incubação de MBSP na planta (plantas com sintomas iniciais ou avançados da doença, e plantas infectadas assintomáticas) sobre a preferência para pouso e oviposição pelo vetor. O efeito indireto na biologia do D. maidis foi estabelecido em dois experimentos de tabela de vida, alimentando o inseto durante seu ciclo de vida em plantas de milho sadias ou plantas infectadas com o fitoplasma em dois tempos de incubação (plantas com sintomas avançados da doença e plantas infectadas assintomáticas). Os testes de escolha mostraram que a preferência de D. maidis para pouso e oviposição em plantas infectadas por MBSP em relação a plantas sadias depende do período de incubação do patógeno na planta. A cigarrinha preferiu plantas infectadas por MBSP na fase assintomática da doença, mas rejeitou plantas com sintomas avançados. Ocorreu aquisição do fitoplasma pelo vetor em plantas assintomáticas a partir de 3 dias após a inoculação, mas a eficiência de transmissão aumentou após 14 dias de incubação do patógeno na planta-fonte, e diminuiu o tempo para expressão de sintomas nas plantas-teste inoculadas. Os resultados sugerem que MBSP modula a preferência do vetor para plantas infectadas no estágio inicial da cultura de modo a permitir sua rápida disseminação. O efeito da infecção de plantas por MBSP na biologia de D. maidis mostrou ser neutro para a maioria dos parâmetros biológicos estimados; houve menor taxa líquida de reprodução (Ro), que foi compensada por maior razão sexual, para insetos criados em plantas com sintomas avançados. Verificou-se, por PCR, aquisição do fitoplasma por todos os estádios ninfais do vetor e sua presença em órgãos reprodutivos dos adultos. Por microscopia eletrônica de transmissão, observaram-se células do tipo fitoplasma no lúmen, microvilosidades e células epiteliais do mesêntero de D. maidis, sugerindo que o MBSP penetra no epitélio através das microvilosidades. No epitélio intestinal, foram observadas massas de células do tipo fitoplasma próximas a mitocôndrias e células bacterianas, possíveis endossimbiontes. Na hemocele, também foram observadas células do tipo fitoplasma agrupadas numa matriz, em associação com bactérias similares às observadas no intestino. Associações semelhantes foram observadas na glândula salivar. A técnica de FISH revelou uma variação na riqueza e abundância das espécies na da microbiota no mesêntero e glândula salivar de D. maidis em função do tempo após a aquisição de MBSP. A abundância de Sulcia sp., Cardinium sp. e eubacteria aumentou, enquanto que a de Rickettsia sp. decresceu. A associação frequente dessas bactérias com fitoplasma em alguns tecidos de D. maidis sugere que endossimbiontes possam ter um papel nas interações fitoplasma-vetor.

As brássicas compreendem diversas espécies de grande relevância comercial dentre as demais espécies olerícolas cultivadas no Brasil. A região localizada próxima à cidade de São Paulo (SP) tem se destacado no cultivo de brássicas, especialmente do repolho, da couve-flor e do brócolis. Em campos de cultivo destas espécies, tem sido observadas plantas exibindo redução de tamanho, inflorescências mal formadas, avermelhamento de folhas e necrose dos vasos condutores. Investigações tem mostrado que estas anormalidades estão associadas aos fitoplasmas e a doença tem sido denominada enfezamento. Ainda, estudos anteriores têm sugerido a ocorrência de algumas espécies de cigarrinhas potencialmente vetoras destes fitoplasmas. Considerando estas informações, o presente trabalho teve por objetivo identificar espécies transmissoras de fitoplasmas para plantas de brócolis, buscando aumentar os conhecimentos sobre os vetores de fitoplasmas envolvidos com o enfezamento desta cultura. Para isto, foram coletados insetos no interior e áreas marginais de campos cultivados. Estes insetos foram separados em grupos, identificados taxonomicamente e confinados em plantas sadias de brócolis. A avaliação da transmissão foi feita com base na detecção de fitoplasmas nos tecidos dos insetos e das plantas, usando-se a técnica de PCR duplo, com primers específicos para identificação de fitoplasmas do grupo 16SrIII. A sobrevivência dos insetos nas plantas de brócolis foi pouco duradoura, não excedendo 48 horas. A transmissão experimental foi constatada em 30% das plantas inoculadas. Dentre as 8 potenciais espécies de vetores que foram testadas, as espécies Atanus nitidus, Balclutha hebe, Agalliana sticticollis e Agallia albidula transmitiram fitoplasma para plantas de brócolis. Os resultados deste estudo confirmaram aqueles obtidos nas investigações anteriores, as quais sugeriam a ocorrência de potenciais espécies vetoras de fitoplasmas dentre aquelas presentes nos campos de cultivo. No entanto, o conhecimento de detalhes sobre a transmissão necessita de estudos com populações sadias e infectivas das espécies vetoras, sob condições controladas. Apesar desta necessidade, uma etapa importante foi cumprida no presente trabalho, o qual se constitui numa contribuição relevante tanto para o conhecimento de aspectos epidemiológicos relacionados à disseminação do agente causal do enfezamento do brócolis como para a área de conhecimento relacionada à transmissão de patógenos por insetos vetores, nas condições brasileiras. / Cole crops include several species of commercial importance among the vegetable crops cultivated in Brazil. The region located near the city of São Paulo (SP) has excelled in the cultivation of brassica, especially cabbage, cauliflower and broccoli. In cultivated fields with these species have been observed plants showing reduction of size, malformed inflorescences, reddening of leaves and necrosis of region of vessels. Previous investigations have shown that these abnormalities are associated with phytoplasmas and the disease has been called stunt. In addition, previous studies have suggested the occurrence of some species of leafhoppers potentially vectors of phytoplasmas. Considering this information, the present study aimed to identify species that transmit phytoplasmas to plants of broccoli, seeking to increase knowledge about vectors of phytoplasmas involved with this culture. Thus, insects were collected within and in marginal areas of cultivated fields. These insects were separated into groups, taxonomically identified and confined in healthy plants of broccoli. The evaluation of transmission was based on detection of phytoplasmas in the tissues of plants and insects using the technique of nested PCR with specific primers for identification of phytoplasmas group 16SrIII. The survival of insects on plants of broccoli was short-lived, not exceeding 48 hours. The experimental transmission was observed in 30% of inoculated plants. Among the 8 potential vector species that were tested, the species Atanus nitidus, Balclutha hebe, Agalliana sticticollis and Agallia albidula transmitted phytoplasma to plants of broccoli. The results of the present study confirmed those obtained in previous research, which suggested the occurrence of potential vector species of phytoplasmas among those present in crop fields. However, details about these species as vectors require the creation of healthy populations of these species and infective for broadcast demonstration in controlled conditions. Despite this need, an important step has been accomplished in this work, which constitutes a significant contribution both to the knowledge of epidemiological aspects related to the spread of causal agent of broccoli stunt and the area of knowledge related to the transmission of pathogens by insects vectors, the Brazilian conditions.

O enfezamento vermelho, causado por um fitoplasma, foi registrado no Brasil no início da década de setenta, sendo relatado como de pequena importância para a cultura do milho. A partir de meados dos anos oitenta, com a introdução dos plantios de safrinha e dos cultivos irrigados, a doença passou a ser considerada de relevância econômica. Atualmente, o enfezamento se constitui em uma das mais importantes doenças do milho, sendo, inclusive, fator limitante para produção em função da região, do híbrido escolhido e da época de plantio.Um ponto crítico no manejo da doença se refere ao escasso conhecimento sobre a sobrevivência do patógeno e do inseto vetor (Dalbulus maidis) durante a ausência da cultura do milho no campo. Este tipo de informação pode ser útil principalmente na redução do inóculo inicial do patógeno, visando um controle mais eficiente da doença. Assim sendo, o presente trabalho teve por objetivo avaliar algumas gramíneas, usadas na formação de pastagens, e espécies daninhas, que ocorrem na cultura do milho, como potenciais hospedeiros alternativos do fitoplasma e do seu vetor . Treze espécies de capins e ervas daninhas foram experimentalmente inoculadas com o fitoplasma do enfezamento vermelho do milho, através de cigarrinhas infectivas. Avaliações foram feitas com base na observação de sintomas, na detecção molecular do fitoplasma nos tecidos das plantas inoculadas e na contagem de insetos sobreviventes nestas plantas inoculadas. A detecção foi feita por duplo PCR e a identificação do fitoplasma foi realizada pela análise de RFLP, com as enzimas de restrição AluI, RsaI, KpnI e MboI. Das treze espécies testadas, o fitoplasma foi encontrado nos capins colonião (Panicum maximum), marmelada (Brachiaria plantaginea) e braquiária (Brachiaria decumbens), através da amplificação do 16S rDNA, visualizado em gel de agarose na forma de bandas. Os insetos sobreviveram nos três capins até o final do período de experimentação, revelando que os capins foram capazes de abrigar a cigarrinha. Estes resultados demonstraram a possibilidade destas espécies atuarem como potenciais hospedeiros alternativos para o patógeno e o seu vetor, em condições naturais. Estas informações poderão contribuir para novas investigações, na busca de melhor conhecimento sobre a epidemiologia da doença, principalmente quanto à sobrevivência do fitoplasma e da cigarrinha vetora. / Maize bushy stunt, caused by a phytoplasma, was reported in Brazil in the beginning of the seventies, and it was considered as not important for corn. Since the middle of the eighties decade, when the later planting practice and irrigation were adopted, the disease became relevant. Currently, maize bushy stunt represents one of the most important diseases and has caused significant losses. In some conditions the disease can limit the production, especially in relation to the region, used hybrids and crop season. A critical point to disease control is the lack of about survival of pathogen and vector, during the absence of corn crop on the field. This kind of information can be useful to promote the reduction of the initial inoculum, aiming a more efficient disease control. Thus, the objective of the present study was to evaluate some grasses and weeds species as potential alternative hosts of the maize bushy stunt phytoplasma and its vector Dalbulus maidis. Thirteen botanical species were experimentally inoculated with the phytoplasma by using infective leafhoppers. Evaluations were based upon symptom observation, molecular detection of the phytoplasma in tissue of inoculated plants and the of number of insects present in the plants. Detection was conducted by nested PCR and phytoplasma identification by RFLP analyses, using AluI, RsaI, KpnI and MboI as restriction enzymes. Phytoplasma was detected in three species, Panicum maximum, Brachiaria plantaginea and Brachiaria decumbens based on amplification of 16S rDNA, visualized as specific band in agarose gel. Insects remain on alive on the plants belonging to those three species up to the end of the assays. Thus, the present study showed the possibility of those species as potential alternative hosts to the pathogen and its vector, under natural conditions. The results can contribute for new investigations, in order to understanding the epidemiology of the disease, especially in relation to phytoplasma and vector survival.

Orientador: João Antonio da Costa Andrade / Resumo: Populações braquíticas têm sido constantemente estudadas no melhoramento de milho, o interesse por cultivares de porte baixo tem aumentado, principalmente por tolerarem plantios adensados, permitindo maior número de plantas por hectare. A prolificidade é um dos principais componentes na produção do milho que além da estabilidade de produção permite maior eficiência na utilização de nutrientes na planta. O objetivo deste trabalho foi verificar a variabilidade genética, para diferentes caracteres, presente nas populações Isanão VF-1 e Isanão VD-1 após sete ciclos de seleção massal para prolificidade. Foram avaliadas 121 progênies de meios irmãos da população Isanão VF-1 e 65 progênies da população Isanão VD-1, ambas populações de milho braquítico, na segunda safra do ano agrícola 2017 (E1) e primeira safra 2017/2018 (E2). Os caracteres avaliados para as duas épocas de semeadura foram enfezamento, tombamento, prolificidade e rendimento de espigas, e apenas para a E2 foram avaliados florescimento feminino, altura de plantas, altura de espigas e rendimento de grãos. Foram estimados parâmetros genéticos e os ganhos esperados com seleção com intensidade de seleção de 20%, para cada época e conjuntamente. Para a população Isanão VF-1 foram estimadas herdabilidades que variaram entre 37,70% e 74,82%, e ganhos de -5,11%, -10,48% para enfezamento, 19,57% e 7,13% para prolificidade, 20,75% e 15,74% para rendimento de espigas na E1 e E2 respectivamente. Para a população Isanão VD-1 as her... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Maize brachytic populations have been constantly studied in maize breeding, the interest for low-growing cultivars has increased, mainly because they tolerate high density of plants. Prolificacy is one of the main components of yield in maize that besides the yield stability allows higher efficiency in the use of nutrients in the plant. The objective of this work was to verify the genetic variability for different carachteres in the Isanão VF-1 and Isanão VD-1 brachytic populations after seven cycles of mass selection for prolificacy. A total of 121 open cross corn progenies from the Isanão VF-1 population and 65 open cross corn progenies from the Isanão VD-1 population, both brachytic maize populations, were evaluated in first crop 2017 (E1) and second crop 2017/2018 (E2). The evaluated traits for the two seasons were corn stunt complex, fall index, prolificacy and ear yield, and only for E2 were evaluated feminine flowering, plant height, ear height and grain yield. Genetic parameters and expected gains with selection, with 20% of intensity, were calculated for each season and jointly. For the Isanão VF-1 population, heritabilities were estimated from 37.70% to 74.82%, and expected gains of -5.11%, -10.48% for corn stunt complex, 19.57% and 7.13% for prolificacy, 20.75% and 15.74% for ear yield at E1 and E2 respectively. For the Isanão VD-1 population the heritabilities varied between 8.01% and 75.36%, and estimated gains were -3.198% and -9.565% for corn stunt complex, 12.... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2016-11-29T18:59:55Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Aurilene Santos Oliveira 2013.pdf: 2646271 bytes, checksum: aa9174ef69bab8b407a57a5e249619fc (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-11-30T15:36:35Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Aurilene Santos Oliveira 2013.pdf: 2646271 bytes, checksum: aa9174ef69bab8b407a57a5e249619fc (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-30T15:36:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Aurilene Santos Oliveira 2013.pdf: 2646271 bytes, checksum: aa9174ef69bab8b407a57a5e249619fc (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2013-08-23 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / With the possibility of planting corn in two seasons (normal and late crops) the Brazil has increased the total corn production, but it is necessary to develop new hybrids and varieties aiming to increase productivity in both planting dates, to attend increasing demand for this commodity. The objectives of the present work were directed for the study the genetic variability, evaluate the yield potential and estimate inbreeding depression in three semiexotic populations of maize, for purposes of recurrent selection. The field evaluation was in two experiments: Jataí (GO) and Anhembi (SP). The first experiment was represented by half-sib families, which were evaluated in randomized complete blocks with three replications with plots of 4m (0.90 m spacing) with 20 plants. The second experiment included half-sib and S1 families in two replications with plots of 3m (0,90 m spacing) with 15 plants. The following primary characters were evaluated: AP - plant height (cm), AE - ear height (cm), DE – ear diameter (cm), EC - ear length (cm), NP - number of plants, NE – ear of number, PE - ear weight (g parcela-1 ), PG – total grain weight (g parcela-1 ), PE4 - four ear weight, PG4 - four ear grain weight , NR -tassel branch number, CP - tassel length (cm), AD - evaluation of foliar disease and ACE - evaluation of corn stunt complex. The semiexótic populations CRE had an excellent pattern of genetic variability and a good productive potential, presenting an average yield of 70% compared to checks. Within the three populations it was observed differences of families in relation to resistance to corn stunt, indicating that selection for this trait can fairly effective. / RESUMO: Com a possibilidade do plantio de milho em duas épocas (safra e safrinha) o Brasil tem elevado a produção total de milho, porém é necessário desenvolver novos híbridos e variedades visando o aumento da produtividade em ambas as épocas de plantio, para atender a crescente demanda pelo grão de milho. Os objetivos do presente trabalho se dirigem ao estudo da variabilidade genética, avaliar o potencial produtivo, estimar a depressão por endogamia e avaliar o comportamento quanto a resistência ao complexo de enfezamento em três populações semiexóticas de milho, para fins de seleção recorrente. Foram instalados dois experimentos: Jataí (GO) e Anhembi (SP). No primeiro experimento foram utilizadas famílias de meios-irmãos, que foram avaliadas em experimentos delineados em blocos casualizados com três repetições de parcelas de 4m (espaçamento de 0,90m) com 20 plantas. No segundo experimento foram utilizadas famílias de meios-irmãos e famílias S1 com duas repetições de parcelas de 3m (espaçamento de 0,90m) com 15 plantas. Foram avaliados os seguintes caracteres: AP – altura de planta (cm), AE – altura de espiga (cm), DE – diâmetro de espiga (cm), CE – comprimento de espiga (cm), NP – número de plantas, NE – número de espiga, PE – peso de espiga (g.parcela-1 ), PG – peso de grãos (g.parcela-1 ), PE4 – peso de quatro espiga, PG4 – peso de grãos de quatro espiga, NR – número de ramificações do pendão, CP – comprimento de pendão (cm), AD – avaliação de doença foliar e ACE – avaliação do complexo de enfezamento. As populações semiexóticas apresentaram um excelente padrão de variabilidade genética e um bom potencial produtivo, apresentando em média produtividade de 70% em relação à testemunha. Dentro das três populações observou-se um comportamento diferente das famílias em relação à resistência ao complexo de enfezamento, indicando que seleções para este caráter nas populações pode trazer resultados satisfatórios.

O enfezamento vermelho, causado por um fitoplasma, foi registrado no Brasil no início da década de setenta, sendo relatado como de pequena importância para a cultura do milho. A partir de meados dos anos oitenta, com a introdução dos plantios de safrinha e dos cultivos irrigados, a doença passou a ser considerada de relevância econômica. Atualmente, o enfezamento se constitui em uma das mais importantes doenças do milho, sendo, inclusive, fator limitante para produção em função da região, do híbrido escolhido e da época de plantio.Um ponto crítico no manejo da doença se refere ao escasso conhecimento sobre a sobrevivência do patógeno e do inseto vetor (Dalbulus maidis) durante a ausência da cultura do milho no campo. Este tipo de informação pode ser útil principalmente na redução do inóculo inicial do patógeno, visando um controle mais eficiente da doença. Assim sendo, o presente trabalho teve por objetivo avaliar algumas gramíneas, usadas na formação de pastagens, e espécies daninhas, que ocorrem na cultura do milho, como potenciais hospedeiros alternativos do fitoplasma e do seu vetor . Treze espécies de capins e ervas daninhas foram experimentalmente inoculadas com o fitoplasma do enfezamento vermelho do milho, através de cigarrinhas infectivas. Avaliações foram feitas com base na observação de sintomas, na detecção molecular do fitoplasma nos tecidos das plantas inoculadas e na contagem de insetos sobreviventes nestas plantas inoculadas. A detecção foi feita por duplo PCR e a identificação do fitoplasma foi realizada pela análise de RFLP, com as enzimas de restrição AluI, RsaI, KpnI e MboI. Das treze espécies testadas, o fitoplasma foi encontrado nos capins colonião (Panicum maximum), marmelada (Brachiaria plantaginea) e braquiária (Brachiaria decumbens), através da amplificação do 16S rDNA, visualizado em gel de agarose na forma de bandas. Os insetos sobreviveram nos três capins até o final do período de experimentação, revelando que os capins foram capazes de abrigar a cigarrinha. Estes resultados demonstraram a possibilidade destas espécies atuarem como potenciais hospedeiros alternativos para o patógeno e o seu vetor, em condições naturais. Estas informações poderão contribuir para novas investigações, na busca de melhor conhecimento sobre a epidemiologia da doença, principalmente quanto à sobrevivência do fitoplasma e da cigarrinha vetora. / Maize bushy stunt, caused by a phytoplasma, was reported in Brazil in the beginning of the seventies, and it was considered as not important for corn. Since the middle of the eighties decade, when the later planting practice and irrigation were adopted, the disease became relevant. Currently, maize bushy stunt represents one of the most important diseases and has caused significant losses. In some conditions the disease can limit the production, especially in relation to the region, used hybrids and crop season. A critical point to disease control is the lack of about survival of pathogen and vector, during the absence of corn crop on the field. This kind of information can be useful to promote the reduction of the initial inoculum, aiming a more efficient disease control. Thus, the objective of the present study was to evaluate some grasses and weeds species as potential alternative hosts of the maize bushy stunt phytoplasma and its vector Dalbulus maidis. Thirteen botanical species were experimentally inoculated with the phytoplasma by using infective leafhoppers. Evaluations were based upon symptom observation, molecular detection of the phytoplasma in tissue of inoculated plants and the of number of insects present in the plants. Detection was conducted by nested PCR and phytoplasma identification by RFLP analyses, using AluI, RsaI, KpnI and MboI as restriction enzymes. Phytoplasma was detected in three species, Panicum maximum, Brachiaria plantaginea and Brachiaria decumbens based on amplification of 16S rDNA, visualized as specific band in agarose gel. Insects remain on alive on the plants belonging to those three species up to the end of the assays. Thus, the present study showed the possibility of those species as potential alternative hosts to the pathogen and its vector, under natural conditions. The results can contribute for new investigations, in order to understanding the epidemiology of the disease, especially in relation to phytoplasma and vector survival.

Os enfezamentos vermelho e pálido são importantes doenças do milho, causadas, respectivamente, por um fitoplasma e por um espiroplasma (Spiroplasma kunkelii). As duas formas de enfezamento foram relatadas no Brasil no início da década de 70 e se tornaram economicamente relevantes no início dos anos 80, com a introdução de novas técnicas de cultivo no milho. Apesar de ser um patossistema conhecido e estudado, ainda há certos pontos em relação à doença que permanecem desconhecidos. Um deles é em relação à sobrevivência do vetor (Dalbulus maidis) e do patógeno durante a entressafra. Outro, diz respeito às alterações bioquímicas envolvidas na relação hospedeiro-patógeno. O presente trabalho visou avaliar algumas gramíneas, usadas na formação de pastagens, e ervas-daninhas, que ocorrem nas áreas cultivadas com milho, como possíveis hospedeiros alternativos destes patógenos; ainda, buscouse estudar algumas alterações bioquímicas que ocorrem nas plantas de milho quando infectadas por espiroplasma. Para isto, o trabalho foi desenvolvido em três etapas. Na primeira, onze espécies de capins e ervas daninhas foram experimentalmente inoculadas com o espiroplasma através do vetor. As avaliações foram realizadas com base na observação de sintomas, na detecção molecular do espiroplasma nos tecidos das plantas inoculadas e na contagem de insetos sobreviventes nestas plantas inoculadas. Como resultado, nenhuma das espécies testadas mostrou resultado positivo para presença do patógeno inoculado e não demonstrou capacidade em hospedar o espiroplasma. Em uma segunda etapa, três gramíneas sabidamente infectadas com o fitoplasma do enfezamento vermelho do milho (capim colonião, capim braquiária e capim marmelada) foram testadas quanto à capacidade de servirem como planta-fonte na aquisição do fitoplasma pelo vetor. Após o estabelecimento dos insetos nestas plantas, os mesmos foram transferidos para plantas sadias de milho. As avaliações também foram realizadas com base na observação de sintomas e detecção molecular do fitoplasma nos tecidos das plantas inoculadas. Das três espécies testadas como hospedeiras alternativas, o capim colonião demonstrou ser um hospedeiro alternativo do fitoplasma. Estes resultados trouxeram uma significativa contribuição ao melhor conhecimento da epidemiologia da doença, mostrando a existência de outro hospedeiro do patógeno além do milho. Na última etapa, foram escolhidos um híbrido suscetível e um resistente, os quais foram inoculados com cigarrinhas infectadas pelo espiroplasma e submetidos à análise bioquímica para avaliação de alguns compostos, como proteínas, fenóis, clorofilas, açúcares e as enzimas peroxidase e -1,3-glucanase. Amostras foliares foram coletadas e avaliadas em 6 diferentes períodos: 0, 10, 20, 40, 60 e 80 dias após a inoculação. Os resultados revelaram um aumento na quantidade de todos os compostos avaliados, porém uma redução na clorofila e proteína total para o híbrido suscetível. As análises evidenciaram que as alterações nas atividades enzimáticas parecem fazer parte de uma resposta inespecífica de defesa da planta. / The maize bushy stunt and corn stunt are relevant diseases caused, respectively, by a phytoplasma and a spiroplasma (Spiroplasma kunkelii). Both kinds of stunting were reported in Brazil in the beginning of the 1970´s and became economically important in the beginning of the 1980´s, with the adoption of new techniques for maize cultivation. Although this pathosystem has been well studied, there are still some unknown points related to the diseases. One of them is related to survival of the leafhopper vector (Dalbulus maidis) and pathogens during the maize off-season. The other one is related to biochemical changes involved in the host-pathogen interaction. This research aimed to evaluate some pasture grasses and weeds that occur on areas cultivated with corn as possible alternatives hosts for these pathogens; an additional study was conducted to investigate biochemical alterations in maize plants infected by S. kunkelii. So, the research was carried out on three steps. First, eleven species of grasses and weeds were inoculated with S. kunkelii by using infective leafhoppers. The evaluations were based on symptoms and molecular detection of the pathogen in the inoculated plants, as well as on counting of surviving insects onto these inoculated plants. S. kunkelii was not detected by PCR or symptoms in any of the inoculated plant species, indicating that they are not able to host this pathogen. In the second step, three species of grasses (Panicum maximum, Brachiaria plantaginea and Brachiaria decumbens) infected with the maize bushy stunt phytoplasma (MBSP) were tested as source plants of this pathogen for acquisition by its vector. After insects establishing on these plants, they were transferred to healthy corn plants. Transmission to maize was determined based on symptoms and molecular detection of the phytoplasma in the inoculated plant tissues. Out of the three grass species tested, only P. maximum was shown to serve as an alternative host of the phytoplasma. These results represent a relevant contribution to understanding of the disease epidemiology, indicating a species distinct of maize as a source plant for MBSP. In the last study, a susceptible and a resistant hybrid were inoculated with S. kunkelii by infective leafhoppers. Biochemical analyses were carried out to evaluate changes in proteins, phenols, chlorophylls, total sugars and enzymes peroxidase and -1, 3 glucanase. Leaf samples were harvested at 6 different times: 0, 10, 20, 40, 60 and 80 days after inoculation. Results revealed an increase in all biochemical parameters evaluated, with exception for the chlorophyll content and soluble protein in a susceptible hybrid that decreased. The analysis showed that enzyme activity may be an unspecific response of the plant to the pathogen.