Mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é uma doença de depósito lisossômico, que possui herança ligada ao cromossomo X, causada pela deficiência da enzima iduronato-2-sulfatase envolvida na degradação dos glicosaminoglicanos (GAGs) dermatan e heparan sulfato. Os GAGs parcialmente degradados acumulam-se nos lisossomos, levando a disfunção celular, tecidual e orgânica. Os mecanismos envolvidos na fisiopatologia desta doença não estão completamente esclarecidos. Considerando que a geração de radicais livres está envolvida na patogênese de várias doenças, inclusive em alguns erros inatos do metabolismo, o objetivo deste trabalho foi avaliar parâmetros de estresse oxidativo em pacientes com MPS II, antes e durante os seis primeiros meses da terapia de reposição enzimática (TRE). Foram verificados níveis aumentados de malondialdeído (MDA) e de grupamentos carbonila plasmáticos assim como da atividade da catalase eritrocitária (CAT) em pacientes com MPS II antes do tratamento quando comparado com os controles. Por outro lado, o conteúdo de grupamentos sulfidrila e o estado antioxidante total (TAS) plasmáticos estavam significativamente diminuídos, enquanto a atividade da superóxido dismutase (SOD) eritrocitária não estava alterada antes do início do tratamento quando comparado com os controles. Durante a TRE, houve uma redução significativa nos níveis de MDA e um aumento significativo de grupamentos sulfidrila, quando comparados com o pré-tratamento. Ainda, foi analisado o dano ao DNA em leucócitos periféricos através do ensaio cometa em pacientes com MPS II no pré-tratamento e durante a TRE. Foi encontrado um aumento significativo no dano ao DNA antes do tratamento quando comparado com os controles e a TRE levou à significante diminuição desse dano quando comparado com o prétratamento. Além disso, foi verificada uma correlação positiva significativa entre o dano ao DNA e os níveis de MDA, assim como com o conteúdo de grupamentos carbonila. Nossos resultados mostram que pacientes com MPS II estão sujeitos a dano oxidativo a lipídios, proteínas e DNA e, pioneiramente, mostram que a TRE é capaz de protegê-los contra esses danos. / Mucopolysaccharidosis type II (MPS II) is a lysosomal storage disease, which has Xlinked inheritance, caused by deficiency of iduronate-2-sulfatase enzyme involved in degradation of glycosaminoglycans (GAGs) dermatan and heparan sulfate. The partially degraded GAGs accumulate in lysosomes, leading to cellular, tissue and organic dysfunction. The mechanisms involved in the pathophysiology of this disease are not completely understood. Considering that the generation of free radicals is involved in the pathogenesis of many diseases, including some inborn errors of metabolism, the aim of this study was to evaluate oxidative stress parameters in patients with MPS II, before and during the first six months of enzyme replacement therapy (ERT). It was veified significantly increased levels of malondialdehyde (MDA) and carbonyl group content in plasma as well as erythrocyte catalase (CAT) activity in patients with MPS II before treatment when compared with controls. On the other hand, plasma sulfhydryl group content and total antioxidant status (TAS) were significantly reduced, while erythrocyte superoxide dismutase (SOD) activity was not altered before the beginning of treatment when compared to controls. During ERT, there was a significant reduction in MDA levels and a significant increase in sulfhydryl groups, when compared to pretreatment. Also, it was analyzed the DNA damage in peripheral leukocytes by the comet assay in MPS II patients at pretreatment and during ERT. It was verified a significant increase in DNA damage before treatment when compared with controls and ERT induced a significant reduction of this damage compared to pretreatment. Furthermore, we observed a significant positive correlation between DNA damage and MDA levels as well as with carbonyl group content. Our results show that MPS II patients are subject to lipid, protein and DNA oxidative damage and, for the first time, show that ERT is able to protect them against such damage.

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Banca: Selma Dzimidas Rodrigues / Banca: Luciana Reitz de Carvalho / Resumo: Os estudos na área de biotecnologia marinha vêm crescendo nas ultimas décadas e os trabalhos recentes têm revelado inúmeros compostos com potencial farmacológico. O Brasil apresenta um extenso litoral, bastante diversificado em espécies e recursos abundantes para uma pesquisa tecnológica dos organismos marinhos. Os polissacarídeos sulfatados de algas já vêm sendo utilizados em diversas aplicações, principalmente inibindo a atividade de determinadas enzimas, como aquelas relacionadas à cascata de coagulação. Este estudo teve como objetivo mostrar a relevância destas moléculas na modulação das atividades enzimática e inflamatórias das Fosfolipases A2 secretórias extraídas do veneno da Crotalus durissus terrificus. O estudo mostrou que os efeitos biológicos e farmacológicos estão relacionados com a fonte dos polissacarídeos sulfatados, ou seja, a macroalga de origem, mas também com sua estrutura química, a composição dos açucares e a massa molecular. Através da cromatografia por exclusão molecular foi possível identificar as massas moleculares aproximadas dos açucares e também pode revelar a interação existente entre a Fosfolipase A2 e os polissacarídeos sulfatados. Os testes enzimáticos revelaram que a ação fosfolipásica é dose dependente do açúcar, ou seja, em baixas doses de polissacarídeos sulfatados das macroalgas Botryocladia occidentalis e Codium isthmocladum, a atividade da Fosfolipase A2 diminuiu e aumentou, respectivamente. Porém, em altas doses, a atividade enzimática aumentava e diminuía, respectivamente, para as mesmas algas. A atividade enzimática diminuiu ao longo do tempo para o polissacarídeo sulfatado da Caulerpa racemosa. Para esta clorófita, a atividade edematogênica aumentou enquanto para as outras diminuíam, bem como para o teste de miotoxicidade / Abstract: Studies in the field of marine biotechnology have been growing in recent decades, and recent studies have revealed numerous compounds with pharmacological potential. Brazil has an extensive coastline, quite diverse in species and abundant resources for technological research of marine organisms. The sulfated polysaccharides of algae have already been used in several applications, mainly by inhibiting the activity of certain enzymes, such as those related to the coagulation cascade. This study aimed to show the relevance of these molecules in the modulation of inflammatory and enzymatic activities of Phospholipase A2 secretory extracted from the venom of Crotalus durissus terrificus. The study showed that the biological and pharmacological effects are related to the source of sulfated polysaccharides, or origin of the seaweed, but also their chemical structure, composition and molecular weight of sugars. Through molecular exclusion chromatography was possible to identify approximate molecular masses of sugars and can also reveal the interaction between the phospholipase A2 and sulfated polysaccharides. The tests revealed that the enzyme phospholipase action is dose-dependent sugar, or low doses of sulfated polysaccharides of macroalgae and Codium isthmocladum, Botryocladia occidentalis, the phospholipase A2 activity decreased and increased, respectively. However, at high doses, the enzyme activity increased and decreased, respectively, for the same algae. The enzyme activity decreased over time for the sulfated polysaccharide the Caulerpa racemosa. For this seaweed, the enzymatic activity increased while the edema decreased / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-12Bitstream added on 2014-06-13T18:57:10Z : No. of bitstreams: 1 santos_e_me_arafcf.pdf: 1072487 bytes, checksum: 4e2fa3eca9088762957409bcafc21442 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O uso e produção de enzimas têm se tornado uma das áreas de maior interesse da indústria biotecnológica. As enzimas obtidas de microrganismos por processos fermentativos têm sido amplamente pesquisadas e utilizadas em todo mundo. A aplicação de enzimas na extração de óleos é uma alternativa consistente aos processos convencionais, por se tratar de um processo que consome menor energia, melhora a qualidade de vários produtos como, por exemplo, o óleo de oliva, e causa um mínimo de impacto ambiental. Para realizar a extração do óleo, que se encontra nos vacúolos intracelulares, há a necessidade do rompimento das paredes e membranas celulares. Os tratamentos mecânico e térmico causam a ruptura das estruturas celulares, porém, não são suficientes, já que parte do óleo permanece na célula, sem ser extraído. Para aumentar o rendimento no processo de extração do óleo se faz necessário a utilização de um complexo multienzimático que irá atuar sobre os componentes da parede, facilitando a sua liberação. O objetivo deste trabalho foi utilizar uma mistura de enzimas contendo celulases, xilanases e pectinases produzidas por microrganismos para extração de óleos essenciais de plantas. As enzimas foram produzidas pelos fungos T. reesei Rut C-30 e Aspergillus niger, em processo fermentativo incubado em biorreator de 10 L. A composição do meio de cultura, bem como as condições de cultivo, foram estabelecidas a fim de se obter maior produção de enzimas. A produção de enzimas em biorreator para a linhagem Rut C-30 de T. reesei mostrou os melhores níveis em pH 4,0, temperatura de 28º C, agitação de 400 rpm e taxa de aeração de 1,5 vvm, obtendo uma produção de 2,01 U/mg, 1,79 U/mg e 0,2 U/mg de celulase, xilanase e pectinase, respectivamente. A produção utilizando A. niger apresentou melhores níveis enzimáticos nas mesmas condições usadas para T. reesei e foram: 1,21 U/mg, 2,96 U/mg e 4,2 U/mg de celulase, / The use and production of enzyme have become one of the areas of great interest of the biotechnological industry. The enzymes produced by microorganisms in fermentation processes have been widely searched and used in the world. The enzyme application in the oil extraction is a consistent alternative to the conventional processes, because represents a process that consumes less energy, improves the quality of some products as, for example, the olive oil, and cause a minimum of environmental impact. To perform the extraction of the oil, which is found in the intracellular vacuoles, it is necessary break the cellular and membranes walls. The mechanical and thermal treatments cause the rupture of the cellular structures, however, they are not enough, since part of the oil remains in the cell, without be extracted. To increase the yield in the process of oil extraction is necessary to use a multienzymatic complex that will act on the components of the wall, facilitating its release. The objective of this work was to utilize a enzyme mixture containing cellulases, xylanases and pectinases produced by microorganisms to extract plants essential oils. The enzymes had been produced by the microorganisms Trichoderma reesei QM9414 and T. reesei Rut C-30 and Aspergillus niger, in fermentative process incubated in a 10L bioreactor. The composition of the culture medium, and the culture conditions were established in order to obtain higher level of enzyme production. The enzyme production in bioreactor by T. reesei Rut C-30 showed the best levels in pH 4.0, temperature of 28º C, agitation of 400 rpm and tax of aeration of 1,5 vvm, and obtaining production of 2.01 U/mg, 1.79 U/mg and 0.2 U/mg of cellulase, xylanase and pectinase, respectively. The production using A. niger showed the best leves at the same conditions used to T. reesei and the were: 1.21 U/mg, 2.96 U/mg and 4.2 U/mg of cellulase, xylanase and pectinase, respectively. Melampodium divaricatum (Rich.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-04Bitstream added on 2014-06-13T20:29:44Z : No. of bitstreams: 1 000736000.pdf: 1119345 bytes, checksum: 15a1cf62b53cf447a235fce25ed7705b (MD5) / Os estudos na área de biotecnologia marinha vêm crescendo nas ultimas décadas e os trabalhos recentes têm revelado inúmeros compostos com potencial farmacológico. O Brasil apresenta um extenso litoral, bastante diversificado em espécies e recursos abundantes para uma pesquisa tecnológica dos organismos marinhos. Os polissacarídeos sulfatados de algas já vêm sendo utilizados em diversas aplicações, principalmente inibindo a atividade de determinadas enzimas, como aquelas relacionadas à cascata de coagulação. Este estudo teve como objetivo mostrar a relevância destas moléculas na modulação das atividades enzimática e inflamatórias das Fosfolipases A2 secretórias extraídas do veneno da Crotalus durissus terrificus. O estudo mostrou que os efeitos biológicos e farmacológicos estão relacionados com a fonte dos polissacarídeos sulfatados, ou seja, a macroalga de origem, mas também com sua estrutura química, a composição dos açucares e a massa molecular. Através da cromatografia por exclusão molecular foi possível identificar as massas moleculares aproximadas dos açucares e também pode revelar a interação existente entre a Fosfolipase A2 e os polissacarídeos sulfatados. Os testes enzimáticos revelaram que a ação fosfolipásica é dose dependente do açúcar, ou seja, em baixas doses de polissacarídeos sulfatados das macroalgas Botryocladia occidentalis e Codium isthmocladum, a atividade da Fosfolipase A2 diminuiu e aumentou, respectivamente. Porém, em altas doses, a atividade enzimática aumentava e diminuía, respectivamente, para as mesmas algas. A atividade enzimática diminuiu ao longo do tempo para o polissacarídeo sulfatado da Caulerpa racemosa. Para esta clorófita, a atividade edematogênica aumentou enquanto para as outras diminuíam, bem como para o teste de miotoxicidade / Studies in the field of marine biotechnology have been growing in recent decades, and recent studies have revealed numerous compounds with pharmacological potential. Brazil has an extensive coastline, quite diverse in species and abundant resources for technological research of marine organisms. The sulfated polysaccharides of algae have already been used in several applications, mainly by inhibiting the activity of certain enzymes, such as those related to the coagulation cascade. This study aimed to show the relevance of these molecules in the modulation of inflammatory and enzymatic activities of Phospholipase A2 secretory extracted from the venom of Crotalus durissus terrificus. The study showed that the biological and pharmacological effects are related to the source of sulfated polysaccharides, or origin of the seaweed, but also their chemical structure, composition and molecular weight of sugars. Through molecular exclusion chromatography was possible to identify approximate molecular masses of sugars and can also reveal the interaction between the phospholipase A2 and sulfated polysaccharides. The tests revealed that the enzyme phospholipase action is dose-dependent sugar, or low doses of sulfated polysaccharides of macroalgae and Codium isthmocladum, Botryocladia occidentalis, the phospholipase A2 activity decreased and increased, respectively. However, at high doses, the enzyme activity increased and decreased, respectively, for the same algae. The enzyme activity decreased over time for the sulfated polysaccharide the Caulerpa racemosa. For this seaweed, the enzymatic activity increased while the edema decreased

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2709.pdf: 3171268 bytes, checksum: 320be443904ef1fb906616e8df53a4eb (MD5) Previous issue date: 2009-04-29 / Fundo Paulista de Defesa da Citricultura / The citrus canker disease is caused by a phytopathogenic bacterium Xanthomonas citri ssp. citri (Xac). The common symptoms are defoliation, twig die-back and premature fruit drop. The infection process of this bacterium is not totally elucidated although it has been reported that peptidases are involved in the infection and virulence process. The genome sequencing of the bacterium Xanthomonas citri ssp. citri enabled the detection of a gene that encodes an enzyme cysteine peptidase like, possibly involved in infection. Aiming to characterize this enzyme and determine its possible involvement in the infection process were performed: expression in recombinant Pichia pastoris, purification of protein and enzyme studies for characterization were done. The kinetic characterization of recombinant enzyme was performed through the hydrolysis of synthetic substrates Z-Leu-Arg-MCA and Z-Phe-Arg-MCA (Z = Carbobenzoxy; MCA = 7-amido-4-methylcoumarin), as well as the use of substrates with intramolecular fluorescence suppression AbzKVRSSKQEDDnp, AbzKLRSSKQ-EDDnp and AbzKIRSSKQ-EDDnp (ABZ = Ortoaminobenzoic acid; EDDnp = Ethylene diamine [2,4-dinitrophenyl]). The best catalytic efficiency (Kcat/Km) of the enzyme was found using the substrate AbzKIRSSKQ-EDDnp that has a isoleucine residue at position P2, showing that the recombinant enzyme (HISCPXAC) prefer aliphatic amino acid residue in this position. Inhibitory experiments of enzyme activity were performed using different cysteine peptidase inhibitors including CaneCPI-1, CaneCPI-2, CaneCPI-3, CaneCPI-4 and E-64 (L- transepoxysuccinyl-leucylamido-[4- guanidino]butane), resulting in a constant of inhibition (Ki) of 84.64, 0.088, 0.10, 0.012 and 1.214 nM respectively. The polyclonal antibody anti- HISCPXAC was produced in mouse and Western blotting analysis revealed that the antibody was able to recognize the recombinant purified cysteine peptidase and also the native cysteine peptidase from Xanthomonas citri ssp. citri strain 306 cultivated in media inductor of pathogenicity. The same antibody did not recognize the protein in a Xac knockout strain for the cysteine peptidase gene. Our results suggest that the cysteine peptidase from Xanthomonas citri ssp. citri may be involved in the bacteria infection and/or virulence. / Uma das doenças que afeta a citricultura é o cancro cítrico, causada pela bactéria fitopatogênica Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). Os sintomas mais comuns desta doença são a desfolhamento, morte dos galhos e queda prematura dos frutos. O processo de infecção dessa bactéria não foi totalmente elucidado, porém, já existem relatos do envolvimento de peptidases no processo de infecção e virulência. O seqüenciamento do genoma da bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, possibilitou a detecção de um gene que codifica uma enzima do tipo cisteíno peptidase, possivelmente envolvida no processo de infecção. Com o objetivo de caracterizar esta enzima e verificar seu possível envolvimento no processo de infecção foram realizadas: a expressão recombinante em Pichia pastoris, purificação da proteína e estudos de caracterização enzimática. A caracterização cinética da enzima recombinante foi realizada, por meio da hidrólise dos substratos sintéticos Z-Leu-Arg-MCA e Z-Phe-Arg-MCA (Z= Carbobenzoxicarbonil; MCA= 7-amino-4-metil-coumarina), assim como dos substratos com supressão intramolecular de fluorescência AbzKVRSSKQ-EDDnp, AbzKLRSSKQ-EDDnp e AbzKIRSSKQ-EDDnp (Abz= ácido orto-amino benzóico; EDDnp= N-[2,4-dinitrofenil]-etilenodiamino). A melhor eficiência catalítica (Kcat/Km) da enzima foi verificada com o uso do substrato AbzKIRSSKQ-EDDnp, o qual possui um resíduo de isoleucina na posição P2, indicando que a enzima recombinante (HISCPXAC) tem uma preferência por resíduos de aminoácidos alifáticos nesta posição. Foram realizados também experimentos de inibição da atividade enzimática com diferentes inibidores de cisteíno peptidases incluindo CaneCPI-1, CaneCPI-2, CaneCPI-3, CaneCPI-4 e E-64 (transepoxi-succinil-L-leucilamido-(4-guanidino) butano), resultando nas constantes de inibição (Ki) de 84.64, 0.088, 0.10, 0.012 e 1.214 nM, respectivamente. Além disso, foram produzidos anticorpos policlonais anti-HISCPXAC e análises de Western blotting revelaram que esse anticorpo reconheceu a cisteíno peptidase recombinante purificada e também a cisteíno peptidase nativa de Xanthomonas citri subsp. citri cepa 306 cultivada em meio indutor de patogenicidade. Os mesmos anticorpos não foram capazes de reconhecer a proteína em uma cepa de Xac que possui o gene da cisteíno peptidase interrompido (knockout), a qual, em estudos anteriores, se mostrou ser menos virulenta que a Xac 306. Os presentes resultados sugerem que a cisteíno peptidase em estudo pode estar envolvida no processo de infecção e/ou virulência de Xanthomonas citri subsp. citri.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6489.pdf: 6160107 bytes, checksum: 81c1fddd8e696b53fe5fd98c9174ba24 (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / The depletion of fossil fuels, the growing energy demand and the great need to reduce carbon emissions gradually increased the demand for new sources of renewable and clean energy. Bioethanol is obtained from the fermentation of lignocellulosic biomass, for example sugar cane, and can be considered a viable alternative. For this biomass can be used it is necessary to degrade the constituent molecules of the cell wall to fermentable sugars through the enzymes called cellulases. Among them there are three classes with different functions: the cellobiohydrolases, endoglucanases and β-glucosidases. In order to contribute to the viability and deployment of ethanol production technologies, purification of two β- glucosidases of the fungus Trichoderma harzianum was performed, named in this work as ThBgl1 e ThBgl2, as well as their biophysical and biochemical characterization. Clones in study were obtained by a cloning platform, expression and purification of recombinant proteins in high performance and expressed in bacteria Escherichia coli. Through the functional characterization of proteins under study it was found that they had the optimum pH in the range of 5.5 and optimum temperature around 40ºC. Results of enzyme kinetics showed that ThBgl1 has higher preference (specificity) by cellobiose, while in ThBgl2 cellobiose is a substrate having low specificity. In ThBgl2 specificity is higher by fucosideos. Furthermore, it was observed the occurrence of transglycosylation catalyzed by β-glucosidases in study and the action of some inhibitors on its enzymatic activity. The three-dimensional analysis of these proteins revealed the presence of the barrel tim typical of family 1 of glycoside hydrolases. / O esgotamento das fontes de combustíveis fósseis, a crescente demanda energética e a grande necessidade de redução da emissão de carbono fizeram com que aumentasse gradativamente a procura por novas fontes de energia renováveis e limpas. O bioetanol obtido da fermentação de biomassas lignocelulósicas, como o bagaço de cana-de-açúcar, pode ser considerado uma alternativa viável. Para que essa biomassa possa ser utilizada, faz-se necessário a degradação das moléculas constituintes da parede celular a açúcares fermentáveis por meio das enzimas chamadas celulases. Dentre elas existem três classes com diferentes funções: as celobiohidrolases, as endoglucanases e as β-glicosidades. Com o objetivo de contribuir para a viabilização e implantação de tecnologias de produção de etanol, foi realizada a purificação de duas β-glicosidases do fungo Trichoderma harzianum, denominadas nesse trabalho como ThBgl1 e ThBgl2, bem como sua caracterização bioquímica e biofísica. Os clones em estudo foram obtidos por meio de uma plataforma de clonagem, expressão e purificação de proteínas recombinantes em alto desempenho e expressos na bactéria Escherichia coli. Através da caracterização funcional das proteínas em estudo, verificou-se que elas apresentaram o pH ótimo na faixa de 5,5 e temperatura ótima em torno de 40ºC. Os resultados de cinética enzimática mostraram que ThBgl1 tem maior preferência (especificidade) por celobiose, enquanto na ThBgl2 a celobiose é um substrato com baixa especificidade. Na ThBgl2 a especificidade é maior por fucosídeos. Além disso, constatou-se a ocorrência de transglicosilação catalisada pelas β-glicosidases em estudo e a ação de alguns inibidores em sua atividade enzimática. A análise tridimensional dessas proteínas revelou a presença de um barril tim típico das hidrolases de glicosídeos da família 1.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-24Bitstream added on 2014-06-13T19:52:15Z : No. of bitstreams: 1 sfalcin_ra_me_botfca.pdf: 969110 bytes, checksum: 9e5ba2f01ad7144e60d01e1c9eef45ec (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / No Brasil, particularmente no Estado de São Paulo, o cultivo de berinjela se desenvolveu muito, porém sua maior limitação é o controle do teor de água do solo. Pesquisas recentes destacam as propriedades medicinais da berinjela, mostrando que nos últimos anos sua procura tem aumentado significativamente, principalmente para o uso de controle do colesterol e enfermidades no aparelho digestivo; além de apresentarem em sua composição nutricional, algumas vitaminas e minerais essenciais como cálcio, fósforo, ferro e potássio. A água é o fator ambiental mais importante para o desenvolvimento das plantas, pois todo e qualquer processo relacionado com a água é fortemente influenciado pelas condições do ambiente, do solo e do ar atmosférico. Nesse sentido, no presente trabalho, conduziu-se plantas de um híbrido de berinjela (Solanum melongena L.), denominados comercialmente “Embu” com o objetivo de se estudar possíveis impactos na produção, decorrentes de uma deficiência hídrica (DH) induzida sobre a cultura. As plantas foram conduzidas em casa de vegetação da Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP - Botucatu-SP, no Dep. de Produção Vegetal, setor de Horticultura. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC), em esquema fatorial 3 x 4, ou seja, três níveis de água no solo e quatro épocas de coleta, com 16 repetições para cada tratamento. As repetições foram separadas em quatro parcelas com quatro vasos por parcela. O primeiro tratamento foi considerado Controle onde as plantas foram irrigadas ao atingir o valor 2 de potencial mínimo de água do solo de -10 kPa. Os demais tratamentos simularam DH Leve (-20 kPa) e Moderada (-30 kPa), respectivamente, também irrigadas ao atingir os valores de potencial mínimo de água do solo, sendo todos os tratamentos monitorados... / In Brazil, particularly in the State of São Paulo, the cultivation of eggplant developed very much, but its great limitation is the control of amount of water of soil. Recent studies feature the medical properties of eggplant, showing that, in the last years, its search has been increased significantly, mainly to the use of control of the cholesterol and illness into digestive system; besides of show in its nutritional composition, some essential vitamins and minerals such as calcium, phosphore, ferro and potassium. Water is the most important environmental factor to the developing of plants, because every and any process related with water é strongly influenced for the environmental conditions, soil, and atmospheric air. In this way, in present study, it had been lead plants of a hybrid of eggplant (Solanum melongena L.), named commercially “Embu” with the aim of studying possible impacts on production, elapsing 4 of a hydric deficiency induced on the culture. The plants were conducted in house of vegetation of Faculdade de Ciencias Agronomicas da UNESP- Botucatu-SP, in Department of Vegetal Production, sector of Horticulture. Experimental design was entirely randomized, in factorial design 3X4, that is, three levels of water in soil and four times of collect, with 16 repetitions for each treatment. Repetitions were apart in four portions with four pots for portion. First treatment was considered Control which the plants were irrigated up to hit the value of minimal potential of soil... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1821.pdf: 5347379 bytes, checksum: cf534f652a54394451b7626ff5df62df (MD5) Previous issue date: 2008-04-11 / Financiadora de Estudos e Projetos / This work is part of a research project in DEQ-UFSCar (Department of Chemical Engineering at Federal University of São Carlos, Brazil). The focus is to develop a competitive industrial enzymatic process to obtain semi-synthetic β- Lactam antibiotics. This process rivals with the conventional one, which uses toxic solvents and generates non-recyclable residues. Thus, the increasing rigor of environmental regulations is an important driving force for the research. The enzymatic production of ampicillin, in aqueous medium, uses a derivate from an acyl donor (in this work, D-phenylglycine methyl ester, PGME) and 6-aminopenicillanic acid (6-APA). Penicillin G acylase (PGA) is usually the biocatalyst for this process. Unfortunately, PGA acts either as transferase, producing ampicillin (AMP), or as hydrolase, producing D-phenylglycine (PG) from PGME (and from ampicillin). This is a series-parallel reaction scheme, with the antibiotic being the desired intermediate product. This work studied the use of multivariate calibration in a spectrophotometer for on-line monitoring the enzymatic synthesis reactor. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is the usual analytical procedure, which is time demanding, expensive and generates amounts of disposals. Multivariate calibration, on its turn, only uses dilutions of reactor samples and a spectrophotomer (with UV detector). Some multivariate calibration techniques (SPA, PCR, PLS) were tested and compared. They didn t show representative differences in cross-validations or in test data. The work also focused the automation of a reactor and its accessories, where the enzymatic production of ampicillin and 6-APA (after Penicillin G enzymatic hydrolysis) takes place. The software was implemented in LabVIEW (National Instruments), which controls the Automatic Sampler (AS) for multivariate analysis, among other equipments. The development of this system provided a real-time concentration response from the reactor, for all chemical species. Following an optimal trajectory in the enzymatic reactor by adding reactants is one of the most important strategies to reach a competitive process. Hence, the concentration sensor represents an important step for the feasibility of the enzymatic process, because it could be used to monitor and control the concentrations of substrates during the industrial feed-batch. Several assays, among then batch and fed-batch runs, were done and many modifications on the experimental scheme were implemented or proposed. Some of these assays could be treated as validation of monitoring software and concentration sensor, which showed good results. / Este trabalho é parte de linha de pesquisa do DEQ/UFSCar, cujo objetivo é o desenvolvimento de processo enzimático para produção de antibióticos β-lactâmicos semi-sintéticos. Este processo se propõe a substituir a rota química convencional, que possui ressalvas devido ao crescente rigor das legislações ambientais, por utilizar solventes tóxicos e gerar quantidades apreciáveis de resíduos não recicláveis. No processo enzimático, a produção de ampicilina é conduzida em meio aquoso, a partir de um derivado ativado do doador acil e do ácido 6- Aminopenicilânico (6-APA). Geralmente, utiliza-se a enzima Penicilina G Acilase (PGA) como catalisador. Neste trabalho, o Éster Metílico de Fenilglicina, EMFG (derivado da Fenilglicina, FG), foi empregado. A mesma enzima atua também nas hidrólises do derivado ativado (EMFG, produzindo FG e metanol) e do antibiótico (ampicilina, AMP, produzindo 6-APA e FG), caracterizando um sistema reacional série-paralelo, onde o produto intermediário é o desejado. Uma das contribuições deste trabalho foi estudar a substituição da análise por HPLC ( High Performance Liquid Chromatography ) pela multicalibração espectrofotométrica, que tornou possível obter as concentrações dos analitos, em solução aquosa multicomponente (AMP, FG, EMFG e 6-APA em água), através da leitura das absorbâncias correspondentes a diferentes comprimentos de onda. A substituição se justifica devido à demanda elevada do HPLC por recursos, tempo e cuidados experimentais. Além disso, viabiliza-se assim o monitoramento do reator em tempo real. Várias técnicas de multicalibração (SPA, PCR e PLS) foram utilizadas e comparadas. Todas apresentaram desempenho semelhante tanto na validação cruzada como durante a apresentação de dados de teste. O trabalho também focou a automação de um reator piloto, que tem utilidade para produção de ampicilina e também 6-APA (pela hidrólise de penicilina G microbiana, catalisada por PGA). A linguagem de programação LabVIEW (National Instruments) foi utilizada nos trabalhos de automação. O programa de monitoramento gerado inclui, entre outros, sistema de amostragem automática (SAA) com análises por multicalibração espectrofotométrica. A aplicação do SAA, integrado a multicalibração, funciona como um sensor de concentrações para produção enzimática de ampicilina e pode ser utilizado no monitoramento e controle do reator em tempo real. Assim, o desenvolvimento do sistema representa um passo marcante rumo à viabilidade técnica e econômica do processo industrial, uma vez que a alimentação de reagentes, visando a obter trajetórias ótimas no reator, é uma das estratégias mais importantes para competitividade do processo. Vários ensaios experimentais, com o reator operando em batelada e em batelada alimentada, foram realizados e motivaram propostas para modificação do aparato experimental, como a retirada de cristais durante o processo reacional. Esses ensaios também podem ser visualizados como validações para o sensor de concentrações desenvolvido e para o sistema automatizado, que mostraram comportamento adequado para o monitoramento do processo.

Submitted by Walter Bertequini Nagata null (walter.bn@hotmail.com) on 2017-01-04T19:05:41Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO DE MESTRADO - Walter Bertequini Nagata.pdf: 726100 bytes, checksum: 44016cb83ccb52d2853fbd5e43a37790 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-01-06T13:34:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nagata_wb_me_araca.pdf: 726100 bytes, checksum: 44016cb83ccb52d2853fbd5e43a37790 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-06T13:34:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nagata_wb_me_araca.pdf: 726100 bytes, checksum: 44016cb83ccb52d2853fbd5e43a37790 (MD5) Previous issue date: 2017-01-03 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo do presente estudo foi investigar, por métodos estatísticos, a ocorrência de reações cruzadas entre Leishmania spp. e Ehrlichia spp. com o uso de técnicas sorológicas e moleculares. Um total de 100 amostras sanguíneas de cães foram colhidas e processadas por meio do ELISA (Ensaio Imunoenzimático Indireto) e PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). A análise estatística consistiu nos testes de McNemar e Coeficiente de concordância Kappa. As estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,05. A sensibilidade e especificidade dos testes foram determinadas pela curva ROC (Receiver Operator Characteristic), considerando o PCR como teste padrão ouro. A partir das análises pode-se verificar que 48,0% dos animais foram reativos na ELISA e 58,0% foram positivos na PCR, no caso da Leishmania spp. Para Ehrlichia spp., a ocorrência de anticorpos pelo ELISA foi de 54,0% e, pela PCR, 48,0% dos cães foram positivos. Nota-se, também, que 37,0% dos animais foram positivos para os dois patógenos por meio do teste molecular, e quatro cães foram reativos no teste ELISA para ambas as doenças e tiveram resultado negativo apenas no teste molecular de Ehrlichia spp. Estes resultados, na sorologia, podem sugerir possíveis casos de reatividade cruzada entre a Leishmania spp. e Ehrlichia spp.. Entretanto, é mais provável que estes resultados estejam relacionados com a coinfecção desses agentes. Por meio dos resultados obtidos, há mais evidências de coinfecção por estes dois agentes patogênicos no cão, do que reatividade cruzada entre eles. / The aim of this study is to investigate, by statistical methods, the occurrence of cross-reactivity between Leishmania spp. and Ehrlichia spp. using serological and molecular techniques. A total of 100 blood samples from dogs were collected and processed by ELISA (indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) and PCR (polymerase chain reaction). Statistical analysis consists of McNemar tests and agreement coefficient Kappa. The statistics were considered significant when p <0.05. The sensitivity and specificity of the tests were determined by ROC curve (Receiver Operator Characteristic), considering the PCR as gold standard. From the analysis it can be seen that 48,0% of the animals were reactive in ELISA and 58,0% were positive in PCR in the case of Leishmania spp. For Ehrlichia spp., the occurrence of antibodies by ELISA was 54,0% and, by PCR, 48,0% of the dogs were positive. It can be noted also that 37,0% of the animals were positive for both parasites through molecular test and four dogs were reactive in the ELISA test for both diseases and were negative only in molecular test for Ehrlichia spp. These results in serology can suggest possible cases of cross-reactivity between Leishmania spp. and Ehrlichia spp.. However, it is more likely that these results are related to coinfection of these agents. Through the results obtained, there are more evidences of coinfection by these two pathogens in dogs than cross-reactivity between them. / FAPESP: 2014/26413-2

Submitted by Fernando Roberto Paz Cedeno null (fernandopazc@yahoo.com) on 2017-04-07T11:26:54Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de mestrado - Fernando Roberto Paz Cedeno.pdf: 2921183 bytes, checksum: f2905dbe63bb30ddbf52d231bf5e9f5d (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-17T13:51:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pazcedeno_fr_me_arafcf.pdf: 2921183 bytes, checksum: f2905dbe63bb30ddbf52d231bf5e9f5d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T13:51:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pazcedeno_fr_me_arafcf.pdf: 2921183 bytes, checksum: f2905dbe63bb30ddbf52d231bf5e9f5d (MD5) Previous issue date: 2017-02-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A macroalga vermelha Kappaphycus alvarezii é rica em carboidratos, porém contém outras frações constituídas de proteínas, inorgânicos e aromáticos. O presente trabalho foi justificado devido ao fato de que o resíduo gerado no processamento de carragena semi-refinada ser menos recalcitrante comparado a resíduos lignocelulósicos. Objetivo: Avaliar o potencial da conversão enzimática das frações geradas no processamento de carragena oriundo da macroalga Kappaphycus alvarezii em açúcares monoméricos fermentescíveis. Métodos: A parte experimental envolveu a obtenção de um resíduo a partir do processamento de carragena semi-refinada de K. alvarezii. A fração não tratada e as frações obtidas no processamento foram caracterizadas quimicamente e hidrolisadas enzimaticamente. Na hidrólise enzimática foram utilizados extratos enzimáticos comerciais e um extrato enzimático obtido a partir de Aspergillus sp. Resultados: O processamento de carragena semi-refinada e a obtenção do resíduo foram realizadas com sucesso. Os rendimentos globais de obtenção de carragena semi-refinada e do resíduo foram de 46,8% e 19,2%, respectivamente. As frações, não tratada, tratada com KOH, o resíduo e a carragena semi-refinada mostraram teores brutos de 44,8%, 41,5%, 32,7% e 53,6% (galactana), 12,4%, 13,4%, 38,4% e 8,3% (glucana), 15,8%, 14,9%, 8,6% e 18,2% (cinzas) e 12,6%, 13,8%, 8,1% e 13,3% (grupos sulfato), respectivamente. A fração do resíduo mostrou ser rica em glucana enquanto a fração de carragena semi-refinada rica em galactanas e cinzas. Os extratos enzimáticos comerciais utilizados foram caracterizados e mostraram níveis máximos de atividade específica de celulases e galactanases de 1,3 FPU.mg-1 e 0,3 UI.mg-1, respectivamente. O extrato obtido a partir de Aspergillus sp. mostrou níveis máximos de atividade de β-galactosidases e galactanases de 0,3 UI.mL-1 e 0,2 UI.mL-1, respectivamente. A hidrólise enzimática da fração de glucana foi eficiente atingindo 100% de conversão. Entretanto, a fração de galactana mostrou uma conversão máxima de aproximadamente 35%. Após 72 horas de hidrólise enzimática, as concentrações máximas de glicose e galactose na fração do resíduo foram de 10 g.L-1 e 1,2 g.L-1, respectivamente. Um tratamento com ácido sulfúrico em condições brandas, após a etapa de hidrólise enzimática, culminou em uma conversão máxima da fração de galactana de 47%. Nesta condição a concentração de galactose no hidrolisado atingiu 1,6 g.L-1. Conclusão: Em resumo, temos demonstrado um novo aspecto dentro do conceito de biorrefinarias de K. alvarezii para produzir não somente carragena, mas também bioprodutos a partir do hidrolisado oriundo da fração do resíduo. Esses avanços podem contribuir para uma melhor concepção de estratégias de produção de biocombustíveis no setor de produção de hidrocoloides. Desta forma, esse método poderia ser considerado como um modelo de produção de biocombustíveis de quarta geração. / The red macroalgae Kappaphycus alvarezii is rich in carbohydrates, but contains other fractions constituted of proteins, inorganic and aromatics. The present study was justified due to the fact that the residue generated in the processing of semirefined carrageenan is less recalcitrant compared to lignocellulosic residues. Objective: Evaluate the potencial of the enzymatic conversion of the fractions generated in the carrageenan processing from macroalgae Kappaphycus alvarezii in fermentable monomeric sugars. Methods: The experimental part involved the obtaining of a residue from the processing of semirefined carrageenan of K. alvarezii. The untreated fraction and fractions obtained in the processing were chemically characterized and enzymatically hydrolyzed. In the enzymatic hydrolysis were used commercial enzymatic extracts and an enzymatic extract obtained from Aspergillus sp. Results: Processing of semirefined carrageenan and the recovery of the residue were carried out successfully. Overall yields of semirefined carrageenan and residue were 46.8% and 19.2%, respectively. The content of untreated fraction, treated with KOH, residue and semirefined carrageenan were 44.8%, 41.5%, 32.7% and 53.6% (galactan), 12.4%, 13.4%, 38.4% e 8.3% (glucan), 15.8%, 14.9%, 8.6% and 18.2% (ash) and 12.6%, 13.8% , 8.1% and 13.3% (sulfate groups), respectively. The fraction of the residue showed to be rich in glucan while the fraction of semirefined carrageenan rich in galactan and ashes. Commercial enzymatic extracts used were characterized and maximum values of specific activity of cellulases and galactanases were 1.3 FPU.mg-1 and 0.3 IU.mg-1 , respectively. Extract obtained from Aspergillus sp. used characterized and maximum values of specific activity of β-galactosidase and galactanases were 0.3 IU.mL-1 and 0.2 IU.mL-1 , respectively. The enzymatic hydrolysis of the glucan fraction was efficient reaching 100% conversion. However, the enzymatic hydrolysis of the galactan fraction showed a maximum conversion of approximately 35%. After 72 hours of enzymatic hydrolysis, the maximum concentration of glucose and galactose in the residue fraction were 10 g.L-1 and 1.2 g.L-1 , respectively. A treatment with sulfuric acid under mild conditions, after the enzymatic hydrolysis step, reaching in a maximum conversion of the galactan fraction of 47%. In this condition, the concentration of galactose in the hydrolyzate reached 1.6 g.L-1 . Conclusion: In summary, we have demonstrated a new aspect of the biorefinery of K. alvarezii for developing not only carrageenan, but also bioproducts starting of the hydrolyzate from residue. Such insights can further advances this hydrocolloid sector towards better design of biofuel production strategies. Therefore, this method would be a fourth generation model for the production of biofuels.