Orientador: Francisco Maugeri Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-02T19:12:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arakaki_Tomaz_D.pdf: 3392715 bytes, checksum: 92341d82e215c40dd54226b61d527d86 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O Brasil como maior produtor mundial e exportador de açúcar de cana sofre as conseqüências de um mercado internacional em que os preços das commodities variam de maneira pouco favorável aos países exportadores. A solução seria obter produtos a partir da sacarose, cujos preços fossem mais valorizados no mercado internacional. A sacarose pode ser hidrolizada, hidrólise ácida ou enzimática, produzindo glicose e frutose . A glicose pode ser transformada em ácido glucônico , através de um complexo enzimático formado pela glicose-oxidase e catalase. Teríamos então uma solução de ácido glucônico e frutose, dois produtos cujos preços unitários são maiores do que a sacarose; o espectro de utilização dessas 2 substâncias também é maior do que a da sacarose. O presente trabalho estuda o processo de transformação da glicose em ácido glucônico, usando um reator contínuo de tanque agitado com injeção de ar , junto com um sistema multienzimático de enzimas imobilizadas, formado pela glicose-oxidase e catalase . Na formação do ácido glucônico é formado também o H202 , que inativa ambas enzimas. Para diminuir a inativação a catalase é adicionada para transformar H202 em H20 e O2; O2 dissolvido é necessário para oxidar a glicose-oxidse reduzida para a glicose-oxidase oxidada, a forma ativa da enzima. O objetivo do trabalho é obter um sistema de equações capaz de simular o processo de produção de ácido glucônico a partir da glicose , para estudar e otimizar o processo. As equações diferenciais parciais descrevendo difusão-reação no interior das partículas esféricas, contendo as enzimas imobilizadas, para a glicose, O2 dissolvido, H202 e ácido glucônico foram discretizadas no espaço pelo método de colocação ortogonal com elementos finitos ; equações diferenciais também foram estabelecidas para a glicose¬oxidase e catalase que são destruídas pelo H202 no interior das partículas; mais 4 equações diferenciais foram derivadas para a glicose , O2 dissolvido, H202 e ácido glucônico no reator. Para tornar mais real o modelo utilizado os coeficientes de transporte de massa, os coeficientes de difusão das substâncias nas partículas foram calculados em função da temperatura e concentração de glicose no sistema; a concentração do O2 dissolvido saturado foi calculado em função da temperatura, pressão do ar no interior do reator e da concentração da glicose ; as constantes cinéticas de reação da glicose-oxidase e as constantes de destruição das duas enzimas foram calculadas em função da temperatura do sistema. Parâmetros como os fatores de tortuosidade do suporte para glicose, O2 dissolvido, H202 e constante cinética de Michaelis-Menten para a catalase foram obtidos através do ajuste de curvas usando dados de trabalhos sobre a produção de ácido glucônico com enzimas imobilizadas, existentes na literatura. As otimizações foram feitas em função de alto rendimento e mínima destruição das enzimas usando como variáveis concentração de glicose-oxidase , concentração de catalase ,temperatura, pressão de ar no interior do reator, tempo de residência, fração de enzima imobilizada no reator, raio das partículas; foram utilizadas nas otimizações 4 diferentes concentrações de glicose 2M, 1,5M, 1M e O,5M. Concentrações de glicose maiores que 1M na alimentação provocam rápida destruição das enzimas, curto tempo de processamento( ~ 100h) e tornam o processo economicamente inviável. Os parâmetros obtidos na otimização dos processos com concentração de glicose 2M; 1,5M; 1M e 0,5M foram: VMAXGLO = 0,5xl0-3 moles.L-1.s-1 VMAXCAT = 3 moles.L-1.s-1 Temperatura = 20°C Tempo de residência = 20 h Fração de enzima imobilizada no reator = 0,20 (volume da enzima imobilizada/volume do reator) Raio da partícula da enzima imobilizada = 0,5xl0-3 m (0,5 mm) Pressão do ar no reator: Pressão = 2026 kPa para processo com concentração de glicose na alimentação de 2M Pressão = 2026 kPa para processo com concentração de glicose na alimentação de 1,5M Pressão = 1862,10 kPa para processo com concentração de glicose na alimentação de 1M Pressão = 1128,03 kPa para processo com concentração de glicose na alimentação de 0,5M. / Abstract: Brazil as the world largest producer and exporter of sugar made from sugar cane have to deal with an intemational market subject to oscillating commodities prices which is not favourable to commodities exporting countries. Obtaining products from sucrose having higher values in the international market could be a solution. Sucrose can be hydrolized , either by enzymes or acid , producing glucose and fructose. Glucose can be transformed into gluconic acid , using an enzymatic complex of glucose-oxidase and catalase; a solution of gluconic acid and ITuctose would be obtained, these 2 products have prices per unit mass higher than sucrose and their range of utilization is broader than the one of sucrose. This work is concemed with glucose transformation into gluconic acid, using a continuous stirred tank reactor (CSTR) equiped with air injection, plus glucose-oxidase and catalase comprising an immobilized enzyme system . At the gluconic acid production H202 is formed which inactivates both enzymes; catalase is added to trasnform H202 into mo and O2; dissolved O2 is essential to oxidise reduced glucose-oxidase into is oxidised form which is the enzyme active form. The goal of the work was to simulate the próduction of gluconic acid from glucose using a system of equations , in order to study and optimize the processo The partial differential equations describing diffusion-reaction process within the spherical partic1es, which hold the immobilized enzymes, in function of time for glucose, dissolved O2, H202 and gluconic acid were discretised in space using orthogonal collocation method with finite elements; differential equations were also derived for glucose-oxidase and catalase destruction by H202 inside partic1es; more four differential equations were stablished for glucose, dissolved 02, H202 and gluconic acid in the CSTR. To make the model closer to a real process mass transport coefficients, diffusion coefficients within partic1es for the substances were derived taking into consideration temperature and glucose concentration in the reactor; saturated dissolved Oz concentration was calculated in function of temperature, air pressure and temperature within the reactor; kinetic constants for glucose-oxidase reaction and the inactivation constants for both enzymes were calculated in function of the system temperature. Parameters like tortuosity factors for glucose, disssolved Oz, HzOz and the Michaelis-Menten constant for catalase were obtained from curve fitting of data ftom previous reported works on gluconic acid production using immobilized glucose-oxidase and catalase. Optimizations were carried out concerning a high gluconic acid yield and minimum enzyme degradation, variables utilized were glucose-oxidase concentration, catalase concentration, temperature, air pressure within reactor, residence time, volumetric immobilized enzyme fraction and particle radius. Optimizations were done using 4 differents glucose concentrations feed 2M, 1.5 M, 1M and 0.5M. Glucose feed concentration greater than 1M caused fast enzymes destruction, short time process (-100 h) and turned the process into a economically infeasible one. The parameters calculated in the optimization of the processes with glucose concentration of 2M; 1.5M; 1M e O.5M were: VMAXGLO = 0.5x10-3 moles.L-1.s-1 VMAXCAT = 3 moles.L-1.s-1 Temperature = 20°C Residence time = 20 h Fraction of immobilized enzyme in the reactor = 0.20 (immobilized enzyme volume/reactor volume) Radius ofimmobilized enzyme partic1e = 0.5xl0-3 m (0.5 mm) Air pressure inside the reator: Pressure = 2026 kPa for the process with a 2M glucose concentration inlet feed Pressure = 2026 kPa for the process with a 1.5M glucose concentration inlet feed Pressure = 1862.10 kPa for the process with a 1M glucose concentration inlet feed Pressure = 1128.03 kPa for the process with a 0.5M glucose concentration inlet feed. / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:14:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4313_1.pdf: 4415707 bytes, checksum: 77682bd2005ccebe78c5e5cf87c30582 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Na elaboração de materiais nanoestruturados, a anodização do alumínio para obtenção de membranas de alumina anódica auto-organizadas tem se revelado ferramenta útil. Elas apresentam elevado grau de ordenamento que se configuram em arranjo de células hexagonais, com poros centrais e individualizados, não interconectados. Este trabalho propôs-se empregar as membranas como parte de um compósito nanoestruturado com vistas ao seu emprego como matriz para imobilização de proteínas. As membranas foram sintetizadas pela anodização de fitas de alumínio de alta pureza, verificando-se que para sua obtenção com alto padrão de organização era necessário um controle rígido do acabamento superficial do alumínio e da temperatura de anodização. O polimento eletroquímico, em uma mistura de ácido perclórico/etanol, foi superior ao químico em relação ao desbastamento da superfície, dando um aspecto espelhado à fita de alumínio (eletrodo). Filmes com bom ordenamento foram obtidos empregando-se eletrodos polidos eletroquimicamente e anodizados a baixas temperaturas. Nanocompósitos de membranas de alumina anódica com polianilina (PANI) e polietilenimina (PEI) foram sintetizados e a eles foram covalentemente imobilizadas duas enzimas importantes biotecnologicamente: peroxidase e tripsina. O compósito com PANI foi obtido tratando-se a membrana com permanganato de potássio, com vistas a depositar o dióxido de manganês sobre sua superfície, que serviu como agente oxidante na polimerização da anilina sobre a superfície da membrana. Ao microscópio eletrônico de varredura observou-se que a síntese deste polímero não obstruiu os poros da membrana. Peroxidase foi imobilizada ao compósito via glutaraldeído. O derivado da imobilização manteve suas propriedades catalíticas e apresentou-se razoavelmente estável ao reuso, bem como quando ensaiado em um sistema em fluxo. Outra funcionalização da membrana foi realizada com PEI, polímero altamente catiônico contendo aminas primárias, secundárias e terciárias, bastante utilizado na imobilização de proteínas devido às suas propriedades hidrofílicas e de fisissorção. Este processo foi conseguido fazendo-se passar pelos poros da membrana uma solução de PEI e em seguida tratando-se a mesma com glutaraldeído. Avaliou-se a porosidade do compósito resultante através de micrografias eletrônicas de varredura e observou-se que a grande maioria dos poros havia sido bloqueada pela presença do polímero e este formou uma camada sobre a superfície da membrana. O compósito alumina anódica/PEI fixou a tripsina de forma que ela permaneceu cataliticamente ativa. Também se apresentou estável ao uso em fluxo e em batelada. Observou-se que quanto maior o diâmetro do poro maiofoi a atividade enzimática encontrada da tripsina. Também foi constatado que a membrana sem funcionalização fixou a tripsina, contudo a lixiviação da mesma foi evidente, demonstrando a importância do polímero para uma imobilização efetiva desta proteína

A preocupação com o desenvolvimento de técnicas menos agressivas em termos ambientais contribuindo para o desenvolvimento sustentável, levou a utilização de tecnologia enzimática e materiais biodegradáveis como uma rota alternativa. A quitosana é um polímero atóxico, biodegradável e biocompatível proveniente da desacetilação da quitina, subproduto da indústria pesqueira. Uma de suas aplicações é como suporte para a imobilização de biocatalisadores com o intuito de melhorar algumas características, como estabilidade e reutilização. A imobilização pode ocorrer por diversas técnicas, não existindo um método único que abrange todo e qualquer caso. Neste contexto, esse trabalho estudou a viabilidade da utilização de um hidrogel à base de quitosana para imobilização da lipase de Rhizopus oryzae (L036P). Para isso foi realizada a imobilização da lipase por adsorção física e por ligação covalente em hidrogel de quitosana ativado com glutaraldeido. A fim de verificar modificações químicas significativas e a perda de massa das amostras em função da temperatura, os materiais foram submetidos às técnicas de termogravimetria (TG) e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). A massa residual foi de 30% para a enzima livre e de 45% para as enzimas imobilizadas e os espectros de FTIR comprovaram a imobilização devido a mudanças ocorridas em algumas bandas de absorção. A análise da morfologia da superfície do suporte foi realizada através de imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura que evidenciaram uma estrutura mais densa e menos porosa após a reticulação do hidrogel. A atividade hidrolítica da lipase imobilizada foi de 406,30 U/g para a imobilização por adsorção física; 439,82 U/g para a imobilização por ligação covalente. Os parâmetros cinéticos km e Vmáx foram determinados e não houve diferença significativa no valor de km para a ambas as lipase imobilizada já o valor de Vmáx sofreu uma queda para ambas as imobilizações indicando uma possível inibição não competitiva. A estabilidade térmica e de estocagem foram avaliadas e foi observada uma melhora na estabilidade térmica após 150 minutos e a atividade hidrolítica de todos os materiais não apresentaram perda significativa após 120 dias. Os biocatalisadores foram ainda caracterizados quanto a atividade ótima de atuação em função da temperatura e pH utilizando a técnica de planejamento de experimentos ( delineamento composto rotacional 2² com três repetições no ponto central). Os resultados encontrados mostraram que há uma variação na temperatura e pH ótimo após a imobilização, sendo encontrado valores máximos de 839,76 U/g para a lipase livre (pH 7,5 a 36°C), 574,18 U/g para a lipase imobilizada por adsorção física (pH 7,5 a 50°C) e 3572,44 U/g para a lipase imobilizada por ligação covalente (pH 8,5 60°C). A partir dos resultados obtidos, verificou-se a potencialidade da utilização de hidrogel como suporte de imobilização da lipase. / The concern with the development of less aggressive techniques for the environment contributing to sustainable development, has led to use of enzyme technology and biodegradable materials as an alternative route. Chitosan is a polymer nontoxic, biodegradable and biocompatible obtained from the deacetylation of chitin by-product of the fishing industry. One of the applications of chitosan is as a support for the immobilization of biocatalysts in order to improve certain characteristics, such as stability and reusability. Immobilization may occur for several ways, with no single method that covers every case. In this context, this study investigated the viability of using a chitosan-based hydrogel to immobilization of lipase Rhizopus oryzae (L036P). To do this was made lipase immobilization by physical adsorption and covalent linking of chitosan hydrogel activated with glutaraldehyde. In order to verify significant chemical modifications and the mass loss of samples as a function of temperature, the materials were subjected to thermogravimetric analysis (TG), and infrared spectroscopy with Fourier transform (FTIR). The residual mass was 30% for the free enzyme and 45% for immobilized enzymes and the infrared spectra confirmed the immobilization due to changes in absorption in certain bands. The analysis of the support surface morphology was performed by images obtained by scanning electron microscopy which showed a denser and less porous structure after crosslinking of the hydrogel. The hydrolytic activity of the immobilized lipase was 406.30 U / g for the immobilization by physical adsorption and 439.82 U / g for the immobilization by covalent attachment. Kinetic parameters (km and Vmáx) were determined and there was no difference difference in the amount of km for both immobilized lipase. The Vmáx value has fallen for both immobilizations indicating a possible non competitive inhibition. The thermal stability and storage were evaluated and it was observed an improvement in thermal stability after 150 minutes and the hydrolytic activity of all the materials showed no significant loss after 120 days. The biocatalysts were further characterized as the optimal activity of action as function of temperature and pH using the experimental design technique through rotational composite design with three replications 2² the center point. The results showed that there is a variation in optimal temperature and pH after immobilization being found maximum values of 839.76 U / g for the free lipase (pH 7.5 and 36 °C), 574.18 U / g for lipase immobilized by physical adsorption (pH 7.5 and 50 °C) and 3572.44 U / g to covalently immobilized lipase (pH 8.5 and 60 °C). From the results obtained, it was verified the potential use of hydrogel as lipase immobilization support. / Programa Institucional de Bolsas de Pós-Graduação - PIB-PÓS

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-25Bitstream added on 2015-03-03T12:06:21Z : No. of bitstreams: 1 000806886_20160725.pdf: 581026 bytes, checksum: 4c55faecb6d2b9cbebcf0fed8076771a (MD5) Bitstreams deleted on 2016-07-25T13:17:27Z: 000806886_20160725.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-25T13:18:38Z : No. of bitstreams: 1 000806886.pdf: 2412685 bytes, checksum: 76a763d7dfe3317535d6f9ec19a7cd78 (MD5) / As endoglicanases EC 3.2.1.4 são enzimas capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas ?-1,4 da celulose, resultando na liberação de glicose, celobiose e celo-oligossacarídeos. Empregadas mundialmente em diversos processos industriais, por exemplo, como amaciante de tecidos de algodão e bioestonagem de jeans, na extração de sucos de frutas, na adição em detergentes comerciais, na fabricação de cerveja, e na produção de papel e de etanol. Atualmente, há um grande interesse em enzimas que hidrolisem biomassa lignocelulósica para obtenção de etanol de segunda geração. A imobilização de enzimas em matrizes sólidas oferece muitas vantagens, entre as quais, reuso da enzima, a fácil separação do produto e o aumento da estabilidade operacional. Os objetivos deste trabalho foram: produzir CMCases secretadas por Aspergillus niger e Humicola grisea var. thermoidea em cultivo sólido e submerso; imobilizar CMCases em suporte agarose com diferentes ativações químicas; determinar a estabilidade térmica e as propriedades cinéticas dos derivados obtidos, comparando-os com as enzimas livres; avaliar a capacidade de reuso dos derivados ativos e estáveis e analisar qualitativamente o produto de hidrólise dos substratos celulósicos. O fungo A. niger secretou grandes quantidades de CMCases, 34,1 U.mg-1, em meio Vogel, utilizando pó de bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono. O pH 5 foi determinado como o ótimo para a enzima, apresentando instabilidade ao pH 10. Com a utilização de aditivos estabilizante, a trealose a 10% (m/v), manteve, em pH 10, 80% de atividade residual, por 25 horas. Em relação à temperatura, apresentou uma faixa ampla de atividade entre 45°C a 75°C, tendo como temperatura ótima 65°C. O derivado enzimático que ofereceu melhor estabilidade foi aquele em que a imobilização foi conduzida juntamente com o substrato carboximeticelulose (CMC 1%), em... / The endoglucanases EC 3.2.1.4 are enzymes that hydrolyze the ?-1, 4 glycosidic linkages of the cellulose producing glucose, cellobiose and cello-oligosaccharides. Used worldwide in many industrial processes such as fabric softener and bioestonagem cotton jeans, extraction of fruit juices, in the addition of commercial detergents, in brewing, and the production of paper and ethanol. Currently, there is great interest in enzymes that hydrolyze lignocellulosic biomass to obtain second-generation ethanol. The immobilization of enzymes on solid arrays provides many advantages as the enzyme reuse, easy separation of the product and increased operational stability. The aims of this study were to produce secreted: CMCases produce secreted by Aspergillus niger and Humicola grisea var. thermoidea in solid and submerged cultivation; CMCases immobilized on agarose support with different chemical activations; determine the thermal stability and kinetic properties of the derivatives obtained comparing them with the free enzyme; evaluate the reuse capacity assets and stable derivatives and qualitatively analyze the product of hydrolysis of cellulosic substrates. The fungus A. niger secreted large amounts of CMCases, 34.1 U.mg-1 amid Vogel, using powdered sugarcane bagasse as a carbon source. The pH of 5 was determined as the optimum for the enzyme, presenting instability to pH 10. With the use of stabilizing additives, the 10% trehalose (w / v), kept at pH10, 80% residual activity for 25 hours. Regarding temperature there was a broad activity range from 45 °C to 75 °C and the optimum temperature as 65 °C. The enzyme derivative which offered better stability was one in which immobilization was conducted with the carboxymethycellulose substrate (1% CMC) in agarose support Glutaraldehyde (70% of reactive groups), preserving catalytic activity of 35% at 60 °C for 250 hours. Through qualitative TLC analysis, it...

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciencias Fisicas e Matematicas / Made available in DSpace on 2012-10-17T05:56:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2016-01-09T00:54:56Z : No. of bitstreams: 1 148818.pdf: 22345368 bytes, checksum: c956fdd898ca38171d6e759c50053878 (MD5) / Neste trabalho dois suportes diferentes foram avaliados para a imobilização de enzimas: o organo-gel contendo lipase de Chromobacterium viscosum (CVL), e a crisotila contendo a lipase de Candida cilindracea (CCL). Estes dois sistemas foram aplicados na resolução dos ácidos carboxílicos racêmicos (±)-2-metil-alcanóicos, (±)-3-metilpentanóico, (±)-2-etil-hexanóico, (±)-2-bromo-alcanóicos, (±)-citronélico, (±)-2-(pclorofenoxi)-propiônico, (±)-canforcarboxílico e o D,L-mandélico via esterificação enantiosseletiva com diferentes álcoois alifáticos, a 25'C em hexano. As enzimas demonstraram preferência pelo enantiômero com rotação óptica positiva para os ácidos (±)-2-metil-alcanóicos com excessos enantioméricos dos produtos na faixa de 54-85%. A CCL imobilizada em crisotila demonstrou preferência pelo enantiômero com rotação óptica negativa para o ácido (±)-2-bromo-octanóico com n-pentanol. Ácidos mais complexos como (±)-2-(p-clorofenoxi)-propiônico, (±)-canforcarboxílico e o D,Lmandélico não foi observado reação nos dois sistemas. Na reação do ácido (±)citronélico com n-pentanol foi observado a preferência pelo enantiômero com rotação óptica positiva na formação do éster para a CVL imobilizada em organo-gel, sendo os valores de excesso enantiomérico para o enantiômero não reativo e o produto de 29 e 48%, respectivamente. Com a CCL imobilizada em crisotila foi observado uma baixa formação de éster (3,19%). Estudos da adsorção da CCL em crisotila demonstraram ser este um processo físico. Os resultados obtidos demonstraram que tanto a crisotila bem como o organo-gel podem ser utilizados, com sucesso, como suportes para a imobilização de enzimas com posterior aplicações destes biocatalisadores em diversas reações em meio orgânico.

A enzima β-D- frutofuranosídeo frutohidrolase (E.C. 3.2.1.26), também conhecida como invertase, é uma hidrolase capaz de clivar o dissacarídeo sacarose, gerando mistura equimolar de glicose e frutose (‘açúcar invertido’). A aplicação deste, bem como a dos monossacarídeos de modo isolado é bastante comum na indústria alimentícia, por exemplo na manufatura de recheios de doces, além de outras aplicações, como na indústria farmacêutica. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes suportes e métodos de imobilização de uma invertase de Saccharomyces cerevisiae. Os experimentos feitos com filmes de celulose, macroesferas de quitosana, e o suporte comercial Immobead não apresentaram resultados conclusivos. A imobilização covalente unipontual da invertase em mistura de nano e agregados de nanopartículas de quitosana possibilitou a obtenção dos seguintes resultados: além desse suporte ser de fácil preparação e ativação, oferecendo grande área superficial para a imobilização, o derivado imobilizado apresentou alta recuperação da atividade, sendo utilizado o protocolo que permitiu obter 74,3 % de rendimento e 61,6 % de eficiência de imobilização. A temperatura (55 ºC) e o pH ótimos de atividade (4,5), estabilidade térmica e ao armazenamento não foram modificados pós-imobilização. A afinidade da invertase pelo substrato decaiu cerca de 3 vezes, devido à reduzida acessibilidade da sacarose ao sítio ativo da enzima. Porém, o parâmetro Vmax manteve-se constante, indicando que não houve perda na máxima conversão da sacarose em seus monossacarídeos. Através da imobilização foi possível obter excelente estabilidade operacional: 59 reusos com 100 % da atividade catalítica da enzima (bateladas de 30 min, sob suave agitação, com solução de sacarose 8 %, a 55 ºC). / The enzyme β-D- fructofuranoside fructohydrolase (E.C. 3.2.1.26), also known as invertase, is one hydrolase able to cleave the sucrose disaccharide, generating an equimolar mixture of glucose and fructose (‘invert sugar’). The application of invert sugar, as well the isolated monosaccharides is very common in the food industry, for example in the manufacture of filling of sweets, besides other applications, as in the pharmaceutical industry. The objective of this work was to evaluate different supports and immobilization methods of an invertase from Saccharomyces cerevisiae. The experiments performed with cellulose films, chitosan macrospheres and the commercial support Immobead did not present conclusive results. The unipoint covalent immobilization of invertase in a mixture of chitosan nano and aggregated nanoparticles made possible to obtain the following results: besides the easy preparation and activation of this support, offering high superficial area for enzyme immobilization, the immobilized derivative presented high activity recovery, which allowed getting 74.3 % of immobilization yield and 61.6 % of immobilization efficiency. The optimal temperature (55 ºC) and pH (4.5) for activity, thermal and storage stabilities were not modified after immobilization. The enzyme affinity for its substrate decreased about 3 folds, mainly due to the reduced accessibility of sucrose to the catalytic site of the enzyme. However the parameter Vmax remained constant, indicating that there was not loss in the maximal conversion of sucrose in its monosaccharides. Through the immobilization was possible to obtain excellent operational stability: 59 reuses with 100 % of the catalytic enzyme activity (batches of 30 min, under genlte stirring, with sucrose solution 8 %, 55 ºC).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-22T09:21:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 225836.pdf: 1172201 bytes, checksum: 6cef987593cfe31ef17852d62cb933d5 (MD5) / Os efluentes das indústrias papeleiras são constituídos de vários compostos fenólicos tóxicos. Dentre esses compostos, alguns de elevadas massas molares (MM) são biotransformados apenas por alguns organismos como fungos da classe Basidiomycota. Diversos estudos demonstram que a biotransformação da madeira por estes fungos depende principalmente de sua capacidade de produzir enzimas lignolíticas extracelulares como as lacases. As lacases catalisam oxidação de uma série de compostos aromáticos, especialmente compostos fenólicos. Várias aplicações vêm sendo sugeridas para essas enzimas, dentre elas, o seu uso na biorremediação de compostos fenólicos e, conseqüentemente, efluentes que possuam tais compostos. No entanto, a aplicação destas, como de quaisquer enzimas na forma livre, torna-se inviável devido a peculiaridades das mesmas, como o fato de perderem atividade em condições e meios densnaturantes. Dessa forma, para aumentar a estabilidade operacional das enzimas, as mesmas podem ser imobilizadas em suportes sólidos, que lhes conferem maior resistência à perda de atividade. Considerando isso, o presente trabalho teve como principal objetivo imobilizar a enzima lacase em esferas de quitosana e avaliar seu potencial para biotransformação de amostras do efluente de uma indústria de papel e celulose. Inicialmente foi possível observar que, apesar da enzima ter adquirido valores baixos de estabilidade operacional, tornou-se mais resistente a diversas condições e meios desnaturantes tais como: pH e temperatura elevados, presença de inibidores e solventes. Em um segundo momento, foram realizados ensaios de biotransformação das amostras de efluente com a enzima imobilizada. O processo de biotransformação foi acompanhado em diversos períodos de tempo pelos seguintes parâmetros: fenóis totais, fenóis de baixa MM, cor e DQO. Com base nos resultados obtidos foi possível observar que, após 24 horas de incubação da enzima imobilizada com o efluente, houve remoção de aproximadamente 65% de fenóis totais, 65% de fenóis de baixa MM e 60% de cor. Embora não se tenha observado modificações estatisticamente significativas nos níveis de DQO após tratamento enzimático, foi possível concluir que a enzima imobilizada em esferas de quitosana possui grande potencial de biotransformação dos compostos fenólicos que, por sua vez, são os que detêm os agentes químicos responsáveis pela elevada toxicidade desse tipo de efluente.

Orientador: Rubens Monti / Banca: José Roberto Ernandes / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Sandra Helena da Cruz / Resumo: As endoglicanases EC 3.2.1.4 são enzimas capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas β-1,4 da celulose, resultando na liberação de glicose, celobiose e celo-oligossacarídeos. Empregadas mundialmente em diversos processos industriais, por exemplo, como amaciante de tecidos de algodão e bioestonagem de jeans, na extração de sucos de frutas, na adição em detergentes comerciais, na fabricação de cerveja, e na produção de papel e de etanol. Atualmente, há um grande interesse em enzimas que hidrolisem biomassa lignocelulósica para obtenção de etanol de segunda geração. A imobilização de enzimas em matrizes sólidas oferece muitas vantagens, entre as quais, reuso da enzima, a fácil separação do produto e o aumento da estabilidade operacional. Os objetivos deste trabalho foram: produzir CMCases secretadas por Aspergillus niger e Humicola grisea var. thermoidea em cultivo sólido e submerso; imobilizar CMCases em suporte agarose com diferentes ativações químicas; determinar a estabilidade térmica e as propriedades cinéticas dos derivados obtidos, comparando-os com as enzimas livres; avaliar a capacidade de reuso dos derivados ativos e estáveis e analisar qualitativamente o produto de hidrólise dos substratos celulósicos. O fungo A. niger secretou grandes quantidades de CMCases, 34,1 U.mg-1, em meio Vogel, utilizando pó de bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono. O pH 5 foi determinado como o ótimo para a enzima, apresentando instabilidade ao pH 10. Com a utilização de aditivos estabilizante, a trealose a 10% (m/v), manteve, em pH 10, 80% de atividade residual, por 25 horas. Em relação à temperatura, apresentou uma faixa ampla de atividade entre 45°C a 75°C, tendo como temperatura ótima 65°C. O derivado enzimático que ofereceu melhor estabilidade foi aquele em que a imobilização foi conduzida juntamente com o substrato carboximeticelulose (CMC 1%), em... / Abstract: The endoglucanases EC 3.2.1.4 are enzymes that hydrolyze the β-1, 4 glycosidic linkages of the cellulose producing glucose, cellobiose and cello-oligosaccharides. Used worldwide in many industrial processes such as fabric softener and bioestonagem cotton jeans, extraction of fruit juices, in the addition of commercial detergents, in brewing, and the production of paper and ethanol. Currently, there is great interest in enzymes that hydrolyze lignocellulosic biomass to obtain second-generation ethanol. The immobilization of enzymes on solid arrays provides many advantages as the enzyme reuse, easy separation of the product and increased operational stability. The aims of this study were to produce secreted: CMCases produce secreted by Aspergillus niger and Humicola grisea var. thermoidea in solid and submerged cultivation; CMCases immobilized on agarose support with different chemical activations; determine the thermal stability and kinetic properties of the derivatives obtained comparing them with the free enzyme; evaluate the reuse capacity assets and stable derivatives and qualitatively analyze the product of hydrolysis of cellulosic substrates. The fungus A. niger secreted large amounts of CMCases, 34.1 U.mg-1 amid Vogel, using powdered sugarcane bagasse as a carbon source. The pH of 5 was determined as the optimum for the enzyme, presenting instability to pH 10. With the use of stabilizing additives, the 10% trehalose (w / v), kept at pH10, 80% residual activity for 25 hours. Regarding temperature there was a broad activity range from 45 °C to 75 °C and the optimum temperature as 65 °C. The enzyme derivative which offered better stability was one in which immobilization was conducted with the carboxymethycellulose substrate (1% CMC) in agarose support Glutaraldehyde (70% of reactive groups), preserving catalytic activity of 35% at 60 °C for 250 hours. Through qualitative TLC analysis, it... / Doutor

Orientador: Daniela Alonso Bocchini Martins / Co-orientador: Roberto da Silva / Banca: Cíntia Duarte de Freitas Milagre / Banca: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Maria de Lourdes Teixeira de Moraes Polizeli / Resumo: Este trabalho visou produzir e estudar a lipase do fungo Fusarium verticillioides . A enzima obtida foi avaliada quanto à capacidade de hidrolise, esterificaçã o e transesterificação para a produção de ácidos graxos e ésteres. A cepa fúngica foi cultivada em diferentes meios de cultura, variando as fontes de nitrogênio e de carbono, avaliando - se as atividades . Verificou - se que o tipo de atividade e e specificidade da lipase dependem dos nutrientes utilizados nos meios de cultivo do fungo por fermentação em estado sólido. A lipase foi caracterizada físico - quimicamente e apresentou temperatura ótima em 35°C e melhor estabilidade durante 5 horas em 30°C, entretanto a 35°C também foi observada uma boa estabilidade. O pH ótimo foi em 8, e melhor estabilidade em pH ácido ( 5 e 6). Esta última característica foi muito importante, já que a reação de transesterificação geralmente ocorre em pH 5. A enzima também se mostrou est ável na presença de n - he xano e etanol e apresentou uma ativação durante 24 horas diante destes solventes orgânicos. Também foi observad a a presença de mais de uma lipase na membrana celular da cepa, o que levou a avaliar sua ação na forma de células imobil izadas diretamente em farelo de trigo e na forma livre. A lipase imobilizada na biomassa fúngica também foi caracterizada, apresentando melhor atuação em pH 8, como ocorreu com a lipase extracelular, porém em 30°C. Por meio de planejamentos fatoriais foi p ossível observar que a lipase apresenta melhor atividade quando se utilizada ácidos graxos e álcoois de cadeias carbônicas maiores, além de atuar melhor em reações de transesterificação, utilizando - se óleo pré - usado. A célula imobilizada em farelo de trigo foi empregada em hidrólises, sendo obtido 34,9 % de ómega 3 a partir do óleo de canola e 70,9 % de ômega 6 a partir do óleo de linhaça em 12 horas de reação... / Abstract: This work aimed to produce and study the lipase from the Fusarium verticillioides fungus. The enzyme obtained was evaluated according to its capacity of hydrolysis, esterification and transesterification to the production of fatty acids and esters. The fungal strain was cultivated in different culture media, varying sources of nitrogen and carbon, evaluating the activities. It was found that the type of activity and the specificity of the lipase depend on th e nutrients used in the fungus culture media by fermentation in solid state. The lipase was physically and chemically characterized and presented optimum temperature at 35°C and better stability during 5 hours at 30°C; however, at 35°C it was also observed good stability. The optimum pH was 8 and the stability was better at acid pHs (5 and 6). This last feature was very important, since the transesterification reaction usually happens at pH 5. The enzyme was also stable in the presence of n - hexane and ethan ol and presented hyper - activation during 24 hours before these organic solvents. It was also observed the presence of more than one lipase on the cell membrane of the strain, which led to the evaluation of its action in the form of immobilized cells direct ly in wheat bran and in free form. The lipase immobilized in the fungal biomass was also described presenting better performance at pH 8, as it happened with the extracellular lipase, but at 30°C. Through factorial design, it was possible to observe that t he lipase has better activity when fatty acids and alcohols from higher carbon chains are used, besides performing better in transesterification reactions using oils pre - used. The immobilized cell in wheat bran was used in hydrolysis, being 34.9 % of omega 3 obtained from canola oil and 70.9 % of omega 6 from linseed oil in 12 hours of reaction. The extracellular enzyme crude extract was submitted to immobilization in inert car... / Doutor

A enzima β-D- frutofuranosídeo frutohidrolase (E.C. 3.2.1.26), também conhecida como invertase, é uma hidrolase capaz de clivar o dissacarídeo sacarose, gerando mistura equimolar de glicose e frutose (‘açúcar invertido’). A aplicação deste, bem como a dos monossacarídeos de modo isolado é bastante comum na indústria alimentícia, por exemplo na manufatura de recheios de doces, além de outras aplicações, como na indústria farmacêutica. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes suportes e métodos de imobilização de uma invertase de Saccharomyces cerevisiae. Os experimentos feitos com filmes de celulose, macroesferas de quitosana, e o suporte comercial Immobead não apresentaram resultados conclusivos. A imobilização covalente unipontual da invertase em mistura de nano e agregados de nanopartículas de quitosana possibilitou a obtenção dos seguintes resultados: além desse suporte ser de fácil preparação e ativação, oferecendo grande área superficial para a imobilização, o derivado imobilizado apresentou alta recuperação da atividade, sendo utilizado o protocolo que permitiu obter 74,3 % de rendimento e 61,6 % de eficiência de imobilização. A temperatura (55 ºC) e o pH ótimos de atividade (4,5), estabilidade térmica e ao armazenamento não foram modificados pós-imobilização. A afinidade da invertase pelo substrato decaiu cerca de 3 vezes, devido à reduzida acessibilidade da sacarose ao sítio ativo da enzima. Porém, o parâmetro Vmax manteve-se constante, indicando que não houve perda na máxima conversão da sacarose em seus monossacarídeos. Através da imobilização foi possível obter excelente estabilidade operacional: 59 reusos com 100 % da atividade catalítica da enzima (bateladas de 30 min, sob suave agitação, com solução de sacarose 8 %, a 55 ºC). / The enzyme β-D- fructofuranoside fructohydrolase (E.C. 3.2.1.26), also known as invertase, is one hydrolase able to cleave the sucrose disaccharide, generating an equimolar mixture of glucose and fructose (‘invert sugar’). The application of invert sugar, as well the isolated monosaccharides is very common in the food industry, for example in the manufacture of filling of sweets, besides other applications, as in the pharmaceutical industry. The objective of this work was to evaluate different supports and immobilization methods of an invertase from Saccharomyces cerevisiae. The experiments performed with cellulose films, chitosan macrospheres and the commercial support Immobead did not present conclusive results. The unipoint covalent immobilization of invertase in a mixture of chitosan nano and aggregated nanoparticles made possible to obtain the following results: besides the easy preparation and activation of this support, offering high superficial area for enzyme immobilization, the immobilized derivative presented high activity recovery, which allowed getting 74.3 % of immobilization yield and 61.6 % of immobilization efficiency. The optimal temperature (55 ºC) and pH (4.5) for activity, thermal and storage stabilities were not modified after immobilization. The enzyme affinity for its substrate decreased about 3 folds, mainly due to the reduced accessibility of sucrose to the catalytic site of the enzyme. However the parameter Vmax remained constant, indicating that there was not loss in the maximal conversion of sucrose in its monosaccharides. Through the immobilization was possible to obtain excellent operational stability: 59 reuses with 100 % of the catalytic enzyme activity (batches of 30 min, under genlte stirring, with sucrose solution 8 %, 55 ºC).