Strikt anaerobe Bakterien wie Clostridium difficile und C. scatologenes verwenden GRE, um die chemisch ungünstige Decarboxylierung von 4-Hydroxyphenylacetat zu p-Cresol zu katalysieren. Das Enzymsystem besteht aus einer Decarboxylase und dem zugehörigen Aktivierungsenzym. Die 4-Hydroxyphenylacetat-Decarboxylase (4Hpad) besitzt zusätzlich zum Protein-basierten Glycinradikal eine weitere Untereinheit mit bis zu zwei [4Fe-4S] Clustern und repräsentiert hierdurch eine neue Klasse von Fe/S-Cluster-haltigen GREs, die aromatische Verbindungen umsetzen. Das Aktivierungsenzym (4Hpad-AE) weicht vom Standardtypus ab, indem es zusätzlich zum S-Adenosylmethionin(SAM)-bindenden [4Fe-4S]-Cluster (RS-Cluster) mindestens einen weiteren [4Fe-4S]-Cluster bindet. In dieser Studie wurden heterologe Expressions- und Reinigungsprotokolle für 4Hpad und 4Hpad-AE entwickelt. Kristallstrukturen von 4Hpad cokristallisiert mit den Substraten (4-Hydroxyphenylacetat, 3,4-Dihydroxyphenylacetat) und dem Inhibitor (4-Hydroxyphenylacetamid) zeigten geringe strukturelle Änderungen im aktiven Zentrum des Proteins. Die Radikalbildung am 4Hpad-AE wurde durch die Überprüfung einer klassischen reduktiven Spaltung von SAM zu den Reaktionsprodukten 5’-Deoxyadenosin und Methionin bestätigt. EPR- und Mössbauer-Spektroskopische Analysen zeigten, dass 4Hpad-AE mindestens einen zusätzlichen [4Fe-4S] Cluster neben dem einzelnen RS-Cluster enthält. Die katalytische Notwendigkeit eines zusätzlichen Clusters wurde durch eine Mutationsanalyse untersucht, wobei eine verkürzte Version des Enzyms ohne die zusätzliche Cystein-reiche Insertion konstruiert wurde. Das verkürzte Mutante ohne die Bindungsmotive für die zusätzlichen Cluster gekennzeichnet, die Konfiguration, Stöchiometrie und die Funktion der zusätzlichen Cluster diagnostizieren. / 4-hydroxyphenylacetate decarboxylase (4Hpad) is a two [4Fe-4S] cluster containing glycyl radical enzyme proposed to use a glycyl/thiyl radical dyad to catalyze the last step of tyrosine fermentation in Clostridium difficile and C. scatologenes by a Kolbe-type decarboxylation. The decarboxylation product p-cresol is a virulence factor of the human pathogen C. difficile. The small subunit of 4Hpad may have a regulatory function with the Fe/S clusters involved in complex formation and radical dissipation in the absence of substrate. The respective activating enzyme (4Hpad-AE) has one or two [4Fe-4S] cluster(s) in addition to the SAM-binding [4Fe-4S] cluster (RS cluster). The role of these auxiliary clusters is still under debate with proposed functions including structural integrity and conduit for electron transfer to the RS cluster. This study shows the optimized expression and purification protocols for the decarboxylase and the co-crystallization experiments and binding studies with 4-hydroxy-phenylacetate and 3,4-dihydroxyphenylacetate and with the inhibitor 4-hydroxy-phenylacetamide. The purification and characterization of active site mutants of decarboxylase are also done. Concerning 4-HPAD-AE, we report on the purification of code-optimized variants, and on spectroscopic and kinetic studies to characterize the respective i) SAM binding enthalpies, ii) rates for reductive cleavage of SAM and iii) putative functions of the additional Fe/S clusters. The truncated mutant lacking the binding motifs for the auxiliary clusters is characterized to diagnose the configuration, stoichiometry and function of the auxiliary clusters.

CD1 Moleküle spielen eine wichtige Rolle in der Lipidpräsentation und T-Zell-Aktivierung. CD1d fungiert als Restriktionselement für NKT-Zellen, eine T-Zell-Untergruppe, die nach Erkennung von Glykosphingolipide (GSL), IFN-gamma und IL-4 produziert. NKT Zellen steuern folglich anschliessende Immunantworten. Den meisten infektiösen Mikroorganismen mangelt es jedoch an GSL-Antigenen zur Stimulation von NKT-Zellen. Der Wirtsorganismus hat daher einen Mechanismus entwickelt, der die Aktivierung der NKT-Zellen dennoch gewährleistet. NKT-Zellen erkennen auch endogene GSL, die in dendritischen Zellen (DZ) infolge von Toll-like-Rezeptor (TLR)-Stimulation durch Pathogene produziert werden. Bislang war unklar, wie genau TLR-Aktivierung zur Produktion von Selbst-GSL-Antigenen führt. Ziel dieser Arbeit war es die Verknüpfung der beiden Prozesse aufzudecken. Diese Dissertation zeigt, dass alpha-Galaktosidase A (a-Gal A) als lysosomales Schlüsselenzym für den konstitutiven Abbau von Selbst-GSL-Antigenen in DZ fungiert. NKT-Zellen antworteten auf CD1d-restringierte Antigene, die von DZ, denen a-Gal A-Aktivität fehlte, präsentiert wurden. Ferner expandierten NKT-Zellen nach adoptiven Transfer in a-Gal A-defiziente Mäuse in Abhängigkeit von CD1d-Expression im Wirtsorganismus. Diese Arbeit zeigte auch, wie GSL-Antigene dem Abbau durch a-Gal A entkommen und für die NKT-Zell-Aktivierung bei Infektionen verfügbar werden. Unter normalen Bedingungen wurden die GSL durch a-Gal A abgebaut. TLR-vermittelte Signale führten jedoch zu Inhibierung der a-Gal A-Aktivität in DZ und resultierten somit in einer GSL-Akkumulation in den Lysosomen. Wir identifizierten einen neuen Regulationsmechanismus der NKT-Zell-Aktivierung bei Infektionen, der auf der Induktion von lysosomalen GSL-Antigenen durch TLR-vermittelte Hemmung der a-Gal A-Aktivität beruht. Diese Dissertation beantwortet fundamentale Fragen der NKT-Zell-Biologie und ebnet den Weg dieses System für therapeutische Ansätze zu nutzen. / CD1 molecules are pivotal for lipid presentation to T lymphocytes. Notably, CD1d functions as a restriction element for NKT cells, a T-cell lineage that produces IFN-gamma and IL-4 following recognition of glycosphingolipids (GSL). Consequently, NKT cells exert decisive regulatory functions on downstream immune responses. Most microbes potentially causing infection of the host lack GSL antigens to stimulate NKT cells. However, facing this challenge, the host developed a mechanism to ensure NKT-cell activation. This pathway exploits the property of NKT cells to react with self GSLs produced in dendritic cells (DCs) stimulated by pathogens through Toll-like receptors (TLR). How TLR engagement leads to production of self GSL antigens remains elusive. The aim of this study was to provide a mechanistic link between these two processes. Here, we identified alpha-galactosidase A (a-Gal A) as a key lysosomal enzyme required for constitutive degradation of self GSL antigens in DCs. Accordingly, NKT cells exposed to DCs lacking a-Gal A activity were activated in the context of CD1d-presented antigens. In addition, NKT cells underwent robust expansion upon transfer to a-Gal A-deficient mice that required CD1d expression by the host. This study further addressed the critical question as to how GSL antigens escape degradation by a-Gal A, and thus become available for presentation to NKT cells in infection. Accordingly, we found that TLR signaling targeted a-Gal A activity for negative regulation in DCs. Consequently, GSLs degraded by a-Gal A in steady-state conditions were induced in lysosomes. Based on these findings, we propose a new pathway that warrants the activation of NKT cells in infection by self GSL antigens induced through TLR-mediated inhibition of a-Gal A activity. Overall, this dissertation answers fundamental questions in the NKT field, and paves the way toward exploring this antigen presentation axis for therapeutic use.

In mehrfaktoriellen 2 x 2 x 4 Untersuchungen im Zeitraum vom 7. - 28. Lebenstag und in Bilanzversuchen vom 15. - 20. Lebenstag mit männlichen Broilerküken (Cobb 500) wurden die Effekte der Versuchsfaktoren Zerkleinerung (Hammermühle vs. Walzenstuhl), thermische Behandlung (Konditionierung bei 70°C vs. Konditionierung/Expandierung 100°C) und Zusätze von Zink-Bacitracin bzw. Roxazym G2 (ohne Zusatz, mit Zink-Bacitracin 50 mg, mit Roxayzm G2 150 ppm und deren Zusatzkombination A+E) sowie die Interaktionen untersucht. Als Kriterien dienten die Parameter Futterverzehr, Lebendmassezunahme, Futteraufwand, Nährstoffansatz und -verwertung, ileale Verdaulichkeit von ausgewählten Aminosäuren, Proteinverwertung/Proteinqualität und Umsetzbarkeit der Energie. Die Versuchstiere erhielten ab dem 7. Lebenstag die entsprechenden Versuchsmischungen. Der Gehalt an XP und MEn aller Versuchsmischungen war einheitlich (XP 21,7% und MEn 12,3 MJ/kg Futter). Die Lysinversorgung wurde auf 90 % unter der optimalen Bedarfsdeckung in allen Futtermischungen limitiert. Die Auswirkungen der Versuchsfaktoren lassen sich wie folgt zusammenfassen: - Zerkleinerung : Die Zerkleinerungstechnologie mit dem Walzenstuhl übte einen signifikanten Einfluss auf den Futterverzehr (-3,5 %) und Futteraufwand (-2,8 %) gegenüber der Zerkleinerung mit der Hammermühle aus. Die Nährstoffverwertung (XP und Energie) zeigten durch Walzenstuhl-Zerkleinerung tendenzielle Verbesserungen. Die ileale Lysinverdaulichkeit blieb unverändert, die ileale Verdaulichkeit von Threonin und Met+Cys wurde signifikant erhöht. Die Walzenstuhl-Zerkleinerung führte zu einer besseren Futterstruktur und zu einer höheren Nährstoffdichte in den Pellets. Das wird deutlich durch die höhere N-Aufnahme bzw. N-Bilanz sowie durch gesteigerte N-Verwertungsparameter und einen erhöhten Gehalt an N-korrigierter umsetzbarer Energie (MEn). - Thermische Behandlung : Durch erhöhte Hitzeapplikation mit dem Expander konnten in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich der Leistungsparameter, Nährstoffansatz und -verwertung keine Unterschiede gegenüber der Konditionierung festgestellt werden. Die Expandierung führte zu einer signifikant erhöhten ilealen Lysinverdaulichkeit, die durch die gemessene Lysinwirksamkeit im Bilanzversuch jedoch nicht widergespiegelt wurde. Auch signifikant niedrigere N-Bilanz und physiologische Proteinnutzwerte (PNu) sowie die tendenzielle Verringerung der N-Verdaulichkeit und des Gehaltes an umsetzbarer Energie deuten auf eine negative Wirkung der intensiveren thermischen Behandlung durch Expandieren hin. Hierzu sind weitere klärende Untersuchungen notwendig. - Futterzusätze: Durch die alleinige Supplementierung mit dem Antibiotikum Zink-Bacitracin oder NSP-spaltenden Enzym Roxazym G2 bzw. deren Kombination reagierten Mastleistung und Futterverwertung signifikant positiv. Während der Effekt der Enzymzulagen bei Nährstoffverwertung und ilealer Verdaulichkeit ausgewählter Aminosäure signifikant höher gegenüber der unsupplementierten Gruppe war, blieb ein Effekt von Zink-Bacitracin hinsichtlich dieser Parameter aus. Der Effekt der Zusatzkombination war bei Mastleistung, Nährstoffansatz und -verwertung und bei der ilealen Verdaulichkeit der ausgewählten Aminosäuren gegenüber der Kontrolle oder dem alleinigen Zusatz signifikant höher. Das deutet auf einen synergistischen Effekt der gleichzeitigen Applikation der beiden Additive hin. Die N-Verwertung einschließlich des Gehalts an N-korrigierter scheinbar umsetzbarer Energie lag nach alleiniger Applikation von Zink-Bacitracin unerwartet signifikant niedriger gegenüber den anderen Zusätzen bzw. tendenziell gegenüber der Kontrolle. Die Gehalte an scheinbar umsetzbarer Energie (AMEn) waren deutlich durch den Enzymzusatz allein oder in Kombination mit Zink-Bacitracin erhöht. -Interaktionen: Die Abhängigkeit der Versuchsfaktoren voneinander im Mastversuch war nicht stark ausgeprägt. Die Zerkleinerung in Verbindung mit anschließender thermischer Behandlung führte zur Beeinflussung der Futterverzehrsdaten. Danach verbesserten die Verfahrenskombinationen Hammermühle x Konditionierung oder Walzenstuhl x Expandierung bedingt durch einen erhöhten Futterverzehr die Lebendmassezunahme und den Nährstoffansatz signifikant. Hinsichtlich der ilealen Aminosäurenverdaulichkeit zeigten die Futterzusätze eine Abhängigkeit von der Behandlung bzw. Zerkleinerung und Behandlung. Die Enzymzulage allein oder in Kombination mit Zink-Bacitracin zeigte stärkere Effektivität in Verbindung mit der thermischen Behandlung durch Expandieren.

Casein is the major protein fraction in milk, and its cross-linking has been a topic of scientific interest for many years. Enzymatic cross-linking has huge potential to modify relevant techno-functional properties of casein, whereas non-enzymatic cross-linking occurs naturally during the storage and processing of milk and dairy products. Two size separation techniques were applied for characterisation of these reactions: gel electrophoresis and size exclusion chromatography. This review summarises their separation principles and discusses the outcome of studies on cross-linked casein from the last ~20 years. Both methods, however, show limitations concerning separation range and are applied mainly under denaturing and reducing conditions. In contrast, field flow fractionation has a broad separation range and can be easily applied under native conditions. Although this method has become a powerful tool in polymer and nanoparticle analysis and was used in few studies on casein micelles, it has not yet been applied to investigate cross-linked casein. Finally, the principles and requirements for absolute molar mass determination are reviewed, which will be of increased interest in the future since suitable calibration substances for casein polymers are scarce.

Part I. The aldosterone synthase gene (CYP11B2) polymorphism T-344C in blood pressure and left ventricular hypertrophy. BACKGROUND: Aldosterone is a key cardovascular hormone, it significantly influences volume, pressure and electrolyte balance. Aldosterone plays an important role in development of left ventricular (LV) hypertrophy and myocardial fibrosis. The aldosterone synthase gene (CYP11B2) is an important candidate gene region in essential hypertension. DESIGN AND METHODS: We assessed the influence of the T-344C polymorphism of aldosterone synthase - the rate-limiting enzyme in aldosterone biosynthesis - on the structure of the left ventricle in young normotensive men. The population included 113 normotensive mid-European Caucasian men aged 18-40 years (mean 27 +/- 5 years). We also studied the association of -344T/C polymorphism of the CYP11B2 gene with the presence and severity of hypertension in 369 individuals, of whom 213 were hypertensive patients (139 controlled hypertensive, 74 resistant hypertensive) and 156 were healthy normotensive subjects. The genotype was assessed using polymerase chain reaction with subsequent cleavage with restriction enzyme HAEIII (restriction fragment length polymorphism method) and visualization with ethidium bromide. Plasma renin activity (PRA) and plasma...

In Waldökosystemen ist Totholz von zentraler Bedeutung, indem es zahlreichen Organismen einen Lebensraum bietet oder als Substrat dient, Bestandteil des Kohlenstoff- und Nährstoffkreislaufs ist sowie als ein wichtiges strukturelles Element fungiert. Für seine Zersetzung ist die Überwindung der Ligninbarriere von besonderer Bedeutung. Dazu sind lediglich saprobionte Pilze aus den Phyla der Basidiomycota und Ascomycota in der Lage, die verschiedene Strategien – die Fäuletypen – entwickelt haben, um Lignin abzubauen oder zu modifizieren und somit Zugang zu den vom Lignin inkrustierten Polysachariden (Zellulose und Hemizellulosen) zu erhalten. Eine besondere Rolle spielen dabei Weißfäulepilze, die mit ihren extrazellulären oxidativen Enzymen, wie Laccasen und verschiedenen Peroxidasen, Lignin komplett bis zum Kohlendioxid (CO2) mineralisieren. Trotz der Bedeutung des Ligninabbaus für die Totholzzersetzung sind extrazelluläre oxidative Enzyme im natürlichen Totholz kaum erforscht. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der oxidativen Enzyme für die Totholzzersetzung unter Realbedingungen zu verifizieren, ihre räumlichen und zeitlichen Muster zu beschreiben und ihre Abhängigkeiten von verschiedenen Totholzvariablen sowie der pilzlichen Artengemeinschaft in und auf Totholz zu ermitteln. Weiter wurde die Veränderung der Totholzvariablen über den Zersetzungsprozess für unterschiedliche Baumarten vergleichend beschrieben und der Einfluss der Waldbewirtschaftung auf den Prozess untersucht. Dazu wurden 197 natürliche Totholzstämme (coarse woody debris, CWD) von Fagus sylvatica (Rotbuche), Picea abies (Gemeine Fichte) und Pinus sylvestris (Gemeine Kiefer) in unterschiedlich stark bewirtschafteten Wäldern in Deutschland untersucht. Insgesamt wurden 735 Proben genommen und darin die Aktivität von Laccase (Lacc), Genereller Peroxidase (GenP) und Mangan-Peroxidase (MnP) gemessen. Weiterhin wurden Variablen wie Dichte, Wassergehalt, pH-Wert, wasserlösliche Ligninfragmente, die Gehalte an Lignin und Extraktiven sowie an Nährstoffen und Metallen (N, Al, Ca, Cu, K, Mg, Mn und Zn) ermittelt. Die pilzliche Artengemeinschaft wurde anhand genetischer Fingerprints (F-ARISA) und mittels Fruchtkörperkartierung erfasst. In 79 % der untersuchten Totholzproben wurden oxidative Enzymaktivitäten festgestellt. Sie waren hoch variabel über den Zersetzungsverlauf sowie in Bezug auf die Probenahmepositionen innerhalb der einzelnen Stämme. Generell waren die Aktivitäten im F.-sylvatica-Totholz höher als im Koniferentotholz. Lineare und logistische Modelle zeigten, dass die pilzliche Artengemeinschaft, gefollgt von den wasserlöslichen Ligninfragmenten, die wichtigste Einflussgröße hinsichtlich der oxidativen Enzyme war. Ein saurer pH-Wert unterstützte die Funktion von Lacc und MnP; Mangan, Eisen und Kupfer waren in ausreichenden Konzentrationen vorhanden, um die Funktion und Bildung der Enzyme zu gewährleisten. Die holzabbauenden Pilze erwiesen sich als optimal an das niedrige Stickstoffangebot im Totholz angepasst, sodass ein erhöhter Stickstoffeintrag über zwei Jahre die oxidativen Enzymaktivitäten nicht weiter beeinflusste. Der pH-Wert sowie die Gehalte an Lignin, Extraktiven und Nährstoffen waren im Vergleich der drei Baumarten signifikant verschieden, obwohl die zeitlichen Veränderungen der Variablen über den Zersetzungsprozess vergleichbar waren. Die Anzahl operativer taxonomischer Einheiten (OTUs ~ molekulare Artenzahl) nahm im Verlauf der Holzzersetzung zu, während die Zahl fruktifizierender Arten für mittlere Zersetzungsgrade am höchsten war. Beide Artenzahlen nahmen zusammen mit dem Stammvolumen zu. Die Weißfäulepilze dominierten über den gesamten Zersetzungsprozess die fruchtkörperbasierte Artenzahl aller drei Baumarten, was mit dem Vorhandensein oxidativer Enzymaktivitäten einhergeht. Generell nahmen der massebezogene Gehalt des Lignins, der Extraktive und der Nährstoffe über die Zersetzung zu, während der volumenbezogene Gehalt abnahm. Der pH-Wert im Holz aller drei Baumarten sank kontinuierlich im Verlauf der Zersetzung. Eine Erhöhung der Waldbewirtschaftungsintensität hatte einen negativen Effekt auf das Stammvolumen und darüber vermittelt auf die Zahl fruktifizierender Pilzarten, jedoch kaum auf andere untersuchte Totholzvariablen. Aufgrund des häufigen Vorkommens von Weißfäulepilzen, der gleichzeitigen Präsenz oxidativer Enzymaktivitäten und des substanziellen Ligninabbaus kann auf eine fundamentale Bedeutung von Laccasen und Peroxidasen für die Zersetzung des Totholzes geschlossen werden. Nicht zuletzt die charakteristische Molekularmassenverteilung der wasserlöslichen Ligninfragmente deutete darauf hin, dass die Mn-oxidierenden Peroxidasen (MnPs) die dominierenden oxidativen Enzyme des Ligninabbaus sind. Das hoch variable Muster der oxidativen Enzymaktivitäten ist jedoch das Resultat eines komplexen Zusammenspiels der Holzeigenschaften und der pilzlichen Artengemeinschaft. Die dabei bestehenden funktionellen Abhängigkeiten müssen weiter im Detail in zukünftigen Studien analysiert und aufgeklärt werden. / In forest ecosystems, deadwood is an important component that provides habitat and substrate for numerous organisms, contributes to the carbon and nutrient cycle as well as serves as a structural element. Overcoming the lignin barrier is a key process in deadwood degradation. Only specialized saprotrophic fungi of the phyla Basidiomycota and Ascomycota developed different strategies – the rot types – to degrade lignin or to modify it in way, which allows them to get access to the polysaccharides (cellulose and hemicelluloses) that are incrusted within the lignocellulosic complex. In this context, basidiomycetous white rot fungi secreting oxidative enzymes (especially laccases and peroxidases) are of particular importance, since they are the only organisms that are able to substantially mineralize lignin to carbon dioxide (CO2). Although lignin degradation is such an important process for deadwood degradation, oxidative enzyme activities have been only poorly studied under natural conditions in deadwood. The aim of this work was to verify the importance of oxidative enzymes for deadwood degradation in the field, to describe their temporal and spatial patterns of occurrence and to identify dependencies from deadwood variables as well as from the fungal community within and on deadwood. Furthermore, the changes of different deadwood variables were studied over the whole period of degradation and compared among three tree species. Last but not least, the influence of forest management intensity on the process of deadwood degradation was evaluated. Therefor, 197 logs of naturally occurring deadwood (coarse woody debris, CWD) of Fagus sylvatica (European beech), Picea abies (Norway spruce) and Pinus sylvestris (Scots pine) were monitored and sampled in forests with different management regimes across three regions in Germany. A total of 735 samples were taken from the logs and analyzed regarding activities of laccase (Lacc), general peroxidase (GenP) and manganese peroxidase (MnP). Wood density, water content, content of lignin and extractives as well as of nutrients and metals (N, Al, Ca, Cu, K, Mg, Mn und Zn) were determined in the samples, too. The fungal community was assessed based on sporocarps (fruiting bodies) and molecular fingerprints (F-ARISA). Oxidative enzyme activities were present in 79 % of all samples. The activities were found to be highly variable both regarding the time course of degradation and their distribution within the logs. Activities were generally higher in wood samples of F. sylvatica than in samples of conifers. Linear and logistic models revealed that the fungal community structure was the most important determinant for oxidative enzyme activities in the samples, followed by the amount of water-soluble lignin fragments. Moreover, the prevalent acidic pH determined in deadwood was suitable to facilitate the function of laccase and peroxidases. Concentrations of metals (manganese, copper, iron) were sufficient to ensure synthesis and functioning of the enzymes. Deadwood-dwelling fungi turned out to be well adapted to low nitrogen concentrations and thus, an elevated nitrogen deposition over a period of two years did not affect the oxidative enzyme activities. The pH as well as the content of lignin, extractives and nutrients significantly differed among the tree species; however, their trend over the course of degradation was rather similar. Molecular species richness (determined by F-ARISA as OTUs) increased over the whole course of degradation, while the number of fruiting species was highest in the intermediate stage of degradation. Both types of species richness increased with increasing volume of the CWD logs. Over the entire degradation period, white rot fungi – based on the identification of sporocarps – were the most abundant group of wood rot fungi in and on all three tree species. This corresponds well with the overall presence of oxidative enzyme activities. During degradation, the mass-related content of lignin, extractives and nutrients frequently increased, although the volume-related content decreased. The pH  of all three tree species decreased in deadwood over the whole period of degradation. Higher forest management intensity had a negative effect on the log volume of deadwood and in consequence on fungal species richness (fruiting bodies), but hardly to other analyzed variables. Based on the widespread occurrence of white rot fungi, the concomitant presence of oxidative enzyme activities as well as the substantial loss of lignin, it can be concluded that laccases and peroxidases are highly relevant for deadwood decomposition. Not least, the detected characteristic molecular size distribution of water-soluble lignin fragments points to a key role of Mn oxidizing peroxidases (MnPs) in enzymatic lignin degradation. The variable patterns of oxidative enzymes observed in wood samples is therefore the result of a complex array of wood variables and the fungal community structure, which will have to be resolved in more detail in future studies.

In Waldökosystemen ist Totholz von zentraler Bedeutung, indem es zahlreichen Organismen einen Lebensraum bietet oder als Substrat dient, Bestandteil des Kohlenstoff- und Nährstoffkreislaufs ist sowie als ein wichtiges strukturelles Element fungiert. Für seine Zersetzung ist die Überwindung der Ligninbarriere von besonderer Bedeutung. Dazu sind lediglich saprobionte Pilze aus den Phyla der Basidiomycota und Ascomycota in der Lage, die verschiedene Strategien – die Fäuletypen – entwickelt haben, um Lignin abzubauen oder zu modifizieren und somit Zugang zu den vom Lignin inkrustierten Polysachariden (Zellulose und Hemizellulosen) zu erhalten. Eine besondere Rolle spielen dabei Weißfäulepilze, die mit ihren extrazellulären oxidativen Enzymen, wie Laccasen und verschiedenen Peroxidasen, Lignin komplett bis zum Kohlendioxid (CO2) mineralisieren. Trotz der Bedeutung des Ligninabbaus für die Totholzzersetzung sind extrazelluläre oxidative Enzyme im natürlichen Totholz kaum erforscht. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der oxidativen Enzyme für die Totholzzersetzung unter Realbedingungen zu verifizieren, ihre räumlichen und zeitlichen Muster zu beschreiben und ihre Abhängigkeiten von verschiedenen Totholzvariablen sowie der pilzlichen Artengemeinschaft in und auf Totholz zu ermitteln. Weiter wurde die Veränderung der Totholzvariablen über den Zersetzungsprozess für unterschiedliche Baumarten vergleichend beschrieben und der Einfluss der Waldbewirtschaftung auf den Prozess untersucht. Dazu wurden 197 natürliche Totholzstämme (coarse woody debris, CWD) von Fagus sylvatica (Rotbuche), Picea abies (Gemeine Fichte) und Pinus sylvestris (Gemeine Kiefer) in unterschiedlich stark bewirtschafteten Wäldern in Deutschland untersucht. Insgesamt wurden 735 Proben genommen und darin die Aktivität von Laccase (Lacc), Genereller Peroxidase (GenP) und Mangan-Peroxidase (MnP) gemessen. Weiterhin wurden Variablen wie Dichte, Wassergehalt, pH-Wert, wasserlösliche Ligninfragmente, die Gehalte an Lignin und Extraktiven sowie an Nährstoffen und Metallen (N, Al, Ca, Cu, K, Mg, Mn und Zn) ermittelt. Die pilzliche Artengemeinschaft wurde anhand genetischer Fingerprints (F-ARISA) und mittels Fruchtkörperkartierung erfasst. In 79 % der untersuchten Totholzproben wurden oxidative Enzymaktivitäten festgestellt. Sie waren hoch variabel über den Zersetzungsverlauf sowie in Bezug auf die Probenahmepositionen innerhalb der einzelnen Stämme. Generell waren die Aktivitäten im F.-sylvatica-Totholz höher als im Koniferentotholz. Lineare und logistische Modelle zeigten, dass die pilzliche Artengemeinschaft, gefollgt von den wasserlöslichen Ligninfragmenten, die wichtigste Einflussgröße hinsichtlich der oxidativen Enzyme war. Ein saurer pH-Wert unterstützte die Funktion von Lacc und MnP; Mangan, Eisen und Kupfer waren in ausreichenden Konzentrationen vorhanden, um die Funktion und Bildung der Enzyme zu gewährleisten. Die holzabbauenden Pilze erwiesen sich als optimal an das niedrige Stickstoffangebot im Totholz angepasst, sodass ein erhöhter Stickstoffeintrag über zwei Jahre die oxidativen Enzymaktivitäten nicht weiter beeinflusste. Der pH-Wert sowie die Gehalte an Lignin, Extraktiven und Nährstoffen waren im Vergleich der drei Baumarten signifikant verschieden, obwohl die zeitlichen Veränderungen der Variablen über den Zersetzungsprozess vergleichbar waren. Die Anzahl operativer taxonomischer Einheiten (OTUs ~ molekulare Artenzahl) nahm im Verlauf der Holzzersetzung zu, während die Zahl fruktifizierender Arten für mittlere Zersetzungsgrade am höchsten war. Beide Artenzahlen nahmen zusammen mit dem Stammvolumen zu. Die Weißfäulepilze dominierten über den gesamten Zersetzungsprozess die fruchtkörperbasierte Artenzahl aller drei Baumarten, was mit dem Vorhandensein oxidativer Enzymaktivitäten einhergeht. Generell nahmen der massebezogene Gehalt des Lignins, der Extraktive und der Nährstoffe über die Zersetzung zu, während der volumenbezogene Gehalt abnahm. Der pH-Wert im Holz aller drei Baumarten sank kontinuierlich im Verlauf der Zersetzung. Eine Erhöhung der Waldbewirtschaftungsintensität hatte einen negativen Effekt auf das Stammvolumen und darüber vermittelt auf die Zahl fruktifizierender Pilzarten, jedoch kaum auf andere untersuchte Totholzvariablen. Aufgrund des häufigen Vorkommens von Weißfäulepilzen, der gleichzeitigen Präsenz oxidativer Enzymaktivitäten und des substanziellen Ligninabbaus kann auf eine fundamentale Bedeutung von Laccasen und Peroxidasen für die Zersetzung des Totholzes geschlossen werden. Nicht zuletzt die charakteristische Molekularmassenverteilung der wasserlöslichen Ligninfragmente deutete darauf hin, dass die Mn-oxidierenden Peroxidasen (MnPs) die dominierenden oxidativen Enzyme des Ligninabbaus sind. Das hoch variable Muster der oxidativen Enzymaktivitäten ist jedoch das Resultat eines komplexen Zusammenspiels der Holzeigenschaften und der pilzlichen Artengemeinschaft. Die dabei bestehenden funktionellen Abhängigkeiten müssen weiter im Detail in zukünftigen Studien analysiert und aufgeklärt werden.:Zusammenfassung I Abstract III Inhaltsverzeichnis V Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung 1 1.1 Totholz als Bestandteil von Waldökosystemen 1 1.1.1 Vorkommen von Totholz 1 1.1.2 Klassifizierung von Totholz 1 1.1.3 Entstehung von Totholz 2 1.1.4 Totholz und Biodiversität 3 1.1.5 Totholz in Stoffkreisläufen 8 1.1.6 Totholz als wichtiges Strukturelement 9 1.2 Holzaufbau 10 1.2.1 Grundsätzlicher Aufbau von Holz 10 1.2.2 Der Lignozellulose-Komplex 14 1.3 Saprobionte Pilze als Spezialisten zur Überwindung der Ligninbarriere 18 1.3.1 Weißfäulepilze 18 1.3.2 Braunfäulepilze 20 1.3.3 Moderfäulepilze 22 1.4 Enzymatischer Ligninabbau 23 1.4.1 Laccase 23 1.4.2 Peroxidasen 26 1.5 Totholz - Stand der Forschung 33 1.5.1 Totholzabbau in Europa 33 1.5.2 Totholz und Waldbewirtschaftung 34 1.5.3 Abbauprozesse 34 1.5.4 Oxidative Enzyme im Totholz 36 2 Zielstellung der Arbeit 39 3 Methoden 43 3.1 Untersuchung von natürlichem Totholz auf den VIP-Flächen 43 3.1.1 Untersuchungsgebiet 43 3.1.2 Probenahme 47 3.1.3 Aufbereitung der Proben für die enzymatischen Messungen 49 3.1.4 Aktivitäten oxidativer Enzyme 50 3.1.5 Physikochemische Variablen der Totholzproben 52 3.1.6 Artenzusammensetzung der Pilze auf und im Totholz 54 3.1.7 Statistik 56 3.2 Erfassung der kleinräumigen Verteilung von Oxidoreduktasen in einem Totholzfragment 63 3.2.1 Probenahme 63 3.2.2 Untersuchung der Proben 65 3.2.3 Statistische Auswertung 66 3.3 Stickstoffexperiment 66 3.3.1 Experimentaufbau 66 3.3.2 Probenahme 68 3.3.3 Aufbereitung der Proben für die enzymatischen Messungen 69 3.3.4 Enzymatische Untersuchungen 69 3.3.5 Untersuchung mit markiertem Stickstoff 74 3.3.6 Statistische Analyse 74 3.4 Optimierung der organischen Extraktion in Vorbereitung der Ligninbestimmung 75 3.4.1 Methodisches Vorgehen 76 3.4.2 Ergebnisse zur Methodenentwicklung 78 3.4.3 Bewertung der Methodenentwicklung 80 4 Ergebnisse 83 4.1 Natürliches Totholz auf den VIP-Flächen 83 4.1.1 Totholzvariablen und Ihre Unterschiede zwischen den Baumarten 83 4.1.2 Einfluss der Waldbewirtschaftung auf die Variablen des Totholzabbaus 91 4.1.3 Veränderungen des Totholzes während der Zersetzung 92 4.1.4 Abhängigkeit der oxidativen Enzymaktivitäten von den physikochemischen Eigenschaften und den Pilzarten (OTUs) 99 4.1.5 Kleinräumige Verteilungsmuster der oxidativen Enzymaktivitäten in den Totholzstämmen 105 4.2 Kleinräumige Muster der oxidativen Enzymaktivitäten in einem einzelnen Totholzfragment 106 4.3 Stickstoffexperiment 111 5 Diskussion 115 5.1 Unterschiede im Zersetzungsprozess zwischen den Baumarten 115 5.2 Oxidative Enzymaktivitäten im Totholz 119 5.2.1 Bedeutung von Lacc, GenP und MnP für die Ligninmodifikation 119 5.2.2 Variabilität der Lacc-, GenP- und MnP-Aktivitäten 121 5.2.3 Kleinräumige Muster der Lacc-, GenP und MnP-Aktivitäten 122 5.2.4 Dynamik der oxidativen Enzymaktivitäten im Verlauf des Zersetzungsprozesses 123 5.2.5 Zusammenhänge zwischen den oxidativen Enzymaktivitäten und den Totholzvariablen 125 5.3 Veränderung des Totholzes über den Zersetzungsprozess 135 5.3.1 Die Artengemeinschaft 136 5.3.2 Die Holzbestandteile und der pH-Wert 138 5.3.3 Die Nährstoffe 139 5.4 Einfluss der Waldbewirtschaftung auf Variablen des Totholzabbaus 141 6 Ausblick 145 7 Thesen 151 8 Literaturverzeichnis 153 Anhang 169 A Charakteristik der Untersuchungsflächen 169 B NMDS-Ordination der pilzlichen Artengemeinschaft 172 C Daten der Totholzstämme 175 D Daten zu den Proben 177 E Daten zur Modellierung der Enzymaktivitäten und der Wahrscheinlichkeit, diese zu detektieren 178 F Daten zur Untersuchung des einzelnen F.-sylvatica-Totholzfragments 189 G Detailabbildungen zur Zersetzungsdynamik 192 H Semivariogrammdaten oxidativer Enzyme im Totholz der VIP-Flächen 195 I Km-Werte von Mangan-Peroxidasen (MnP) für Mangan(II)-Ionen (Mn2+) aus der Literatur 196 J Zuordnung der Fäuletypen zu den Pilzarten 198 K Publikationen 208 L Danksagung 251 M Rechtliche Erklärung 253 / In forest ecosystems, deadwood is an important component that provides habitat and substrate for numerous organisms, contributes to the carbon and nutrient cycle as well as serves as a structural element. Overcoming the lignin barrier is a key process in deadwood degradation. Only specialized saprotrophic fungi of the phyla Basidiomycota and Ascomycota developed different strategies – the rot types – to degrade lignin or to modify it in way, which allows them to get access to the polysaccharides (cellulose and hemicelluloses) that are incrusted within the lignocellulosic complex. In this context, basidiomycetous white rot fungi secreting oxidative enzymes (especially laccases and peroxidases) are of particular importance, since they are the only organisms that are able to substantially mineralize lignin to carbon dioxide (CO2). Although lignin degradation is such an important process for deadwood degradation, oxidative enzyme activities have been only poorly studied under natural conditions in deadwood. The aim of this work was to verify the importance of oxidative enzymes for deadwood degradation in the field, to describe their temporal and spatial patterns of occurrence and to identify dependencies from deadwood variables as well as from the fungal community within and on deadwood. Furthermore, the changes of different deadwood variables were studied over the whole period of degradation and compared among three tree species. Last but not least, the influence of forest management intensity on the process of deadwood degradation was evaluated. Therefor, 197 logs of naturally occurring deadwood (coarse woody debris, CWD) of Fagus sylvatica (European beech), Picea abies (Norway spruce) and Pinus sylvestris (Scots pine) were monitored and sampled in forests with different management regimes across three regions in Germany. A total of 735 samples were taken from the logs and analyzed regarding activities of laccase (Lacc), general peroxidase (GenP) and manganese peroxidase (MnP). Wood density, water content, content of lignin and extractives as well as of nutrients and metals (N, Al, Ca, Cu, K, Mg, Mn und Zn) were determined in the samples, too. The fungal community was assessed based on sporocarps (fruiting bodies) and molecular fingerprints (F-ARISA). Oxidative enzyme activities were present in 79 % of all samples. The activities were found to be highly variable both regarding the time course of degradation and their distribution within the logs. Activities were generally higher in wood samples of F. sylvatica than in samples of conifers. Linear and logistic models revealed that the fungal community structure was the most important determinant for oxidative enzyme activities in the samples, followed by the amount of water-soluble lignin fragments. Moreover, the prevalent acidic pH determined in deadwood was suitable to facilitate the function of laccase and peroxidases. Concentrations of metals (manganese, copper, iron) were sufficient to ensure synthesis and functioning of the enzymes. Deadwood-dwelling fungi turned out to be well adapted to low nitrogen concentrations and thus, an elevated nitrogen deposition over a period of two years did not affect the oxidative enzyme activities. The pH as well as the content of lignin, extractives and nutrients significantly differed among the tree species; however, their trend over the course of degradation was rather similar. Molecular species richness (determined by F-ARISA as OTUs) increased over the whole course of degradation, while the number of fruiting species was highest in the intermediate stage of degradation. Both types of species richness increased with increasing volume of the CWD logs. Over the entire degradation period, white rot fungi – based on the identification of sporocarps – were the most abundant group of wood rot fungi in and on all three tree species. This corresponds well with the overall presence of oxidative enzyme activities. During degradation, the mass-related content of lignin, extractives and nutrients frequently increased, although the volume-related content decreased. The pH  of all three tree species decreased in deadwood over the whole period of degradation. Higher forest management intensity had a negative effect on the log volume of deadwood and in consequence on fungal species richness (fruiting bodies), but hardly to other analyzed variables. Based on the widespread occurrence of white rot fungi, the concomitant presence of oxidative enzyme activities as well as the substantial loss of lignin, it can be concluded that laccases and peroxidases are highly relevant for deadwood decomposition. Not least, the detected characteristic molecular size distribution of water-soluble lignin fragments points to a key role of Mn oxidizing peroxidases (MnPs) in enzymatic lignin degradation. The variable patterns of oxidative enzymes observed in wood samples is therefore the result of a complex array of wood variables and the fungal community structure, which will have to be resolved in more detail in future studies.:Zusammenfassung I Abstract III Inhaltsverzeichnis V Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung 1 1.1 Totholz als Bestandteil von Waldökosystemen 1 1.1.1 Vorkommen von Totholz 1 1.1.2 Klassifizierung von Totholz 1 1.1.3 Entstehung von Totholz 2 1.1.4 Totholz und Biodiversität 3 1.1.5 Totholz in Stoffkreisläufen 8 1.1.6 Totholz als wichtiges Strukturelement 9 1.2 Holzaufbau 10 1.2.1 Grundsätzlicher Aufbau von Holz 10 1.2.2 Der Lignozellulose-Komplex 14 1.3 Saprobionte Pilze als Spezialisten zur Überwindung der Ligninbarriere 18 1.3.1 Weißfäulepilze 18 1.3.2 Braunfäulepilze 20 1.3.3 Moderfäulepilze 22 1.4 Enzymatischer Ligninabbau 23 1.4.1 Laccase 23 1.4.2 Peroxidasen 26 1.5 Totholz - Stand der Forschung 33 1.5.1 Totholzabbau in Europa 33 1.5.2 Totholz und Waldbewirtschaftung 34 1.5.3 Abbauprozesse 34 1.5.4 Oxidative Enzyme im Totholz 36 2 Zielstellung der Arbeit 39 3 Methoden 43 3.1 Untersuchung von natürlichem Totholz auf den VIP-Flächen 43 3.1.1 Untersuchungsgebiet 43 3.1.2 Probenahme 47 3.1.3 Aufbereitung der Proben für die enzymatischen Messungen 49 3.1.4 Aktivitäten oxidativer Enzyme 50 3.1.5 Physikochemische Variablen der Totholzproben 52 3.1.6 Artenzusammensetzung der Pilze auf und im Totholz 54 3.1.7 Statistik 56 3.2 Erfassung der kleinräumigen Verteilung von Oxidoreduktasen in einem Totholzfragment 63 3.2.1 Probenahme 63 3.2.2 Untersuchung der Proben 65 3.2.3 Statistische Auswertung 66 3.3 Stickstoffexperiment 66 3.3.1 Experimentaufbau 66 3.3.2 Probenahme 68 3.3.3 Aufbereitung der Proben für die enzymatischen Messungen 69 3.3.4 Enzymatische Untersuchungen 69 3.3.5 Untersuchung mit markiertem Stickstoff 74 3.3.6 Statistische Analyse 74 3.4 Optimierung der organischen Extraktion in Vorbereitung der Ligninbestimmung 75 3.4.1 Methodisches Vorgehen 76 3.4.2 Ergebnisse zur Methodenentwicklung 78 3.4.3 Bewertung der Methodenentwicklung 80 4 Ergebnisse 83 4.1 Natürliches Totholz auf den VIP-Flächen 83 4.1.1 Totholzvariablen und Ihre Unterschiede zwischen den Baumarten 83 4.1.2 Einfluss der Waldbewirtschaftung auf die Variablen des Totholzabbaus 91 4.1.3 Veränderungen des Totholzes während der Zersetzung 92 4.1.4 Abhängigkeit der oxidativen Enzymaktivitäten von den physikochemischen Eigenschaften und den Pilzarten (OTUs) 99 4.1.5 Kleinräumige Verteilungsmuster der oxidativen Enzymaktivitäten in den Totholzstämmen 105 4.2 Kleinräumige Muster der oxidativen Enzymaktivitäten in einem einzelnen Totholzfragment 106 4.3 Stickstoffexperiment 111 5 Diskussion 115 5.1 Unterschiede im Zersetzungsprozess zwischen den Baumarten 115 5.2 Oxidative Enzymaktivitäten im Totholz 119 5.2.1 Bedeutung von Lacc, GenP und MnP für die Ligninmodifikation 119 5.2.2 Variabilität der Lacc-, GenP- und MnP-Aktivitäten 121 5.2.3 Kleinräumige Muster der Lacc-, GenP und MnP-Aktivitäten 122 5.2.4 Dynamik der oxidativen Enzymaktivitäten im Verlauf des Zersetzungsprozesses 123 5.2.5 Zusammenhänge zwischen den oxidativen Enzymaktivitäten und den Totholzvariablen 125 5.3 Veränderung des Totholzes über den Zersetzungsprozess 135 5.3.1 Die Artengemeinschaft 136 5.3.2 Die Holzbestandteile und der pH-Wert 138 5.3.3 Die Nährstoffe 139 5.4 Einfluss der Waldbewirtschaftung auf Variablen des Totholzabbaus 141 6 Ausblick 145 7 Thesen 151 8 Literaturverzeichnis 153 Anhang 169 A Charakteristik der Untersuchungsflächen 169 B NMDS-Ordination der pilzlichen Artengemeinschaft 172 C Daten der Totholzstämme 175 D Daten zu den Proben 177 E Daten zur Modellierung der Enzymaktivitäten und der Wahrscheinlichkeit, diese zu detektieren 178 F Daten zur Untersuchung des einzelnen F.-sylvatica-Totholzfragments 189 G Detailabbildungen zur Zersetzungsdynamik 192 H Semivariogrammdaten oxidativer Enzyme im Totholz der VIP-Flächen 195 I Km-Werte von Mangan-Peroxidasen (MnP) für Mangan(II)-Ionen (Mn2+) aus der Literatur 196 J Zuordnung der Fäuletypen zu den Pilzarten 198 K Publikationen 208 L Danksagung 251 M Rechtliche Erklärung 253

In my thesis, I focused on monitoring of microorganisms in the sample of red grape juice and on the interactions between yeasts, bacteria and filamentous fungi. Three different media were applied for the cultivation of microorganisms; firstly for monitoring of total volume of microorganisms, secondly for yeasts and third time for lactic acid bacteria. The indirect method was used for the determination of the amount of viable cells. This method consists in enumerating of visible macroscopic colonies grown up on agar plates. When the cells grew up, the forms of colonies were analyzed visually and the morphology of microorganisms was detected microscopically. The operating time of enzymes in grape juice in the production of red wine was monitored after application of commercial enzymatic preparation. The enzym action in grape juice was observed on the basis of the process of degradation of high – molecular substrate by enzymes through the use of Ubbelohd´s viscometer. The research findings provided a lot of knowledge about the occurance of microflora in the process of production of red wine. The commercial preparations added to grape juice played a significant role.