A sinvastatina é um agente antilipêmico, da classe das estatinas, utilizado no tratamento de primeira escolha em pacientes com hipercolesterolemia primária. A apresentação referência da sinvastatina no Brasil é o medicamento Zocor® (Merck Sharp & Dohme Farmacêutica Ltda.). Os medicamentos genéricos e similares podem ser considerados “cópias” do medicamento de referência e para o registro de ambos medicamentos, há obrigatoriedade de apresentação dos estudos de biodisponibilidade relativa e equivalência farmacêutica. Por isso este trabalho teve por objetivo o desenvolvimento e validação de um método bioanalítico para aplicação em estudos de biodisponibilidade relativa do fármaco sinvastatina em voluntários sadios. Aplicou-se a técnica de extração líquido-líquido para purificação das amostras e para quantificação foi utilizada a cromatografia líquida de ultra performance acoplada a espectrometria de massas (UPLC-MS/MS). O método desenvolvido e validado apresentou uma faixa linear de 0,4 - 40,0 ng/mL, com seletividade, recuperação, precisão, exatidão e estabilidades adequadas segundo a RE 899/2003 da ANVISA e o Guia de Validação de Métodos Bioanalíticos do FDA. Após a validação o método foi aplicado para estudo de biodisponibilidade relativa de sinvastatina. Os resultados dos parâmetros farmacocinéticos foram obtidos através das curvas de concentração plasmática do fármaco em função do tempo, e analisados estatisticamente para determinação da bioequivalência. Os seguintes parâmetros farmacocinéticos foram determinados: ASC, Cmax e tmax. O método desenvolvido apresentou preparo de amostras simples, baixo limite de quantificação e tempo de corrida curto, adequados a estudos com grande volume de amostras e baixos níveis plasmáticos. Portanto, o método desenvolvido e validado, bem como o estudo de bioequivalência foram adequados para avaliação das formulações de sinvastatina comprimido de 40 mg (teste e referência). O produto teste analisado não foi considerado bioequivalente ao produto referência. / Simvastatin (member of the statin class) is an antilipemic agent used in the primary treatment of primary hypercholesterolemia. The simvastatin reference drug in Brazil is Zocor® (Merck Sharp & Dohme Pharmaceutical Ltda.). The generic and similars drugs can be considered as “copies” of the reference drug. Relative bioavailability studies and pharmaceutical equivalence studies are needed before submitting the registration petition of these drugs. Thus, the aim of this work was the development and validation of a bioanalytical method for application in relative bioavailability studies in healthy volunteers. Liquid-liquid extraction was employed as a purification technique and the ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) as a quantitative technique. The method was developed and validated and presented a linear range of 0.4 – 40.0 ng/mL, and fulfilled all preset criteria for selectivity, recovery, precision, accuracy and stabilities according to ANVISA`s RE 899/2003 and FDA`s Bioanalylical Method Validation Guidance. After the validation, the method was applied to the relative bioavailability study of simvastatin. The pharmacokinetics parameters results was obtained through the blood concentration-time curves, and statistically analyzed for the determination of bioequivalence. The following pharmacokinetic parameters were obtained: AUC, Cmax, tmax. The developed method showed simple sample preparation, low lower limit of quantification and short running time, which was suitable for applying. Therefore, the proposed bioanalytical method and the bioequivalence study showed adequate for evaluating the simvastatin 40 mg tablet formulations (reference and test). The test drug analyzed was not considered bioequivalent to the reference drug. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O presente estudo objetivou desenvolver um método para determinação simultânea de fármacos antineoplásicos por cromatografia líquida de ultra performance acoplada ao espectrômetro de massas em tandem (UHPLC-MS/MS), para ser aplicado no monitoramento de superfícies de trabalho, em locais de manipulação dessas substâncias químicas. Os compostos alvos foram a ciclofosfamida (CP), a doxorrubicina (DOXO), o docetaxel (DOC) e a 5-fluoruracila (5-FU), escolhidos em função do seu uso e/ou considerados indicadores de exposição aos antineoplásicos. O metotrexato (MTX) também foi avaliado, todavia não foram obtidos resultados satisfatórios para esse composto, nas condições otimizadas para os outros analitos. As análises foram realizadas no modo de ionização positivo, exceto para a 5-FU, e monitoramento de reação múltipla (MRM). A separação cromatográfica foi realizada em 15 minutos, utilizando coluna Shim-pack® XR-ODS C18 (100 x 3,0 mm, 2,2 μm) e uma pré-coluna similar, gradiente de eluição, para a fase móvel, ácido fórmico 0,1% em água e acetonitrila, em uma vazão de 0,3 mL min-¹. As transições de massa, utilizadas para quantificação, seletivamente monitoradas para cada composto, foram: 261,0 > 140,0 m/z para CP; 830,3 > 304,0 m/z para DOC; 544,1 > 396,9 m/z para DOXO e 129,1 > 42,1 m/z para o 5-FU. O método analítico validado foi linear, apresentando r² ≥ 0,9939, no intervalo avaliado de 5 a 300 μg L-¹, para CP e de 10 a 300 μg L-¹, para DOC, DOXO e 5-FU; preciso, com valores de desvios-padrão relativos menores que 15%, para todas as concentrações e todos os analitos estudados. Os limites de detecção e de quantificação foram determinados entre 0,5-1,3 ng mL-¹ e 1,7-4,3 ng mL-¹, respectivamente. Após análise de 54 superfícies, adicionadas com os analitos, em uma quantidade de 150, 250 e 500 ng, as recuperações médias obtidas foram entre 59,9-104,8%, com erros-padrão relativos de até ±6%. Os resultados obtidos, no presente estudo, sugerem que o método desenvolvido é adequado para identificar, simultaneamente, quatro, dos cinco, antineoplásicos estudados, constituindo uma promissora e importante ferramenta analítica para o monitoramento da exposição ocupacional a tais fármacos. / The present study aimed to develop a method for simultaneous determination of antineoplastic drugs by ultra performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometer (UHPLC-MS/MS), to be applied in monitoring work surfaces, in handling locations of these chemicals. The targed compounds were the cyclophosphamide (CP), the docetaxel (DOC), the doxorrubicin (DOXO) and the 5-fluorouracil (5-FU), chosen according to their use and/or considered exposure indicators to antineoplastics. The methotrexate (MTX) was also evaluated, but satisfactory results were not obtained for this compound, under optimized conditions for other analytes. The analyses were carried out in the positive ionization mode, except for the 5-FU, and multiple reaction monitoring (MRM). The chromatographic separation was performed in 15 minutes using Shim-pack® XR-ODS C18 column (100 x 3,0 mm, 2,2 ƒÊm) and a similar pre-column, gradient elution, to the mobile phase, formic acid 0,1% and acetonitrile, at a flow rate of 0,3 mL min-¹. The mass transitions used to quantify selectively monitored for each compound, were: m/z 261,0 > 140,0 for CP; m/z 830,3 > 304,0 for DOC; m/z 544,1 > 396,9 for DOXO and m/z 129,1 > 42,1 for 5-FU. The validated analytical method was linear, with r² . 0,9939, in the assessed range of 5 to 300 ng mL-¹, for CP and of 10 to 300 ng mL-¹, for DOC, DOXO and 5-FU; accurate, with relative standard deviations lower than 15%, for all concentrations and all studied analytes. The limits of detection and quantification were determined from 0,5-1,3 ng mL-1 and 1,7-4,3 ng mL-¹, respectively. After analysis of 54 surfaces, spiked with the analytes, in a quantity of 150, 250 and 500 ng, the obtained mean recoveries were between 59,9-104,8%, with relative standard errors of up to ±6%. The obtained results, in this study, suggest that the developed method is suitable to identify, simultaneously, four, of the five, studied antineoplastics, becoming a promising and important analytical tool for the occupational exposure monitoring to these drugs. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:08:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 andre_veloso_ioc_dout_2015.pdf: 5077168 bytes, checksum: 9fce6d548bd0ac2fa5e83f9b028c4bf2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os dípteros Aedes aegypti, Anopheles albitarsis e Culex quinquefasciatus pertencem à família Culicidae e são considerados um problema de saúde pública quando atuam como vetores de parasitos e/ou arboviroses. O regime de alimentação de fêmeas dos mosquitos anautógenos influencia os processos que ocorrem no intestino e regula os genes envolvidos na reprodução. Além disso, apesar dos ciclos de vida dos parasitos veiculados por essas espécies de vetores serem distintos, todos eles são ingeridos durante a hematofagia e expostos ao ambiente do intestino médio (estômago) para em seguida atravessar o epitélio intestinal e chegarem ao tecido apropriado para seu desenvolvimento e/ou transmissão para um novo hospedeiro vertebrado. Neste trabalho, utilizamos uma abordagem proteômica para a identificação de proteínas totais, bem como ensaios em solução e enzimografia em gel copolimerizado com substrato para identificação de peptidases ativas presentes no intestino de fêmeas de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis s.s sob regime de alimentação com açúcar. As técnicas de enzimografia também foram utilizadas aqui para a caracterização de peptidases ativas de intestinos de fêmeas de Ae. aegypti alimentadas com açúcar ou sangue. Foi observado que o intestino de fêmeas das três espécies alimentadas com açúcar apresenta um complexo perfil de peptidases ativas, do tipo tripsina, composto por bandas migrando nas regiões entre ~ 24 a 40 kDa e em regiões de alto peso molecular Atividades proteolíticas foram detectadas entre pH 3,5 \2013 10, revelando diferenças quantitativas e qualitativas entre os perfis proteolíticos das três espécies. Em fêmeas de Ae. aegypti, o regime de alimentação com açúcar ou sangue alterou o perfil de SPtrip ativas do intestino de forma qualitativa e quantitativa. Um total de oito tripsinas em Cx. quinquefasciatus e dez tripsinas em An. albitarsis, foram identificadas por SDS-PAGE acoplado a LC-MS/MS. Apesar dessas SPtrip identificadas apresentarem características comuns às tripsinas digestivas de invertebrados, foram observadas diferenças nas sequências de aminoácidos, como por exemplo, em regiões de especificidade ao substrato e de ativação do zimogênio. Foi observado que os genes codificadores para SPtrip possuem diferentes tamanhos e organização, tais como, diferenças no número de éxons/introns. Com relação à composição de proteínas totais solúveis do intestino de fêmeas de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis, análise por LC-MS/MS e bioinformática revelou a presença de proteínas envolvidas em processos fisiológicos importantes, como exopeptidaes, glicosidades, enzimas detoxificantes e proteínas relacionadas com a interação parasito/vetor Em Cx. quinquefasciatus, foram identificadas 1397 proteínas, distribuídas em 1090 grupos, representando um total de ~ 7,5% das proteínas codificadas pelo genoma dessa espécie. Em An. albitarsis foram identificadas 916 proteínas distribuídas em 748 grupos. As centenas de proteínas presentes no intestino de fêmeas alimentadas com açúcar, de ambas as espécies, foram classificadas segundo sua ontologia gênica e o papel de algumas famílias de proteínas historicamente importante em mosquitos foram discutidas. Finalmente, foi demonstrado que abordagem proteômica combinada à enzimografia e bioinformática é uma ferramenta que pode auxiliar na anotação funcional dos genes de tripsinas expressos no intestino de fêmeas alimentadas com açúcar, bem como auxilia no mapeamento do repertório de proteínas totais presentes no intestino de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis / Culex quinquefasciatus, Anopheles albitarsis and Aedes aegypti are hematophagous insect from the Culicidae family that feeds on the blood of humans, dogs, birds and livestock. These species transmit a wide variety of pathogens between humans and animals. The midgut environment is the first location of pathogen-vector interaction for blood-feeding mosquitoes and the expression of specific peptidases in the early stages of feeding could influence the outcome of the infection. Trypsin-like serine peptidases belong to a multi-gene family that can be expressed in different isoforms under distinct physiological conditions. However, the confident assignment of the trypsin genes that are expressed under each condition is still a challenge due to the large number of trypsin-coding genes in the Culicidae family and most likely because they are low abundance proteins. We used zymography for the biochemical characterization of the peptidase profile of the midgut from Cx. quinquefasciatus, An. albitarsis, and Ae. aegypti females fed on sugar. We also caracterized the peptidses profile of the midgut from Ae. aegypti fed on blood, during different moments after fedding. Protein samples were also submitted to SDS-PAGE followed by liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) analysis for peptidase identification. The peptidases sequences were analyzed by bioinformatics tools to assess their distinct features. Zymography revealed that trypsin-like serine peptidases were responsible for the proteolytic activity in the midgut of females fed on sugar or blood diet. In addition, we observed that the profile is influenced by the blood ingestion. After fractionation in SDS-PAGE, eight and ten trypsin-like serine peptidases were identified by LC-MS/MS in Cx. quinquefasciatus and An. albitarsis, respectively. Peptidases from Cx. quinquefasciatus were also analysed with bioinformatic tools revealing that they have structural features typical of invertebrate digestive trypsin peptidases but exhibited singularities at the protein sequence level such as: the presence of different amino acids at the autocatalytic motif and substrate binding regions as well as different number of disulfide bounds. Data mining revealed a group of trypsin-like serine peptidases that are specific to C. quinquefasciatus when compared to the culicids genomes sequenced so far. We demonstrated that proteomics approaches combined with bioinformatics tools and zymographic analysis can lead to the functional annotation of trypsin-like serine peptidases coding genes and aid in the understanding of the complexity of peptidase expression in mosquitoes. / 2016-10-11

Recentemente, foi descrito um grupo de alterações no metabolismo da creatina denominado Síndromes de Deficiência de Creatina. Há três formas da doença geneticamente determinadas que cursam com deficiência de creatina, seja por comprometimento de sua síntese ou por defeito na proteína transportadora. O espectro de apresentação clínica dessa condição é inespecífico e inclui atraso ou estagnação do desenvolvimento neuromotor, hipotonia muscular, movimentos involuntários do tipo coreoatetose, retardo ou ausência do desenvolvimento da fala, retardo mental de grau variável, comportamento autista e epilepsia. Neste trabalho, foi desenvolvida e validada uma alternativa metodológica àquelas disponíveis na literatura, com a utilização de extração por troca catiônica forte e separação e detecção por cromatografia líquida de interação hidrofílica acoplada a espectrometria de massas em tandem em que foram exploradas as características químicas das moléculas de creatina e guanidinoacetato, metabólito intermediário da síntese de creatina. Os valores de referência para o método foram definidos pela sua aplicação a 150 amostras de urina e 197 amostras de soro de indivíduos de ambos os sexos e idades entre 0 e 16 anos. Foram também analisadas amostras de urina, soro e plasma de 54 pacientes com clínica compatível com a síndrome de deficiência de creatina sendo que 3 deles apresentaram perfil bioquímico característico de uma das formas dessa condição / Recently, a new group of inborn errors of metabolism, collectively named as creatine deficiency syndrome, was identified. Three genetically determined presentations are currently known, affecting both creatine synthesis and transport. Clinical presentation spectrum is non-specific and includes developmental delay, hypotonia, involuntary movements as choreoathetosis, delay or lack of speech acquisition, mental retardation of variable severity, autistic behavior, and epilepsy. Herein, we developed and validated an innovative method for determination of creatine and of its metabolic intermediate, guanidinoacetate, based on cation-exchange solid-phase extraction and hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Reference values for the method were defined testing 150 urine and 197 serum samples in males and females with age ranging from 0 to 16 years. Urine and serum samples from 54 patients with some clinical features that might be attributable to creatine deficiency were also evaluated, and in three, biochemical profile characteristic of one of the disorders was detected

Recentemente, foi descrito um grupo de alterações no metabolismo da creatina denominado Síndromes de Deficiência de Creatina. Há três formas da doença geneticamente determinadas que cursam com deficiência de creatina, seja por comprometimento de sua síntese ou por defeito na proteína transportadora. O espectro de apresentação clínica dessa condição é inespecífico e inclui atraso ou estagnação do desenvolvimento neuromotor, hipotonia muscular, movimentos involuntários do tipo coreoatetose, retardo ou ausência do desenvolvimento da fala, retardo mental de grau variável, comportamento autista e epilepsia. Neste trabalho, foi desenvolvida e validada uma alternativa metodológica àquelas disponíveis na literatura, com a utilização de extração por troca catiônica forte e separação e detecção por cromatografia líquida de interação hidrofílica acoplada a espectrometria de massas em tandem em que foram exploradas as características químicas das moléculas de creatina e guanidinoacetato, metabólito intermediário da síntese de creatina. Os valores de referência para o método foram definidos pela sua aplicação a 150 amostras de urina e 197 amostras de soro de indivíduos de ambos os sexos e idades entre 0 e 16 anos. Foram também analisadas amostras de urina, soro e plasma de 54 pacientes com clínica compatível com a síndrome de deficiência de creatina sendo que 3 deles apresentaram perfil bioquímico característico de uma das formas dessa condição / Recently, a new group of inborn errors of metabolism, collectively named as creatine deficiency syndrome, was identified. Three genetically determined presentations are currently known, affecting both creatine synthesis and transport. Clinical presentation spectrum is non-specific and includes developmental delay, hypotonia, involuntary movements as choreoathetosis, delay or lack of speech acquisition, mental retardation of variable severity, autistic behavior, and epilepsy. Herein, we developed and validated an innovative method for determination of creatine and of its metabolic intermediate, guanidinoacetate, based on cation-exchange solid-phase extraction and hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Reference values for the method were defined testing 150 urine and 197 serum samples in males and females with age ranging from 0 to 16 years. Urine and serum samples from 54 patients with some clinical features that might be attributable to creatine deficiency were also evaluated, and in three, biochemical profile characteristic of one of the disorders was detected

A venlafaxina (VEN), em razão de sua eficácia e brandos efeitos adversos, tem sido um dos antidepressivos mais prescritos no tratamento da depressão e ansiedade. Neste trabalho, um método analítico empregando as técnicas MISPE miniaturizada e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em Tandem, foi utilizado para a determinação de VEN e seus principais metabólitos em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. A fase MIP foi sintetizada via polimerização radicalar por precipitação, fazendo uso de VEN (molécula molde), ácido metacrílico (monômero funcional), etileno glicol dimetacrilato, (reagente reticulante) e 2,2 azobisisobutironitrila (iniciador radicalar) em tolueno (solvente). Para controle utilizou-se o polímero não impresso (NIP), sintetizado por procedimento análogo ao do MIP, porém sem o uso da molécula molde. A caracterização química e estrutural dos polímeros foi realizada por espectroscopia no infravermelho com transformada de fourier e microscopia eletrônica de varredura. A otimização das variáveis de MISPE miniaturizada favoreceu a detectabilidade analítica e diminuiu o efeito de memória. As extrações realizadas com MIP apresentaram taxa de recuperação de 84% para VEN e de 2-28% para os antidepressivos (clorpromazina, fluoxetina, clomipramina, imipramina e sertralina). O polímero não impresso apresentou baixa recuperação para a VEN (taxa de recuperação: 49%) e para os demais antidepressivos (taxas de recuperação menores que 40%). Estes experimentos comprovam a seletividade da fase MIP desenvolvida. O método padronizado apresentou linearidade na faixa de 3 a 700 ng mL-1 para VEN, 5 a 700 ng mL-1 para O-desmetilvenlafaxina (ODV) e de 3 a 500 ng mL-1 para N-desmetilvenlafaxina (NDV), precisão com coeficientes de variação menores que 15% e exatidão com valores de erro padrão relativo na faixa de -11,8 a 16,01 %. As concentrações correspondentes aos limites inferiores de quantificação para VEN (3 ng mL-1) e ODV ( 5 ng mL-1) foram inferiores aos intervalos terapêuticos preconizados. O método desenvolvido, quando comparado a aos métodos da literatura para determinação de VEN e metabolitos, apresentou maior seletividade, menor consumo de amostra e de solventes orgânicos e permitiu a reutilização da fase extratora. Segundo os parâmetros de validação analítica avaliados e amostras de pacientes em terapia com VEN analisadas, o método proposto é adequado para determinação de VEN, ODV e NDV em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. / Venlafaxine elicits a small number of adverse effects, so it is one of the most frequently prescribed drugs to treat major depression, generalized anxiety, and social anxiety disorders in adults. In this study, venlafaxine (VEN), O-desmethylvenlafaxine (ODV), and N-desmethylvenlafaxine (NDV) were pre-concentrated with the aid of miniaturized SPE based on MIPs as extraction phase. MIPs are synthetic polymers with cavities specifically designed to hold a target molecule or structurally similar compounds. The molecularly imprinted polymers were prepared by addition of VEN, metacrylic acid (MAA, monomer), ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA, cross-linker), and 2,2-azobisisobutyronitrile (AIBN, initiator) to toluene (solvent). The non-imprinted polymer (NIP), used for comparison, was also synthesized by following exactly the same procedure, but excluding the template VEN from the formulation. The polymer was characterized by Fourier transform infrared spectroscopy and scanning electron microscopy (SEM). Optimization of the MIP phase extraction variables favored miniaturized analytical detectability and reduced the memory effect. The extractions performed with the synthesized MIP showed recovery rate of 84% for VEN and 2-28% for other antidepressants (chlorpromazine, fluoxetine, clomipramine, imipramine, and sertraline). The non-imprinted polymer provided low recovery of VEN (recovery rate: 49%) and other antidepressants (recovery rates lower than 40%). These experiments demonstrated the selectivity of the developed MIP phase. The standardized method was linear in the range of 300 - 700 ng mL-1 for VEN, 5-700 ng mL-1 for ODV, and 3 to 500 ng mL-1 for NDV. Precision had coefficients of variation smaller than 15%; the accuracy standard error values ranged from -11.8 to 16.01%. Compared with literature methods, the developed method was more selective for determination of VEN and metabolites, required lower consumption of sample and organic solvents, and enabled reuse of the extraction phase. According to the assessed analytical validation parameters and to the analysis of samples obtained from patients undergoing therapy with VEN, the proposed method is suitable to determine VEN, NDV, and ODV in plasma samples for therapeutic drug monitoring.

Pregnenolona (PREG) e 17-alfa-hidroxipregnenolona (17OHPREG) são dois esteroides produzidos pela glândula adrenal e precursores de vários hormônios esteroidais. A dosagem desses compostos tem aplicações clínicas, como o diagnóstico de doenças relacionadas aos corticoesteroides e mineralocorticóides e especialmente na avaliação da atividade da enzima 3-β-hidroxidesidrogenase que é decisiva no diagnóstico de um dos tipos de hiperplasia da glândula adrenal que causa defeitos severos na síntese de esteroides. Métodos cromatográficos associados à espectrometria de massas superaram a especificidade reduzida dos imunoensaios e tem sido crescentemente utilizados na quantificação de esteroides. Os últimos anos tem sido marcados pela hegemonia da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) em grande parte devido à velocidade e possibilidade da análise direta de vários analitos. Porém, no caso específico dos esteroides de tipo 3-hidroxi-5-eno, que apresentam baixa afinidade protônica e, portanto, baixa eficiência de ionização, são necessárias muitas etapas para a conversão em derivados mais detectáveis. Embora desfavorecida em relação ao LC-MS/MS nos últimos anos, a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-MS) apresenta várias características favoráveis para a análise de esteroides como a eficiência cromatográfica ainda insuperável. Adicionalmente, a incorporação da espectrometria de massas em tandem ao CG (CG-MS/MS) torna a técnica tão seletiva quanto LC-MS/MS. No presente trabalho, foi desenvolvido um novo método que permite a extração e derivatização simultâneas da PREG e 17OHPREG de amostras de soro tornando o método de preparo da amostra tão simples quanto os descritos para LC-MS/MS. O método de detecção desenvolvido baseado em ionização química no modo negativo obteve a sensibilidade necessária para o diagnóstico da deficiência da enzima 3-beta-hidroxidesidrogenase utilizando apenas 250 &#181:L de amostra. / Pregnenolone (PREG) and 17α-hydroxypregnenolone (17OHPREG) are two steroid precursors produced by the adrenal gland. The quantification of these compounds is essential for the evaluation of 3-β-hidroxidesidrogenase enzyme activity, which promotes the conversion of PREG in 17OHPREG. The 3-&#946:-hidroxidesidrogenase deficiency is a rare but severe type of adrenal hyperplasia that causes serious defects in steroid synthesis. Chromatographic methods coupled to mass spectrometry overcame immunoassays limitations such as reduced specificity, and have been widely used for steroids quantification. Recent years have been marked by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) hegemony due to the speed and possibility to analyze directly several analytes. However, in the case of type 3-hydroxy-5-ene steroids, which have low affinity for protons and, therefore, low ionization efficiency, many steps are required for conversion to detectable products. Notwithstanding, gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) has some favorable features for steroid analysis such as unbeatable chromatographic efficiency. In addition, the incorporation of tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) makes it as selective as LC-MS/MS. In this study, a new method for simultaneous extraction and derivatization of PREG and 17OHPREG from serum was developed. This procedure makes sample preparation for GC-MS/MS as simples as those described for LC-MS/MS. The detection method based on negative mode chemical ionization achieved the sensitivity required for the diagnosis of 3-β-hidroxidesidrogenase defficiency using only 250 µL of sample.

Pregnenolona (PREG) e 17-alfa-hidroxipregnenolona (17OHPREG) são dois esteroides produzidos pela glândula adrenal e precursores de vários hormônios esteroidais. A dosagem desses compostos tem aplicações clínicas, como o diagnóstico de doenças relacionadas aos corticoesteroides e mineralocorticóides e especialmente na avaliação da atividade da enzima 3-β-hidroxidesidrogenase que é decisiva no diagnóstico de um dos tipos de hiperplasia da glândula adrenal que causa defeitos severos na síntese de esteroides. Métodos cromatográficos associados à espectrometria de massas superaram a especificidade reduzida dos imunoensaios e tem sido crescentemente utilizados na quantificação de esteroides. Os últimos anos tem sido marcados pela hegemonia da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) em grande parte devido à velocidade e possibilidade da análise direta de vários analitos. Porém, no caso específico dos esteroides de tipo 3-hidroxi-5-eno, que apresentam baixa afinidade protônica e, portanto, baixa eficiência de ionização, são necessárias muitas etapas para a conversão em derivados mais detectáveis. Embora desfavorecida em relação ao LC-MS/MS nos últimos anos, a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-MS) apresenta várias características favoráveis para a análise de esteroides como a eficiência cromatográfica ainda insuperável. Adicionalmente, a incorporação da espectrometria de massas em tandem ao CG (CG-MS/MS) torna a técnica tão seletiva quanto LC-MS/MS. No presente trabalho, foi desenvolvido um novo método que permite a extração e derivatização simultâneas da PREG e 17OHPREG de amostras de soro tornando o método de preparo da amostra tão simples quanto os descritos para LC-MS/MS. O método de detecção desenvolvido baseado em ionização química no modo negativo obteve a sensibilidade necessária para o diagnóstico da deficiência da enzima 3-beta-hidroxidesidrogenase utilizando apenas 250 &#181:L de amostra. / Pregnenolone (PREG) and 17α-hydroxypregnenolone (17OHPREG) are two steroid precursors produced by the adrenal gland. The quantification of these compounds is essential for the evaluation of 3-β-hidroxidesidrogenase enzyme activity, which promotes the conversion of PREG in 17OHPREG. The 3-&#946:-hidroxidesidrogenase deficiency is a rare but severe type of adrenal hyperplasia that causes serious defects in steroid synthesis. Chromatographic methods coupled to mass spectrometry overcame immunoassays limitations such as reduced specificity, and have been widely used for steroids quantification. Recent years have been marked by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) hegemony due to the speed and possibility to analyze directly several analytes. However, in the case of type 3-hydroxy-5-ene steroids, which have low affinity for protons and, therefore, low ionization efficiency, many steps are required for conversion to detectable products. Notwithstanding, gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) has some favorable features for steroid analysis such as unbeatable chromatographic efficiency. In addition, the incorporation of tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) makes it as selective as LC-MS/MS. In this study, a new method for simultaneous extraction and derivatization of PREG and 17OHPREG from serum was developed. This procedure makes sample preparation for GC-MS/MS as simples as those described for LC-MS/MS. The detection method based on negative mode chemical ionization achieved the sensitivity required for the diagnosis of 3-β-hidroxidesidrogenase defficiency using only 250 µL of sample.

A venlafaxina (VEN), em razão de sua eficácia e brandos efeitos adversos, tem sido um dos antidepressivos mais prescritos no tratamento da depressão e ansiedade. Neste trabalho, um método analítico empregando as técnicas MISPE miniaturizada e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em Tandem, foi utilizado para a determinação de VEN e seus principais metabólitos em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. A fase MIP foi sintetizada via polimerização radicalar por precipitação, fazendo uso de VEN (molécula molde), ácido metacrílico (monômero funcional), etileno glicol dimetacrilato, (reagente reticulante) e 2,2 azobisisobutironitrila (iniciador radicalar) em tolueno (solvente). Para controle utilizou-se o polímero não impresso (NIP), sintetizado por procedimento análogo ao do MIP, porém sem o uso da molécula molde. A caracterização química e estrutural dos polímeros foi realizada por espectroscopia no infravermelho com transformada de fourier e microscopia eletrônica de varredura. A otimização das variáveis de MISPE miniaturizada favoreceu a detectabilidade analítica e diminuiu o efeito de memória. As extrações realizadas com MIP apresentaram taxa de recuperação de 84% para VEN e de 2-28% para os antidepressivos (clorpromazina, fluoxetina, clomipramina, imipramina e sertralina). O polímero não impresso apresentou baixa recuperação para a VEN (taxa de recuperação: 49%) e para os demais antidepressivos (taxas de recuperação menores que 40%). Estes experimentos comprovam a seletividade da fase MIP desenvolvida. O método padronizado apresentou linearidade na faixa de 3 a 700 ng mL-1 para VEN, 5 a 700 ng mL-1 para O-desmetilvenlafaxina (ODV) e de 3 a 500 ng mL-1 para N-desmetilvenlafaxina (NDV), precisão com coeficientes de variação menores que 15% e exatidão com valores de erro padrão relativo na faixa de -11,8 a 16,01 %. As concentrações correspondentes aos limites inferiores de quantificação para VEN (3 ng mL-1) e ODV ( 5 ng mL-1) foram inferiores aos intervalos terapêuticos preconizados. O método desenvolvido, quando comparado a aos métodos da literatura para determinação de VEN e metabolitos, apresentou maior seletividade, menor consumo de amostra e de solventes orgânicos e permitiu a reutilização da fase extratora. Segundo os parâmetros de validação analítica avaliados e amostras de pacientes em terapia com VEN analisadas, o método proposto é adequado para determinação de VEN, ODV e NDV em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. / Venlafaxine elicits a small number of adverse effects, so it is one of the most frequently prescribed drugs to treat major depression, generalized anxiety, and social anxiety disorders in adults. In this study, venlafaxine (VEN), O-desmethylvenlafaxine (ODV), and N-desmethylvenlafaxine (NDV) were pre-concentrated with the aid of miniaturized SPE based on MIPs as extraction phase. MIPs are synthetic polymers with cavities specifically designed to hold a target molecule or structurally similar compounds. The molecularly imprinted polymers were prepared by addition of VEN, metacrylic acid (MAA, monomer), ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA, cross-linker), and 2,2-azobisisobutyronitrile (AIBN, initiator) to toluene (solvent). The non-imprinted polymer (NIP), used for comparison, was also synthesized by following exactly the same procedure, but excluding the template VEN from the formulation. The polymer was characterized by Fourier transform infrared spectroscopy and scanning electron microscopy (SEM). Optimization of the MIP phase extraction variables favored miniaturized analytical detectability and reduced the memory effect. The extractions performed with the synthesized MIP showed recovery rate of 84% for VEN and 2-28% for other antidepressants (chlorpromazine, fluoxetine, clomipramine, imipramine, and sertraline). The non-imprinted polymer provided low recovery of VEN (recovery rate: 49%) and other antidepressants (recovery rates lower than 40%). These experiments demonstrated the selectivity of the developed MIP phase. The standardized method was linear in the range of 300 - 700 ng mL-1 for VEN, 5-700 ng mL-1 for ODV, and 3 to 500 ng mL-1 for NDV. Precision had coefficients of variation smaller than 15%; the accuracy standard error values ranged from -11.8 to 16.01%. Compared with literature methods, the developed method was more selective for determination of VEN and metabolites, required lower consumption of sample and organic solvents, and enabled reuse of the extraction phase. According to the assessed analytical validation parameters and to the analysis of samples obtained from patients undergoing therapy with VEN, the proposed method is suitable to determine VEN, NDV, and ODV in plasma samples for therapeutic drug monitoring.

As aves marinhas são sensíveis às alterações em todos os níveis tróficos, decorrentes de variações na disponibilidade de presas e contaminação por alguns compostos, capazes de se acumular nos tecidos dos organismos e magnificar-se através da cadeia trófica. As ilhas oceânicas brasileiras abrigam importantes colônias reprodutivas de aves marinhas e, apesar de serem consideradas locais remotos, estão sujeitas à contaminação decorrente de atividades humanas. Este trabalho avaliou a presença de poluentes orgânicos persistentes (POPs) em sangue, uma matriz não-destrutiva, de seis espécies de aves marinhas no Arquipélago de São Pedro e São Paulo e na Ilha da Trindade, que possibilita o monitoramento destes indivíduos ao longo dos anos. Os resultados indicaram que os principais POPs detectados no sangue (em ng g-1 de massa úmida) foram PCBs (0,05 a 55,09), DDTs (0,01 a 17,36) e Mirex (0,01 a 5,53). A migração influenciou nos altos níveis de POPs encontrados em Pterodroma arminjoniana e a massa (g) média dos indivíduos apresentou uma forte correlação negativa com as concentrações dos compostos predominantes no sangue. O sexo das aves não contribuiu significativamente nas concentrações de POPs em espécies monotípicas, exceto para a espécie Sula leucogaster que apresenta dimorfismo sexual acentuado. O comportamento alimentar, avaliado através da análise de isótopos estáveis de carbono e de nitrogênio (δ13C e δ15N), bem como as condições biológicas de cada animal contribuíram para explicar as variações nos perfis de contaminação entre as diferentes espécies. No geral, observou-se que as concentrações de POPS nos dois locais apresentaram valores baixos e similares sugerindo a via atmosférica como principal mecanismo de entrada desses contaminantes para estas regiões. Os resultados inéditos de POPs em sangue das aves marinhas nas duas mais recentes unidades de conservação marinhas criadas no Brasil, podem contribuir como referência para o monitoramento desses compostos em longo-prazo nessas regiões. / Seabirds are sensitive to changes at all trophic levels, due to variations in prey availability and contamination by some compounds, which can be accumulated in the tissues of organisms and to be magnified through the trophic chain. The Brazilian oceanic islands harbor important seabird breeding colonies and, although they are considered remote sites, they are subject to contamination from human activities. This work evaluated the presence of Persistent Organic Pollutants (POPs) in blood, a non-destructive matrix, of six species of seabirds in the São Pedro and São Paulo Archipelago (SPSPA) and Trindade Island (TI), that allows the monitoring of these individuals over the years. The results indicated that the major POPs detected in blood (ng g-1 in wet weight) were PCBs (0.05 to 55.09), DDTs (0.01 to 17.36) and Mirex (0.01 to 5,53). Migration influenced the high levels of POPs found in Pterodroma arminjoniana and the mean mass (g) of the individuals drove a strong negative correlation with the concentrations of the predominant compounds in the blood. The gender of the individuals did not contribute significantly to the concentrations of POPs in monotypic species, except for the species Sula leucogaster that presents marked sexual dimorphism. The feeding behavior was evaluated through the analysis of stable isotopes of carbon and nitrogen (δ13C and δ15N) as well as the biological conditions of each animal contributed to explain the variations in the contamination profiles between the different species. In general, we observed that POPS concentrations at both sites presented low and similar values suggesting the atmospheric transport as the main input mechanism of these compounds for these regions. The unpublished results of POPs, in blood of seabirds from the two most recent marine conservation units created in Brazil, can contribute as reference values for their long-term monitoring in those regions.