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Análise da expressão protéica e de peptidases em formas pré-imaginais e imagos de Aedes aegypti e Aedes albopictusMatilde, Leonardo Saboia Vahia January 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os mosquitos Aedes albopictus (Skuse, 1894) e Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) apresentam significativa importância epidemiológica dentro da família Culicidae por serem os principais vetores da febre amarela e dos quatro sorotipos do vírus da dengue. As peptidases ou proteases são enzimas que clivam ligações peptídicas. No sistema digestivo de invertebrados as peptidases, especificamente aquelas da classe das serino-peptidases, são abundantes e participam de vários processos fisiológicos, desempenhando um papel principal na hidrólise de proteínas destinadas à nutrição. Estas enzimas podem apresentar características espécie-específicas e essas diferenças são respostas adaptativas a diferentes estilos de vida, ambientes e habilidade de sobrevivência entre as espécies. Neste trabalho descreve-se a caracterização das atividades proteolíticas detectadas em extratos totais das formas pré-imaginais de A. aegypti e A. albopictus por enzimografia em uma dimensão. A estabilidade da expressão de peptidases nessas espécies foi avaliada pela comparação do perfil proteolítico de formas larvais obtidas de ovos de insetos recém coletados no ambiente com ovos de insetos mantidos em colônia por longo período. Foram também comparados os perfis proteolíticos das pupas com seus respectivos imagos, bem como a estabilidade térmica das peptidases detectadas. Observaram-se complexos perfis de serino-peptidases do tipo tripsina em ambas as espécies vetoras
Contudo esses perfis apresentam diferenças espécie-específicas e também diferenças entre os distintos estágios evolutivos dentro de uma mesma espécie. Também, neste trabalho, descreve-se a caracterização das atividades proteolíticas detectadas no intestino médio de fêmeas de A. albopictus alimentadas com açúcar bem como o primeiro mapa proteô mico e a identificação de peptidases por eletroforese bi-dimensional e espectrometria de massas neste órgão. São discutidas aqui as estratégias usadas para analisar as peptidases expressas nesse tecido. As proteínas expressas no intestino médio de A. albopictus foram identificadas por similaridade com as sequencias de genoma de A. aegypti e distintas ferramentas bioinformáticas foram usadas para obter informação funcional de muitas dessas sequencias que estão pobremente anotadas. Foram identificadas 59 proteínas entre v Resumo as quais três serino-peptidases, e dessas, duas do tipo tripsina e uma quimiotripsina. Os resultados obtidos nos permitiram atribuir de maneira confiável um local de expressão para os genes de tripsina, tripsina alfa e quimotripsina. Em outras palavras, podemos afirmar que os genes acima mencionados se expressam no intestino médio de fêmeas adultas de A. albopictus alimentadas com açúcar. Este achado representa um pequeno, mas importante passo, para a atribuição funcional, ao nível de proteína, de genes codificantes para serino-peptidases do tipo tripsina e quimiotripsina no gênero Aedes / The mosquitoes Aedes albopictus (Skuse, 1894) and Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) have significant epidemiological importance within the family Culicidae because they are the main vectors of the yellow fever virus and the four serotypes of Dengue virus. Peptidases or proteases are enzymes that hydrolyze peptide bonds. In the digestive system of invertebrates, the peptidases, specifically those from the class of serine peptidases, are abundant and participate in various physiological processes, playing a major role in the hydrolysis of proteins destined to nutrition. These enzymes may have species-specific characteristics, and such differences reflect adaptive responses to different lifestyles and environments. In this work we describe the characterization, using zymography, of the proteolytic activities detected in total extracts of larval forms of A. aegypti and A. albopictus. The stability of expression of peptidases in these species was evaluated by comparing the proteolytic profile of larval forms obtained from eggs of newly collected insects to that from eggs of insect kept in colony for a long period. We also compared the proteolytic profiles of pupae as well as the thermal stability of the peptidases detected. Complex profiles of trypsin-like serine peptidases were observed in both species. However, these profiles differ between species and also differences between the different evolutionary stages were detected within the same species. Also, in this work, we describe the characterization of the proteolytic activities detected in the midgut of A. albopictus females fed on sugar as well as the first proteome map and proteomic identification of peptidases in this organ, using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. The strategies used to analyze the proteases expressed in this tissue are discussed here. The proteins expressed in the midgut of A. albopictus were identified by similarity with the genome sequences of A. aegypti and various bioinformatic tools were used to obtain functional information for many of these sequences that are poorly annotated. We identified 59 proteins including three serine peptidases, and among these, two types of trypsin-like and one chymotrypsin. The results obtained here allowed us to reliably assign a localization for the expression of trypsin, trypsin-alpha and chymotrypsin genes. In other words, we can say that the above mentioned genes are expressed in the midgut of adult females of A. albopictus fed with sugar. This finding represents a small but important step for the functional assignment, at the protein level, of the genes coding for trypsin-like and chymotrypsin serine peptidases of the Aedes genus.
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Purificação e Caracterização parcial de um inibidor de serinoproteinases de sementes de Delonix regia (Flamboyant)Pando, Silvana Cristina 28 January 1999 (has links)
Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T16:20:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 1999 / Resumo: No presente trabalho foi investigado um inibidor de proteinases em sementes da espécie Delonix regia Leguminosae-Caesalpinioideae). As sementes das leguminosas contêm uma alta concentração de proteína em relação aos outros componentes da planta. Dentre essas proteínas, os inibidores de proteinases, particularmente inibidores de enzimas da família das serinoproteinases (que inclui tripsina, quimotripsina e enzimas da coagulação sanguínea), exercem uma importante função na fisiologia da planta. Os inibidores de proteinases têm sido estudados há mais de 50 anos. Eles têm mostrado ser muito importantes no tratamento de disfunções metabólicas associadas às enzimas proteolíticas, tais como em casos de pancreatites, efizemas, alergias, inflamação, hipertensão e câncer. O inibidor de Delonix regia (DrTI) foi isolado em solução salina 10% (p/v), submetido a uma precipitação por acetona 80% (v/v) e purificado através de cromatografias de troca iônica (Sephadex A-50 e DEAE 5PW) e de exclusão molecular (Sephadex G-75). o DrTI inibiu tripsina bovina e porcina e a calicreína plasmática humana. Os valores de Ki encontrados foram 2, 19x1 0-8M, 4,53x10-8M e 5,25x 10-9 M, respectivamente. A pureza do inibidor foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida (10-20%), na presença de 5DS. O inibidor apresentou uma única banda de proteína em condições nativas e reduzidas (0,1 M DTT). Estes resultados indicam que o DrTI é constituído por uma única cadeia polipeptídica. A massa molecular aparente do inibidor foi de 22 kDa, um resultado similar aos inibidores de proteinase do tipo Kunitz. O DrTI foi submetido a estudos cristalográficos e seu modelo permitiu comparação estrutural com o inibidor de tripsina do tipo Kunitz isolado de sementes de Erythrina caffra / Abstract: In the present work, a proteinase inhibitor in seeds of Delonix regia (LeguminosaeCaesalpinioideae) specie, was investigated.
The Leguminosae seeds contain a high concentration of protein in relation to the other components of the plant. Among these proteins, the proteinase inhibitors, particularly enzymes inhibitors of serinoproteinases family (that include trypsin, chymotrypsin and blood coagulating enzymes), play an important role in plant physiology. Plant inhibitors have been investigated for more than fifty years ago. They have been shown to be very important in the treatment of metabolic disfunctions associated to proteolytic enzymes, such as in cases of pancreatits, emphyzema, allergy, inflamation and cancers. The Delonix regia inhibitor (DrTI) was isolated in saline solution 10% (p/v), after acetonic precipitation 80% (v/v), and purified through ion exchange chromatography (Sephadex A-50 e DEAE 5PW) and molecular exclusion (Sephadex G-75). DrTI inhibited bovine and porcine trypsin and human plasma kallikrein. The values of Ki found were 2,19 x 10-8M, 4,53 x 10-8M and 5,25 x 10-9M, respectively. Purity of inhibitor was detected by poliacrylamide gel electrophoresis (10-20%) in the presence of SDS. The inhibitor displayed a single protein band, in native and reduced conditions (0,1 M DTT). These results indicate that DrTI is constituted by a single polipeptide chain.The apparent molecular mass of inhibitor was of 22 kDa, a result similar to the proteinase inhibitors of the Kunitz-type.
DrTI was submitted to crystallographic studies and its model allowed structural comparison to the trypsin inhibitor of the Kunitz-type isolated from Erythrina caffra seeds / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas
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Obtenção de derivados semissintéticos a partir de benzofenona natural e avaliação do potencial antiproteolíticoJANUÁRIO, Jaqueline Pereira 23 February 2011 (has links)
O gênero Garcinia, também conhecido como Rheedia, é o mais numeroso da família
Clusiaceae e rico em uma considerável diversidade de compostos, tais como
benzofenonas polipreniladas, flavonóides, proantocianinas e xantonas. A espécie
Garcinia brasiliensis é uma planta nativa da região amazônica e seus frutos
são popularmente conhecidos como “bacupari”. Neste trabalho, a partir do extrato
acetato de etila das sementes de Garcinia brasiliensis, foi possível isolar a
benzofenona natural poliprenilada guttiferona-A. Modificações moleculares nas
hidroxilas fenólicas deste composto levaram a obtenção de sete derivados
semissintéticos inéditos, os quais foram avaliados quanto à atividade antiproteolítica,
através de ensaios sobre as enzimas tripsina e papaína. O interesse pela busca de
inibidores de proteases justifica-se pela comprovada relação desta classe de
enzimas a uma série de patologias, incluindo entre outras, o câncer e a AIDS. A
guttiferona-A, apresentou resultados relevantes para as duas enzimas testadas,
demonstrando a importância dos grupos prenila e hidroxila da molécula. Além disso,
os derivados acilados também apresentaram valores significativos de IC50
comparados ao produto de partida, com destaque dois deles, sendo possível ainda
relacionar a atividade inibitória dessas moléculas com a presença do grupo
carbonílico. / The genus Garcinia also known as Rheedia, is the biggest of the family Clusiaceae
and rich in a considerable variety of compounds such as benzophenones
polipreniladas, flavonoids, and xanthones proanthocyanins. The species Garcinia
brasiliensis is a plant native to the Amazon region and its fruits are popularly known
as "bacupari". In this work, from the ethyl acetate extract of the seeds of Garcinia
brasiliensis were isolated the natural poliprenilada benzophenone guttiferone-A.
Molecular changes in the phenolic hydroxyl of this compound led to the formation of
seven novel semisynthetic derivatives, which were evaluated for anti-proteolytic
activity, through experiments on the enzymes trypsin and papain. The interest in the
search of protease inhibitors is justified by the proven link between this class of
enzymes to a variety of diseases, including among others, cancer and AIDS. The
guttiferone-A, showed significant results for the two enzymes tested, demonstrating
the importance of the prenyl and hydroxyl groups of the molecule. Furthermore, the
acylated derivatives also showed a significant IC50 compared to original product,
especially two of them, is still possible to relate the inhibitory activity of
these molecules in the presence of carbonyl group. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
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Inibição do mTOR agrava a mucosite intestinal induzida por irinotecano / mTOR inhibition enhances irinotecan-induced intestinal mucositisCarvalho, Lucas de Lima 21 October 2016 (has links)
CARVALHO, L. L. Inibição do mTOR agrava a mucosite intestinal induzida por irinotecano. 2016. 118 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-02-06T15:50:42Z
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Previous issue date: 2016-10-21 / INTRODUCTION. Colorectal cancer (CRC) is one of the most prevalent neoplasms worldwide, being one of the leading causes of death from cancer. In Brazil, it is the third most frequent cancer in men and second in women. In the last decades new drugs incorporated into the clinical protocols for the treatment of mCRM have provided a significant increase in the survival of patients with this type of malignancy. Among these drugs, irinotecan occupies a prominent place and is commonly used as the first line in the treatment of metastatic RCC. However, since all chemotherapy treatments have a burden, a quarter of patients receiving irinotecan have a severe intestinal mucositis as a more noticeable side effect. Deregulation of cell signaling pathways is certainly one of the main reasons for the development of cancer. The mammalian rapamycin target protein (mTOR) is responsible for cell growth and the PI3K / Akt / mTOR axis is often dysregulated in several types of cancer. Thus, this work focused on investigating the role of mTOR during experimental intestinal mucositis induced by irinotecan. METHODS. C57BL / 6 male mice (n = 6 / group) were given intraperitoneally with saline or irinotecan (75 mg / kg or 45 mg / kg) for four consecutive days and treated with rapamycin or everolimus (mTOR inhibitors, 1.5 mg / Kg and 3 mg / kg, respectively) followed by irinotecan administration. Periodically the body weight variation and scores were evaluated for the degree of diarrhea. After euthanasia of the animals, ileus samples were collected for determination of myeloperoxidase activity (MPO), histopathology and morphometric analysis and cytokine levels measurement [KC (human IL-8 analogue chemokine), IL-1β, TGF-β And IFN-γ]. Gene expression of the mRNA of the PI3K / Akt / mTOR pathway proteins was performed by qRT-PCR. Blood was also collected from the animals to evaluate the total white blood cell count. The ANOVA / Bonferroni or Kruskal-Wallis / Dunn tests were used for statistical analysis. P <0.05 was accepted as significant. The present work was approved by the ethics committee of UFC (protocol number 100/14). RESULTS. Animals injected with irinotecan 75 mg / kg showed an increase in the gene expression of PI3K, Akt and mTOR mRNA evidencing the participation of the pathway in iatrogeny. Irinotecan 75 mg / kg significantly reduced body weight, total leukocyte count, villus / crypt ratio and promoted a characteristic intestinal lesion when compared to the saline control group. In addition, inhibition of mTOR with rapamycin or everolimus generally aggravated most of these parameters, such as weight loss, diarrhea, histopathology, neutrophil infiltration, and inflammatory mediators such as TGF-β and IFN-γ. CONCLUSION. Inhibition of mTOR aggravates irinotecan-induced intestinal mucositis probably by increasing the pro-inflammatory response via TGF-β and IFN-γ with important involvement of Paneth's Cells. Financial support: CNPq. / INTRODUÇÃO. O câncer colorretal (CCR) é uma das neoplasias mais prevalentes em todo o mundo, sendo uma das principais causas de óbito por câncer. No Brasil, apresenta-se como o terceiro câncer mais frequente nos homens e segundo nas mulheres. Nas últimas décadas novas drogas incorporadas à protocolos clínicos para o tratamento do CCRm tem proporcionado um aumento significativo na sobrevida de pacientes com esse tipo de malignidade. Dentre estas drogas o irinotecano ocupa lugar de destaque e é comumente utilizado como primeira linha no tratamento do CCR metastático. Entretanto, como todo tratamento quimioterápico há um ônus, um quarto dos pacientes em tratamento com irinotecano apresentam uma grave mucosite intestinal como efeito colateral mais notório. A desregulação de vias de sinalização celular certamente é uma das principais razões para o desenvolvimento do câncer. A proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) é responsável pelo crescimento celular e o eixo compreendido por PI3K/Akt/mTOR está frequentemente desregulada em vários tipos de câncer. Dessa forma, esse trabalho focou em investigar o papel do mTOR durante a mucosite intestinal experimental induzida pelo irinotecano. MÉTODOS. Camundongos machos C57BL/6 (n=6/grupo) foram administrados intraperitonialmente com salina ou irinotecano (75 mg/kg ou 45 mg/kg) durante quatro dias consecutivos e tratados com rapamicina ou everolimo (inibidores de mTOR, 1,5 mg/kg e 3 mg/kg, respectivamente) seguidos da administração de irinotecano. Periodicamente foram avaliados a variação de peso corpóreo e escores para avaliação do grau de diarreia. Após a eutanásia dos animais, amostras de íleo foram coletadas para determinação da atividade de mieloperoxidase (MPO), histopatologia e análise morfométrica e dosagem dos níveis de citocinas [KC (quimiocina análoga da IL-8 humana), IL-1β, TGF-β e IFN-γ]. A expressão gênica do RNAm das proteínas da via PI3K/Akt/mTOR foi realizada por qRT-PCR. Também foi colhido sangue dos animais para avaliação da contagem total de leucócitos. Os testes de ANOVA/Bonferroni ou Kruskal-Wallis/Dunn foram usados para as análises estatísticas. P<0,05 foi aceito como significativo. O presente trabalho foi aprovado pelo comitê de ética da UFC (número de protocolo Nº100/14). RESULTADOS. Os animais injetados com irinotecano 75 mg/kg apresentaram um aumento na expressão gênica do RNAm de PI3K, Akt e mTOR evidenciando a participação da via na iatrogenia. O irinotecano 75 mg/kg reduziu significativamente o peso corpóreo, contagem total de leucócitos, razão vilo/cripta e promoveu uma lesão intestinal que lhe é característico quando comparado ao grupo controle salina. Além disso, de forma geral, a inibição do mTOR com rapamicina ou everolimo agravou a maioria desses parâmetros, tais como perda de peso, diarreia, histopatologia, infiltração de neutrófilos e mediadores inflamatórios como TGF-β e IFN-γ. CONCLUSÃO. A inibição do mTOR agrava a mucosite intestinal induzida por irinotecano provavelmente pelo aumento da resposta pro-inflamatória via TGF-β e IFN-γ com participação importante das Células de Paneth. Apoio financeiro: CNPq.
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Mecanismos associados a obesidade e carcinogênesepapel da leptina e corpúsculos lipídicos na regulação do metabolismo lipídico e progressao tumoralFazolini, Narayana P. B. January 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A obesidade é uma condição predisponente ao desenvolvimento de câncer de cólon, esôfago, pulmão, próstata, dentre outros. Um dos maiores desafios no estabelecimento da ligação de obesidade e o risco de câncer tem sido correlacionar a epidemiologia e sua base biológica, ou seja, o mecanismo pelo qual a obesidade leva ao desenvolvimento de câncer. A leptina é uma adipocitocina, produzida e secretada pelo tecido adiposo que possui além dos efeitos em nível central no controle da saciedade, ações na regulação da resposta imune e inflamatória. Temos por hipótese que os níveis elevados de leptina na obesidade ative vias de sinalização envolvidas na regulação da inflamação, metabolismo lipídico e proliferação celular em células epiteliais. Os corpúsculos lipídicos são organelas dinâmicas envolvidas no metabolismo lipídico e inflamação, e o aumento no número destas organelas foi observado no câncer de cólon humano. A mTOR é uma serina/treonina cinase que está relacionada com o estímulo à tradução de proteínas, proliferação celular e progressão tumoral. Nosso objetivo foi, portanto, estudar o papel da leptina na alteração do metabolismo lipídico e progressão tumoral. Células epiteliais intestinais (IEC-6) não-transformadas de rato foram incubadas com leptina por 6h, na presença ou ausência do inibidor de mTOR, rapamicina. O estímulo com leptina induziu aumento na formação de corpúsculos lipídicos em células IEC-6 quando comparadas às células controle após coloração com tetróxido de ósmio ou ORO. O pré-tratamento com rapamicina inibiu significantemente a indução de corpúsculos lipídicos por leptina, sugerindo um papel de mTOR na sinalização induzida por esta adipocina
Nós demonstramos que a leptina aumenta a fosforilação de S6K em um mecanismo sensível à rapamicina. Além, disso, a leptina aumenta a proliferação de células epiteliais de forma dependente da via de mTOR, aumentando o número de células na fase S do ciclo celular. Através de proteoma descritivo de corpúsculos lipídicos de células de adenocarcinoma de cólon, verificamos a presença de 370 proteínas, incluindo diversas proteínas importantes no metabolismo lipídico, tradução de proteínas, sinalização e proliferação celular, sugerindo que estas organelas podem ser sítios de tradução de proteínas e sinalização, e poderiam contribuir para o fenótipo hiperproliferativo observado em tumores. Através de fracionamento subcelular e microscopia confocal, validamos que corpúsculos lipídicos de células de adenocarcinoma de cólon são sítios de localização da proteína S6K e mTOR. O estudo da regulação e ativação de mTOR e outras importantes vias durante processos patológicos como o câncer poderá contribuir para o entendimento dos mecanismos básicos de regulação do metabolismo lipídico e transformação celular de células tumorais. Dessa forma, nossos estudos podem contribuir para a identificação de novos alvos terapêuticos para o tratamento do câncer / Obesity is a predisposing condition to cancer development in colon, esophagus, lung, prostate, among others. One of the greatest challenge in establishing the link of obesity and the risk of cancer has been to establish the mechanism by which obesity leads to the development of cancer. Leptin is a adipocytokine, produced and secreted by adipose tissue that beyond its central effects in the control of satiety, has actions in the regulation of immune and inflammatory response. We hypothesized that elevated levels of leptin in obesity activate signaling pathways involved in the regulation of inflammation, lipid metabolism and cell proliferation in epithelial cells. Lipid droplets are dynamic organelles involved in lipid metabolism and inflammation, and the increase in the number of these organelles was observed in human colon cancer. mTOR is a serine / threonine kinase that regulates protein translation, cell proliferation and tumor progression. Our goal was therefore to study the impact of leptin in changes in lipid metabolism and tumor progression. Non-transformed rat intestinal epithelial cells (IEC-6) were incubated with leptin for 6h in the presence or absence of the mTOR inhibitor, rapamycin. Leptin stimulation induced increase in lipid droplet formation in IEC-6 cells when compared to control cells after staining with osmium tetroxide or ORO
Pre-treatment with rapamycin significantly inhibited the induction of lipid droplet by leptin, suggesting a role for mTOR in leptin-induced signaling. Leptin treatment leads to an increase in the phosphorylation of S6K in a rapamycin-sensitive manner. In addition, leptin-induced increase in epithelial cell proliferation is dependent of mTOR. Through descriptive proteomics of lipid droplets from colon adenocarcinoma cells, we identified 370 proteins, several of them involved in lipid metabolism, translation, cell signaling and proliferation, suggesting that these organelles can be sites of protein translation, contributing to the hyperproliferative phenotype observed in tumors. We have also demonstrated by confocal microscopy and subcellular fractionation that the S6K protein and mTOR are located at lipid droplets in colon adenocarcinoma cells. The study of regulation and activation of mTOR and other important pathways for diseases like cancer may contribute to a better understanding of the basic mechanisms involved in lipid metabolism and cell transformation in tumor cells, thus permitting the identification of new therapeutic targets for treatment of cancer / 2017-03-15
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Sinalização autofágica e níveis de miostatina em modelo de hipertrofia cardíaca fisiológica em camundongosPinto, Graziela Hünning January 2014 (has links)
A hipertrofia cardíaca é caracterizada pelo aumento do músculo cardíaco devido aumento das dimensões dos cardiomiócitos. Em condições fisiológicas ou patológicas a hipertrofia está relacionada com o aumento da força do coração, provocando alterações nas células miocárdicas. O exercício ativa a via da proteína Akt relacionada à sobrevivência celular em resposta ao exercício e atua sobre a proteína quinase mTOR, ocasionando síntese proteica e hipertrofia. A mTOR participa da proliferação e crescimento celular através da regulação da tradução da proteína. Além disso, a mTOR também controla outros processos celulares como autofagia e parece estar relacionada com a sinalização de miostatina. Portanto, quando miostatina aumentada, inibe o crescimento muscular provavelmente através da inibição de mTOR. A autofagia é um mecanismo homeostático com a finalidade de degradação e reciclagem através da ação lisossomal reciclando organelas citoplasmáticas e proteínas a fim de remover esses materiais intracelulares. A ativação da autofagia ocorre em duas situações: uma em baixo nível de fluxo autofágico, devido uma baixa energética a fim de manter a sobrevivência celular e em outra situação há ativação pronunciada a fim de esgotar os elementos celulares culminando em morte celular. Esses dois extremos nas ações autofágicas são mecanismos potenciais pró ou anti-sobrevivência. Estudos mostram uma ativação da autofagia durante o exercício agudo e parece estar relacionado com a repressão da via AKT/mTOR. Por outro lado, no exercício crônico a autofagia é ativada em músculo esquelético através de aumento das proteínas autofágicas. Tal evento é explicado pela mudança do perfil muscular esquelético pós-exercício gerando maior quantidade de metabólitos que são reciclados pelo sistema, porém em músculo cardíaco ainda está sendo estudado. A miostatina é um regulador negativo do crescimento muscular esquelético. Em doenças seu aumento resulta em perda muscular, contudo, na hipertrofia fisiológica a miostatina está reduzida no músculo esquelético e no cardíaco. A miostatina aumentada bloqueia não só Akt, mas também mTOR, favorecendo a via de degradação proteica através da maquinaria autofágica. Assim, a miostatina tem ação na autofagia durante o exercício e essas vias podem estar relacionadas com o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca.
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Efeito in vitro de inibidores de proteases sobre trofozoítos de Giardia duodenalisCarvalho, Thaís Batista de [UNESP] 31 July 2012 (has links) (PDF)
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carvalho_tb_dr_botfm.pdf: 1064227 bytes, checksum: 6970ff58c4a9d38097a4690dd21b1c4a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Entre os alvos mais promissores para o desenvolvimento de novos agentes antiparasitários, destacam-se as proteases que nos protozoários participam de processos metabólicos e fisiológicos, atuando como importantes fatores de virulência. Como a atividade dessas moléculas pode ser controlada por inibidores específicos, essas substâncias têm sido avaliadas quanto ao potencial terapêutico em diferentes infecções parasitárias, inclusive por Giardia. O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito in vitro dos inibidores de cisteína (IAA e E-64) e serina-proteases (antipaina, leupeptina e TLCK) sobre o crescimento, aderência, viabilidade e ultraestrutura de trofozoítos de cepa de Giardia isolada e axenizada em Botucatu. Para isso, trofozoítos foram incubados em meio contendo os inibidores a diferentes concentrações durante 24, 48 e 72 horas. Nos ensaios de crescimento e aderência, o número de trofozoítos foi estimado a partir de contagens em hemocitômetro, enquanto que a viabilidade celular e as alterações ultraestruturais foram avaliadas, respectivamente, pelo método de redução do MTT e por microscopia eletrônica de transmissão. De acordo com as observações feitas no presente estudo, todos os inibidores de proteases apresentaram efeito sobre o crescimento, aderência e viabilidade dos trofozoítos. Entretanto, melhor desempenho quanto à capacidade de reduzir os parâmetros avaliados foi demonstrado nos ensaios com os inibidores de cisteína-proteases, especialmente a IAA. As maiores porcentagens de inibição do crescimento e aderência e as menores taxas de viabilidade foram observadas após o tratamento com IAA. Da mesma forma, as alterações ultraestruturais mais marcantes ficaram a cargo deste inibidor, principalmente após exposição a 100 μM, quando foi possível... / The quest for new antiparasitic alternatives has led researchers to base their studies on insights into biology, host-parasite interactions and pathogenesis. In light of this, the proteolytic enzymes or proteases have excited the researcher’s interest, once they have been identified as important virulence factors as well as potential chemotherapeutic targets in parasites. Considering that proteases are naturally regulated by specific inhibitors, these substances have been evaluated for their therapeutic potential in parasitic infections including Giardia. In this way, we proposed to evaluate the in vitro effect of inhibitors of cysteine (IAA and E-64) and serine proteases (antipain, leupeptin and TLCK) on growth, adherence, viability and ultrastructure of Giardia trophozoites of a strain isolated and axenized in Botucatu. For this, trophozoites were incubated in medium containing the inhibitors at various concentrations for 24, 48 and 72 hours. In growth and adherence assays, the number of trophozoites was estimated microscopically in a haemocytometer, whereas cell viability and ultrastructural changes were evaluated, respectively, by the method of MTT and transmission electron microscopy. In this study, all protease inhibitors showed effect on growth, adherence and viability of trophozoites. However, better performance in their ability to reduce the parameters assessed was demonstrated in experiments with cysteine proteases inhibitors, especially IAA. The highest rates of growth and adhesion inhibition and the lowest rates of viability were detected in the IAA-treated cultures. Likewise, ultrastructural changes were most marked with this inhibitor, especially after exposure to 100 μM, when it was possible to demonstrate strong nuclear and cytoplasmic disorganization and drastic changes in... (Complete abstract click electronic access below)
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Polimorfismos do gene MASP2 e concentrações séricas da proteína MASP-2 na febre reumática e cardiopatia reumática crônicaCatarino, Sandra Jeremias dos Santos January 2014 (has links)
Orientador: Prof. Dr. Iara José de Mesias Reasson / Orientador: Prof. Dr. Angelica B. Winter Boldt / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 23/05/2014 / Inclui referências / Linha de pesquisa: Associação genética a doenças / Resumo: MASP-2, a serina protease 2 associada à lectina ligante de manose ou ficolinas, é uma proteína-chave na ativação da via das lectinas do complemento. Diversos polimorfismos do gene MASP2 estão associados com concentrações séricas ou grau de atividade funcional de MASP-2. Neste trabalho, investigamos uma possível associação entre polimorfismos de MASP2 e concentrações séricas de MASP-2 com a suscetibilidade à febre reumática (FR) e a cardiopatia reumática crônica (CRC). Foram haplotipados 11 polimorfismos de MASP2 utilizando PCR multiplex sequência-específica em 145 pacientes com história de FR provenientes do sul do Brasil (103 com CRC e 42 sem acometimento cardíaco [FRo]) e 290 controles saudáveis. As concentrações de MASP-2 foram determinadas por ensaio de imunoadsorbância enzimática em 145 pacientes e 145 controles. Os polimorfismos p.377A e p.439H, associados à baixa produção de MASP-2, foram negativamente associados à CRC (p=0,02, OR=0,25). Em contraste, haplótipos com quatro polimorfismos, localizados do intron 9 ao exon 12 (CDVR) e associados a concentrações intermediárias de MASP-2, aumentaram a suscetibilidade a CRC (p=0,02, OR=4,9). Apesar disso, as concentrações de MASP-2 foram mais baixas nos pacientes, do que nos controles, provavelmente devido ao consumo da proteína pela ativação da via das lectinas (medianas 253 vs. 321 ng/ml respectivamente, p<0,0001). Logo, polimorfismos de MASP2 associados à concentração sérica de MASP-2 podem atuar como moduladores no desenvolvimento da FR. A elucidação do papel desempenhado por MASP-2 na suscetibilidade a FR poderá auxiliar no desenho de estratégias de prevenção e tratamento da doença. Palavras-chave: Febre reumática; cardiopatia reumática crônica; MASP-2; polimorfismos de MASP2 / Abstract: MASP-2, the serine protease 2 associated with mannose-binding lectin or ficolins, is a key protein in the activation of the lectin pathway of complement. Several MASP2 gene polymorphisms have been associated with serum levels or degree of functional activity of MASP-2. In this work, we investigated a possible association between MASP2 polymorphisms and MASP-2 serum levels with the susceptibility to Rheumatic Fever (RF) and Rheumatic Heart Disease (RHD). We haplotyped 11 MASP2 polymorphisms with multiplex sequence-specific PCR in 145 patients with history of RF from south Brazil (103 with RHD and 42 without cardiac lesion [RFo]) and 290 healthy controls. MASP-2 levels were determined by enzyme-linked immunoadsorbance assay in 145 patients and 145 controls. The p.377A and p.439H polymorphisms, associated with low MASP-2 production, were negatively associated with RHD (p=0.02, OR=0.25). In contrast, haplotypes comprising four polymorphisms, located from intron 9 to exon 12 (CDVR) and associated with intermediate MASP-2 concentrations, increased the susceptibility to RHD (p=0.02, OR=4.9). Nevertheless, MASP-2 levels were lower in patients than in controls, probably due to protein consumption by the activation of the lectin pathway (medians 253 vs. 321 ng/ml, p<0.0001). Thus, MASP2 polymorphisms associated MASP-2 production may act as immune modulators in the development of RF. The elucidation of the role of MASP-2 in RF susceptibility might help in the design of strategies for RF prevention and treatment. Keywords: Rheumatic fever; rheumatic heart disease; MASP-2; MASP2 polimorphysms.
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Prospecção e expressão de uma enzima proteolítica a partir de uma biblioteca metagenômica do consórcio microbiano degradador de óleo dieselSilveira, Bianca de Melo [UNESP] 03 December 2015 (has links) (PDF)
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000865034.pdf: 1774770 bytes, checksum: cbbb1c1e9d8ae900c12fb9153a166e2e (MD5) / A partir de uma biblioteca metagenômica de um consórcio microbiano degradador de óleo diesel, um clone (PL3C3) expressando um novo gene de protease foi selecionado dentre vinte e seis positivos para degradação de azocaseína. Através do sequenciamento, foi analisado um contig e identificado uma ORF que codifica a proteína, denominada ORF19 composta por 966 pb, 321 aminoácidos, exibindo 69% de identidade com uma alfa/beta hidrolase de Parvibaculum lavamentivorans DS-1(número de acesso ABS62095.1). A sequência da ORF19 após análise em um banco de dados de protease - MEROPS - mostrou 74,3% de identidade com uma serino-protease da família S9U (número de acesso MER095859). Através da análise filogenética, foi possível sugerir que a ORF19 é um novo membro desta família exibindo a tríade catalítica e motivos conservados característicos. A massa molecular da proteína foi estimado em 35 kDa, tendo por base a sua composição em aminoácidos e estimativas junto ao programa Protparam, e considerando o padrão de migração eletroforética da proteína em condições desnaturantes. O gene da ORF19 foi clonado no vetor de expressão pET28a, porém, a proteína recombinante não foi super-expressa em Escherichia coli BL21 (DE3). Contudo, a troca de hospedeiro, vetor, e estudos para uma super-expressão é necessário para a obtenção da proteína, visando sua futura caracterização. Este estudo contribui para a descoberta de uma nova serino-protease utilizando abordagens moleculares, como a metagenômica / From a metagenomic library of a microbial consortium that degrades diesel oil, a clone (PL3C3) expressing a novel protease gene was selected from twenty six positive for azocasein degradation. Through sequencing, an analysis was made contig and identified an ORF encoding a protein, called ORF19 composed of 966 bp, 321 amino acids, exhibiting 69% identity with an alpha / hydrolase beta Parvibaculum lavamentivorans DS-1 (accession number ABS62095. 1). The sequence of ORF19 after analysis of a protease database - MEROPS - showed 74.3% identity with a serine protease family S9U (access number MER095859). Through phylogenetic analysis, it was possible to suggest that ORF19 is a new member of this family displaying the catalytic triad and characteristic conserved motifs. The molecular mass of the protein was estimated at 35 KDa, based on its amino acid composition and estimates Protparam by the program, and considering the pattern of electrophoretic migration of the protein under denaturing conditions. The ORF19 gene was cloned into the pET28a expression vector, but not the recombinant protein was overexpressed in E. coli BL21 (DE3). However, the exchange of host, vector, and studies for overexpression is required to obtain the protein, for their further characterization. This study contributes to the discovery of a new serine protease using molecular approaches, as metagenomic
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Efeito in vitro de inibidores de proteases sobre trofozoítos de Giardia duodenalis /Carvalho, Thaís Batista de. January 2012 (has links)
Orientador: Semíramis Guimarães Ferraz Viana / Coorientador: Teresa Cristina Goulart de Oliveira-Sequeira / Banca: Silvana Torossian Coradi / Banca: Clélia Akiko Hiruma Lima / Banca: Sérgio de Albuquerque / Banca: Ary Fernandes Junior / Resumo: Entre os alvos mais promissores para o desenvolvimento de novos agentes antiparasitários, destacam-se as proteases que nos protozoários participam de processos metabólicos e fisiológicos, atuando como importantes fatores de virulência. Como a atividade dessas moléculas pode ser controlada por inibidores específicos, essas substâncias têm sido avaliadas quanto ao potencial terapêutico em diferentes infecções parasitárias, inclusive por Giardia. O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito in vitro dos inibidores de cisteína (IAA e E-64) e serina-proteases (antipaina, leupeptina e TLCK) sobre o crescimento, aderência, viabilidade e ultraestrutura de trofozoítos de cepa de Giardia isolada e axenizada em Botucatu. Para isso, trofozoítos foram incubados em meio contendo os inibidores a diferentes concentrações durante 24, 48 e 72 horas. Nos ensaios de crescimento e aderência, o número de trofozoítos foi estimado a partir de contagens em hemocitômetro, enquanto que a viabilidade celular e as alterações ultraestruturais foram avaliadas, respectivamente, pelo método de redução do MTT e por microscopia eletrônica de transmissão. De acordo com as observações feitas no presente estudo, todos os inibidores de proteases apresentaram efeito sobre o crescimento, aderência e viabilidade dos trofozoítos. Entretanto, melhor desempenho quanto à capacidade de reduzir os parâmetros avaliados foi demonstrado nos ensaios com os inibidores de cisteína-proteases, especialmente a IAA. As maiores porcentagens de inibição do crescimento e aderência e as menores taxas de viabilidade foram observadas após o tratamento com IAA. Da mesma forma, as alterações ultraestruturais mais marcantes ficaram a cargo deste inibidor, principalmente após exposição a 100 μM, quando foi possível... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The quest for new antiparasitic alternatives has led researchers to base their studies on insights into biology, host-parasite interactions and pathogenesis. In light of this, the proteolytic enzymes or proteases have excited the researcher's interest, once they have been identified as important virulence factors as well as potential chemotherapeutic targets in parasites. Considering that proteases are naturally regulated by specific inhibitors, these substances have been evaluated for their therapeutic potential in parasitic infections including Giardia. In this way, we proposed to evaluate the in vitro effect of inhibitors of cysteine (IAA and E-64) and serine proteases (antipain, leupeptin and TLCK) on growth, adherence, viability and ultrastructure of Giardia trophozoites of a strain isolated and axenized in Botucatu. For this, trophozoites were incubated in medium containing the inhibitors at various concentrations for 24, 48 and 72 hours. In growth and adherence assays, the number of trophozoites was estimated microscopically in a haemocytometer, whereas cell viability and ultrastructural changes were evaluated, respectively, by the method of MTT and transmission electron microscopy. In this study, all protease inhibitors showed effect on growth, adherence and viability of trophozoites. However, better performance in their ability to reduce the parameters assessed was demonstrated in experiments with cysteine proteases inhibitors, especially IAA. The highest rates of growth and adhesion inhibition and the lowest rates of viability were detected in the IAA-treated cultures. Likewise, ultrastructural changes were most marked with this inhibitor, especially after exposure to 100 μM, when it was possible to demonstrate strong nuclear and cytoplasmic disorganization and drastic changes in... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor
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