Novas informações assimiladas pelo sistema nervoso primeiramente ficam em um estado de labilidade para depois se estabilizarem através de um processo conhecido como consolidação, que envolve síntese de proteínas. Depois da reativação, uma memória previamente consolidada retorna ao seu estado de labilidade, e para que volte a ser estável, é necessário que haja novamente síntese de proteínas. Este segundo processo é chamado de reconsolidação. Recentemente os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na regulação da síntese protéica relacionados à formação de memória de longa duração vêm sendo esclarecidos. A proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) modula a plasticidade sináptica pela regulação da fosforilação de dois alvos: a proteína ribossomal S6K e a proteína de ligação 4E. A amígdala basolateral e o hipocampo dorsal são parte integrante do sistema neural envolvido na formação e expressão de diversos tipos de memórias. Estudos indicam que a via de sinalização da mTOR no hipocampo tem um papel importante na consolidação da memória de ratos submetidos a tarefa de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e na reconsolidação da memória de medo contextual condicionado. Contudo, estudos anteriores não avaliaram o efeito da inibição de mTOR amigdalar sobre a memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos. O objetivo do presente trabalho é investigar o efeito da inibição de mTOR na amígdala basolateral por rapamicina na consolidação e reconsolidação da memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e comparar estes resultados com a inibição de mTOR no hipocampo. Ratos Wistar machos foram submetidos à cirurgia estereotáxica para implantação de cânulas na amígdala basolateral e hipocampo dorsal. Os animais foram submetidos à tarefa de esquiva inibitória, um modelo animal de memória de caráter aversivo, e a tarefa de reconhecimento de objetos, um modelo animal de memória de caráter pouco aversivo. Para investigar o efeito da inibição de mTOR na consolidação e reconsolidação da memória, os animais receberam microinfusões de rapamicina intra-amigdalar e intra-hipocampal em diferentes tempos em torno do treino e do teste. Nós demonstramos que a via de sinalização de mTOR na amígdala basolateral é necessária para consolidação da memória de esquiva inibitória e de reconhecimento de objetos. Nós também mostramos que a reativação torna a memória novamente suscetível e sensível à inibição de mTOR por rapamicina. / Memory formation requires protein synthesis, but only recently the cellular and molecular mechanisms involved in the regulation of protein synthesis related to the formation of long term memory has been elucidated. During memory formation, new information is acquired by the central nervous system as an initially fragile trace that over time becomes stable through a process known as consolidation. After reactivation, previously consolidated memories might return to a labile state, requiring a new round of protein synthesis to be restabilized. This second process is called reconsolidation. The basolateral amygdala and dorsal hippocampus are part of the neural systems involved in the formation and expression of several types of memory. One key regulator of protein synthesis is mTOR, a protein critical for different forms of synaptic plasticity by regulation of two targets: S6K and 4EBP. Evidence indicates that the mTOR signaling pathway in hippocampus has an important role in consolidation in rats of inhibitory avoidance and object recognition in rats, as well as in reconsolidation of contextual fear conditioning. However, previous studies have not examinated the effect of amygdalar mTOR inhibition on reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition. The aim of the present study was to evaluate the effect of amygdalar mTOR inhibition by rapamycin on consolidation and reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition, and compare the results with those obtained with hippocampal mTOR inhibition. Male rats Wistar underwent stereotaxic surgeries for cannulae implantation above the basolateral amygdala or dorsal hippocampus. After recovery, the animals were trained in inhibitory avoidance, an aversive memory task, or object recognition, a less aversive task. To investigate the effect of mTOR inhibition on memory consolidation and reconsolidation, we administered rapamycin, a specific mTOR inhibitor, into the basolateral amygdala or the dorsal hippocampus before or after training or reactivation. Our results provide evidence that mTOR in the basolateral amygdala and hippocampus might play a role in inhibitory avoidance and object recognition memory formation and reconsolidation.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-05T10:48:41Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 697501 bytes, checksum: 226788e066952b4d3ef7e7b8fa9382b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T10:48:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 697501 bytes, checksum: 226788e066952b4d3ef7e7b8fa9382b3 (MD5) Previous issue date: 2002-08-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A identificação e caracterização de proteases de intestino médio de insetos são importantes para o desenvolvimento de cultivares resistentes ao ataque de insetos. Neste estudo, a atividade proteolítica em intestino médio de larvas de A. gemmatalis foi investigada. O extrato enzimático foi obtido após ciclos de congelamento e descongelamento dos intestinos e posterior centrifugação do homogenato a 100,000 g, e o sobrenadante resultante (Fração I) foi utilizado como fonte de proteína solúvel. Como parte de nossos estudos, envolvendo a identificação de proteases do intestino médio de larvas de of A. gemmatalis, a presença de enzimas ligadas a membrana foi avaliada. Para este propósito, o precipitado do homogenato de intestino médio centrifugado a 100,000 g. foi ressuspendido em tampão com Triton X-100, centrifugado como anteriormente e o sobrenadante (Fração II) usado como fonte de proteases ligadas à membrana. A Fração I foi capaz de hidrolisar a caseína, e o substratos sintéticos L -BApNA e TAME. Usando L - BApNA como substrato, a atividade da Fração I foi investigada na presença de vários inibidores de proteases. Assim, EDTA, PMSF, TLCK, benzamidina e aprotinina, foram todos capazes de inibir a atividade da Fração I, com maior inibição observada com TLCK e benzamidina. De acordo com este resultados, conclui-se que o intestino médio de larvas de A. gemmatalis possui uma serino protease trpsina-like. Com o propósito de caracterizar melhor a atividade tripsina-like, foi determinada a atividade ótima para a Fração I. O pH ótimo foi de 8.5 e à temperatura ótima foi a 35 o C, sobre L -BApNA. O pH ótimo e temperatura foi de 8.0 e 30 o C, sobre TAME. O efeito de cálcio na atividade da Fração I foi investigado usando L -BApNA como substrato. A atividade máxima foi obtida na concentração de 20 mM de cálcio. Valores de K Mapp para L -BApNA e TAME foram de 0.32mM e 52.5μM, respectivamente. A Fração II foi capaz de hidrolisar a caseína, e os substratos sintéticos, L -BApNA e TAME. O efeito de vários inibidores de proteases também foi avaliado, usando L -BApNA como substrato. EDTA, PMSF, TLCK, benzamidina e aprotinina foram capazes de inibir a atividade da Fração II, com TLCK e benzamidina exibindo forte inibição. Estes resultados mostram que o intestino médio de larvas de A. gemmatalis possui proteases tripsin-like ligadas a membrana. Esta atividade tripsina-like foi melhor caracterizada. O pH ótimo para a Fração II usando L -BApNA e TAME foi 8.5 e 8.0, respectivamente. A atividade ótima exibida foi a 50 o C para ambos substratos, L-BApNA e TAME. Na concentração de 20 mM de cálcio, a Fração II mostrou um aumento na atividade sobre o L -BApNA. Os valores de K Mapp para L -BApNA e TAME foram de 0.23mM e 95.4 μM, respectivamente. / The identification and characterization of proteases from insects midgut are important in developing cultivars resistant to insect attack. In this study, proteolytic activities in the larval midgut of A. gemmatalis were investigated. Enzymatic extracts were obtained after frozen-and-thawed several times and centrifugation of the midgtus homogenate at 100,000 g, and the resulting supernatant (Fraction I) used as source of soluble proteins. As part of our studies involving the identification of proteases from midgut larvae of A. gemmatalis, the presence of the membrane-bound enzymes was evaluated. For this purpose, the pellet from midgut homogenates centrifuged at 100,000 g. was resuspended in buffer with Triton X-100, centrifuged as before and the supernatant (Fraction II), used as a source of membrane-bound proteases. Fraction I was able to hydrolyze casein, and the synthetic substrates, L-BApNA and TAME. Using L-BApNA as substrate, Fraction I activity was investigated in the presence of several protease inhibitors. Thus, EDTA, PMSF, TLCK, benzamidine and aprotinin, were all able to inhibit Fraction I activity, with greater inhibition observed with TLCK and benzamidine. According with these results, we conclude that the midgut larvae of A. gemmatalis have a trypsin-like serine protease. In order to further characterize the trypsin-like activities, the optimal activity for Fraction I was determined. The optimal pH was 8.5 and the optimal temperature was 35 o C, toward L-BApNA. Optimum pH and temperature were 8.0 and 30 o C, toward TAME. The effect of calcium on Fraction I activity was investigated using L-BApNA as substrate. The maximum activity was obtained at 20 mM calcium concentration. K Mapp values for L- BApNA and TAME were 0.32mM and 52.5μM, respectively. Fraction II was able to hydrolyze casein, and the synthetic substrates, L-BApNA and TAME. Also, the effect of several proteases inhibitors were evaluated, using L-BApNA as substrate. EDTA, PMSF, TLCK, Benzamidine and Aprotinin were able to inhibit Fraction II activity, with TLCK and benzamidine exhibiting stronger inhibition. These results showed that the midgut larvae of A. gemmatalis have a membrane-bound trypsin-like protease. These trypsin-like activities were further characterized. Optimum of pH for Fraction II activity using L-BApNA and TAME were 8.5 and 8.0, respectively. Optimal activity was exhibited at 50 o C toward L- BApNA and TAME. At 20 mM calcium concentration, Fraction II showed the highest activity toward L-BApNA. K Mapp values for L-BApNA and TAME were 0.23mM and 95.4 μM, respectively. / Dissertação importada do Alexandria

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:08:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 andre_veloso_ioc_dout_2015.pdf: 5077168 bytes, checksum: 9fce6d548bd0ac2fa5e83f9b028c4bf2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os dípteros Aedes aegypti, Anopheles albitarsis e Culex quinquefasciatus pertencem à família Culicidae e são considerados um problema de saúde pública quando atuam como vetores de parasitos e/ou arboviroses. O regime de alimentação de fêmeas dos mosquitos anautógenos influencia os processos que ocorrem no intestino e regula os genes envolvidos na reprodução. Além disso, apesar dos ciclos de vida dos parasitos veiculados por essas espécies de vetores serem distintos, todos eles são ingeridos durante a hematofagia e expostos ao ambiente do intestino médio (estômago) para em seguida atravessar o epitélio intestinal e chegarem ao tecido apropriado para seu desenvolvimento e/ou transmissão para um novo hospedeiro vertebrado. Neste trabalho, utilizamos uma abordagem proteômica para a identificação de proteínas totais, bem como ensaios em solução e enzimografia em gel copolimerizado com substrato para identificação de peptidases ativas presentes no intestino de fêmeas de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis s.s sob regime de alimentação com açúcar. As técnicas de enzimografia também foram utilizadas aqui para a caracterização de peptidases ativas de intestinos de fêmeas de Ae. aegypti alimentadas com açúcar ou sangue. Foi observado que o intestino de fêmeas das três espécies alimentadas com açúcar apresenta um complexo perfil de peptidases ativas, do tipo tripsina, composto por bandas migrando nas regiões entre ~ 24 a 40 kDa e em regiões de alto peso molecular Atividades proteolíticas foram detectadas entre pH 3,5 \2013 10, revelando diferenças quantitativas e qualitativas entre os perfis proteolíticos das três espécies. Em fêmeas de Ae. aegypti, o regime de alimentação com açúcar ou sangue alterou o perfil de SPtrip ativas do intestino de forma qualitativa e quantitativa. Um total de oito tripsinas em Cx. quinquefasciatus e dez tripsinas em An. albitarsis, foram identificadas por SDS-PAGE acoplado a LC-MS/MS. Apesar dessas SPtrip identificadas apresentarem características comuns às tripsinas digestivas de invertebrados, foram observadas diferenças nas sequências de aminoácidos, como por exemplo, em regiões de especificidade ao substrato e de ativação do zimogênio. Foi observado que os genes codificadores para SPtrip possuem diferentes tamanhos e organização, tais como, diferenças no número de éxons/introns. Com relação à composição de proteínas totais solúveis do intestino de fêmeas de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis, análise por LC-MS/MS e bioinformática revelou a presença de proteínas envolvidas em processos fisiológicos importantes, como exopeptidaes, glicosidades, enzimas detoxificantes e proteínas relacionadas com a interação parasito/vetor Em Cx. quinquefasciatus, foram identificadas 1397 proteínas, distribuídas em 1090 grupos, representando um total de ~ 7,5% das proteínas codificadas pelo genoma dessa espécie. Em An. albitarsis foram identificadas 916 proteínas distribuídas em 748 grupos. As centenas de proteínas presentes no intestino de fêmeas alimentadas com açúcar, de ambas as espécies, foram classificadas segundo sua ontologia gênica e o papel de algumas famílias de proteínas historicamente importante em mosquitos foram discutidas. Finalmente, foi demonstrado que abordagem proteômica combinada à enzimografia e bioinformática é uma ferramenta que pode auxiliar na anotação funcional dos genes de tripsinas expressos no intestino de fêmeas alimentadas com açúcar, bem como auxilia no mapeamento do repertório de proteínas totais presentes no intestino de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis / Culex quinquefasciatus, Anopheles albitarsis and Aedes aegypti are hematophagous insect from the Culicidae family that feeds on the blood of humans, dogs, birds and livestock. These species transmit a wide variety of pathogens between humans and animals. The midgut environment is the first location of pathogen-vector interaction for blood-feeding mosquitoes and the expression of specific peptidases in the early stages of feeding could influence the outcome of the infection. Trypsin-like serine peptidases belong to a multi-gene family that can be expressed in different isoforms under distinct physiological conditions. However, the confident assignment of the trypsin genes that are expressed under each condition is still a challenge due to the large number of trypsin-coding genes in the Culicidae family and most likely because they are low abundance proteins. We used zymography for the biochemical characterization of the peptidase profile of the midgut from Cx. quinquefasciatus, An. albitarsis, and Ae. aegypti females fed on sugar. We also caracterized the peptidses profile of the midgut from Ae. aegypti fed on blood, during different moments after fedding. Protein samples were also submitted to SDS-PAGE followed by liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) analysis for peptidase identification. The peptidases sequences were analyzed by bioinformatics tools to assess their distinct features. Zymography revealed that trypsin-like serine peptidases were responsible for the proteolytic activity in the midgut of females fed on sugar or blood diet. In addition, we observed that the profile is influenced by the blood ingestion. After fractionation in SDS-PAGE, eight and ten trypsin-like serine peptidases were identified by LC-MS/MS in Cx. quinquefasciatus and An. albitarsis, respectively. Peptidases from Cx. quinquefasciatus were also analysed with bioinformatic tools revealing that they have structural features typical of invertebrate digestive trypsin peptidases but exhibited singularities at the protein sequence level such as: the presence of different amino acids at the autocatalytic motif and substrate binding regions as well as different number of disulfide bounds. Data mining revealed a group of trypsin-like serine peptidases that are specific to C. quinquefasciatus when compared to the culicids genomes sequenced so far. We demonstrated that proteomics approaches combined with bioinformatics tools and zymographic analysis can lead to the functional annotation of trypsin-like serine peptidases coding genes and aid in the understanding of the complexity of peptidase expression in mosquitoes. / 2016-10-11

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:02:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 mariana_almeida_ioc_dout_2014.pdf: 10914971 bytes, checksum: 979497712c5a77cc8a8934caa85ef74e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os parasitos do gênero Leishmania, protozoários veiculados por insetos flebotomíneos e responsáveis pelas leishmanioses visceral e tegumentar, se encontram amplamente distribuídos pelo mundo. O potencial adaptativo destes protozoários é um reflexo da diversidade biológica do gênero Leishmania, em especial a espécie Leishmania (Viannia) braziliensis, que se encontra em diversos biomas acometendo diferentes animais e vetores de acordo com a região que se encontra. Os estudos biológicos e de expressão gênica de fatores de virulência do parasito são importantes para auxiliar na elucidação destes mecanismos de adaptação. Portanto este trabalho tem o objetivo de avaliar variações biológicas e na expressão de genes de proteinases de L. (V.) braziliensis, cepa MCAN/BR/1998/R619 e seus clones. Inicialmente foi realizada uma análise do genoma de L. (V.) braziliensis frente aos de L. (L.) infantum, L. (L.) major e L. (L.) mexicana, com o propósito de identificar características espécie-específicas que possam contribuir para compreender as diferenças fenotípicas ou de virulência entre as espécies estudadas. Foi observado que todos os cromossomos das quatro espécies apresentam genes de proteases em diferentes quantidades; alto grau de conservação entre os alelos de proteases; e as sequências dos genes de proteases dos parasitos não apresentam similaridade entre as de genes de proteases de mamíferos. Portanto, a análise dos genomas das Leishmania spp. indica uma grande diversidade de genes da protease nestas espécies Posteriormente foram obtidos clones da cepa em estudo oriundos de um único promastigota e avaliados seu comportamento in vitro e o potencial biológico destes parasitos na infecção experimental in vitro. A cepa em estudo reúne vários clones de parasitos e estas produzem padrões distintos de infecção in vitro de macrófagos de camundongos BALB/c; com produção de citocinas no sobrenadante de forma heterogênea. Algumas são menos indutoras de IL-1\03B2 e IL-6, e as citocinas TNF-\03B1 e IL-12p70, bem como o óxido nítrico, são induzidas de forma equilibrada pelos clones estudados. Uma análise de agrupamento permitiu a classificação de dois grupos distintos dos clones obtidos neste estudo. O conjunto de dados que mais influenciou para a definição destes grupos foi os relativos à infecção em macrófagos peritoneais murinos. Isto ressalta a possibilidade de haver outros marcadores, não contemplados neste estudo, que influenciam no sucesso da adaptação da cepa em estudo ao hospedeiro vertebrado. Também foi observado que os clones da cepa expressam diferentemente os genes das quatro classes de proteinases. Os amastigotas expressam mais proteinases que os promastigotas. Entre os promastigotas há maior expressão de aspártico e metaloproteinase enquanto que os amastigotas expressam mais metalo e serino proteinases. A diversidade da espécie vista entre isolados pôde ser comprovada também dentro de uma única cepa. O conjunto de resultados agrupados aqui enfatiza a capacidade da L. (V.) braziliensis utilizar a plasticidade de seu genoma para modular seu fenótipo e aumentar suas chances de sobrevivência nos hospedeiros / Parasites of the genus Leishmania are protozoans transmitted during the bite of female phlebotomines and are the causative agents of visceral or tegumentary leishmaniasis, presenting a worldwide distribution. The adaptative potential of these protozoa is a reflection of their biological diversity, especially that of the species Leishmania (Viannia) braziliensis, which is found in many biomes and affect different animals and vectors. Studies about the biology of parasites and their expression of virulence factor genes are important to help on the elucidation of their mechanisms of adaptation. Therefore, the purpose of this work is to evaluate the the biology and expression of protease genes of L. (V.) braziliensis, strain MCAN/BR/1998/R619, checking for variations among clones of this strain. Initially, we performed a comparative analysis of L. (V.) braziliensis genome against L. (L.) infantum, L. (L.) major and L. (L.) mexicana genomes to identify species-specific features that could potentially relate to characteristic phenotypic and virulence traits of the species. We could observe that protease genes are present in all chromosomes of the studied species, but in different frequencies. Additionally, a high degree of alleles conservation was noted, as well as a prominent distinction among the protease gene sequences of parasites and those of mammals, with no similarity detected. Thus, the analysis of genome of Leishmania spp. pointed to a great diversity of protease genes in these species. In an additional analysis, we obtained clones from single promastigotes isolated from L. (V.) braziliensis strain MCAN/BR/1998/R619 and evaluated their behaviors in vitro as well as their potential to cause infection in BALB/c macrophage cultures. Our results suggested that this strain is, in fact, composed by many clones with different characteristics, as they are able to promote distinct patterns of infection in macrophages in vitro, with a heterogenic production of cytokines by these cells. While some clones induced lower IL-1β or IL-6 production, TNF-α, IL-12p70 and nitric oxide production were homogeneously induced by the clones. A cluster analysis led to the classification of two distinct groups of clones in this study. Data analysis indicated that the capacity to promote infection in murine macrophages was the feature that most contributed to the clusters definition. However, the possibility remain that other features, no analyzed in the present study, could also play important roles regarding the success the studied strain’s adaptation to the vertebrate host. It was also observed that the clones differentially expressed genes related to the four main protease classes of Leishmania: cysteine, serine, metallo and aspartic-proteinases. Generally, the amastigotes expressed higher levels of proteinases-related mRNAs than promastigotes. Also, it was observed that promastigotes express more aspartic and metalloproteinases mRNAs, while amastigotes express more metallo and serine proteinases mRNAs. Therefore, a reflection of the features diversity already reported among isolates of L. (V.) braziliensis can also be noted among clones of a single strain. The results gathered herein emphasize the ability of L. (V.) braziliensis to apply its genome plasticity to modulate its phenotype and, thus, increase its odds to survive in the vertebrate host.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-09-16Bitstream added on 2014-06-13T20:33:38Z : No. of bitstreams: 1 fernandes_cah_me_botib.pdf: 1288061 bytes, checksum: 481773a993e5e2c2a2095ba6bcf346cc (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As serpentes do gênero Bothrops são de grande interesse científico, médico e social para o Brasil, visto que este gênero é responsável por cerca de 90% dos acidentes ofídicos que ocorrem em nosso país. Dois dos principais componentes do veneno desses animais são as fosfolipases A2 e as serino proteases. As fosfolipases A2 são enzimas responsáveis pela destruição da membrana celular através da hidrólise de fosfolipídios Ca2+ dependente. Uma classe destas fosfolipases, as fosfolipases homólogas (Lys49-PLA2s), que se caracteriza pela uma substituição natural na posição 49 de um resíduo de Asp para um resíduo de Lys, não apresenta atividade catalítica, mas é capaz de induzir mionecrose por um mecanismo Ca2+ independente devido, provavelmente, à resíduos da região C-terminal. Neste trabalho, através de estudos por cristalografia de raios-X de Lys49-PLA2s botrópicas nativas e quimicamente modificadas pelo brometo de p-bromofenacila (BPB), revisamos a posição da Lys122 – anteriormente apontado como um dos responsáveis ela ausência da atividade catalítica das Lys49-PLA2s por conta da hiperpolarização que causaria na ligação peptídica Cys29/Gly30 – e concluímos que, por conta de esta hiperpolarização ocorrer apenas em alguns monômeros de Lys49-PLA2s complexadas, a Lys122 não deve estar envolvida no “bloqueio” da atividade catalítica. Além disso, a comparação estrutural do loop de ligação de Ca2+ entre as Lys49 e Asp49-PLA2s nos mostra a importância da conservação da Tyr28 dentre as Asp49-PLA2s para a integridade do loop de ligação do Ca2+. Este resíduo estabiliza essa região através de uma ponte de hidrogênio com a Gly35. Nas Lys49-PLA2s, que possuem um resíduo de Asn na posição 28, não ocorre a formação dessa ponte, o que contribuiria para a desestabilização dessa região nessas proteínas... / The snakes from Botrops genus are objects with great scientific, medical and social interesting since that these snakes are responsible of 90% of snakebites in our country. Two of the main components of the venom from these animals are the phospholipases A2 and the serine proteases. The phospholipases A2 are enzymes responsible of cellular membrane disruption through phospholipids hydrolysis Ca2+-dependent. A class of these phospholipases, the homolog phospholipases (Lys49-PLA2s) that underwent a natural substitution Lys to Asp substitution in 49 position, does not show catalytic activity. However, these proteins can perform myonecrosis by a Ca2+-independent mechanism probably, due to action of C-termini region residues. In this work, by x-ray crystallography studies with bothropic Lys49-PLA2s in native and chemically modified by p-bromophenacyl bromide (BPB) forms, we revised the position of Lys122, previously pointed as one of the responsibles of Lys49-PLA2s due to hiperpolarization of its side chain on Cys29/Cys30 peptide bond. Here, we conclude that this hiperpolarization are present only in a few monomers and thus, Lys122 may not be involved in the “blocking” of catalytic activity. Furthermore, structural comparisons of Ca2+ binding loop between Lys49 and Asp49-PLA2s revels the importance of the Tyr28 residue conservation to the integrity of this region. This residue stabilizes the Ca2+ binding loop by a hydrogen bond to Gly35. In Lys49-PLA2s that have an Asn residue in 28 position, does not occur the formation of this bond, contributing to unstabilization of this region and difficulting the binding of Ca2+ cofactor. Phylogenetic studies showed that Asp49- PLA2s with reduced catalytic inactivity and capable to induce myonecrosis are phylogenetic more related to Lys49-PLA2s than to others Asp49-PLA2s, forming a ...(Complete abstract click electronic access below)

Orientadora : Profª. Drª. Iara José de Messias-Reason / Co-orientadora : Profª. Drª. Angelica B. Winter Boldt / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 23/02/2015 / Inclui referências / Área de concentração: Análises clínicas / Resumo: A hanseníase é causada pelo patógeno intracelular obrigatório Mycobacterium leprae, que infecta principalmente macrófagos e células Schwann do hospedeiro. A lectina ligante de manose (MBL) e as ficolinas (FCNs) reconhecem padrões de açúcares e resíduos acetilados (PAMP), respectivamente, em uma ampla variedade de patógenos, incluindo o M. leprae. Este reconhecimento desencadeia a transativação das serina-proteases 1 e 2, associadas a MBL (MASP-1 e MASP-2), e em seguida, a ativação da via das lectinas do sistema complemento. O gene MASP1 apresenta diversos polimorfismos que estão associados à modulação das concentrações de MASP-1 e de mais duas outras proteínas, resultantes de processamento alternativo do pré-mRNA: MASP-3 e a forma não-enzimática MAp44, ambas envolvidas na regulação negativa do sistema complemento, através da competição pelos sítios de ligação aos PAMP nas moléculas de reconhecimento. Neste estudo, avaliamos possível associação entre polimorfismos do gene MASP1 e concentrações séricas de MASP-1, MASP-3 e MAp44 em 389 indivíduos da população brasileira e 210 da dinamarqueses (segundo grupo controle), assim como com a susceptibilidade à hanseníase em 196 pacientes e 193 controles do Sul do Brasil. As amostras foram genotipadas por PCR sequência-específica multiplex para g.8113G>A (rs7609662) e g.8795C>T (rs13064994), localizados no intron 01, e g.61897C>G (rs72549262), g.62223C>T (rs1109452) e g.62224G>A (rs850314), localizados no exon 12 do gene MASP1. Os níveis séricos das proteínas foram quantificados com ensaio imunofluorimétrico cronometrado (TRIFMA). Pacientes com hanseníase apresentaram concentrações séricas de MASP-3 e MAp44 menores do que controles (medianas: 4603 ng/ml vs. 5606 ng/ml para MASP-3, p<0.005; 1732 vs. 2350 ng/ml para MAp44, p<0.0001). Pacientes com a forma lepromatosa de hanseníase também apresentaram concentrações reduzidas de MASP-3 e MAp44, quando comparados a não-lepromatosos (P=0,0016 e P<0,0001). Houve também uma associação entre a presença do alelo T para o SNP rs1109452 e níveis séricos elevados de MASP-1 e diminuídos de MASP-3 nos três diferentes grupos analisados. O haplótipo GC CCG se associou com a susceptibilidade à hanseníase (P=0,028, OR=1,43 [IC95%=1,04-1,94]). O haplótipo do exon 12 apresentou associação com os níveis de MASP-3 em controles (P=0,012) e no grupo comparação (P=0,0006), e os genótipos destas variantes também apresentaram associação com níveis de MAp44 em pacientes (P=0,023), e com os níveis de MASP-3 nos controles (P=0,024) e no grupo de dinamarqueses (P<0,0001). Concentrações baixas de MAp44 e MASP-3 em pacientes com hanseníase podem ser decorrentes de polimorfismos no gene MASP1. Este efeito pode estar aliado a possível consumo das proteínas no processo da doença e/ou baixa produção das mesmas nesses indivíduos. Palavras-chave: MASP1, MASP-3, MAp44, serina protease associada a MBL, complemento, via das lectinas, hanseníase. / Abstract: Leprosy is caused by the obligate intracellular pathogen Mycobacterium leprae, which infects mainly macrophages and Schwann cells of the host. The mannose-binding lectin (MBL) and Ficolins (FCNs) recognize sugar patterns and acetylated molecules (PAMP) respectively in a wide range of pathogens including M. leprae. This recognition triggers the transactivation of mannan-binding lectin serine protease 1 and 2 (MASP-1 e MASP-2) followed by the activation of complement system lectin pathway. MASP1 gene presents several polymorphisms associated to the modulation of MASP-1 concentration as well as two other proteins resulting from alternative processing of pre-mRNA: MASP-3 and the non-enzimatic MAp44, both involved in the down-regulation of complement system by competing for PAMP binding sites at the recognition molecules. Here, we aimed to assess possible associations between MASP1 gene polymorphisms and the serum levels of MASP-1, MASP-3 and MAp44 in 389 individuals from Brazil and 210 from Denmark (second control group), as well as with susceptibility to Leprosy in 196 patients and 193 control subjects from South Brazil. Samples were genotyped by multiplex sequence-specific PCR for g.8113G>A (rs7609662) and g.8795C>T (rs13064994) located in intron 01 and g.61897C>G (rs72549262), g.62223C>T (rs1109452) and g.62224G>A (rs850314) located in exon 12 of MASP1 gene. Protein serum levels were quantified by time-resolved immunofluorometric assays (TRIFMA). Leprosy patients presented lower MASP-3 and MAp44 serum levels (median: 4603 ng/ml vs. 5606 ng/ml for MASP-3, p<0.005; 1732 vs. 2350 ng/ml for MAp44, p<0.0001). Patients presenting the lepromatous clinical form of Leprosy also showed lower MASP-3 and MAp44 serum levels when compared to non-lepromatous patients (P=0.0016 and P<0.0001). There was an association between the T allele of rs1109452 with higher MASP-1 and lower MASP-3 serum levels in all three groups. The GC CCG haplotype was related to susceptibility to Leprosy (P=0.028, OR=1.43 [CI95%=1.04-1.94]). The exon 12 haplotype distribution is associated to MASP-3 levels in controls (P=0.012) and Danish (P=0.0006), and the genotypes of this variants, also revealed an association with MAp44 levels in patients (P=0.023), with MASP-3 levels in controls (P=0.024) and MASP-3 levels in the Danish cohort group (P<0,0001). Low MASP-3 and MAp44 serum levels in leprosy may be conferred by haplotypes/genotypes of MASP1 gene in addition to possible protein consumption and/or low production in leprosy patients. Key-words: MASP1, MASP-3, MAp44, MBL-associated serine-protease, complement, lectin pathway, leprosy.

Novas informações assimiladas pelo sistema nervoso primeiramente ficam em um estado de labilidade para depois se estabilizarem através de um processo conhecido como consolidação, que envolve síntese de proteínas. Depois da reativação, uma memória previamente consolidada retorna ao seu estado de labilidade, e para que volte a ser estável, é necessário que haja novamente síntese de proteínas. Este segundo processo é chamado de reconsolidação. Recentemente os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na regulação da síntese protéica relacionados à formação de memória de longa duração vêm sendo esclarecidos. A proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) modula a plasticidade sináptica pela regulação da fosforilação de dois alvos: a proteína ribossomal S6K e a proteína de ligação 4E. A amígdala basolateral e o hipocampo dorsal são parte integrante do sistema neural envolvido na formação e expressão de diversos tipos de memórias. Estudos indicam que a via de sinalização da mTOR no hipocampo tem um papel importante na consolidação da memória de ratos submetidos a tarefa de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e na reconsolidação da memória de medo contextual condicionado. Contudo, estudos anteriores não avaliaram o efeito da inibição de mTOR amigdalar sobre a memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos. O objetivo do presente trabalho é investigar o efeito da inibição de mTOR na amígdala basolateral por rapamicina na consolidação e reconsolidação da memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e comparar estes resultados com a inibição de mTOR no hipocampo. Ratos Wistar machos foram submetidos à cirurgia estereotáxica para implantação de cânulas na amígdala basolateral e hipocampo dorsal. Os animais foram submetidos à tarefa de esquiva inibitória, um modelo animal de memória de caráter aversivo, e a tarefa de reconhecimento de objetos, um modelo animal de memória de caráter pouco aversivo. Para investigar o efeito da inibição de mTOR na consolidação e reconsolidação da memória, os animais receberam microinfusões de rapamicina intra-amigdalar e intra-hipocampal em diferentes tempos em torno do treino e do teste. Nós demonstramos que a via de sinalização de mTOR na amígdala basolateral é necessária para consolidação da memória de esquiva inibitória e de reconhecimento de objetos. Nós também mostramos que a reativação torna a memória novamente suscetível e sensível à inibição de mTOR por rapamicina. / Memory formation requires protein synthesis, but only recently the cellular and molecular mechanisms involved in the regulation of protein synthesis related to the formation of long term memory has been elucidated. During memory formation, new information is acquired by the central nervous system as an initially fragile trace that over time becomes stable through a process known as consolidation. After reactivation, previously consolidated memories might return to a labile state, requiring a new round of protein synthesis to be restabilized. This second process is called reconsolidation. The basolateral amygdala and dorsal hippocampus are part of the neural systems involved in the formation and expression of several types of memory. One key regulator of protein synthesis is mTOR, a protein critical for different forms of synaptic plasticity by regulation of two targets: S6K and 4EBP. Evidence indicates that the mTOR signaling pathway in hippocampus has an important role in consolidation in rats of inhibitory avoidance and object recognition in rats, as well as in reconsolidation of contextual fear conditioning. However, previous studies have not examinated the effect of amygdalar mTOR inhibition on reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition. The aim of the present study was to evaluate the effect of amygdalar mTOR inhibition by rapamycin on consolidation and reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition, and compare the results with those obtained with hippocampal mTOR inhibition. Male rats Wistar underwent stereotaxic surgeries for cannulae implantation above the basolateral amygdala or dorsal hippocampus. After recovery, the animals were trained in inhibitory avoidance, an aversive memory task, or object recognition, a less aversive task. To investigate the effect of mTOR inhibition on memory consolidation and reconsolidation, we administered rapamycin, a specific mTOR inhibitor, into the basolateral amygdala or the dorsal hippocampus before or after training or reactivation. Our results provide evidence that mTOR in the basolateral amygdala and hippocampus might play a role in inhibitory avoidance and object recognition memory formation and reconsolidation.

Novas informações assimiladas pelo sistema nervoso primeiramente ficam em um estado de labilidade para depois se estabilizarem através de um processo conhecido como consolidação, que envolve síntese de proteínas. Depois da reativação, uma memória previamente consolidada retorna ao seu estado de labilidade, e para que volte a ser estável, é necessário que haja novamente síntese de proteínas. Este segundo processo é chamado de reconsolidação. Recentemente os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na regulação da síntese protéica relacionados à formação de memória de longa duração vêm sendo esclarecidos. A proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) modula a plasticidade sináptica pela regulação da fosforilação de dois alvos: a proteína ribossomal S6K e a proteína de ligação 4E. A amígdala basolateral e o hipocampo dorsal são parte integrante do sistema neural envolvido na formação e expressão de diversos tipos de memórias. Estudos indicam que a via de sinalização da mTOR no hipocampo tem um papel importante na consolidação da memória de ratos submetidos a tarefa de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e na reconsolidação da memória de medo contextual condicionado. Contudo, estudos anteriores não avaliaram o efeito da inibição de mTOR amigdalar sobre a memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos. O objetivo do presente trabalho é investigar o efeito da inibição de mTOR na amígdala basolateral por rapamicina na consolidação e reconsolidação da memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e comparar estes resultados com a inibição de mTOR no hipocampo. Ratos Wistar machos foram submetidos à cirurgia estereotáxica para implantação de cânulas na amígdala basolateral e hipocampo dorsal. Os animais foram submetidos à tarefa de esquiva inibitória, um modelo animal de memória de caráter aversivo, e a tarefa de reconhecimento de objetos, um modelo animal de memória de caráter pouco aversivo. Para investigar o efeito da inibição de mTOR na consolidação e reconsolidação da memória, os animais receberam microinfusões de rapamicina intra-amigdalar e intra-hipocampal em diferentes tempos em torno do treino e do teste. Nós demonstramos que a via de sinalização de mTOR na amígdala basolateral é necessária para consolidação da memória de esquiva inibitória e de reconhecimento de objetos. Nós também mostramos que a reativação torna a memória novamente suscetível e sensível à inibição de mTOR por rapamicina. / Memory formation requires protein synthesis, but only recently the cellular and molecular mechanisms involved in the regulation of protein synthesis related to the formation of long term memory has been elucidated. During memory formation, new information is acquired by the central nervous system as an initially fragile trace that over time becomes stable through a process known as consolidation. After reactivation, previously consolidated memories might return to a labile state, requiring a new round of protein synthesis to be restabilized. This second process is called reconsolidation. The basolateral amygdala and dorsal hippocampus are part of the neural systems involved in the formation and expression of several types of memory. One key regulator of protein synthesis is mTOR, a protein critical for different forms of synaptic plasticity by regulation of two targets: S6K and 4EBP. Evidence indicates that the mTOR signaling pathway in hippocampus has an important role in consolidation in rats of inhibitory avoidance and object recognition in rats, as well as in reconsolidation of contextual fear conditioning. However, previous studies have not examinated the effect of amygdalar mTOR inhibition on reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition. The aim of the present study was to evaluate the effect of amygdalar mTOR inhibition by rapamycin on consolidation and reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition, and compare the results with those obtained with hippocampal mTOR inhibition. Male rats Wistar underwent stereotaxic surgeries for cannulae implantation above the basolateral amygdala or dorsal hippocampus. After recovery, the animals were trained in inhibitory avoidance, an aversive memory task, or object recognition, a less aversive task. To investigate the effect of mTOR inhibition on memory consolidation and reconsolidation, we administered rapamycin, a specific mTOR inhibitor, into the basolateral amygdala or the dorsal hippocampus before or after training or reactivation. Our results provide evidence that mTOR in the basolateral amygdala and hippocampus might play a role in inhibitory avoidance and object recognition memory formation and reconsolidation.

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T00:18:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_FabianaVieira_M.pdf: 764391 bytes, checksum: 2ea9b8ea9a806b452272ef5f3e45ba17 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O uso de toxinas isoladas de venenos como ferramentas moleculares na compreensão de diversos eventos fisiológicos e patológicos tem sido comprovadas por vários trabalhos na literatura. A serpente Crotalus durissus cascavella é encontrada nas áreas de caatinga do nordeste do Brasil, desde o Maranhão até norte do estado de Minas Gerais, e apesar de pouco estudada sua picada constitui um importante problema da saúde pública (Martins et al, 1998). A agregação platequetária é bem caracterizada para a convulxina isolada do veneno de Crotalus durissus cascavella e Crotalus durissus terrificus. O objetivo principal do projeto foi avaliar a atividade de agregação plaquetária induzida por outras frações biológicas e farmacologicamente importantes do veneno total de Cotalus durissus cascavella, que neste projeto foram a crotoxina e giroxina. Através de uma combinação de varias metodologias em HPLC como exclusão molecular, troca iônica e de fase reversa conseguimos isolar os principais constituintes da crotoxina (PLA2, crotapotina e as proteínas ¿trombina-like¿) e a L-aminoácido oxidase a partir da giroxina. Durante o fracionamento do veneno total em coluna de HPLC de exclusão molecular foram detectados dois picos de atividade serino protease, um na fração giroxínica e outro na fração crotoxínica, sendo que na fração crotoxínica encontrou-se uma nova protease até então não caracterizada e na fração giroxínica foram monitoradas a atividade L-aminácido oxidase. Através da cromatografia em HPLC de troca iônica em DEAE 5PW obteve-se a fração Laminoácido oxidase cujo grau de homogeneidade molecular foi confirmado por HPLC de fase reversa. Da fração crotoxínica foram obtidos três grupos principais de proteínas (PLA2, crotapotinas e proteases) e da fração proteolítica foram isoladas três isoformas principais denominadas de F201, F202 e F203, sendo a fração F202, a fração majoritária. F202 foi obtida com maior homegeneidade molecular com massa molecular de 28kDa e mostrou uma alta quantidade de ácido aspártico, ácido glutâmico e outros aminoácidos importantes como histidina, cisteína e lisina. Esta proteína mostrou alta especificidade para BApNA e mostrou um comportamento Michaelis-Menten com Vmáx estimado em 5,64 µM/min e um Km de 0,58mM para este substrato. Neste trabalho foi investigada a habilidade desta proteína em degradar fibrinogênio e observou-se que F202 clivou ambas as cadeias a e ß. A atividade enzimática assim como a agregação plaquetária foi inibida fortemente com a incubação com TLCK, um inibidor específico para serinoproteases. O N-terminal da seqüência de aminoácidos de F202 mostrou alta homologia com outras proteínas ¿trombina-like¿, mas foi significantemente diferente da ¿trombina-like¿ isolada da fração giroxina. Crotalus durissus cascavella apresenta uma fração menos estudada denominada giroxina que tem sido descrita como uma proteína ¿trombina-like¿ como relatado por Raw et al. (1986) e Alexander et al. (1988). Neste trabalho foi demonstrado que a giroxina é uma fração heterogênea composta de uma ¿trombina-like¿ e proteína LAO, a qual parece estar envolvida em várias atividades / Abstract: The use of the isolated toxins from poisons as molecular tools in the understanding of diverse physiological and pathological events has been proved by some works in literature. The serpent Crotalus durissus cascavella is found in the areas of Caatinga Northeast of Brazil, since Maranhão until North of the state of Minas Gerais, and in spite of it hasn¿t been studied a lot, its bite constitutes an important problem to the public health (Martins et al, 1998). The platelet aggregation is well characterized to the isolated convulxin of the poison of Crotalus durissus cascavella and Crotalus durissus terrificus. The main objective of the project was to evaluate the activity of platelet aggregation induced by gyroxin and crotoxin that are biological and pharmacological important fractions of the total poison of Cotalus durissus cascavella. Through a combination of various methodologies in HPLC -as molecular exclusion, ionic exchange and the reverse phase- we managed to isolate the main constituent of the crotoxin (PLA2, crotapotin and the thrombin-like proteins) and the L-amino acid oxidase from the gyroxin. During the fragmentation of the total poison in column of HPLC of molecular exclusion two peaks of serine protease were found: one in the gyroxin fraction and another one in the crotoxin fraction. In the crotoxin fraction a new protease in not characterized yet and in the gyroxin fraction was found the L-amino acid activity oxidase. Through the chromatography in HPLC of ionic exchange in DEAE 5PW that allowed to the attainment of the fraction L-amino acid oxidase whose degree of molecular homogeneity was confirmed by HPLC of reverse phase. From the crotoxin fraction three main groups of proteins (PLA2, crotapotin and proteases) were isolated, and from the named proteolyitic fraction three isoforms of F201, F202 and F203, noticing that the F202 fraction is the major one. The fraction F202 showed a high quantity of aspartic acid, glutamic acid and others amino acids very important as histidine, cysteine and lysine and so more molecular homogeneity could be obtained and with molecular mass of 28kDa. This protein whose behavior Michaelis-Menten with Vmáx measured in 5,64 µM/min and one Km de 0,58 mM to this substratum showed high specificity to BapNA. In this work was investigated the ability of this protein in degrading the fibrinogen and was observed that the F202 made the cleavage into both chains a and ß. The enzymatic activity as well as the platelet aggregation were strongly inhibited with the incubation with TLCK, a specific inhibitor to serine protease. The N-terminal of the amino acid sequence of F202 showed the high homology with other proteins thrombin-like, but it was significantly different from thrombin-like isolated fro m the gyroxin fraction. Crotalus durissus cascavella presents a fraction less studied named gyroxin that has been described as a protein thrombin-like as related by Raw et al. (1986) and Alexander et al. (1988). In this work was demonstrated that the gyroxin is a composed heterogeneous fraction of one thrombin-like and protein LAO, and this seems to be involved in some activities / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2017-03-17T18:50:12Z No. of bitstreams: 1 Portela, Aline Cordeiro [Dissertação, 2014].pdf: 9279752 bytes, checksum: 9172b58477a24ce8a80f3405e0759adb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-17T18:50:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Portela, Aline Cordeiro [Dissertação, 2014].pdf: 9279752 bytes, checksum: 9172b58477a24ce8a80f3405e0759adb (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A dengue é um problema de saúde pública mundial, acometendo cerca de 50 milhões de pessoas por ano. O HCV é a principal causa de hepatite crônica e estima-se que 200 milhões de pessoas estejam infectadas no mundo. A terapia atual contra o HCV apresenta eficácia limitada e baixa tolerância, enquanto que para a dengue não existe um tratamento antiviral específico. Com o objetivo de explorar essa demanda, o presente trabalho descreve a síntese para a obtenção de quinze compostos peptideomiméticos inéditos, contendo o cerne rígido proveniente do isosorbídeo, como potenciais agentes inibidores da enzima NS3 protease de ambos os vírus. A estratégia de síntese dos peptideomiméticos consistiu inicialmente na obtenção de dez compostos inéditos, das séries 28a-c (derivada de oxazolonas) e 29a-g (derivada de aminoácidos N-protegidos). Os compostos foram inicialmente testados frente à inibição da protease do DENV-2, os quais não apresentaram resultados significativos. Entretanto, os resultados de inibição enzimática dos compostos frente à NS3/4A do HCV-1b foram mais satisfatórios, sendo o composto 28a (1,4:3,6-dianidro-5-[[(2Z)-2-(benzoilamino)-1-oxo-3-(2-tienil)-2-propen-1-il]amino] -2-deoxi-2-O-(fenilmetil)-D-iditiol, o mais ativo, com IC50 = 88μm. Estudos de docking molecular foram realizados para avaliar o modo de interação dos ligantes com a serina protease NS3/4A do HCV. Dentre os compostos sintetizados, 28a foi considerado protótipo para o desenvolvimento de novos compostos com potencial de inibição da enzima em questão. A partir de 28a, a nova série de compostos inéditos 42a-e foi proposta e obtida. Os resultados dos ensaios farmacológicos frente à NS3/4A do HCV-1b permitiram-nos inferir que a substituição do tiofeno de 28a pelo furano e 3-metiltiofeno em 42b e 42c, respectivamente, resultou em um aumento de cerca de 30% no perfil de inibição enzimática, com inibição de 70% dessa enzima viral. Dessa forma, podemos identificar esses dois novos compostos como protótipos para o planejamento de futuras moléculas potencialmente inibidoras da enzima serina protease do vírus da Hepatite C / Dengue fever is a worldwide public health concern, affecting approximately 50 million people per year. HCV is the main cause of chronic hepatitis and it is estimated that 200 million people are infected worldwide. Current therapy against HCV has limited efficacy and low tolerance, and there is no specific antiviral treatment for dengue fever. In order to exploit this demand, this work describes the synthesis for obtaining fifteen novel peptidemimetic compounds, isosorbide derivatives as potential inhibitory agents of the NS3 protease enzyme of both viruses. Initially the synthetic strategy of peptidemimetics consisted in obtaining ten novel compounds: 28a-c (derived from oxazolones) and 29a-g (derived from N-protected amino acids) series. The compounds were initially tested on the inhibition of protease DENV-2 , which results were not significant. However, the results of enzymatic inhibition of the compounds against the NS3/4A HCV-1b was more satisfactory, and the compound 28a (1,4 : 3,6- dianhydro -5 - [[( 2Z ) -2- ( benzoylamino) -1 -oxo- 3- (2- thienyl) -2 - propen -1- yl] amino] -2- deoxy -2- O- ( phenylmethyl ) -D- iditiol) , the most active , presenting IC50 = 88μm. Molecular docking studies were performed to assess the compounds mode of interaction with the serine protease NS3 / 4A HCV. Among the compounds synthesized, 28a was considered a prototype for the development of new compounds with a potential inhibition of the enzyme in question. Staring from 28a as a prototype the 42a-e serie was proposed and obtained. The results of pharmacological tests against the NS3/ 4A HCV -1b allowed us to conclude that substitution of the 28a furan thiophene and 3- methylthiophene in 42b and 42c respectively resulted in an increase of 30 % in the profile enzyme inhibition , with inhibition of 70 % of the viral enzyme . Thus , we can identify these new compounds as prototypes for planning future potentially molecule inhibitors of serine protease enzyme of the Hepatitis C virus