A sinvastatina é um agente antilipêmico, da classe das estatinas, utilizado no tratamento de primeira escolha em pacientes com hipercolesterolemia primária. A apresentação referência da sinvastatina no Brasil é o medicamento Zocor® (Merck Sharp & Dohme Farmacêutica Ltda.). Os medicamentos genéricos e similares podem ser considerados “cópias” do medicamento de referência e para o registro de ambos medicamentos, há obrigatoriedade de apresentação dos estudos de biodisponibilidade relativa e equivalência farmacêutica. Por isso este trabalho teve por objetivo o desenvolvimento e validação de um método bioanalítico para aplicação em estudos de biodisponibilidade relativa do fármaco sinvastatina em voluntários sadios. Aplicou-se a técnica de extração líquido-líquido para purificação das amostras e para quantificação foi utilizada a cromatografia líquida de ultra performance acoplada a espectrometria de massas (UPLC-MS/MS). O método desenvolvido e validado apresentou uma faixa linear de 0,4 - 40,0 ng/mL, com seletividade, recuperação, precisão, exatidão e estabilidades adequadas segundo a RE 899/2003 da ANVISA e o Guia de Validação de Métodos Bioanalíticos do FDA. Após a validação o método foi aplicado para estudo de biodisponibilidade relativa de sinvastatina. Os resultados dos parâmetros farmacocinéticos foram obtidos através das curvas de concentração plasmática do fármaco em função do tempo, e analisados estatisticamente para determinação da bioequivalência. Os seguintes parâmetros farmacocinéticos foram determinados: ASC, Cmax e tmax. O método desenvolvido apresentou preparo de amostras simples, baixo limite de quantificação e tempo de corrida curto, adequados a estudos com grande volume de amostras e baixos níveis plasmáticos. Portanto, o método desenvolvido e validado, bem como o estudo de bioequivalência foram adequados para avaliação das formulações de sinvastatina comprimido de 40 mg (teste e referência). O produto teste analisado não foi considerado bioequivalente ao produto referência. / Simvastatin (member of the statin class) is an antilipemic agent used in the primary treatment of primary hypercholesterolemia. The simvastatin reference drug in Brazil is Zocor® (Merck Sharp & Dohme Pharmaceutical Ltda.). The generic and similars drugs can be considered as “copies” of the reference drug. Relative bioavailability studies and pharmaceutical equivalence studies are needed before submitting the registration petition of these drugs. Thus, the aim of this work was the development and validation of a bioanalytical method for application in relative bioavailability studies in healthy volunteers. Liquid-liquid extraction was employed as a purification technique and the ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) as a quantitative technique. The method was developed and validated and presented a linear range of 0.4 – 40.0 ng/mL, and fulfilled all preset criteria for selectivity, recovery, precision, accuracy and stabilities according to ANVISA`s RE 899/2003 and FDA`s Bioanalylical Method Validation Guidance. After the validation, the method was applied to the relative bioavailability study of simvastatin. The pharmacokinetics parameters results was obtained through the blood concentration-time curves, and statistically analyzed for the determination of bioequivalence. The following pharmacokinetic parameters were obtained: AUC, Cmax, tmax. The developed method showed simple sample preparation, low lower limit of quantification and short running time, which was suitable for applying. Therefore, the proposed bioanalytical method and the bioequivalence study showed adequate for evaluating the simvastatin 40 mg tablet formulations (reference and test). The test drug analyzed was not considered bioequivalent to the reference drug. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O presente estudo objetivou desenvolver um método para determinação simultânea de fármacos antineoplásicos por cromatografia líquida de ultra performance acoplada ao espectrômetro de massas em tandem (UHPLC-MS/MS), para ser aplicado no monitoramento de superfícies de trabalho, em locais de manipulação dessas substâncias químicas. Os compostos alvos foram a ciclofosfamida (CP), a doxorrubicina (DOXO), o docetaxel (DOC) e a 5-fluoruracila (5-FU), escolhidos em função do seu uso e/ou considerados indicadores de exposição aos antineoplásicos. O metotrexato (MTX) também foi avaliado, todavia não foram obtidos resultados satisfatórios para esse composto, nas condições otimizadas para os outros analitos. As análises foram realizadas no modo de ionização positivo, exceto para a 5-FU, e monitoramento de reação múltipla (MRM). A separação cromatográfica foi realizada em 15 minutos, utilizando coluna Shim-pack® XR-ODS C18 (100 x 3,0 mm, 2,2 μm) e uma pré-coluna similar, gradiente de eluição, para a fase móvel, ácido fórmico 0,1% em água e acetonitrila, em uma vazão de 0,3 mL min-¹. As transições de massa, utilizadas para quantificação, seletivamente monitoradas para cada composto, foram: 261,0 > 140,0 m/z para CP; 830,3 > 304,0 m/z para DOC; 544,1 > 396,9 m/z para DOXO e 129,1 > 42,1 m/z para o 5-FU. O método analítico validado foi linear, apresentando r² ≥ 0,9939, no intervalo avaliado de 5 a 300 μg L-¹, para CP e de 10 a 300 μg L-¹, para DOC, DOXO e 5-FU; preciso, com valores de desvios-padrão relativos menores que 15%, para todas as concentrações e todos os analitos estudados. Os limites de detecção e de quantificação foram determinados entre 0,5-1,3 ng mL-¹ e 1,7-4,3 ng mL-¹, respectivamente. Após análise de 54 superfícies, adicionadas com os analitos, em uma quantidade de 150, 250 e 500 ng, as recuperações médias obtidas foram entre 59,9-104,8%, com erros-padrão relativos de até ±6%. Os resultados obtidos, no presente estudo, sugerem que o método desenvolvido é adequado para identificar, simultaneamente, quatro, dos cinco, antineoplásicos estudados, constituindo uma promissora e importante ferramenta analítica para o monitoramento da exposição ocupacional a tais fármacos. / The present study aimed to develop a method for simultaneous determination of antineoplastic drugs by ultra performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometer (UHPLC-MS/MS), to be applied in monitoring work surfaces, in handling locations of these chemicals. The targed compounds were the cyclophosphamide (CP), the docetaxel (DOC), the doxorrubicin (DOXO) and the 5-fluorouracil (5-FU), chosen according to their use and/or considered exposure indicators to antineoplastics. The methotrexate (MTX) was also evaluated, but satisfactory results were not obtained for this compound, under optimized conditions for other analytes. The analyses were carried out in the positive ionization mode, except for the 5-FU, and multiple reaction monitoring (MRM). The chromatographic separation was performed in 15 minutes using Shim-pack® XR-ODS C18 column (100 x 3,0 mm, 2,2 ƒÊm) and a similar pre-column, gradient elution, to the mobile phase, formic acid 0,1% and acetonitrile, at a flow rate of 0,3 mL min-¹. The mass transitions used to quantify selectively monitored for each compound, were: m/z 261,0 > 140,0 for CP; m/z 830,3 > 304,0 for DOC; m/z 544,1 > 396,9 for DOXO and m/z 129,1 > 42,1 for 5-FU. The validated analytical method was linear, with r² . 0,9939, in the assessed range of 5 to 300 ng mL-¹, for CP and of 10 to 300 ng mL-¹, for DOC, DOXO and 5-FU; accurate, with relative standard deviations lower than 15%, for all concentrations and all studied analytes. The limits of detection and quantification were determined from 0,5-1,3 ng mL-1 and 1,7-4,3 ng mL-¹, respectively. After analysis of 54 surfaces, spiked with the analytes, in a quantity of 150, 250 and 500 ng, the obtained mean recoveries were between 59,9-104,8%, with relative standard errors of up to ±6%. The obtained results, in this study, suggest that the developed method is suitable to identify, simultaneously, four, of the five, studied antineoplastics, becoming a promising and important analytical tool for the occupational exposure monitoring to these drugs. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:08:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 andre_veloso_ioc_dout_2015.pdf: 5077168 bytes, checksum: 9fce6d548bd0ac2fa5e83f9b028c4bf2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os dípteros Aedes aegypti, Anopheles albitarsis e Culex quinquefasciatus pertencem à família Culicidae e são considerados um problema de saúde pública quando atuam como vetores de parasitos e/ou arboviroses. O regime de alimentação de fêmeas dos mosquitos anautógenos influencia os processos que ocorrem no intestino e regula os genes envolvidos na reprodução. Além disso, apesar dos ciclos de vida dos parasitos veiculados por essas espécies de vetores serem distintos, todos eles são ingeridos durante a hematofagia e expostos ao ambiente do intestino médio (estômago) para em seguida atravessar o epitélio intestinal e chegarem ao tecido apropriado para seu desenvolvimento e/ou transmissão para um novo hospedeiro vertebrado. Neste trabalho, utilizamos uma abordagem proteômica para a identificação de proteínas totais, bem como ensaios em solução e enzimografia em gel copolimerizado com substrato para identificação de peptidases ativas presentes no intestino de fêmeas de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis s.s sob regime de alimentação com açúcar. As técnicas de enzimografia também foram utilizadas aqui para a caracterização de peptidases ativas de intestinos de fêmeas de Ae. aegypti alimentadas com açúcar ou sangue. Foi observado que o intestino de fêmeas das três espécies alimentadas com açúcar apresenta um complexo perfil de peptidases ativas, do tipo tripsina, composto por bandas migrando nas regiões entre ~ 24 a 40 kDa e em regiões de alto peso molecular Atividades proteolíticas foram detectadas entre pH 3,5 \2013 10, revelando diferenças quantitativas e qualitativas entre os perfis proteolíticos das três espécies. Em fêmeas de Ae. aegypti, o regime de alimentação com açúcar ou sangue alterou o perfil de SPtrip ativas do intestino de forma qualitativa e quantitativa. Um total de oito tripsinas em Cx. quinquefasciatus e dez tripsinas em An. albitarsis, foram identificadas por SDS-PAGE acoplado a LC-MS/MS. Apesar dessas SPtrip identificadas apresentarem características comuns às tripsinas digestivas de invertebrados, foram observadas diferenças nas sequências de aminoácidos, como por exemplo, em regiões de especificidade ao substrato e de ativação do zimogênio. Foi observado que os genes codificadores para SPtrip possuem diferentes tamanhos e organização, tais como, diferenças no número de éxons/introns. Com relação à composição de proteínas totais solúveis do intestino de fêmeas de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis, análise por LC-MS/MS e bioinformática revelou a presença de proteínas envolvidas em processos fisiológicos importantes, como exopeptidaes, glicosidades, enzimas detoxificantes e proteínas relacionadas com a interação parasito/vetor Em Cx. quinquefasciatus, foram identificadas 1397 proteínas, distribuídas em 1090 grupos, representando um total de ~ 7,5% das proteínas codificadas pelo genoma dessa espécie. Em An. albitarsis foram identificadas 916 proteínas distribuídas em 748 grupos. As centenas de proteínas presentes no intestino de fêmeas alimentadas com açúcar, de ambas as espécies, foram classificadas segundo sua ontologia gênica e o papel de algumas famílias de proteínas historicamente importante em mosquitos foram discutidas. Finalmente, foi demonstrado que abordagem proteômica combinada à enzimografia e bioinformática é uma ferramenta que pode auxiliar na anotação funcional dos genes de tripsinas expressos no intestino de fêmeas alimentadas com açúcar, bem como auxilia no mapeamento do repertório de proteínas totais presentes no intestino de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis / Culex quinquefasciatus, Anopheles albitarsis and Aedes aegypti are hematophagous insect from the Culicidae family that feeds on the blood of humans, dogs, birds and livestock. These species transmit a wide variety of pathogens between humans and animals. The midgut environment is the first location of pathogen-vector interaction for blood-feeding mosquitoes and the expression of specific peptidases in the early stages of feeding could influence the outcome of the infection. Trypsin-like serine peptidases belong to a multi-gene family that can be expressed in different isoforms under distinct physiological conditions. However, the confident assignment of the trypsin genes that are expressed under each condition is still a challenge due to the large number of trypsin-coding genes in the Culicidae family and most likely because they are low abundance proteins. We used zymography for the biochemical characterization of the peptidase profile of the midgut from Cx. quinquefasciatus, An. albitarsis, and Ae. aegypti females fed on sugar. We also caracterized the peptidses profile of the midgut from Ae. aegypti fed on blood, during different moments after fedding. Protein samples were also submitted to SDS-PAGE followed by liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) analysis for peptidase identification. The peptidases sequences were analyzed by bioinformatics tools to assess their distinct features. Zymography revealed that trypsin-like serine peptidases were responsible for the proteolytic activity in the midgut of females fed on sugar or blood diet. In addition, we observed that the profile is influenced by the blood ingestion. After fractionation in SDS-PAGE, eight and ten trypsin-like serine peptidases were identified by LC-MS/MS in Cx. quinquefasciatus and An. albitarsis, respectively. Peptidases from Cx. quinquefasciatus were also analysed with bioinformatic tools revealing that they have structural features typical of invertebrate digestive trypsin peptidases but exhibited singularities at the protein sequence level such as: the presence of different amino acids at the autocatalytic motif and substrate binding regions as well as different number of disulfide bounds. Data mining revealed a group of trypsin-like serine peptidases that are specific to C. quinquefasciatus when compared to the culicids genomes sequenced so far. We demonstrated that proteomics approaches combined with bioinformatics tools and zymographic analysis can lead to the functional annotation of trypsin-like serine peptidases coding genes and aid in the understanding of the complexity of peptidase expression in mosquitoes. / 2016-10-11

Recentemente, foi descrito um grupo de alterações no metabolismo da creatina denominado Síndromes de Deficiência de Creatina. Há três formas da doença geneticamente determinadas que cursam com deficiência de creatina, seja por comprometimento de sua síntese ou por defeito na proteína transportadora. O espectro de apresentação clínica dessa condição é inespecífico e inclui atraso ou estagnação do desenvolvimento neuromotor, hipotonia muscular, movimentos involuntários do tipo coreoatetose, retardo ou ausência do desenvolvimento da fala, retardo mental de grau variável, comportamento autista e epilepsia. Neste trabalho, foi desenvolvida e validada uma alternativa metodológica àquelas disponíveis na literatura, com a utilização de extração por troca catiônica forte e separação e detecção por cromatografia líquida de interação hidrofílica acoplada a espectrometria de massas em tandem em que foram exploradas as características químicas das moléculas de creatina e guanidinoacetato, metabólito intermediário da síntese de creatina. Os valores de referência para o método foram definidos pela sua aplicação a 150 amostras de urina e 197 amostras de soro de indivíduos de ambos os sexos e idades entre 0 e 16 anos. Foram também analisadas amostras de urina, soro e plasma de 54 pacientes com clínica compatível com a síndrome de deficiência de creatina sendo que 3 deles apresentaram perfil bioquímico característico de uma das formas dessa condição / Recently, a new group of inborn errors of metabolism, collectively named as creatine deficiency syndrome, was identified. Three genetically determined presentations are currently known, affecting both creatine synthesis and transport. Clinical presentation spectrum is non-specific and includes developmental delay, hypotonia, involuntary movements as choreoathetosis, delay or lack of speech acquisition, mental retardation of variable severity, autistic behavior, and epilepsy. Herein, we developed and validated an innovative method for determination of creatine and of its metabolic intermediate, guanidinoacetate, based on cation-exchange solid-phase extraction and hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Reference values for the method were defined testing 150 urine and 197 serum samples in males and females with age ranging from 0 to 16 years. Urine and serum samples from 54 patients with some clinical features that might be attributable to creatine deficiency were also evaluated, and in three, biochemical profile characteristic of one of the disorders was detected

Recentemente, foi descrito um grupo de alterações no metabolismo da creatina denominado Síndromes de Deficiência de Creatina. Há três formas da doença geneticamente determinadas que cursam com deficiência de creatina, seja por comprometimento de sua síntese ou por defeito na proteína transportadora. O espectro de apresentação clínica dessa condição é inespecífico e inclui atraso ou estagnação do desenvolvimento neuromotor, hipotonia muscular, movimentos involuntários do tipo coreoatetose, retardo ou ausência do desenvolvimento da fala, retardo mental de grau variável, comportamento autista e epilepsia. Neste trabalho, foi desenvolvida e validada uma alternativa metodológica àquelas disponíveis na literatura, com a utilização de extração por troca catiônica forte e separação e detecção por cromatografia líquida de interação hidrofílica acoplada a espectrometria de massas em tandem em que foram exploradas as características químicas das moléculas de creatina e guanidinoacetato, metabólito intermediário da síntese de creatina. Os valores de referência para o método foram definidos pela sua aplicação a 150 amostras de urina e 197 amostras de soro de indivíduos de ambos os sexos e idades entre 0 e 16 anos. Foram também analisadas amostras de urina, soro e plasma de 54 pacientes com clínica compatível com a síndrome de deficiência de creatina sendo que 3 deles apresentaram perfil bioquímico característico de uma das formas dessa condição / Recently, a new group of inborn errors of metabolism, collectively named as creatine deficiency syndrome, was identified. Three genetically determined presentations are currently known, affecting both creatine synthesis and transport. Clinical presentation spectrum is non-specific and includes developmental delay, hypotonia, involuntary movements as choreoathetosis, delay or lack of speech acquisition, mental retardation of variable severity, autistic behavior, and epilepsy. Herein, we developed and validated an innovative method for determination of creatine and of its metabolic intermediate, guanidinoacetate, based on cation-exchange solid-phase extraction and hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Reference values for the method were defined testing 150 urine and 197 serum samples in males and females with age ranging from 0 to 16 years. Urine and serum samples from 54 patients with some clinical features that might be attributable to creatine deficiency were also evaluated, and in three, biochemical profile characteristic of one of the disorders was detected

A venlafaxina (VEN), em razão de sua eficácia e brandos efeitos adversos, tem sido um dos antidepressivos mais prescritos no tratamento da depressão e ansiedade. Neste trabalho, um método analítico empregando as técnicas MISPE miniaturizada e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em Tandem, foi utilizado para a determinação de VEN e seus principais metabólitos em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. A fase MIP foi sintetizada via polimerização radicalar por precipitação, fazendo uso de VEN (molécula molde), ácido metacrílico (monômero funcional), etileno glicol dimetacrilato, (reagente reticulante) e 2,2 azobisisobutironitrila (iniciador radicalar) em tolueno (solvente). Para controle utilizou-se o polímero não impresso (NIP), sintetizado por procedimento análogo ao do MIP, porém sem o uso da molécula molde. A caracterização química e estrutural dos polímeros foi realizada por espectroscopia no infravermelho com transformada de fourier e microscopia eletrônica de varredura. A otimização das variáveis de MISPE miniaturizada favoreceu a detectabilidade analítica e diminuiu o efeito de memória. As extrações realizadas com MIP apresentaram taxa de recuperação de 84% para VEN e de 2-28% para os antidepressivos (clorpromazina, fluoxetina, clomipramina, imipramina e sertralina). O polímero não impresso apresentou baixa recuperação para a VEN (taxa de recuperação: 49%) e para os demais antidepressivos (taxas de recuperação menores que 40%). Estes experimentos comprovam a seletividade da fase MIP desenvolvida. O método padronizado apresentou linearidade na faixa de 3 a 700 ng mL-1 para VEN, 5 a 700 ng mL-1 para O-desmetilvenlafaxina (ODV) e de 3 a 500 ng mL-1 para N-desmetilvenlafaxina (NDV), precisão com coeficientes de variação menores que 15% e exatidão com valores de erro padrão relativo na faixa de -11,8 a 16,01 %. As concentrações correspondentes aos limites inferiores de quantificação para VEN (3 ng mL-1) e ODV ( 5 ng mL-1) foram inferiores aos intervalos terapêuticos preconizados. O método desenvolvido, quando comparado a aos métodos da literatura para determinação de VEN e metabolitos, apresentou maior seletividade, menor consumo de amostra e de solventes orgânicos e permitiu a reutilização da fase extratora. Segundo os parâmetros de validação analítica avaliados e amostras de pacientes em terapia com VEN analisadas, o método proposto é adequado para determinação de VEN, ODV e NDV em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. / Venlafaxine elicits a small number of adverse effects, so it is one of the most frequently prescribed drugs to treat major depression, generalized anxiety, and social anxiety disorders in adults. In this study, venlafaxine (VEN), O-desmethylvenlafaxine (ODV), and N-desmethylvenlafaxine (NDV) were pre-concentrated with the aid of miniaturized SPE based on MIPs as extraction phase. MIPs are synthetic polymers with cavities specifically designed to hold a target molecule or structurally similar compounds. The molecularly imprinted polymers were prepared by addition of VEN, metacrylic acid (MAA, monomer), ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA, cross-linker), and 2,2-azobisisobutyronitrile (AIBN, initiator) to toluene (solvent). The non-imprinted polymer (NIP), used for comparison, was also synthesized by following exactly the same procedure, but excluding the template VEN from the formulation. The polymer was characterized by Fourier transform infrared spectroscopy and scanning electron microscopy (SEM). Optimization of the MIP phase extraction variables favored miniaturized analytical detectability and reduced the memory effect. The extractions performed with the synthesized MIP showed recovery rate of 84% for VEN and 2-28% for other antidepressants (chlorpromazine, fluoxetine, clomipramine, imipramine, and sertraline). The non-imprinted polymer provided low recovery of VEN (recovery rate: 49%) and other antidepressants (recovery rates lower than 40%). These experiments demonstrated the selectivity of the developed MIP phase. The standardized method was linear in the range of 300 - 700 ng mL-1 for VEN, 5-700 ng mL-1 for ODV, and 3 to 500 ng mL-1 for NDV. Precision had coefficients of variation smaller than 15%; the accuracy standard error values ranged from -11.8 to 16.01%. Compared with literature methods, the developed method was more selective for determination of VEN and metabolites, required lower consumption of sample and organic solvents, and enabled reuse of the extraction phase. According to the assessed analytical validation parameters and to the analysis of samples obtained from patients undergoing therapy with VEN, the proposed method is suitable to determine VEN, NDV, and ODV in plasma samples for therapeutic drug monitoring.

Pregnenolona (PREG) e 17-alfa-hidroxipregnenolona (17OHPREG) são dois esteroides produzidos pela glândula adrenal e precursores de vários hormônios esteroidais. A dosagem desses compostos tem aplicações clínicas, como o diagnóstico de doenças relacionadas aos corticoesteroides e mineralocorticóides e especialmente na avaliação da atividade da enzima 3-β-hidroxidesidrogenase que é decisiva no diagnóstico de um dos tipos de hiperplasia da glândula adrenal que causa defeitos severos na síntese de esteroides. Métodos cromatográficos associados à espectrometria de massas superaram a especificidade reduzida dos imunoensaios e tem sido crescentemente utilizados na quantificação de esteroides. Os últimos anos tem sido marcados pela hegemonia da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) em grande parte devido à velocidade e possibilidade da análise direta de vários analitos. Porém, no caso específico dos esteroides de tipo 3-hidroxi-5-eno, que apresentam baixa afinidade protônica e, portanto, baixa eficiência de ionização, são necessárias muitas etapas para a conversão em derivados mais detectáveis. Embora desfavorecida em relação ao LC-MS/MS nos últimos anos, a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-MS) apresenta várias características favoráveis para a análise de esteroides como a eficiência cromatográfica ainda insuperável. Adicionalmente, a incorporação da espectrometria de massas em tandem ao CG (CG-MS/MS) torna a técnica tão seletiva quanto LC-MS/MS. No presente trabalho, foi desenvolvido um novo método que permite a extração e derivatização simultâneas da PREG e 17OHPREG de amostras de soro tornando o método de preparo da amostra tão simples quanto os descritos para LC-MS/MS. O método de detecção desenvolvido baseado em ionização química no modo negativo obteve a sensibilidade necessária para o diagnóstico da deficiência da enzima 3-beta-hidroxidesidrogenase utilizando apenas 250 &#181:L de amostra. / Pregnenolone (PREG) and 17α-hydroxypregnenolone (17OHPREG) are two steroid precursors produced by the adrenal gland. The quantification of these compounds is essential for the evaluation of 3-β-hidroxidesidrogenase enzyme activity, which promotes the conversion of PREG in 17OHPREG. The 3-&#946:-hidroxidesidrogenase deficiency is a rare but severe type of adrenal hyperplasia that causes serious defects in steroid synthesis. Chromatographic methods coupled to mass spectrometry overcame immunoassays limitations such as reduced specificity, and have been widely used for steroids quantification. Recent years have been marked by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) hegemony due to the speed and possibility to analyze directly several analytes. However, in the case of type 3-hydroxy-5-ene steroids, which have low affinity for protons and, therefore, low ionization efficiency, many steps are required for conversion to detectable products. Notwithstanding, gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) has some favorable features for steroid analysis such as unbeatable chromatographic efficiency. In addition, the incorporation of tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) makes it as selective as LC-MS/MS. In this study, a new method for simultaneous extraction and derivatization of PREG and 17OHPREG from serum was developed. This procedure makes sample preparation for GC-MS/MS as simples as those described for LC-MS/MS. The detection method based on negative mode chemical ionization achieved the sensitivity required for the diagnosis of 3-β-hidroxidesidrogenase defficiency using only 250 µL of sample.

Pregnenolona (PREG) e 17-alfa-hidroxipregnenolona (17OHPREG) são dois esteroides produzidos pela glândula adrenal e precursores de vários hormônios esteroidais. A dosagem desses compostos tem aplicações clínicas, como o diagnóstico de doenças relacionadas aos corticoesteroides e mineralocorticóides e especialmente na avaliação da atividade da enzima 3-β-hidroxidesidrogenase que é decisiva no diagnóstico de um dos tipos de hiperplasia da glândula adrenal que causa defeitos severos na síntese de esteroides. Métodos cromatográficos associados à espectrometria de massas superaram a especificidade reduzida dos imunoensaios e tem sido crescentemente utilizados na quantificação de esteroides. Os últimos anos tem sido marcados pela hegemonia da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) em grande parte devido à velocidade e possibilidade da análise direta de vários analitos. Porém, no caso específico dos esteroides de tipo 3-hidroxi-5-eno, que apresentam baixa afinidade protônica e, portanto, baixa eficiência de ionização, são necessárias muitas etapas para a conversão em derivados mais detectáveis. Embora desfavorecida em relação ao LC-MS/MS nos últimos anos, a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-MS) apresenta várias características favoráveis para a análise de esteroides como a eficiência cromatográfica ainda insuperável. Adicionalmente, a incorporação da espectrometria de massas em tandem ao CG (CG-MS/MS) torna a técnica tão seletiva quanto LC-MS/MS. No presente trabalho, foi desenvolvido um novo método que permite a extração e derivatização simultâneas da PREG e 17OHPREG de amostras de soro tornando o método de preparo da amostra tão simples quanto os descritos para LC-MS/MS. O método de detecção desenvolvido baseado em ionização química no modo negativo obteve a sensibilidade necessária para o diagnóstico da deficiência da enzima 3-beta-hidroxidesidrogenase utilizando apenas 250 &#181:L de amostra. / Pregnenolone (PREG) and 17α-hydroxypregnenolone (17OHPREG) are two steroid precursors produced by the adrenal gland. The quantification of these compounds is essential for the evaluation of 3-β-hidroxidesidrogenase enzyme activity, which promotes the conversion of PREG in 17OHPREG. The 3-&#946:-hidroxidesidrogenase deficiency is a rare but severe type of adrenal hyperplasia that causes serious defects in steroid synthesis. Chromatographic methods coupled to mass spectrometry overcame immunoassays limitations such as reduced specificity, and have been widely used for steroids quantification. Recent years have been marked by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) hegemony due to the speed and possibility to analyze directly several analytes. However, in the case of type 3-hydroxy-5-ene steroids, which have low affinity for protons and, therefore, low ionization efficiency, many steps are required for conversion to detectable products. Notwithstanding, gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) has some favorable features for steroid analysis such as unbeatable chromatographic efficiency. In addition, the incorporation of tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) makes it as selective as LC-MS/MS. In this study, a new method for simultaneous extraction and derivatization of PREG and 17OHPREG from serum was developed. This procedure makes sample preparation for GC-MS/MS as simples as those described for LC-MS/MS. The detection method based on negative mode chemical ionization achieved the sensitivity required for the diagnosis of 3-β-hidroxidesidrogenase defficiency using only 250 µL of sample.

A venlafaxina (VEN), em razão de sua eficácia e brandos efeitos adversos, tem sido um dos antidepressivos mais prescritos no tratamento da depressão e ansiedade. Neste trabalho, um método analítico empregando as técnicas MISPE miniaturizada e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em Tandem, foi utilizado para a determinação de VEN e seus principais metabólitos em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. A fase MIP foi sintetizada via polimerização radicalar por precipitação, fazendo uso de VEN (molécula molde), ácido metacrílico (monômero funcional), etileno glicol dimetacrilato, (reagente reticulante) e 2,2 azobisisobutironitrila (iniciador radicalar) em tolueno (solvente). Para controle utilizou-se o polímero não impresso (NIP), sintetizado por procedimento análogo ao do MIP, porém sem o uso da molécula molde. A caracterização química e estrutural dos polímeros foi realizada por espectroscopia no infravermelho com transformada de fourier e microscopia eletrônica de varredura. A otimização das variáveis de MISPE miniaturizada favoreceu a detectabilidade analítica e diminuiu o efeito de memória. As extrações realizadas com MIP apresentaram taxa de recuperação de 84% para VEN e de 2-28% para os antidepressivos (clorpromazina, fluoxetina, clomipramina, imipramina e sertralina). O polímero não impresso apresentou baixa recuperação para a VEN (taxa de recuperação: 49%) e para os demais antidepressivos (taxas de recuperação menores que 40%). Estes experimentos comprovam a seletividade da fase MIP desenvolvida. O método padronizado apresentou linearidade na faixa de 3 a 700 ng mL-1 para VEN, 5 a 700 ng mL-1 para O-desmetilvenlafaxina (ODV) e de 3 a 500 ng mL-1 para N-desmetilvenlafaxina (NDV), precisão com coeficientes de variação menores que 15% e exatidão com valores de erro padrão relativo na faixa de -11,8 a 16,01 %. As concentrações correspondentes aos limites inferiores de quantificação para VEN (3 ng mL-1) e ODV ( 5 ng mL-1) foram inferiores aos intervalos terapêuticos preconizados. O método desenvolvido, quando comparado a aos métodos da literatura para determinação de VEN e metabolitos, apresentou maior seletividade, menor consumo de amostra e de solventes orgânicos e permitiu a reutilização da fase extratora. Segundo os parâmetros de validação analítica avaliados e amostras de pacientes em terapia com VEN analisadas, o método proposto é adequado para determinação de VEN, ODV e NDV em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. / Venlafaxine elicits a small number of adverse effects, so it is one of the most frequently prescribed drugs to treat major depression, generalized anxiety, and social anxiety disorders in adults. In this study, venlafaxine (VEN), O-desmethylvenlafaxine (ODV), and N-desmethylvenlafaxine (NDV) were pre-concentrated with the aid of miniaturized SPE based on MIPs as extraction phase. MIPs are synthetic polymers with cavities specifically designed to hold a target molecule or structurally similar compounds. The molecularly imprinted polymers were prepared by addition of VEN, metacrylic acid (MAA, monomer), ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA, cross-linker), and 2,2-azobisisobutyronitrile (AIBN, initiator) to toluene (solvent). The non-imprinted polymer (NIP), used for comparison, was also synthesized by following exactly the same procedure, but excluding the template VEN from the formulation. The polymer was characterized by Fourier transform infrared spectroscopy and scanning electron microscopy (SEM). Optimization of the MIP phase extraction variables favored miniaturized analytical detectability and reduced the memory effect. The extractions performed with the synthesized MIP showed recovery rate of 84% for VEN and 2-28% for other antidepressants (chlorpromazine, fluoxetine, clomipramine, imipramine, and sertraline). The non-imprinted polymer provided low recovery of VEN (recovery rate: 49%) and other antidepressants (recovery rates lower than 40%). These experiments demonstrated the selectivity of the developed MIP phase. The standardized method was linear in the range of 300 - 700 ng mL-1 for VEN, 5-700 ng mL-1 for ODV, and 3 to 500 ng mL-1 for NDV. Precision had coefficients of variation smaller than 15%; the accuracy standard error values ranged from -11.8 to 16.01%. Compared with literature methods, the developed method was more selective for determination of VEN and metabolites, required lower consumption of sample and organic solvents, and enabled reuse of the extraction phase. According to the assessed analytical validation parameters and to the analysis of samples obtained from patients undergoing therapy with VEN, the proposed method is suitable to determine VEN, NDV, and ODV in plasma samples for therapeutic drug monitoring.

A esquizofrenia é um transtorno neuropsiquiátrico crônico que afeta aproximadamente 1% da população mundial. As teorias neurobiológicas descrevem que a esquizofrenia é essencialmente causada por alterações bioquímicas e estruturais do cérebro, devido às disfunções nos sistemas glutamatérgico, dopaminérgico e serotoninérgico. Desta forma, a determinação das concentrações de aminoácidos e neurotransmissores em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos pode auxiliar na avaliação da eficácia da terapia. Além dos antipsicóticos, medicação de primeira linha no tratamento inicial da esquizofrenia, a maioria dos pacientes também faz uso concomitante de outras classes de fármacos, tais como antidepressivos, anticonvulsivantes e ansiolíticos para minimizar os sintomas associados a esta doença. Nesta tese, um método empregando a precipitação de proteínas (PPT) e a cromatografia líquida por interação hidrofílica acoplada à espectrometria de massas em tandem (HILIC-MS/MS) foi adequadamente desenvolvido e validado para a determinação de aminoácidos (aspartato, serina, glicina, alanina, metionina, leucina, tirosina e triptofano) e neurotransmissores (glutamato e ácido -aminobutírico) em amostras de plasma de 35 pacientes esquizofrênicos em tratamento com clozapina (27 pacientes) e olanzapina (8 pacientes) para avaliar a eficácia do tratamento, tendo como controle 38 voluntários sadios. O método HILIC-MS/MS apresentou linearidade do LIQ (9,7 pmol mL-1 - 13,3 nmol mL-1) ao LSQ (19,4 nmol mL-1 - 800 nmol mL-1), tempo de análise de 3,0 min, exatidão com EPR de -18 a 19% e precisão com CV de 0,1 a 16% (LIQ). A análise de variância (ANOVA), seguida por teste post-hoc de Duncan, revelou que os níveis médios plasmáticos (nmol mL-1) de metionina (F2,70 = 3,14, p = 0,049) de pacientes esquizofrênicos em tratamento com olanzapina foram significativamente mais elevados, quando comparados aos valores obtidos com o grupo controle (voluntários saudáveis), já o nível de glutamato em pacientes esquizofrênicos em tratamento com clozapina apresentaram tendência a valores mais altos (F2.70 = 2,50, p = 0,090). Já os métodos, PPT/LC-MS/MS e LC-MS/MS no modo column switching utilizando uma coluna monolítica de sílica híbrida com grupos cianopropil na primeira dimensão, foram desenvolvidos e validados para a determinação dos antipsicóticos (olanzapina, quetiapina, clozapina, haloperidol e clorpromazina), antidepressivos (mirtazapina, paroxetina, citalopram, sertralina, imipramina, clomipramina e fluoxetina), anticonvulsivantes (carbamazepina e lamotrigina), e ansiolíticos (diazepam e clonazepam) em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos para fins de monitorização terapêutica. O método PPT/LC-MS/MS apresentou linearidade do LIQ (0,2 ng mL-1 - 5,0 ng mL-1) ao LSQ (40,5 ng mL-1 - 10,5 g mL-1), exatidão com EPR de -9,7 a 8,0%, e precisão com CV de 0,1 a 12%. Já o método LC-MS/MS no modo column switching apresentou linearidade do LIQ (63,0 pg mL-1 - 1250,0 pg mL-1) ao LSQ (40,5 ng mL-1 - 10,5 g mL-1), exatidão com EPR de -14 a 12% e precisão com CV de 0,6 a 6,5%. A pré-concentração seletiva dos fármacos na coluna monolítica com grupos cianopropil incorporados e a remoção dos componentes endógenos da amostra biológica, antes da separação cromatográfica, favoreceram a seletividade e detectabilidade do método LC-MS/MS no modo column switching. Este método quando comparado ao de referência PPT/LC-MS/MS, através da análise de 10 amostras de pacientes esquizofrênicos, não apresentou diferença significativa (teste t) entre as concentrações plasmáticas, podendo ser aplicado na monitorização terapêutica. Além deste fato, este método automatizado favoreceu a precisão, a exatidão e a freqüência analítica. / Schizophrenia is a chronic neuropsychiatric disorder that affects approximately 1% of the world population. According to neurobiological theories, schizophrenia stems from biochemical and structural alterations in the brain due to dysfunction in the glutamatergic, dopaminergic, and serotonergic systems. Determining the concentrations of amino acids and neurotransmitters in plasma samples from schizophrenic patients may assist evaluation of therapy effectiveness. In addition to antipsychotics (the first-line drug in the initial treatment of schizophrenia), most patients concomitantly use other classes of drugs such as antidepressants, anticonvulsants, and anxiolytics to minimize the symptoms associated with this disease. To evaluate treatment efficacy, in this thesis a method based on protein precipitation (PPT) and hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HILIC-MS/MS) has been properly developed and validated to determine amino acids (aspartate, serine, glycine, alanine, methionine, leucine, tyrosine, and tryptophan) and neurotransmitters (glutamate and -aminobutyric acid) in plasma samples obtained from 35 schizophrenia patients treated with clozapine (27 patients) or olanzapine (8 patients); 38 healthy volunteers served as controls. The HILIC-MS/MS method was linear for concentrations ranging from the LLOQ (9.7 pmol mL-1 - 13.3 nmol mL-1) to the ULOQ (19.4 nmol mL-1 - 800 nmol mL-1). The analysis time was 3.0 min. In the case of accuracy, RSE ranged from -18 to 19%. As for precision, CV lay between 0.1 and 16% (LLOQ). Analysis of variance (ANOVA) followed by post-hoc Duncan showed that the average methionine serum levels (nmol mL-1) (F2.70 = 3.14, p = 0.049) in schizophrenic patients treated with olanzapine were significantly higher as compared with the control group (healthy volunteers). The glutamate level in schizophrenic patients treated with clozapine tended to higher values (F2.70 = 2.50, p = 0.090). Concerning the analytical methods, PPT/LC-MS/MS and LC-MS/MS operating in the column-switching mode were developed and validated to determine antipsychotic (olanzapine, quetiapine, clozapine, haloperidol, and chlorpromazine), antidepressants (mirtazapine, paroxetine, citalopram, sertraline, imipramine, clomipramine, and fluoxetine), anticonvulsants (carbamazepine and lamotrigine), and anxiolytics (diazepam and clonazepam) in plasma samples taken from schizophrenic patients for therapeutic drug monitoring. A monolithic hybrid column containing silica with cyanopropyl groups in the first dimension was employed. The PPT/LC-MS/MS method was linear from the LLOQ (0.2 ng mL-1 - 5.0 ng mL-1) to the ULOQ (40.5 ng mL-1 - 10.5 g mL-1). In the case of accuracy, RSE ranged from -9.7 to 8.0%; as for precision, CV lay between 0.1 and 12%. LC-MS/MS in the column-switching mode was linear from the LLOQ (63.0 pg mL-1 - 1250.0 pg mL-1) to the ULOQ (40.5 ng mL-1 - 10.5 g mL-1). RSE ranged from -14 to 12%; CV lay between 0.6 and 6.5%. The drugs were selectively pre-concentrated in the monolithic column containing silica incorporated with cyanopropyl groups. For the LC-MS/MS method operating in the column-switching mode, the endogenous components of the biological sample of the LC-MS/MS method were removed before analysis. Analysis of 10 plasma samples obtained from schizophrenic patients did not reveal any significant differences (t test) between the LC-MS/MS method and the reference PPT/LC-MS/MS method. Therefore, LC-MS/MS can be applied in therapeutic monitoring, with the advantage that this method offers improved precision, accuracy, and analytical frequency.