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Identificação de proteínas da região cambial de Eucalyptus grandis por eletroforese bidimensional e espectrometria de massas / Identification of proteins from the cambial region of Eucalyptus grandis by bidimensional electrophoresis and mass spectrometryCeledon, Paola Alejandra Fiorani 19 May 2006 (has links)
A proteômica expandiu-se dentro da área biológica a partir da década de 90 com o desenvolvimento de técnicas de ionização branda que permitem analisar macromoléculas por espectrometria de massas (MS) e é uma nova estratégia na busca de genes de interesse e de informações sobre o controle da expressão gênica para a manipulação genética de plantas. Na busca por genes diferencialmente expressos durante o desenvolvimento da madeira, foi estabelecida uma plataforma 2D-LC-MS/MS (eletroforese bidimensional seguida de cromatografia líquida e espectrometria de massas em tandem) e identificadas 72 proteínas da região cambial de Eucalyptus grandis de árvores de 2 anos e 8 meses. A identificação foi feita por homologia com o banco de proteínas SwissProt, com um banco de ESTs específico de Eucalyptus spp. (GENOLYPTUS) e com o NCBI. Os dados de proteínas também foram confrontados com a expressão dos transcritos correspondentes obtidos a partir do mesmo tecido por SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). Dentre as proteínas identificadas, a maior parcela (24,1 %) tem função relacionada com resposta a estresse, 20,5 % pertence a metabolismo de energia, 17,8 % são componentes estruturais, 14,3 % participam em metabolismo de macromoléculas e 15,2 % em metabolismos básicos como de nitrogênio, aminoácidos, nucleotídeos, lipídeos e metabolismo secundário. / Proteomics impacted the biological sciences since the 90´s after the development of soft ionization techniques that allow to analyse macromolecules by mass spectrometry (MS). It became a new strategy to identify genes and obtain information about the molecular control of gene expression, of importance to genetic manipulation of plants. In order to search for genes involved in wood quality and to understand gene expression during wood development, a 2D-LC-MS/MS system (bidimensional electrophoresis followed by liquid cromatography coupled to mass spectrometry in tandem) was stablished. 72 proteins from the cambial region of Eucalyptus grandis trees at the age of 2 years and 8 months were identified. The MS/MS spectra were processed using the SwissProt databank, an EST (Expressed Sequence Tags) bank of Eucalyptus spp. (GENOLYPTUS) and the NCBI. A comparation of gene and protein expression was carried out using a databank constructed in our laboratory using SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) obtained from the same cambial tissue. Most identified proteins are related to stress response (24.1 %), 20.5 % participate in energy metabolism, 17.8 % are important to the cell as structural components, 14,3 % are related to macromolecular metabolism and 15,2 % to basic metabolism of nitrogen, amino acids, nucleotides, lipids and secondary metabolism.
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Perfis metabolômicos da ingestão de café / Metabolomic profiles of coffee intakeGois, Tamiris Carneiro 20 September 2018 (has links)
Diversos estudos relacionados ao consumo de café na literatura não apresentam um consenso do papel deste alimento na saúde. Esta divergência pode ser o reflexo da utilização do consumo habitual auto-relatado pelos indivíduos como o único fator de exposição avaliado, visto que não existem biomarcadores de consumo, além de diferenças na composição química e na metabolização interindividual dos compostos bioativos (CBAs) da bebida. Desta forma, o presente estudo tem como objetivo identificar as alterações no perfil metabolômico de indivíduos saudáveis após o consumo controlado de café, bem como em extratos de café do tipo tradicional e expresso de diferentes marcas. Participaram deste estudo 35 homens saudáveis divididos entre os grupos café (n = 30) e controle (n = 5). As amostras de soro foram coletadas em jejum e 6, 12 e 24 horas após consumo de café (grupo café) ou água (grupo controle) seguida da extração de metabólitos, derivação com reagentes químicos e avaliação pelo método CG-EM. Posteriormente, os metabólitos foram identificados, selecionados, caracterizados e estatisticamente analisados. A análise metabolômica não direcionada permitiu a identificação de três compostos específicos do café (Caffeine, Quinic acid, m-Hydrocoumaric acid) a partir de 6 horas no grupo café. Além destes compostos, o metabólito Methylmalonic acid também demonstrou ser um candidato à biomarcador sérico da ingestão de café. Por meio das comparações entre os grupos café e controle ao decorrer dos tempos no modelo misto observamos diferentes respostas do perfil metabolômico de aminoácidos, carboidratos e lipídeos, promovidas pelos fatores tempo e grupo como também sua interação. Os aminoácidos 4-Hydroxyproline 1, LAlanine 1, L-Cystine 3, L-Methionine 1 e L-Threonine 2 apresentaram diferentes perfis de comportamento no grupo café ao longo de 24 horas, em relação ao grupo controle. Em paralelo, foram realizadas às análises metabolômicas de dois tipos de café: tradicional (Pilão, Melitta, 3 Corações e Prima Qualitá) e expresso (Nespresso, Dolce Gusto e Café Do Ponto). Após a preparação das bebidas, os extratos foram submetidos aos mesmos procedimentos do estudo de intervenção nutricional. No grupo tradicional, nenhum metabólito exclusivo foi identificado nas 4 marcas, porém o perfil metabolômico das marcas Melitta e 3 Corações foram similares e diferentes das demais. No grupo expresso, os cafés Nespresso e Dolce Gusto mostraram perfis semelhantes e diferentes do Café do Ponto, o qual apresentou exclusivamente Cellobiose 2 e beta- Gentiobiose. A comparação entre os grupos tradicional e expresso demonstrou que seus perfis metabolômicos foram distintos, bem como cada um deles apresentou metabólitos exclusivos com algumas funções celulares e moleculares diferentes. A quantidade dos principais compostos bioativos do café foi diferente entre os dois tipos e suas marcas. A caracterização do metaboloma em um grupo homogêneo de indivíduos saudáveis permitiu identificar candidatos à biomarcadores e alterações no perfil de alguns aminoácidos após a ingestão controlada de café. Assim, a identificação de candidatos à biomarcadores de efeito agudo do café mostra a importância de validar um painel com biomarcadores de alta confiabilidade e que possam colaborar com futuros estudos de intervenção nutricional, não apenas baseado do consumo de café reportado. Além disso, diferentes métodos de preparo do café, tradicional e expresso, bem como as diversas marcas analisadas, apresentaram diferença nos seus perfis metabolômicos. Desta forma, este estudo também pode ressaltar a importância de se considerar não somente a quantidade, mas também o tipo e a marca de café consumido como fatores de exposição em estudos de intervenção nutricional e de associação entre o consumo de café e seus efeitos no organismo / There are several studies associating coffee consumption and diseases, however they are not concordant about the coffee role in health. This divergence may reflect a lack of standard in data acquisition since most of the time the subjects\' self-reported habitual consumption is the only exposure factor evaluated and there is no biomarker. Add, there are differences of coffee beverage bioactive compounds composition and subjects show difference in coffee metabolization resulting in many covaries to be considered in these studies. Our study aimed to identify changes in metabolomic profile of healthy individuals after controlled consumption of coffee, as well as metabolic profile of traditional and espresso coffee beverages from different brands. 35 healthy men were distributed into coffee (n = 30) and control (n = 5) groups. Serum was sampled at fasting and 6, 12 and 24 hours after coffee (coffee group) or water (control group) intake. Metabolites were extracted, derivatized with MSTFA and TMCS, and run in GC-MS. Subsequently, the metabolites were identified using Fiehn Metabolomics Library and NIST, filtered, characterized and statistically analyzed. Untargeted metabolomic analysis identified three specific compounds of coffee (Caffeine, Quinic acid, m-Hydrocoumaric acid) in serum of subjects six hours after coffee intake. In addition to these compounds, Methylmalonic acid showed as a potential biomarker candidate of coffee intake in serum. Comparing coffee and control groups over time in a mixed model, we observed difference in the metabolomic profile related to amino acids, carbohydrates and lipids. 4-Hydroxyproline 1, L-Alanine 1, L-Cystine 3, L-Methionine 1 and L-Threonine 2 showed different profiles in coffee group over 24 hours compared to control group. In parallel to serum samples, we performed metabolomic analysis of the beverage. Two types of coffee were used: traditional powder (Pilão, Melitta, 3 Corações and Prima Qualitá) and capsule espresso (Nespresso, Dolce Gusto and Café Do Ponto). After beverages preparation, extracts were submitted to same metabolites extraction and analysis procedures of serum samples. In traditional coffee group, no exclusive metabolites were identified in four brands, but metabolomic profile of Melitta and 3 Corações were similar between them and different from the others. In espresso coffee group, Nespresso and Dolce Gusto showed similarity and they were different from of Café do Ponto, which presented exclusively Cellobiose 2 and beta-Gentiobiose. The comparison between traditional coffee and espresso coffee groups showed a difference in their metabolomic profiles, as well as each of them presented exclusive metabolites with different cellular and molecular functions. The amount of major bioactive compounds in coffee was different between the two modes of preparation and their brands. The characterization of metabolome in a homogeneous group of healthy individuals allowed the identification of potential biomarkers and showed alterations in some amino acids profile after controlled coffee intake. The identification of candidates for biomarkers of acute coffee effect showed the importance of validating a panel with biomarkers of high reliability and that may collaborate with future studies of nutritional intervention, not only based on the reported coffee consumption. In addition, coffee brewing method and brand of the product resulted in differences in their metabolomic profiles. Thus, this study may also highlight the importance of considering not only quantity, but also the brewing method and brand of coffee consumed as exposure factors in studies of nutritional intervention
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Métodos eletroanalíticos visando análises qualitativa e quantitativa de pesticidas usando eletrodo de diamante dopado com boro / Electroanalytical Methods Aiming for Qualitative and Quantitative Analysis of Pesticides Using Boron Doped Diamond ElectrodeThiago Matheus Guimarães Selva 30 October 2017 (has links)
Métodos analíticos empregando técnicas eletroquímicas foram desenvolvidos para o monitoramento qualitativo e quantitativo de pesticidas carbamatos. O sensor utilizado no desenvolvimento dos métodos foi o eletrodo de diamante dopado com boro pré-tratado catodicamente. No desenvolvimento do método qualitativo, foi possível discriminar e classificar cinco pesticidas carbamatos (aldicarb, carbaril, carbofurano, metomil e propoxur) com a ajuda de ferramentas quimiométricas, tais como análise de componentes principais e do algoritmo dos k-vizinhos mais próximos. Nesse método, os valores de corrente, obtidos por voltametria de onda quadrada, para os pesticidas foram utilizados como dados de entrada nas ferramentas quimiométricas. Um método eletroquímico, utilizando voltametria de pulso diferencial, para a quantificação do pesticida propoxur foi desenvolvido. Após a otimização dos parâmetros da técnica e das condições experimentais, construiu-se uma curva analítica de 1,66 a 155 µmol L-1 (R2 = 0,9935) e limite de detecção estimado de 0,50 µmol L-1. A exatidão do método foi avaliada por adição e recuperação em amostras de águas naturais, onde se alcançou níveis de recuperação na faixa de 86,7 a 103%. Para o pesticida pirimicarbe, foi realizado um amplo estudo visando elucidar o comportamento eletroquímico de oxidação desse composto, o qual foi suportado por dados de espectrometria de massas. Na faixa de pH estudada (2 a 8), o pirimicarbe apresentou três sinais de oxidação irreversíveis, sendo os dois primeiros dependentes do pH. Por outro lado, em experimento realizado em meio orgânico, evidenciou a presença de apenas um sinal de oxidação para o pesticida. Também foi desenvolvido um método eletroquímico por voltametria de pulso diferencial para a quantificação do pirimicarbe. Os parâmetros da técnica de voltametria de pulso diferencial foram otimizados utilizando planejamento experimental. A curva analítica apresentou faixa de trabalho de 2,00 a 219 µmol L1-1 (R2 = 0,9982) e limite de detecção estimado de 1,24 µmol L-1. O método de adição e recuperação juntamente com calibração externa foram utilizados para avaliação da exatidão do método em amostras de águas naturais, obtendo-se recuperações entre 88,6 e 96,3%. Adicionalmente, um método para a quantificação do pesticida paraquate foi desenvolvida utilizando a técnica de voltametria de onda quadrada. O pesticida apresentou dois sinais de redução reversíveis e com magnitude de corrente semelhantes, portanto, sendo possível utilizar qualquer um dos dois sinais para sua quantificação. Com a otimização dos parâmetros da técnica e das condições experimentais, foi possível obter uma curva analítica na faixa de 0,800 a 167 µmol L-1 (R2 = 0,9990) e limite de detecção estimado em 70 nmol L1-1. O método foi aplicado em amostras de saliva humana e águas naturais e níveis de recuperação na faixa de 83,0 a 105% foram alcançados. Vale ressaltar que todos os métodos analíticos aqui propostos apresentaram simplicidade, confiança e podem ser considerados adequados tanto para análises de rotina quanto para aplicações em campo, devido à portabilidade apresentada pelos métodos eletroquímicos. / Electroanalytical methods were developed for the qualitative and quantitative monitoring of carbamate pesticides. The sensor used for the development of the proposed methods was the boron-doped diamond electrode cathodically pre-treated. In the development of the qualitative method, it was possible to discriminate and classify five carbamate pesticides (aldicarb, carbaryl, carbofuran, methomyl and propoxur) using chemometric tools such as principal component analysis and the k-nearest neighbors algorithm. In qualitative approach, current values obtained by square-wave voltammetry for pesticides were used as input data of the chemometric tools. An electrochemical method, using differential pulse voltammetry, for the quantification of pesticide propoxur was also developed. At the best conditions (parameters of the technique and the experimental conditions), an analytical curve from 1.66 to 155 µmol L-1 (R2 = 0.9935) and an estimated detection limit of 0.50 µmol L-1 were obtained. The accuracy of the method was evaluated by addition and recovery approach in natural waters samples and recovery levels ranging from 86.7 to 103% were reached. For the pesticide pirimicarb, a study was carried out to elucidate the electrochemical oxidation behavior of this compound, which was supported by mass spectrometry data. In the pH range (2 to 8) studied, the pirimicarb shown three irreversible oxidation signals, the first two were pH-dependent. On the other hand, in an experiment carried out in organic medium, it exhibited the presence of only one oxidation signal for the pesticide. An electrochemical method was also developed by differential pulse voltammetry for the quantification of pirimicarb. The parameters of the differential pulse voltammetry technique were optimized using experimental design. The analytical curve showed a working range from 2.00 to 219 µmol L-1 (R2 = 0.9982) and an estimated detection limit of 1.24 µmol L-1. The addition and recovery approach with external calibration were used to evaluate the accuracy of the method in natural water samples, obtaining recoveries values between 88.6 and 96.3%. In addition, a method for the quantification of the paraquat pesticide was developed using the square-wave voltammetry technique. The pesticide presented two reversible reduction signals with similar current magnitude, therefore, it is possible to use either of the two signals for its quantification. Under optimized parameters of the technique and the experimental conditions, it was possible to obtain an analytical curve in the range from 0.800 to 167 µmol L-1 (R2 = 0.9999) and detection limit estimated of 70 nmol L-1. This method was applied for human saliva and natural water samples and recovery levels ranging from 83.0 to 105% were achieved. It should be noted that all the analytical methods proposed here exhibited simplicity, reliability and can be considered adequate for routine analysis and in-field applications due to the portability characteristics of the electrochemical methods.
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Acúmulo da ribonucleoproteína heterogênea nuclear K em câncer de cabeça e pescoço: estudos mitocondriais / Accumulation of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K in head and neck cancer: mitochondrial studiesGarcia, Cristiana Bernadelli 03 April 2014 (has links)
A ribonucleoproteína heterogênea nuclear K (hnRNP K) é uma proteína envolvida em processos de expressão gênica e tem sido proposta como ligante de RNAs mensageiros mitocondriais. Apesar de ser considerada um marcador de pior prognóstico no câncer de cabeça e pescoço, o papel da hnRNP K nesta doença ainda é pouco conhecido. O objetivo deste trabalho foi estudar o envolvimento da hnRNP K na mitocôndria com ênfase na bioenergética e na identificação de novos potenciais ligantes de hnRNP K. As linhagens celulares utilizadas foram de carcinoma de cabeça e pescoço (HN13 e CAL 27) com silenciamento de RNA para hnRNP K e células HEK293 com super-expressão de hnRNP K. O efeito do acúmulo celular da hnRNP K na cadeia transportadora de elétrons mitocondrial foi avaliado por meio da atividade dos complexos mitocondriais I, II e V em células HN13. A redução do nível de hnRNP K usando RNA de interferência promoveu uma diminuição da atividade dos complexos nas células HN13, indicando o envolvimento da proteína na eficiência do transporte de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial. Células HEK293 com super-expressão da hnRNP K (HEK293/hnRNP K) e as linhagens HN13 e CAL 27 com silenciamento e redução estável de hnRNP K foram utilizadas para determinar o papel de hnRNP K no potencial de membrana mitocondrial, níveis de ATP, produção de lactato e consumo de oxigênio. Células HEK293/hnRNP K comparadas ao controle apresentaram maior nível de ATP, menor potencial de membrana mitocondrial, menor consumo de oxigênio e maior produção de lactato. As células HN13 com redução da hnRNP K apresentaram níveis mais baixos de ATP, com menor liberação de lactato para o meio extracelular e maior consumo de oxigênio. Esses resultados sugerem que o acúmulo da proteína hnRNP K tem ação importante na mitocôndria por alterar o metabolismo bioenergético celular de fosforilação oxidativa para glicólise anaeróbica. A estratégia de co-imunoprecipitação usando anticorpos para hnRNP K, digestão de proteínas com tripsina e cromatografia líquida acoplada a espectrômetria de massa foi usada para encontrar novos potenciais ligantes de hnRNP K. A análise dos dados com o software SEPro identificou 57 proteínas candidatas a ligantes da hnRNP K. Três proteínas foram validadas por co-IP e Western blotting: o fator de transcrição mitocondrial PTCD3, YB1 e PSF. Propomos que a hnRNP K apresenta função na energética mitocondrial, e provavelmente, a sua interação com PTCD3 participa desta função. / Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K (hnRNP K) is a protein involved in gene expression processes, which has been proposed to bind mitochondrial mRNAs. Despite it to be considered a prognostic marker in cancer, the hnRNPK role in this disease is unknown. We addressed the involvement of hnRNP K in mitochondria with emphasis on bioenergetics and identification of new potential ligands of hnRNP K. The cell lines used were from head and neck squamous cell carcinoma (HN13 and CAL 27) with RNA silencing for hnRNP K , and HEK293 cells with overexpression of hnRNP K. The effects of cellular accumulation of hnRNP K in mitochondrial electron chain carriers were assessed by the activity of mitochondrial complexes I, II and V in HN13 cells. Reduced levels of hnRNP K using RNA interference promoted a decrease in the activity of the complexes in HN13 cells, indicating the involvement of the protein in the efficiency of the electron transport in mitochondrial respiratory chain. HEK293 cells with overexpression of hnRNP K (HEK293/hnRNP K) and HN13 and CAL 27 cells with silencing and stable reduction of hnRNP K were used to determine the role of hnRNP K in mitochondrial membrane potential, ATP levels, lactate production and oxygen consumption. HEK293/hnRNP K, compared to control cells, showed higher levels of ATP, reduced mitochondrial membrane potential, lower oxygen consumption and higher production of lactate. HN13 cells with reduced hnRNP K had lower ATP levels, with lower release of lactate to the extracellular medium and higher oxygen consumption. These results suggest that accumulation of hnRNP K protein plays a role in mitochondria by changing the cellular energetic metabolism from oxidative phosphorylation to glycolysis. The strategy of co-immunoprecipitation using antibodies for hnRNP K, protein digestion with trypsin, and liquid chromatography, coupled to mass spectrometer, were used to search for new potential ligands of hnRNP K. Data analysis with software SEPro identified 57 candidate proteins binding to hnRNP K. Three proteins were validated by co-IP and Western blotting: the mitochondrial transcription factor PTCD3, YB1, and PSF. We propose that hnRNP K plays a role in the mitochondrial energetics, and probably its interaction with PTCD3 participates in this function.
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Biossíntese de vitamina E nos estágios intraeritrocitários de P. falciparum. / Vitamin E biosynthesis in intraerythrocytic stages of Plasmodium falciparum.Sussmann, Rodrigo Antonio Ceschini 15 February 2011 (has links)
O estudo da biossíntese de isoprenóides em P. falciparum por meio da via 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato (MEP) é apontado como possível alvo terapêutico, visto a via ser ausente em humanos. Foi descrito que nos estágios intraeritrocitários de P. falciparum a via essencial de biossíntese de isoprenóides é a via MEP. As vias do Chiquimato e MEP são precursoras da biossíntese de vitamina E e ambas já foram descritas em P. falciparum. É sugerido que a biossíntese de vitamina E possa ocorrer no parasita, representando um possível alvo para o desenvolvimento de novas drogas antimaláricas. Empregando marcações metabólicas com precursores radioativos, três diferentes métodos de RP-HPLC e análises por espectrometria de massas confirmamos a biossíntese de vitamina E nos três estágios intraeritrocíticos do parasita. O tratamento com ácido úsnico, mostrou inibição dessa biossíntese no estágio esquizonte e do crescimento do parasita. Demonstramos por meio de uma sonda fluorescente, ácido Parinárico, que a vitamina E atua como antioxidante lipofílico, protegendo a lipoperoxidação. Esses resultados não só contribuem para a compreensão da biologia de P. falciparum, mas também elucidam partes das vias MEP e do Chiquimato que podem servir como alvos terapêuticos. / The study of isoprenoid biosynthesis in Plasmodium falciparum by 2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway (MEP) it is presented as a therapeutic target once that it is absent in humans. It was found in intraerythrocytic stages of P. falciparum the biosynthesis of isoprenoids by the MEP pathway. The shikimate and MEP pathways are the precursors of biosynthesis of vitamin E and both pathways have already been described in P. falciparum. It is suggested that the biosynthesis of vitamin E might occur in the parasite, representing a possible target for developing new antimalarial drugs. Using metabolic labelling with radiolabelled precursors, three different methods of RP-HPLC and mass spectrometry analyses confirmed the biosynthesis of vitamin E in the three intraerythrocytic stages of parasite. The treatment with usnic acid showed an inhibition of this biosynthesis and of the growth of parasite. We demonstrated by means of a fluorescent probe, the acid Parinaric, that vitamin E acts as a lipophilic antioxidant protecting the membrane of lipoperoxidation. These findings not only contribute to the current understanding of P. falciparum biology but shed light on a pathway that could serve as a chemotherapeutic target.
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Perfis metabolômicos da ingestão de café / Metabolomic profiles of coffee intakeTamiris Carneiro Gois 20 September 2018 (has links)
Diversos estudos relacionados ao consumo de café na literatura não apresentam um consenso do papel deste alimento na saúde. Esta divergência pode ser o reflexo da utilização do consumo habitual auto-relatado pelos indivíduos como o único fator de exposição avaliado, visto que não existem biomarcadores de consumo, além de diferenças na composição química e na metabolização interindividual dos compostos bioativos (CBAs) da bebida. Desta forma, o presente estudo tem como objetivo identificar as alterações no perfil metabolômico de indivíduos saudáveis após o consumo controlado de café, bem como em extratos de café do tipo tradicional e expresso de diferentes marcas. Participaram deste estudo 35 homens saudáveis divididos entre os grupos café (n = 30) e controle (n = 5). As amostras de soro foram coletadas em jejum e 6, 12 e 24 horas após consumo de café (grupo café) ou água (grupo controle) seguida da extração de metabólitos, derivação com reagentes químicos e avaliação pelo método CG-EM. Posteriormente, os metabólitos foram identificados, selecionados, caracterizados e estatisticamente analisados. A análise metabolômica não direcionada permitiu a identificação de três compostos específicos do café (Caffeine, Quinic acid, m-Hydrocoumaric acid) a partir de 6 horas no grupo café. Além destes compostos, o metabólito Methylmalonic acid também demonstrou ser um candidato à biomarcador sérico da ingestão de café. Por meio das comparações entre os grupos café e controle ao decorrer dos tempos no modelo misto observamos diferentes respostas do perfil metabolômico de aminoácidos, carboidratos e lipídeos, promovidas pelos fatores tempo e grupo como também sua interação. Os aminoácidos 4-Hydroxyproline 1, LAlanine 1, L-Cystine 3, L-Methionine 1 e L-Threonine 2 apresentaram diferentes perfis de comportamento no grupo café ao longo de 24 horas, em relação ao grupo controle. Em paralelo, foram realizadas às análises metabolômicas de dois tipos de café: tradicional (Pilão, Melitta, 3 Corações e Prima Qualitá) e expresso (Nespresso, Dolce Gusto e Café Do Ponto). Após a preparação das bebidas, os extratos foram submetidos aos mesmos procedimentos do estudo de intervenção nutricional. No grupo tradicional, nenhum metabólito exclusivo foi identificado nas 4 marcas, porém o perfil metabolômico das marcas Melitta e 3 Corações foram similares e diferentes das demais. No grupo expresso, os cafés Nespresso e Dolce Gusto mostraram perfis semelhantes e diferentes do Café do Ponto, o qual apresentou exclusivamente Cellobiose 2 e beta- Gentiobiose. A comparação entre os grupos tradicional e expresso demonstrou que seus perfis metabolômicos foram distintos, bem como cada um deles apresentou metabólitos exclusivos com algumas funções celulares e moleculares diferentes. A quantidade dos principais compostos bioativos do café foi diferente entre os dois tipos e suas marcas. A caracterização do metaboloma em um grupo homogêneo de indivíduos saudáveis permitiu identificar candidatos à biomarcadores e alterações no perfil de alguns aminoácidos após a ingestão controlada de café. Assim, a identificação de candidatos à biomarcadores de efeito agudo do café mostra a importância de validar um painel com biomarcadores de alta confiabilidade e que possam colaborar com futuros estudos de intervenção nutricional, não apenas baseado do consumo de café reportado. Além disso, diferentes métodos de preparo do café, tradicional e expresso, bem como as diversas marcas analisadas, apresentaram diferença nos seus perfis metabolômicos. Desta forma, este estudo também pode ressaltar a importância de se considerar não somente a quantidade, mas também o tipo e a marca de café consumido como fatores de exposição em estudos de intervenção nutricional e de associação entre o consumo de café e seus efeitos no organismo / There are several studies associating coffee consumption and diseases, however they are not concordant about the coffee role in health. This divergence may reflect a lack of standard in data acquisition since most of the time the subjects\' self-reported habitual consumption is the only exposure factor evaluated and there is no biomarker. Add, there are differences of coffee beverage bioactive compounds composition and subjects show difference in coffee metabolization resulting in many covaries to be considered in these studies. Our study aimed to identify changes in metabolomic profile of healthy individuals after controlled consumption of coffee, as well as metabolic profile of traditional and espresso coffee beverages from different brands. 35 healthy men were distributed into coffee (n = 30) and control (n = 5) groups. Serum was sampled at fasting and 6, 12 and 24 hours after coffee (coffee group) or water (control group) intake. Metabolites were extracted, derivatized with MSTFA and TMCS, and run in GC-MS. Subsequently, the metabolites were identified using Fiehn Metabolomics Library and NIST, filtered, characterized and statistically analyzed. Untargeted metabolomic analysis identified three specific compounds of coffee (Caffeine, Quinic acid, m-Hydrocoumaric acid) in serum of subjects six hours after coffee intake. In addition to these compounds, Methylmalonic acid showed as a potential biomarker candidate of coffee intake in serum. Comparing coffee and control groups over time in a mixed model, we observed difference in the metabolomic profile related to amino acids, carbohydrates and lipids. 4-Hydroxyproline 1, L-Alanine 1, L-Cystine 3, L-Methionine 1 and L-Threonine 2 showed different profiles in coffee group over 24 hours compared to control group. In parallel to serum samples, we performed metabolomic analysis of the beverage. Two types of coffee were used: traditional powder (Pilão, Melitta, 3 Corações and Prima Qualitá) and capsule espresso (Nespresso, Dolce Gusto and Café Do Ponto). After beverages preparation, extracts were submitted to same metabolites extraction and analysis procedures of serum samples. In traditional coffee group, no exclusive metabolites were identified in four brands, but metabolomic profile of Melitta and 3 Corações were similar between them and different from the others. In espresso coffee group, Nespresso and Dolce Gusto showed similarity and they were different from of Café do Ponto, which presented exclusively Cellobiose 2 and beta-Gentiobiose. The comparison between traditional coffee and espresso coffee groups showed a difference in their metabolomic profiles, as well as each of them presented exclusive metabolites with different cellular and molecular functions. The amount of major bioactive compounds in coffee was different between the two modes of preparation and their brands. The characterization of metabolome in a homogeneous group of healthy individuals allowed the identification of potential biomarkers and showed alterations in some amino acids profile after controlled coffee intake. The identification of candidates for biomarkers of acute coffee effect showed the importance of validating a panel with biomarkers of high reliability and that may collaborate with future studies of nutritional intervention, not only based on the reported coffee consumption. In addition, coffee brewing method and brand of the product resulted in differences in their metabolomic profiles. Thus, this study may also highlight the importance of considering not only quantity, but also the brewing method and brand of coffee consumed as exposure factors in studies of nutritional intervention
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Desenvolvimento e aplicação de técnicas miniaturizadas de preparo de amostra na determinação de fármacos no ambiente / Development and application of microextraction sample preparation techniques to determine pharmaceutical drugs in the environmentPaulo Clairmont Feitosa de Lima Gomes 10 August 2012 (has links)
A presença de fármacos no ambiente é um problema preocupante em virtude dos efeitos ecotoxicológicos conhecidos, e ainda os que continuam desconhecidos. A água é um dos compartimentos ambientais mais afetado por esses contaminantes, já que é utilizado em diversas atividades humanas. A contaminação da água afeta não somente os humanos, mas também todos os demais seres vivos que vivem ou utilizam dessa água. Por esse motivo, o desenvolvimento de métodos para análise de medicamentos em matrizes ambientais é essencial para o monitoramento desses contaminantes. Além disso, os métodos já desenvolvidos podem ainda ser aplicados para auxiliar no desenvolvimento de novas tecnologias de tratamento de água, bem como no estudo de produtos de degradação de fármacos durante as etapas de tratamento. Para essas finalidades, são utilizadas técnicas cromatográficas com detecção por espectrometria de massas para obter a separação dos compostos, permitindo a quantificação e a identificação inequívoca. Para realização dessas análises é necessário adotar métodos de preparo de amostra que possibilitem a concentração dos analitos presentes, e também, a eliminação dos interferentes presentes na matriz. Dessa maneira, nesse trabalho foram desenvolvidos 2 métodos de análise, um usando a cromatografia gasosa convencional acoplada a espectrometria de massas (GC-MS), e outro usando a cromatografia bidimensional abrangente com detecção por espectrometria de massas usando analisador do tipo tempo de voo (GCxGC-ToF/MS) para análise de resíduo de fármacos em matrizes aquosas, ambos utilizando como técnica de preparo de amostra a microextração em fase sólida (SPME). Na análise usando SPME-GC-MS foi utilizado a derivatização in situ para evitar picos assimétricos e possibilitar uma melhor separação cromatográfica. Esse método foi aplicado em amostras de rio, águas residuárias de entrada e saída de estação de tratamento (ETE) e esgoto industrial. Em todas as amostras foi possível detectar a presença dos fármacos, porém somente na entrada da ETE foi possível quantificar a presença de cetoprofeno (KET) presente na concentração de 1050 ng L-1. Já para o método SPME-GCxGC-ToF/MS, devido o alto poder de separação do sistema bidimensional, foi possível separar 13 fármacos sem necessitar de derivatização. O método foi aplicado para amostra de rio, sendo que em nenhuma das amostras não foi detectado e quantificado os medicamentos em estudo. Em ambos os métodos foi aplicado planejamento experimental para otimizar o preparo de amostra e a reação de derivatização in situ quando utilizada. Após o desenvolvimento desses métodos, uma nova vertente foi estudada com o desenvolvimento de novas fases extratoras para extração por sorção em barras de agitação (SBSE) labmade foram desenvolvidas. Cerca de 7 novas fases extratoras foram desenvolvidas, sendo mistas tendo como base uma mistura de polidimetilsiloxano (PDMS) com outros polímeros e/ou outro material adsorvente. Essas fases foram testadas e comparadas com a barra de PDMS comercial na extração de 9 fármacos presentes em água. A barra que apresentou melhor desempenho tinha como fase extratora uma mistura de PDMS com 30% OV-17-vinil. Além disso, uma barra de SBSE contendo 5% carvão ativo foi aplicado com sucesso na análise de fenol em urina. Além dessas novas fases, foi explorado em conjunto o desenvolvimento de novas fases extratoras para extração por sorção nas paredes do frasco (VWSE) direcionados para extração de fármacos em água. As fases desenvolvidas eram compostas por uma mistura de carvão ativo com PDMS, e PDMS com divinilbenzeno (PDMS/DVB), em diferentes proporções. Por último, um aperfeiçoamento foi realizado na técnica de VWSE. Essas modificações foram testadas na extração de compostos com caracerísticas não-polares (progesterona) e polares (cafeína), e demonstrou eficiência na extração de ambos. / The occurrence of pharmaceutical drugs in the environment is a worldwide problem caused by the genotoxicity and ecotoxicity activities of those compounds. Water is one of most used natural resource in human activities which explain the presence of emerging contaminants. Those compounds affect not only humans but also aquatic animals that spend the whole life cycle in this environment. In order to monitor drugs in the environment, it is essential the development of analytical methods to analyze pharmaceutical drugs in environmental matrices. Moreover, those methods developed are useful for the development of new water treatment techniques, and analysis of drug metabolites formed during the water treatment process. To accomplish all these purposes, chromatographic methods of analysis coupled to mass spectrometry detection are essential to separate the analytes, and further to identify and quantify them unequivocally. Before the analysis, the sample preparation step is fundamental to concentrate the analytes, eliminate and clean-up all the matrices interferents. Thus, in this thesis is described the development of 2 methods, one using conventional gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), the latter one using comprehensive two dimensional gas chromatography coupled to time of flight mass spectrometry (GCxGC-ToF/MS) to analyze pharmaceutical drugs in water matrices. In both methods, solid phase microextraction (SPME) was used in the sample preparation procedure. In the SPME-GC-MS method in situ derivatization was applied to improve the chromatographic separation, providing neat and sharp peaks. This method were applied to analyze river, sewage and wastewater samples. In all samples were detected the presence of pharmaceutical drugs. However, one wastewater sample from the entrance of wastewater treatment plants (WWTP) presented ketoprofen in the concentration level of 1050 ng L-1. GCxGC-ToF/MS method it was possible to accomplish a complete separation of 13 analytes absent of peak tailing, co-elution and degradation without a derivatization reaction. River water samples were analyzed using this method, although, in none of the compounds were present in the samples. In both methods, an experimental design was used to optimize the SPME extraction and derivatization reaction. A second phase in this study explored the development of new polymeric phases for stir bar sorptive extraction (SBSE). About 7 new phases were developed, all phases were mixed of polidimethylsiloxane (PDMS) with other polymeric phases or with adsorptive material. All these new phases were tested and compared against the comercial version in the extraction of 9 pharmaceuticals compounds in water. The mixed polymeric phase of PDMS and OV-17-vinyl demonstrated a suitable selectivity to extract all pharmaceutical drugs in water. Also, a SBSE bar containing activated carbon 5% was applied in the analysis of phenol in urine. Also, it was studied the development of new polymeric phases applied for the vial wall sorptive extraction (VWSE) used in the analysis of drugs in water. These new phases were based on a mixture of PDMS with activated carbon, and PDMS combined with divinylbenzene (PDMS/DVB) in different amounts of each compound. At least, a new configuration in the VWSE was purposed. This new configuration was tested for the extraction of non-polar (progesterone) and polar (caffeine) compounds in water, and presented adequate response for both compounds.
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Estudo dos poluentes orgânicos persistentes (POPs) em regiões industriais da Grande São Paulo - via cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas (GC-MS) e captura de elétrons (GC-ECD) / Study of persistent organic pollutants (POPs) in industrial areas of Greater São Paulo - via gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and electron capture (GC-ECD)Justine Paula Ramos de Oliveira 20 December 2011 (has links)
O estudo objetivou desenvolver e validar um método para identificar e quantificar poluentes orgânicos persistentes, conhecidos como POPs, em solo de regiões industriais dos municípios de Caieiras e Franco da Rocha SP, via cromatografia a gás acoplada a Espectrometria de Massas (GC-MS) e Detector por Captura de Elétrons (ECD). Em observância ao Tratado de Estocolmo, patrocinado pela Organização das Nações Unidas ONU, que prevê o banimento de pelo menos doze dos POPs, e no qual o Brasil é um dos 113 países signatários, o trabalho visou colaborar positivamente com essa questão ambiental tão importante. Estes compostos são tóxicos e altamente estáveis no ambiente e em organismos vivos, dentre os quais, são abordados nesse trabalho o clordano cis/trans (C10H6Cl8), o heptacloro (C10H5Cl7), o heptacloro epóxido cis/trans (C10H5Cl7) e os isômeros α-, β-, γ- e δ-BHC (C6Cl6). Para garantir a confiabilidade das análises realizadas, foram realizados ensaios de Validação da metodologia, com base nas diretrizes do INMETRO. A técnica de extração utilizada foi o QuEChERS, obtendo resultados de recuperação na faixa de 70 a 120% para a maioria dos compostos estudados, considerados aceitáveis para matrizes complexas. Os limites de detecção e quantificação do método compreenderam a faixa de 0,0002 e 0,01 μg.g1, respectivamente. As amostras analisadas apresentaram contaminação pelos compostos hexaclorobenzeno α-, β-, γ- e δ-, muitas das quais estão acima dos limites máximos permissíveis, de acordo com as legislações nacionais e internacionais vigentes. / The study aimed to develop and validate a method to identify and quantify persistent organic pollutants, known as POPs in soil of industrial regions Caieiras and Franco da Rocha municipalities in São Paulo, via gas chromatography coupled with Mass Spectrometry (GC-MS) and Electron Capture Detector (ECD). In compliance with the Treaty of Stockholm, sponsored by the United Nations - UN, which provides for a ban of at least twelve POPs, in which Brazil is one of the 113 signatory countries, the work aims to contribute positively to the environmental issue as important . These compounds are highly toxic and stable in the environment and living organisms, among which are address in this work chlordane cis / trans (C10H6Cl8), heptachlor (C10H5Cl7), heptachlor epoxide the cis / trans (C10H5Cl7) and the isomers α-, β-, γ- and δ-BHC (C6Cl6). To ensure reliability of the analysis carried out, tests were carried out validation method, based on the guidelines of INMETRO. The extraction technique was used QuEChERS, achieving recovery in the range 70 to 120% for the most of compounds, acceptable for complex matrices. The limits of detection and quantification of the method comprises the range of 0.0002 and 0.01 μg.g-1, respectively. The samples analyzed were contaminated by compounds hexachlorobenzene α-, β-, γ- and δ-, many of which are above the maximum allowable in accordance with national legislation and international law.
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Estudo fitoquímico e biológico de Unonopsis guatterioides e Unonopsis duckeiSilva, Felipe Moura Araújo da 19 December 2011 (has links)
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Previous issue date: 2011-12-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The neotropical genus Unonopsis, one among the 130 genera belonging to the
Annonaceae family, has been a promising source of aporphine alkaloids and derivatives. The
antiprotozoal activity of this class of substances, mainly anti-leishmania activity, has aroused
the interest of several research groups around the world. In the present work were carried out
the analysis from alkaloidal fractions of the leaves, twigs and barks of the trunk from
Unonopsis duckei and Unonopsis guatterioides by mass spectrometry, doing an investigation
in the alkaloid profile in order to obtain promising structures with activity against Leishmania.
The analysis of MSn and LC/APCI/MS of the alkaloidal fractions of U. guatterioides
confirmed the presence of some alkaloids previously reported in the literature such as
anonaine, asimilobine, liriodenine and lysicamine. It was possible identify the nornuciferine
alkaloid which was characterized for the first time in the Unonopsis genus, and suggest the
presence of azafluorenone type alkaloid. The spectrometric investigation of U. duckei
revealed the presence of aporphine and oxoaporphine alkaloids which were already reported
in this genus, as well as guided the isolation of the proaporphine alkaloid glaziovine and the
mixture of glaucine and norglaucine alkaloids. These compounds are inedit in the Unonopsis
genus. The triterpene polycarpol was isolated from both species, observed U. duckei like the
best yield. In the phytochemical investigation of the apolar extracts of U. guatterioides was
possible to identify a mixture of sitosterol/stigmasterol steroids. The biological analyses of U.
duckei and U. guatterioides alkaloidal fractions showed that four of them were considered
highly active, one of them was moderatly active and only one was not showed active against
Leishmania amazonensis. Among the substances evaluated, the alkaloid glaziovine showed
the most effective activity against Leishmania amazonensis. / O gênero neotropical Unonopsis, um dos 130 gêneros pertencentes à família
Annonaceae, tem se mostrado uma fonte promissora de alcalóides aporfínicos e derivados. A
atividade antiprotozoário desta classe de substâncias, principalmente a atividade
antileishmania, tem despertado o interesse de diversos grupos de pesquisa ao redor do mundo.
No presente trabalho foram realizadas as análises das frações alcaloídicas das folhas, galhos e
cascas do tronco de Unonopsis duckei e Unonopsis guatterioides por meio de espectrometria
de massas, investigando seu perfil alcaloídico com vistas à obtenção de estruturas promissoras
em atividade antileishmania. Através das análises de MSn e LC/APCI/MS das frações
alcaloídicas de U. guatterioides foi possível confirmar a presença dos alcalóides anonaina,
asimilobina, liriodenina e lisicamina, já reportados na literatura da espécie, identificar pela
primeira vez no gênero o alcalóide nornuciferina, além de sugerir a presença de um alcalóide
do tipo azafluorenona, previamente reportado na espécie U. lindimanii. A investigação
espectrométrica de U. duckei revelou a existência de alcalóides aporfínicos e oxoaporfínicos
já reportados no gênero, bem como conduziu ao isolamento do alcalóide aporfínico glaziovina
e de uma mistura de glaucina e norglaucina, sendo todos esses alcalóides inéditos no gênero.
Foi realizado o isolamento do triterpeno policarpol de ambas as espécies, sendo o melhor
rendimento observado em U. duckei. A investigação dos constituintes menos polares de U.
guatterioides levou ao isolamento de misturas de sitosterol/estigmasterol. Das frações
alcaloídicas de U. duckei e U. guatterioides analisadas, quatro foram consideradas altamente
ativas, uma ativa e apenas uma não se apresentou ativa frente a Leishmania amazonensis.
Entre as substâncias avaliadas, o alcalóide glaziovina apresentou alta atividade frente a
Leishmania amazonensis.
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Estudo dos produtos químicos originados a partir da degradação do gel de clorexidina a 2%, por meio da Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas / Study of chemicals derived from the degradation of 2 % chlorhexidine gel, by means gas chromatography coupled to mass spectrometrySamuel Henrique Camara De-Bem 23 January 2012 (has links)
O presente trabalho teve como objetivo determinar, por meio da Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-MS), produtos oriundos da degradação do digluconato de clorexidina (CHX) 2 % em gel. Foram selecionados três géis: comercial Gel_Chlorhexidina® (Maquira), CHX gel UNIARARAS (Manipulado pela Farmácia Ensino Uniararas) e gel CHX 2 % preparado a partir de uma uma solução comercial de CHX 20 % Sigma® no laboratório. Para que fosse possível comparar os resultados, foi preparada uma solução de CHX 2 % partindo da mesma solução comercial de CHX Sigma®. Para a avaliação dos produtos de degradação da CHX 2 %, os géis e a solução foram pesados (1 g / gel 1 mL /solução) e acondicionados em tubos plásticos (Eppendorf®). Os tubos foram subdivididos em quatro diferentes situações de armazenamento (sobre a bancada de trabalho com e sem a presença de luz, em forno de Pasteur a 36,5 °C sem luz e em geladeira a 8 °C sem luz) e quatro diferentes períodos de análise (inicial, após 1 mês, 3 meses e 6 meses de armazenamento) resultando em 52 análises cromatográficas. Após o período determinado, as amostras foram extraídas, filtradas e analisadas por meio de CG-MS. Os resultados mostraram, na análise inicial, que todos os géis e a solução já continham produtos de degradação da CHX (espécies de oxigênios reativos - ROS). Um dos ROS era a pCA. Além da pCA, outros ROS foram observados, oCA e/ou mCA (isômeros da pCA) e os organoclorados orto-isocianato clorofenil e 2-amino-5-clorobenzonitrila. A porcentagem de pCA calculada nas amostras dos géis não foi gradual nem uniforme, levantando a hipótese de falta de homogeneidade da CHX na formulação do gel. A não homogeneidade foi comprovada através de análise em espectrofotometria UV/Vis. Uma sugestão de manipulação dos géis de CHX foi então sugerida e a homogeneidade da CHX nos géis manipulados desta maneira foi comprovada através de análise em espectrofotometria UV/Vis. Concluiu-se que os géis e a solução de CHX a 2 % analisados neste trabalho, apresentaram produtos oriundos da degradação da CHX em todas as situações de armazenamento e tempo de análises propostas, essa degradação é um problema intrínseco da CHX. Os produtos formados a partir da oxidação da CHX são tóxicos e possuem características genotóxicas, podendo trazer riscos ao seres humanos com danos celulares e no DNA. Mais estudos são necessários para verificar o potencial carcinogênico da CHX, de seus produtos de degradação e se o uso de produtos contendo CHX é seguro em seres humanos. / The aim of this study was to determine, by means of gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), products originated from the degradation of 2 % chlorhexidine digluconate (CHX) gel. Three gels were selected: commercial Gel_Chlorhexidina® (Maquira), 2 % CHX gel UNIARARAS (handled at the Pharmacy Education UNIARARAS) and 2% CHX gel prepared in laboratory from a commercial 20% CHX solution (Sigma®). For comparison of the results, a 2% CHX solution was also prepared from the same commercial 20 % CHX solution (Sigma®). For assessment of the products of 2 % CHX degradation, the gels and the solution were weighed (1 g / gel - 1 mL / solution) and placed in plastic tubes (Eppendorf®). The tubes were divided into four different storage conditions (on the workbench with and without the presence of light, Pasteur oven at 36.5 °C without light and in a refrigerator at 8 °C without light) and four different evaluation periods (initial and after 1 month, 3 months and 6 months of storage), resulting in 52 chromatographic analyses. After the specified evaluation periods, the samples were extracted, filtered and analyzed by GC-MS. The results showed that, in the initial analysis, all gels and the solution already contained CHX degradation products (reactive oxygen species - ROS). One of the ROS was para-chloroaniline (pCA). In addition to pCA, other ROS were observed, oCA and/or mCA (pCA isomers) as well as the organochlorines ortho-chlorophenyl isocyanate and 2-amino-5-chloro-benzonitrile. The percentage of pCA calculated in the CHX gel samples was neither gradual nor uniform, raising the possibility of lack of homogeneity in gel formulation. The lack of homogeneity was confirmed by UV/Vis spectrophotometry. Changes in the preparation of the CHX gels were suggested, and the homogeneity of the CHX gels prepared following the suggestions was confirmed by UV/Vis spectrophotometry. It was concluded that the 2% CHX gels and solution evaluated in this study presented products from CHX degradation in all storage conditions and evaluation periods, and this degradation is an intrinsic problem of CHX. The products formed from the oxidation of CHX are toxic and have genotoxic characteristics, and may pose risks for humans such as damage to cells and DNA. Further studies are required to determine the carcinogenic potential of CHX and its degradation products and whether the use of products containing CHX in humans is safe.
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